In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミング ヒトリンパ球のイメージング高度な

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Summary

ここで導入されたプロトコルでは、体内の炎症性条件の下で主要な人間のリンパ球のホーミング肺活量の評価をことができます。アレルギー性炎症のマウス モデルの転送に対して人間の免疫細胞の肺の浸潤をイメージし、化学的にクリアされた肺組織の光シート蛍光顕微鏡による定量化できます。

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Schulz-Kuhnt, A., Zundler, S., Grüneboom, A., Neufert, C., Wirtz, S., Neurath, M. F., Atreya, I. Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59043, doi:10.3791/59043 (2019).

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Abstract

高活性の免疫細胞の組織蓄積を圧倒的な様々 な慢性炎症性疾患の特徴を表し、影響を受ける患者の臨床管理に魅力的な治療上のターゲットとして浮上しました。プロ炎症性免疫細胞の病理組織学的不均衡な組織浸潤の治療の規制を目指す戦略をさらに最適化するためには、病・臓器別に改良された洞察力を達成するために特に重要なこと末梢血リンパ球のホーミングのプロパティです。ここで説明されている実験的なプロトコルは、パパイン誘発肺炎症のコンテキストで蛍光に分類された、本人間のリンパ球の肺蓄積を監視できます。免疫細胞の移動と走化性の分析のために頻繁に使用される標準試験管内アッセイと対照をなして今導入された生体内の設定を組織のアカウント肺固有の側面と炎症性のコンプレックスの影響考慮します。シナリオ生物マウスで行われています。さらに、三次元断面光シート蛍光顕微鏡イメージングは免疫細胞の浸潤にだけ定量的なデータを提供しませんが、また炎症を起こした肺内免疫細胞局在化のパターンを示しています。全体的に、提供されているステップバイ ステップのプロトコルに従うことによって簡単に適用することができます慢性炎症性肺疾患における免疫学的研究価値の高い革新的な技術を導入することが。

Introduction

肺、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患 (COPD) などの古典的な炎症性疾患、肺組織1,2に活性化リンパ球の増加の採用によって駆動されるよく知られています。サイトカインはリンパ球リリース (例えば、IL 4、IL-5、IL 9、IL-13、IFN-γ、TNF-α) 自然免疫と適応免疫細胞の走化性を促進、線維症の気道リモデリング誘導や肺実質2の直接損害します。これまでのところ、肺組織内のリンパ球の病理学的蓄積のための責任の根本的なメカニズムはまだよくわかっていません。肺樹状細胞 (Dc) は明らかに首相の CCR4 発現誘導を介して少なくとも部分的の優遇肺癌浸潤の末梢 T 細胞にすることができる T 細胞の組織選択的刷り込み腸と皮膚ホーミングへの類似で、リンパ球3の表面。CCR4 は、以外にも気道浸潤 T 細胞も CCR5 と末梢血1,4,5内 T 細胞に比べて CXCR3 ケモカイン受容体の発現が特に増加によって特徴付けられます。全体的に、既存のデータが肺生理学的または炎症性条件の下で T リンパ球のホーミングが異なるケモカイン受容体とのそれぞれの配位子の数を含む、従って重大決まる概念と一貫性のある、密接に自然免疫と適応免疫細胞1間のコラボレーションを制御します。特に、病原体や抗原暴露の初期段階では、生得の免疫組織の細胞応答 TLR 刺激、LTB4CCL1、CCL17 のような異なる塩基の即時釈放によって架橋 igeCCL22、CCL20、CXCL10 PGD21,6,7。主な例として PGD2と走化性因子受容体の相互作用 CRTh2 は Th2 細胞の走化性にとって特に重要なが知られている、従って喘息の臨床管理に、有望な治療上のターゲットが登場します。確かに、中等度の喘息患者を示し, 症状の改善治療後 1 秒 (fev 社1) 強制呼気量の大幅な増加 CRTh2 の選択的拮抗薬プラセボ グループの8 と比較して、9。炎症反応のより進行した状態で既に採用の T 細胞が il-4, IL 13 のリリースを介して肺の Dc の強力な刺激としての肺リンパ球蓄積をさらに増幅することができます。その後、これらの骨髄由来の生得的な細胞を調整 STAT6 依存の方法1,1011CCL17 ・ CCL22 式。 説明したシナリオの複雑さはまだホーミング T 細胞肺の完全な理解を妨げているが、炎症やアレルギー性の肺疾患の可能性があります最適治療制御の分子標的の茄多を提供しています。そのため、緊急の必要性を深めるおよび T 細胞走化性と肺ホーミングの分野で我々 の知識を補完することができる革新的な実験があります。

肺、人体内のリンパ球のホーミングは複数の細胞、体液性および物理的なパラメーター1によって影響を受け、という事実のために、既存の実験手法のほとんどはこの免疫学的プロセスの全体の複雑さをモデル化することがありません。代わりに、ホーミングが選択的に肺の解析の多くの標準的なプロトコルはリンパ球の魅力、接着、移行および保持のカスケードに関連する特定の側面に焦点を当てます。純粋に記述決定周辺機器または肺に浸潤リンパ球のインテグリンとケモカイン受容体の mRNA やタンパク質の発現パターンとそれぞれケモカイン、血中レベルの相補的な測定のほか気管支肺胞洗浄 (BAL) または肺組織12,13,14,15、老舗の in vitro における細胞培養の試金によりリンパ球の接着や走化性の機能解析実験条件16,17,18を定義します。原則として、静的体外付着の試金監視培養リンパ球内皮細胞の単層または組換え内皮細胞接着分子 (例えば、MAdCAM 1、VCAM 1) でコーティングされたガラスの結合容量標準体外走化性アッセイは、transwell システム19のケモカイン勾配に沿って移行するリンパ球の機能を定量化するために通常適用されます。体外の両方の設定は制御調整と実験条件の変調を有効にするが、一方で批判的に体内の走化性とリンパ球の接着に影響する知られている重要な変数がないです。主に、静的な細胞培養の試金は恒久的な血流19によりせん断力の影響を無視し、可能性のある周囲の免疫環境と相互作用する非リンパ球免疫細胞の関与を無視両方の生きている有機体の存在。これらの制限を克服するために静的なインビトロ走化性または付着試験で取得した結果の解釈に必要なさらにフロー条件20,21の下での動的付着実験で検証炎症性器官病理学19の生体モデル。確かに、T 細胞肺の炎症やアレルギー性の条件の下でホーミングの規制に関する結論動物の研究から重要な遺伝子分析変更異なる肺疾患3に定義されたモデルのマウス22,23. 興味の特定の遺伝子が特定の細胞の影響を定義するためよく確立され、広く使用されているツールを表すため欠損マウスと野生型マウスのリンパ球の浸潤肺の定量的比較経路や T 細胞分布の病気の駆動パターン上の受容体。しかし、対照的に培養細胞培養の試金を議論する前に古典的な動物モデルに基づく研究デザインを欠いている分析し、主なヒト T 細胞血液または炎症性肺を患っている患者のバルから直接派生を監視する能力病気。したがって、それはまだ機能的診断によって指定された肺疾患が優遇肺トロピズムと臨床パラメーター可能性がありますこのシナリオに影響を与えるどの程度までの人間のリンパ球をインプリントすることができるかどうかを検証する挑戦的なままです。最近では、非常にエレガントな生体内でのアプローチは、これらの制限のほとんどを克服することができたし、腸管リンパ球ホーミング24 トランスレーショナル研究の新時代が開かれた炎症性腸疾患 (IBD) のコンテキストで導入されました。.強力なイメージング ツールとして断面光シート蛍光顕微鏡に続いて溶媒基づく組織クリアするためのプロトコルを活かし、浸潤に対して転送ヒト T 細胞の分布を視覚化する可能だった24合併免疫不全マウスの腸。特に、この実験の設定は 2 つの主要な技術革新を実装: 実験的定義の生体内での条件の下で (1) 主な人間の免疫細胞を分析できます(2) 病気にかかった器官の幾分大きい区域 (約 1.5 cm × 1.5 cm) の高画質、3 D 再構築が続くイメージを作成することができます。また、いくつかの最近の研究は、正常に肺癌25,26をイメージングのための重要なツールとしてオフ溶剤系組織と光シート蛍光顕微鏡の使用を設立しました。肺の免疫学の分野でこの技術の進歩から利益のために我々 は今肺ホーミングの分析システムを採用しました。

浄化する方法と蛍光ラベル プライマリ ヒト T 細胞の肺炎症を誘導したマウスに転送するためと、また、光シートの後続のプロセスの詳細に説明します、ここで提示されたプロトコルが紹介の手順蛍光顕微鏡イメージング、器官の準備、画像処理など。全体的に、洗練された、生体内での条件の時にリンパ肺ホーミングを監視するためそれにもかかわらず可能、実験的モデルを導入することによって炎症やアレルギー性の肺疾患の分野で将来の橋渡し研究を支援していきます。

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Protocol

エルランゲン (Regierung ・ フォン ・ Unterfranken、ヴュルツブルク、ドイツ) に関連する地方自治体によって承認されたプロトコルに従い動物を含む実験を行った。マウスに特定の病原体フリーの条件の下で収容されました。人間の血のコレクションは、ローカル倫理委員会とエアランゲン ・ ニュルンベルグ大学の倫理委員会によって承認されました。各患者は、書面によるインフォームド コンセントを与えた。

1. マウスのアレルギー性の肺の炎症を誘発します。

注:以前の研究27に記載されている、次の実験マウスのアレルギー性気道炎症を誘発することができます、したがって、BAL で自然免疫と適応免疫細胞の蓄積をトリガーします。記述されていたプロトコルは c57bl/6 j マウスで確立されていますが、他近交系標準に採用は可能なはず。

図 1生体内で実験手順の概要についてを参照してください。

  1. ケタミン ・ キシラジンの腹腔内投与によるマウスを麻酔します。
    注:
    だけ少なくとも 16 g の体重と 6 週間以上古い c57bl/6 j マウスを使用します。
    1. PBS (12 mg/mL ケタミン; 1.6 mg/mL キシラジン) でケタミン ・ キシラジン ソリューションを準備し、マウスの正確な体重を決定します。
    2. ケタミン ・ キシラジン ソリューションの 8 μ L/g の体重で最初のマウスを腹腔内注入し、1.3 のステップに進む前に前足ピンチ反射の不在によって深い麻酔を確認します。
  2. たて 5 mg/mL の PBS のパパインを準備します。ゆっくりと鼻孔にパパイン液の 10 μ L (50 μ g) をピペットします。覚醒までマウスを注意深く監視します。
  3. 手順 1.1 と 1.2 を実験に含まれているすべてのマウス。連続 3 日間 1.1-1.3 の手順に従います。

2. 浄化し、人間の末梢血 CD4 の蛍光ラベル+ T 細胞

注:無菌条件下でプロセスのセルです。

  1. 末梢静脈から 18 ミリリットルの血液を完全に人間を収集します。末梢血単核球 (PBMC) の一部を選択するために Ficoll 後腹勾配遠心を実行します。
    注:主なひと由来の材料の収集と分析はローカル倫理的な当局によって承認される必要があります。末梢静脈から血液を収集するために十分な医療資格を持つ人だけとなっています。
    1. エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) に採血の凝集を避けるために monovettes (1.6 mg/mL の EDTA 血) を含みます。
      オプション:バフィー コート血、血寄付完了の静脈血ではなく、白血球の濃縮の副産物を使用します。
    2. 50 mL の円錐管に血液を移すし、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 1:2 を希釈します。慎重に Ficoll 培地 10 mL を追加 (密度 1.077 g/mL) 希釈血液の下底層として。遠心分離機のサンプル (800 x gブレーキしなくても室温で 15 分間)。
    3. 慎重に遠心分離機からチューブを削除し、新しい 50 mL の円錐管に PBMC を含む中間期を転送します。上と下のレイヤーを破棄します。PBS と遠心分離機 (300 x g 4 ° C で 10 分間) PBMC を含む管を埋めます。上澄みを除去します。
      注:必要に応じて、必要に応じて、残りの赤血球の溶解を行います。慎重に再懸濁細胞ペレットと渦サンプル 3 mL のアンモニウム塩化カリウム (ACP) 換散バッファー (155 mM 塩化アンモニウム; 19 mM カリウム水素炭酸と 0.68 mM EDTA、pH 7.27) を追加します。3 分の管を振る。ACP の換散バッファーを削除するには、40 mL の PBS の遠心分離機 (300 x g 4 ° C で 10 分間) を追加します。上清を捨てます。
  2. CD4 を浄化+ T 細胞の CD4 ビーズを介して。
    注:一般に、人間の CD4 の浄化用磁気ビーズのいくつかの代理店がある+細胞は、細胞の純度の同等のレベルになります。製品の選択は、個人の好みをに基づく必要があります。プロトコル (2.2.2–2.2.7) の次の手順は、定義された CD4 ビーズ製品と材料表のとおりさらにそれぞれ分離カラムに調整されます。プロトコルのいくつかの変更は、代替の CD4 ビーズ製品が選択されている場合必要があります。
    1. 最低 0.5% ウシ胎児血清 (FBS) と 10 に 2 mM EDTA (PBS、FBS EDTA-バッファー) を含む 80 μ L の PBS の PBMC ペレットを再懸濁します7 PBMC。使用約 30 × 106約 3 x 106 6 × 106終わるのための PBMC の開始人口精製ヒト CD4+ T 細胞。
    2. CD4 ビーズ 10 あたりの 20 μ L を追加7 PBMC、穏やかに混合し、4 ° C で 20 分間インキュベートPBS/国債/EDTA-バッファー (4 ° C まで冷却) と遠心力 (300 x g 4 ° C で 10 分間)、管を埋めます。上清を除去します。
    3. 磁気フィールドに分離カラムを配置します。3 mL の PBS/国債/EDTA-バッファーの列をすすいでください。500 μ L の PBS/国債/EDTA-バッファー (4 ° C まで冷却) で細胞ペレットを再懸濁し、磁気フィールド内に配置するリンス分離列に細胞懸濁液を転送します。
    4. 3 回に 3 mL の PBS/国債/EDTA-バッファー (4 ° C まで冷却) 分離カラムを洗浄し、排水を破棄します。
    5. 磁気フィールドから分離カラムを削除し、15 mL チューブに入れます。溶出が CD4+プランジャーを使用して PBS/国債/EDTA-バッファーの 5 mL の細胞画分。
    6. PBS および遠心分離機 (300 x g 4 ° C で 10 分間) で管を埋めます。上清を除去します。この洗浄工程を 2 回繰り返します。
    7. 選択 (例えば、ノイバウアー商工会議所) の標準メソッドによって返されたセルの数を決定します。
  3. CD4 をラベル+ T 細胞蛍光細胞増殖染付。
    1. CD4 を再懸濁します PBS の+ T 細胞 (細胞/ml7 10 まで; 未満 500 μ L の PBS を使用しないでください)。
    2. 赤色光興奮性細胞増殖の 6 μ M 溶液を調製 PBS (部屋の温度で加温) で (材料の表を参照) を染めます。このソリューション 1:2 をミックス、前に作製した細胞懸濁液と渦徹底的に (3 μ M 最終濃度)。
    3. (光から保護) 37 ° C で 10 分間インキュベートします。その後、RPMI 培 10% の 5 巻を追加 FBS (光から保護) 氷の上 5 分間インキュベートし、。
    4. 洗浄標識 RPMI で 3 回細胞媒体含む 10 %fbs (300 x gで 4 ° C で 10 分間遠心)。PBS の標識細胞を再懸濁します、氷の上を格納に使用されるまでを光から保護します。
      注:細胞を長期保管 (> 60 分) 細胞の生存に悪影響を及ぼす可能性があります。
      オプション:CD4 の純度を決定する+フローサイトメトリーによる細胞分画とラベリングのプロシージャの有効性。0.5 x 10 を再懸濁します6 1 x 106 CD4 に+細胞のバッファー (1 %fbs、2 ミリメートルの EDTA PBS で) を 100 μ l 添加し好みの蛍光色素を結合した抗 CD4 抗体を追加。4 ° C で 30 分間インキュベートします。1 mL のバッファーと遠心分離機 (300 x g 4 ° C で 10 分間) を追加します。上清を捨てます。サンプルの流れフローサイト メーターによる測定を続行 (代表的な結果は、図 1B、Cに描かれている)。

3. 本人間の CD4 を転送パパイン公開受信者 Mmice に+ T 細胞

注:図 1生体内での概要は実験の手順を実行して参照してください。パパインの最後の経鼻投与後 1 日セル転送を実行します。

  1. 蛍光に分類された人間 CD4 のサスペンションを調整+ T 細胞 (手順 2.3.4) PBS で 1 × 107細胞/ml の濃度にします。1 mL/30 G に細胞懸濁液を 100 μ l 添加を埋める-注射器。
  2. 慎重に尾静脈注射用拘束デバイスに最初のパパイン公開 c57bl/6 j マウス (手順 1.1-1.3) を配置します。尾静脈を穿刺し、1 × 106ヒト CD4 をラベルを含む細胞懸濁液を 100 μ l 添加をゆっくり注入する準備の注射器 (ステップ 3.1) を使用して+細胞。すぐに引っ張らないで針を注入後、しかし、細胞懸濁液の排出を防ぐためにさらに 5 秒間待ちます。
  3. 拘束デバイスからマウス ボタンを離します、次の動物に進みます。光シート蛍光顕微鏡用のネガティブ コントロールとして機能する蛍光標識細胞の伝達が発生しない、少なくとも 1 つのパパインにさらされた動物を維持します。

4. 光シート蛍光顕微鏡の肺組織を準備します。

注:次の手順は、転送蛍光標識ヒト細胞 (ステップ 3.2) 後 3 h が実行されます。肺組織の採取を含む記載されている実験手順、固定・消去溶剤ベースの組織現在記述されていたプロトコル24,28から適応されました。

  1. 二酸化炭素 (C02) 吸入によるマウスを犠牲に。
  2. 5 mM EDTA を含む PBS でその場での肺を灌流します。
    1. 中心部を公開する胸骨に沿って切断によって胸郭を開きます。点状 21 G カニューレと右心室は、カテーテルに接続されています。
    2. 切断することによって左心室を開いて終了する血と血流の流体を許可します。ゆっくりと 20 ml のカテーテルを介して 5 mM EDTA を含む氷冷 PBS の肺を灌流します。
  3. 肺の場固定を実行するためにカテーテルを右心室から削除しないでください。ゆっくりと 2 ml の冷たい 4% パラホルムアルデヒド (PFA) PBS で解決の肺を灌流します。カテーテル、カニューレを削除します。
    注:肺組織の場固定の PFA ベースは、後続の顕微解析29,30マウス肺組織を準備するために確立された技術を表します。
    注意:PFA は、ケアのフードの下で処理することは有毒であります。
  4. その場で 0.75% の agarose で肺を満たしなさい。
    1. PBS の 0.75% の agarose を準備しておく固体サーモ シェーカーで 50 ° c まで使用。マウスの唾液腺を削除、胸骨舌骨筋をカット、スライドの下に鉗子で気管を公開します。
    2. 30 G 針気管を露出を強調し、agarose の望ましくない漏れに気管のさらなる損傷を防ぐために鈍 30 G カテーテルで置き換えます。挿入したカテーテルと針ホルダーを使用する気管との間の接合部をシールします。
      オプション:ここにバル コレクション詳細31記載として最近バルで浸透したヒトの細胞を分析するための手順が説明されている結合 (図 2Eの代表的な結果を参照してください)。
    3. (体の温度冷却) 0.75% の agarose が付いて、肺の完全な展開までカテーテルを介して気道を慎重に記入します。agarose の凝固が完了まで待機します。カテーテルを外し、4% 暗い 2 mL チューブに肺を慎重に収穫 PFA。
  5. 追加固定孵化 4 %pfa は、連続回転 (31 rpm) 下 4 ° C で 2 時間 PBS の解決でサンプルのため。
  6. 50% エタノール (pH 9)、70% エタノール (pH 9) で 4 ° C でその後連続回転 (31 rpm) の下でサンプルの孵化によって組織を脱水し、100% エタノール;少なくとも 4 時間の各ステップ。最後に、4 h の新鮮な 100% エタノールで 2 番目のインキュベーションを実行します。
  7. 桂皮酸エチル (ECi) を使用して組織の溶剤ベースのクリアを実行します。したがって、ECi にサンプルを転送します。インキュベート組織半透明 (図 1Dの代表的な画像を参照してください) が表示されるまで (一定の回転) の下で室温で一晩。
    注:常温 (光から保護) ECi に格納されているサンプルは数ヶ月に数週間にわたって安定しています。

5. Wwhole マウス肺野光シート蛍光顕微鏡を実行します。

注:光シート蛍光顕微鏡と対応するソフトウェアは、次の手順を実行の基になる詳細については材料の表を参照してください。ただし、他のメーカーで同等のシステムは以下のプロトコルの開発者固有の変更にも使用できます。始める前に、特定の顕微鏡の操作マニュアルに慣れるし、サイトの責任者から技術的な指示に従います。

  1. 光シート顕微鏡を設定します。
    1. 光シート顕微鏡をオンにし、対応するコンピューター上のソフトウェアを画像を開きます。フィルター処理された ECi (100 μ m フィルター) と試料室を埋めるし、レーザー ビーム間の位置にそれを置きます。
    2. サンプル ホルダーに肺を固執するのに有機溶媒に安定な接着剤の小さなドロップを使用します。光シートの必要な溶け込みを可能な限り小さく保つために、直立した肺葉, 肺区域を設定します。次に、その商工会議所のサンプル ホルダーを配置します。
    3. 試薬をクリアとして ECi を使用すると、目的の屈折を 3.5 に設定します。
  2. 全臓器のコンテキストで人間の細胞を検出する光シート顕微鏡で設定を調整します。
    1. 必要なレーザーを選択 (測定用フィルター > 必要なレーザーのチェック ボックスをアクティブにする) 制御ソフトウェアで適切な強度を選択し、(レーザ伝送制御 >レーザー強度を設定するスライダーを使用して >適用)。488 の励起波長を使用して検出される肺組織と 640 nm (525/50 フィルター) nm (680/30 フィルター) 赤いスペクトルの蛍光体発光の付いた人間の細胞を刺激します。
    2. 488 に興奮のサンプルに焦点を当てる nm と 640 の励起波長で「色収差補正」ツールを使って焦点を合わせる nm (色収差補正を設定するスライダーを使用 > 適用).
    3. 適切な倍率を選択します。低倍率の概要を使用して、(例えば、6.3 x) 詳細なローカリゼーションのため肺組織と拡大画像 (例えば、32 x) 内の標識細胞の全体的な分布を決定します。
    4. 全体の器官または興味の特定のセクションを均一に解明のシート幅を選択 (光学 > シート幅を設定するスライダーを使用; 20-40% の間に通常)。鮮明な画像を作成する高い NA とシート開口数 (NA) を定義 (光学 > シート NA を設定するスライダーを使用; マウス肺葉 0.025% の NA を使用多くの場合ことができますその生理学的なサイズに拡張)。
    5. 「高度な計測設定」で使用する光シートの数を選択します。双方向の照明の場合マージゆく照らされたイメージを作成する左と右の光-シート (高度な > lightsheets をマージ > 選択ブレンド モード > スライダーを使用して、両方の光シート間の重複を定義します)。
      注:光 - 3枚各サンプルの双方向照明の活用することをお勧めします。
      オプション:さらに画質が向上、動的なフォーカス操作を使用します。これにより、画像取得時に x 方向にフォーカスを移動します。
    6. 測定およびステップ サイズを 5 μ m に設定する z スタックの開始と終了の位置を定義 (xyz テーブル Z > スキャン範囲)。
      注:Z スタックの開始と終了の位置は試料室内肺葉のサイズや位置に依存します。しかし、約 300 に 800 z スタックは通常単一の肺葉 (5 μ m ステップ サイズ) を取得します。
    7. [自動設定] を使用してファイルを保存し、画像をキャプチャする測定を開始します。仕上げのデータ集録後 ECi 汚染試料ホルダーと流水の下で部屋をきれいに。
      注:同じ設定を使用すると、その後の比較になっている複数の肺葉をイメージします。

6. 後画像処理とひと細胞の肺蓄積の定量化

注:3 D 解析、次の手順が基づいているの後のイメージング ソフトウェアの詳細については材料の表を参照してください。ただし、代替ソフトウェアを撮影後を同様に使用できます。

  1. Z スタックの最初のイメージを読み込む (越えのボタン、ファイル > 開く > 選択イメージ) 選ばれた z スタックとその自動 3次元再構成の他のすべてのイメージの開始を開始するために。
  2. X を正しく表示するには、y と z の寸法は、ボクセル サイズをチェックに応じてそれらを調整して、(編集 > 画像のプロパティ > ボクセル サイズを手動で入力する)。Z のボクセル サイズ、2 つのイメージ (ここで 5 μ m) の間選ばれたステップ サイズを入力します。
  3. 各チャンネルを個別の色で表示 (編集 > ディスプレイの調整を表示)。好みの色を定義する他の後の 1 つ各チャンネルをクリックして (図 2A、B、C、D蛍光信号は灰色に表示され、人間の CD4 をラベル赤細胞の+ )。
  4. 強度、黒レベルと各チャンネルのコントラストを調整 (編集 > ディスプレイの調整を表示) チャンネル バーの三角形を使用してまたはチャネルの設定で正確な数値を入力します。強度の調整、直角三角形を使用します。黒レベル調整、左の三角形を使用し、コントラストの調整、真ん中の三角形を使用します。
    注:肺の使用は携帯転送 (ステップ 3.3) 特定のひと細胞由来の信号と非特異的背景を区別せずコントロール マウスに由来します。
  5. 定量化する肺組織内標識細胞 'の新しいスポットを追加」ツールバーの使用と選択 '自動作成をスキップ, 手動で編集' 手動セルをカウントするため。
    注:
    また、数える 'スポット' 下ツール自動セルを使用します。ただし、特定と不特定の信号をより正確に区別することができます手動カウントします。
    1. 3 D 切削工具を使用して、特定のボリュームで肺キューブを定義の異なるサンプルの間で、人間の細胞の蓄積を比較する (編集 > 作物の 3 D) (ここで 813 μ x 813 μ x 1,000 μ m)。
    2. 640 nm チャンネル蓄積されたセルを選択をカウントし、10 μ m の '半径スケール' を定義します。「編集」をクリックして、ポインター メニューで「選択」をチェックし各セル マウスの左ボタンと shift クリックでドットをマークします。全体的な統計情報に表示されるカウントのセル数を見つけます。
      注:カウントの肺容積の科学者依存性選択の肺葉 (ここ 5) 結果の信頼性を確保し、補償にあたりいくつかのキューブをカウントする勧め (定量化の戦略と代表の結果はで表示されます2 D を図)。
  6. 'スナップショット' ツールを使用してイメージをキャプチャおよび/または 'アニメ' ツールを使用してビデオを取る。保存調整 .ims ファイルとしてファイル (ファイル > エクスポート)。
    注:代表的な目的の表示またはツールバーのフレームをオンまたはフレームを非表示。さらに、画像の表示は最大強度の投射 (MIP) のいずれかとして (ツールバー > ボリューム > モード > MIP をチェック) '表面 'モードを使用または (ツールバー > 新しいサーフェスを追加)。'表面モード' が組織アーキテクチャおよび/または細胞体 (代表的な画像が表示されます図 2C) を強調する各チャンネルで個別にアクティブ化されます。

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Representative Results

提案するプロトコルは、監視と定量化ライト シート蛍光顕微鏡を介して肺に対して転送ヒト T リンパ球の蓄積を可能にするマウスの実験的モデルをについて説明します。図 1A実験スケジュールの生体内での手順の図式的な概観を提供します。信頼性の高い結果を保証するためには相当な重要性、分離および蛍光良い品質を確保するのにラベル付けヒト CD4+ T 細胞は、その後マウスに転送されます。図 1B、C、ビーズを利用した細胞濃縮とその後蛍光ラベル化通常のため上記の説明手順に代表して描かれる流れ細胞の結果決定 CD4+ T 細胞純度 > 95%すべての CD4 の成功した蛍光標識と+ T 細胞。光シート蛍光顕微鏡の質および浸透の深さは批判的に組織の清算の適切な等級によって異なります。図 1Dで示されているようにクリア ECi ベース組織のここ応用プロトコルであった一致する成功の屈折を示す臓器透明性の高いレベルを保証することができます。最後に、図 2B, C, D付録の動画完全に処理されたライト シート蛍光顕微鏡画像の形式で記述されている実験的プロトコルの代表的な全体の結果が示されています。(灰色で表示される) される信号は、肺の解剖学的構造のイメージングのための有用なツールを提供します。赤い信号を表す肺蓄積人間 CD4+ T 細胞。光シート蛍光顕微鏡イメージングの定量化は全体を決定することができます肺の数蓄積人間 CD4+ T 細胞の炎症を起こした肺組織の定義済み領域あたり。人間の細胞浸潤の定量化のための戦略は、図 2Eに示します。(オプション) 流れフローサイトメトリー検出蛍光標識受信者マウスのバル内細胞、図 2Fで示したとして使用できる補足の技術利用の成功組織移行を確認するためにCD4 を転送+ T 細胞。また、転送された T 細胞の設定ここで炎症を起こした肺組織の選択的蓄積実験的設定の説明だったさらにヒト cd4 陽性という事実によってサポートされて+ T 細胞は腸の粘膜で取得できませんでした受信者の動物図 2B (右側のパネル) で描かれています。

Figure 1
図 1: In vivo 実験ワークフローの図式的な概観します。(A) アレルギー肺炎症 c57bl/6 j マウスの連続 3 日間 (d0、d1 および d2) パパイン (50 μ g/マウス) の吸入によって誘導されました。次の日 (d3)、新鮮な分離し、蛍光標識ヒト CD4+ T 細胞に対してに移ったマウス尾静脈注射を介して。別の 3 時間後は、続いて内灌流法と肺の固定、マウスが犠牲になった。最後に、肺は仔されさらに前のヴィヴォ光シート蛍光顕微鏡による分析します。必要に応じて、実行する肺植が正常に管外と移行したひと細胞の生体内解析 ex 拡張される前に、バルを収集できます。(B) 代表的なヒストグラム分離 CD4 の純度を確認する+ T 細胞分画フローサイトメトリーによって決定されます。抗 CD4 抗体またはアイソタイプ コントロールによって染色細胞はそれぞれブラックとグレーで表示されます。(C) 代表的なヒストグラム ヒト CD4 の蛍光標識の有効性を確認する養子の転送前に細胞の+ 。(D) 前に、と ECi とクリア後のマウス肺の灌流葉の代表的なイメージ。当ホテルは、蛍光強度。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: ヒト cd4 陽性の肺蓄積の代表的な解析+細胞 in vivo 肺炎症のコンテキストで。人間 CD4+細胞は密度勾配遠心法は続いて磁気ビーズを用いた精製ステップを用いた末梢血から分離しました。人間 CD4+細胞赤色光興奮性細胞増殖の染料を使用してラベル付け, パパイン公開 c57bl/6 j マウスに静脈内に注入します。3 時間後、収集し、さらに光シート蛍光顕微鏡を介して肺組織を分析するマウスが犠牲になった。(A) 標識ヒト CD4 の静脈内注射後 3 時間、パパインにさらされたマウスの肺組織 (グレー) の 3 D 再構築の代表的な概要+ (赤) ライト シート蛍光で記録された顕微鏡の細胞します。(B) 肺組織の受信者のマウスの概要または高倍率セグメント (左側のパネル) として示されている細胞移植後 3 時間。人間の CD4 を取得+セル可能性があります赤い信号として可視化して肺組織のシングル チャンネル画像として蛍光信号をオーバーレイにも描かれています。検出信号の特異性を確認するために静脈内のセル転送せずコントロール肺組織はネガティブ コントロール (中央のパネル) を務めた。肺組織、ない標識ヒト CD4 と対照をなして+ (右側のパネル) 同じ受信者マウス回腸の細胞 (赤) を検出できます。(C) 投稿画像処理を表すことができますいずれかまたは表面モードの最大強度の投射 (MIP) として全臓器のセグメントの 3次元再構成の世代と同様に、肺組織の単一スライスの解析が可能します。代表的なイメージが描かれています。(D) 定量化方法はすでに説明同じ肺の exemplarily は図 2で描かれています。分析された肺セグメントの定義されているキューブが選ばれたとヒト CD4 数+細胞 (赤) の各キューブの定量化を行った。その後行われた定量化 (イベント/813 μ x 813 μ x 1,000 μ m キューブ) の結果として示されます平均 ± SEM. (E) は、追加オプションとして受信者動物のバルに蛍光に分類された T 細胞の流れフローサイトメトリー検出をすることができます。蓄積されたヒト CD4 の成功組織移行を確認するために実行される+ T 細胞。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Supplementary Video
補足動画: 代表的な動画像表示蓄積人間 CD4 マウス肺組織内で細胞の+三次元表示するマウス肺蓄積人間 CD4+ (赤) コンテキスト内で組織の細胞肺 (グレー) 3 時間尾静脈に静脈内注射後。画像は、初めと終わりの表面モード MIP として表示されます。画像は光シート蛍光顕微鏡を介して取得され、3 D 解析の後のイメージング ソフトウェアによって処理されます。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)

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Discussion

ここで説明されている実験の設定提供古典的な体内の炎症性条件およびそれにより適切補完したプライマリ人間免疫細胞のホーミング肺活量を監視する機会を実行体外密着性と走化性試金。肺のアカウント特定の解剖学的な臓器特性を考慮に、臨床的意義および集録したデータの譲渡 (標的臓器内の走化性、細胞の分布) を含むホーミング免疫細胞の重要な側面を撮りました3 技術的なキー機能の活用: (1); マウス生物内ひと初代細胞の解析(2) の肺炎症; パパインを介する誘導クリアされた肺組織の (3) の光シート蛍光顕微鏡。

受容体リガンドの相互作用マウスと男性の一般的な概念との間に関連する可能性の非互換性のためのいくつかの側面で生マウス体内で免疫細胞機能学に対して人間転送が限定されます。ヒト化マウスモデルのいるトランスレーショナル医学の分野で重要な実験ツールとして正常に中に確立されて、最後の数十年24,32,33,34,35.シナリオでは生体内の免疫細胞を患者由来の直接分析し、特定疾患32、によって捺印機能の変化を識別する利点を提供するヒト化マウス研究古典的な動物モデルと比較して、 36,37。可能性のある不一致との関連性について人間の免疫細胞とマウスそれぞれ ligands の表面の受容器の定義のまたは逆に、元の研究は既に人間を示されて CD4+ T 細胞は効率的に対話することがマウスの接着分子 MAdCAM 1、VCAM 1 インテグリンを介するリンパ球ホーミング32の重要な配位子を表します。したがって、巡って移された人間の免疫細胞のマウスの腸のティッシュへの移行が正常にによってブロックされる生体内で臨床的に使用される α4β7 インテグリン抗体 vedolizumab32治療。ただし、場合でも特定受容体-リガンド-の相互作用の関連性が完全な人間/マウス不一致を表示可能性がありますおそらくあろう遺伝子工学によって、例えば、遺伝子の過剰発現によるこのような制限を克服するために、それぞれの人間のリガンド、成長因子、サイトカインまたはマウス生物33,35内受容体。

ケモカインのローカルの分泌に慢性的な炎症の影響、として内皮接着分子発現とリンパ球の後続の蓄積を多数出版物38,39 に記載されています。 ,40, 肺炎症の適切な実験モデルの選択の表現の重要なステップそれぞれの試験の臨床コンテキスト依存を適応上記プロトコルを記述した、可能性がありますを確立中。パパイン アレルギー肺のここで選択した設定を表しますローカル管理のシステインのプロテアーゼのパパインの気道上皮とトリガーを刺激する能力に基づいているよく説明実験モデル、alarmins27,41,42の後続のリリース。興味深いことに、パパインに偶発的な博覧会はよく43として人間の喘息発症を引き起こすこと知られています。パパイン、自然免疫と適応免疫細胞の蓄積および肺272 型サイトカインのレベルが上昇、露出マウス ショーの吸入量に依存します。適当な投与スケジュールが顕著な肺好酸球増加と一緒に行った増量が判明空域 (COPD の古典的な組織学的現象) と後続の出血と血管壁の破壊の拡大の結果中、したがってヒトの喘息27の重要な組織学的特徴をまねると。私たちの目的は、この実験モデルを使用してホーミング肺の免疫細胞による炎症性のコンテキストを生成するは、私たちを慎重にパパイン、生理的で可能性がありますそれ以外の場合、血管の損傷を避けるために試みた血管内皮障害の整合性のための人間の免疫細胞の漏出。したがって、上記記載されているプロトコルにパパイン マウスの 1 日あたりの 50 μ g の中間の量を選択しました。パパイン誘起の開発気道炎症にも B の不在で発生します、T リンパ球、適応免疫細胞を浸潤肺疾患27,42のコースに大きく影響する知られています。例えば、制御性 T 細胞は、パパイン誘発気道好酸球増加27の強力な調節因子として識別できます。観点では、パパインにさらされたマウスの炎症病態における肺リンパ球の積極的な関与関与上記説明プロトコル可能性があります、さらに、に対しての機能を分析する有効にして正常肺蓄積人間の免疫細胞 (例えば、経由バルで好酸球数の流れフローサイトメトリーによる買収) 肺の病理を調節します。さらに、血管内細胞移植直前に選択した疾患関連人間ケモカインのさらに実行の鼻腔内投与は異なる人間の肺のホーミング過程に関するこれらの液性メディエーターの影響を分析できます。体内で免疫細胞群。同様に、肺のホーミング過程と、その後、炎症性肺の病理の阻害剤の効果を学ぶことができます。

ここで導入実験プロシージャの特定の利点は精密な追跡およびライト シート蛍光顕微鏡のハイエンドの画像品質による人間の免疫細胞を浸潤肺のローカリゼーション。最近の研究は、光シート蛍光顕微鏡技術 IBD トランスレーショナルリサーチのホーミング腸内の免疫細胞の解析のための貴重な実験ツールを表しの主な限界を克服することがすでに実証従来の蛍光顕微鏡と流れ cytometry24,32。従来の顕微鏡観察に基づく分析は通常非常に小さいに制限されて、臓器とフローサイトメトリーの代表ではない可能性がある領域に入れないアカウント組織形成の面、光シート蛍光顕微鏡化学的にクリアされた組織の解像度の主要な損失することがなく高められた浸透深さができ、むしろ大きい器官のセクションの 3 D 再構成可能 (最大 1.5 cm × 1.5 cm)24,28,44。確かに、品質と取得した 3次元再構成の妥当性は批判的に組織クリアランスのパフォーマンスに依存します。ここで説明されている設定で44をクリア ECi ベース組織の最近公開されたプロトコルの若干採用バージョンを含まれています。26,をオフ溶剤ベースの組織の他の確立された戦略と比較して45,46、ECi ベースのプロトコルを組み合わせてクリアして優秀なプロパティの利点、使用の低毒性試薬とそれなりの時間要件44。肺胞毛細血管の下でもまだ限られているような最高級の組織構造を解決する標準的なライト シート蛍光顕微鏡の容量として最適なクリア条件28、何とかことがあります確実に区別することは困難間血管内および既に管外免疫細胞。追加標準蛍光による血管のここで説明されているプロトコルに染色封入おそらく完全にこの制限を克服することができるでしょう。したがって、肺微小循環またはその漏出内の免疫細胞の動作の特定焦点との研究に優先的に考慮される多光子励起に基づく生体肺イメージングのための最近出版された、非常にエレガントなプロトコル顕微鏡47。この実験の設定で胸部ウィンドウが共鳴スキャンすることによって、安定した肺を監視できる麻酔と換気のマウスに移植された高解像の全体映像を許可する 2 光子顕微鏡モジュール、換気と血流の保持の47,48時に呼吸のサイクル。この技術は様々 な研究で正常に適用されている、例えば肺内血小板形成、循環腫瘍細胞49,50の肺の入口を視覚化することができた。ただし、高度な機器装置 (例えば、マウス換気システム) の要件や生きている動物 (胸部ウィンドウと生体顕微鏡の注入) の広範な侵襲的操作の必要以外にも主な制限このライブの肺の顕微鏡システムは、限られた z 軸貫通です。実行される肺表面のイメージングでは、胸膜肺組織47,48の外側 100 μ m の分析のみ使用できます。科学的な文脈に依存して、それは上記の説明したプロトコルに追加の手順として explanted 肺の 2 光子励起顕微鏡を実装する貴重な選択肢をかもしれない。2 光子励起顕微鏡、光シート蛍光顕微鏡その後同じ肺をまず分析分布の定量的概要とマウス肺 (内人間の免疫細胞の局在を取得する戦略を表す場合があります。光シート蛍光顕微鏡) と、同時に細胞や血管のプロセス (2 光子励起顕微鏡) により詳細な洞察を得る。確かに、マウスの気管植の 2 光子励起顕微鏡実験的肺炎症51,52のコンテキストで免疫細胞の挙動を分析するための確立されたイメージング ツールを表します。小さな肺毛細血管を可視化、代わりに私たちの実験モデルで移されたヒト T 細胞の成功の血管外漏出と肺組織の浸透はまた受信者のバル内の蛍光に分類されたひと細胞を検出することにより証明します。図 2Eに、exemplarily 示されているフローサイトメトリーによる動物。一般に、バルの細胞内コンパートメントの解析は、炎症性呼吸器疾患31のコンテキストで肺の免疫細胞流入を特徴付けるため確立されたメソッドを表します。最後に、肺組織内転送に対して免疫細胞の血管外漏出を定量化するための別の流れフローサイトメトリーによる戦略撮影 et al. (2005)53によって記述されていた、ここで説明されているプロトコルを組み合わせることができる可能性があります。撮影らによる研究では、肺の切除は、排他的な完全なラベリングの前に、直前の蛍光標識抗 CD8 抗体の静脈内注射転送 CD8+ T 細胞の肺内既に管外 CD8 中の血管コンパートメント無染色のまま肺間質内+ T 細胞します。体内標識肺の免疫細胞のそれに続く分析は肺組織53前のヴィヴォ消化後実行される細胞.もちろん、組織消化のプロセス内および血管外肺を解剖学的に区別を廃止し、したがって、偽陽性抗体の漏れが原因の間質性の免疫細胞の分類の一般的な危険性があることを意味します。間両方のコンパートメント。このリスクのみを最小化できる無標号の抗体53の量が飽和状態の存在下で組織の消化を行いまたは潜在的に、フローサイトメトリーによる解析を置き換えることによって可能になる光シート蛍光顕微鏡による完全にティッシュの構造の破壊を回避します。

要約すると、ここは蛍光に分類された主な免疫細胞の生体内でのホーミングの組み合わせを導入され、後続のライト シート蛍光顕微鏡は確実に特定、定量化および肺蓄積ひと免疫細胞をローカライズすることができる、実験的マウス肺炎症のモデル。

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Disclosures

M. f. ノイラートはペンタックス、ジュリアーニ、MSD、Abbvie、ヤンセン、武田、ベーリンガーの顧問として役立った。残りの著者は、任意の競合を開示しません。

Acknowledgments

著者は、DFG 共同研究センター SFB 1181 TRR 241 で感謝します。光学イメージング センター エルランゲン (入居) と特定のラルフ パルミサーノ ・ フィリップ ・ Tripal ・ ティナ Fraaß (DFG CRC 1181 のプロジェクト Z2) 光シート蛍光顕微鏡イメージングのエキスパート技術サポートのために認めています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose NEEO Ultra Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody BioLegend, San Diego, USA 304060
Ammonium chloride Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany K2981
Cannula 21 G Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 301300
Cell proliferation dye eflour670 eBioscience Inc., San Diego, USA 65-0840-85
CD4 MicroBeads, human Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 21066001
Ethly cinnamate (ECi) Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany 112372-100G
Ethanol ≥ 99.5% (EtOH) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany P40-47500
Filter 100 µm  VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany 732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 Bitplane AG, Zurich, Switzerland n.a.
ImspectorPro software Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany n.a.
Ketamin  Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany 3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany n.a.
MACS MultiStand Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-303
Multifly cannula 20 G Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 851638035
30 G needle B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9161502
Neubauer counting chamber neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany C-1003
Pattex Glue Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany PSK1C
LS column Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL) anprotec AC-AF-0018
Papain Merck 1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) Biochrom GmbH, Berlin, Germany L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 BioLegend, San Diego, USA 317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl BioLegend, San Diego, USA 400337
PFA (paraformaldehyde) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 0335.1
Potassium hydrogen carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany P7481
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 86.1254.001 
Syringe 1 mL B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9166017V
Syringe 5 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260067
Syringe 20 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260069
Tube 1.5 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,706,400
Tube 2 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72.695.400 
Tube 2 mL, brown Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,695,001
Tube 15 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.554.502 
Tube 50 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.547.254 
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-090-976
Xylazin (Rompun 2%) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany KPOBD32

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14, (21), 2250-2256 (2007).
  3. Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210, (9), 1855-1869 (2013).
  4. Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179, (3), 1901-1912 (2007).
  5. Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254, (6), 564-571 (2003).
  6. Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190, (9), 4500-4507 (2013).
  7. Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79, (2), 149-153 (2001).
  8. Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112, (2), 108-115 (2014).
  9. Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42, (1), 38-48 (2012).
  10. Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182, (1), 623-635 (2009).
  11. Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70, (11), 1440-1449 (2015).
  12. Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171, (3), 767-776 (2007).
  13. Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35, (1), 26-33 (2005).
  14. Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69, (3), 268-274 (2009).
  15. Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166, (4), 2842-2848 (2001).
  16. Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9, (12), 114604 (2014).
  17. Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158, (5), 1703-1711 (2001).
  18. Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57, (12), 1054-1059 (2002).
  19. Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14, (9), 641-666 (2005).
  20. Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294, (5), 1257-1267 (2008).
  21. Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23, (3), 379-391 (2017).
  22. Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186, (1), 174-182 (2011).
  23. Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8, (4), 373-378 (2002).
  24. Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153, (4), 898-900 (2017).
  25. Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. (2018).
  26. Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382 (2014).
  27. Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43, (1), 175-186 (2015).
  28. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450 (2017).
  29. Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38 (2013).
  30. Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72, (6), 314-315 (2005).
  31. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398 (2017).
  32. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65, (10), 1642-1664 (2016).
  33. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, (2), 118-130 (2007).
  34. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25, (4), 428-435 (2013).
  35. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. (2018).
  36. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8, (1), 707 (2017).
  37. Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2), (2017).
  38. Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95, (10), 3032-3043 (2000).
  39. Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14, (12), 1715-1735 (2008).
  40. Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23, (4), 617-627 (2017).
  41. Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36, (3), 451-463 (2012).
  42. Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190, (9), 4489-4499 (2013).
  43. Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32, (4), 302-307 (1975).
  44. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28, (2), 452-459 (2017).
  45. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  46. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, (2), 246-257 (2015).
  47. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8, (1), 91-96 (2011).
  48. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
  49. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544, (7648), 105-109 (2017).
  50. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531, (7595), 513-517 (2016).
  51. Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15, (4), 410-416 (2009).
  52. Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10, (3), 0118513 (2015).
  53. Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115, (12), 3473-3483 (2005).

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