Author Produced

अध्ययन मानव P53 करने के लिए कार्यात्मक परख के विकास के लिए एक चेसिस के रूप में खमीर

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

यहाँ प्रस्तुत चार प्रोटोकॉल का निर्माण और खमीर Saccharomyces cerevisiae रिपोर्टर उपभेदों मानव P53 transactivation क्षमता का अध्ययन करने के लिए शोषण कर रहे हैं, इसके विभिन्न कैंसर से जुड़े उत्परिवर्तनों के प्रभावों, सह expressed बातचीत प्रोटीन, और विशिष्ट छोटे अणुओं के प्रभाव.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

यह निष्कर्ष कि प्रसिद्ध स्तनधारी P53 प्रोटीन खमीर एस सेरेविएसिया में एक प्रतिलेखन कारक (टीएफ) के रूप में कार्य कर सकता है, विभिन्न कार्यात्मक परख के विकास के लिए अनुमति दी गई है 1) बाइंडिंग साइट [यानी, प्रतिक्रिया तत्व (आरई)] P53 transactivation विशिष्टता या 2) TP53 उत्परिवर्तनों पर अनुक्रम वेरिएंट, सह expressed cofactors, या P53 रूपांतरण गतिविधि पर छोटे अणुओं. विभिन्न बुनियादी और अनुवाद अनुसंधान अनुप्रयोगों को विकसित किया गया है. प्रायोगिक रूप से, ये दृष्टिकोण खमीर मॉडल के दो प्रमुख लाभ का फायदा उठाते हैं। एक तरफ, जीनोम संपादन की आसानी isogenic उपभेदों है कि केवल एक विशिष्ट P53-RE के स्तर पर अलग P53-निर्भर की अनुक्रम-विशिष्टता की जांच करने के लिए शोषण द्वारा गुणात्मक या मात्रात्मक रिपोर्टर सिस्टम के त्वरित निर्माण सक्षम बनाता है रूपांतरण. दूसरी ओर, अस्थानिक P53 अभिव्यक्ति के लिए विनियमित प्रणालियों की उपलब्धता प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक विस्तृत श्रृंखला में transactivation के मूल्यांकन की अनुमति देता है. इस रिपोर्ट में समीक्षा की बड़े पैमाने पर सिस्टम है कि रंग रिपोर्टर जीन, luciferase पर आधारित हैं, और खमीर के विकास के लिए उनके मुख्य methodological कदम वर्णन और गंभीर रूप से उनके भविष्य कहनेवाला शक्ति का आकलन कर रहे हैं. इसके अलावा, इन दृष्टिकोणों की चरम बहुमुखी प्रतिभा आसानी से P63 और P73, जो TP53 जीन परिवार के अन्य सदस्य हैं सहित विभिन्न TFs का अध्ययन करने के लिए शोषण किया जा सकता है.

Introduction

ट्रांसक्रिप्शन एक अत्यंत जटिल प्रक्रिया है जिसमें विशिष्ट उत्तेजनाओं 1 के प्रत्युत्तर में क्रोमैटिन क्षेत्रों पर आरएनए पॉलिमरेज की भर्ती और मॉडुलन के लिए प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) के गतिशील, स्थानिक और अस्थायी संगठन शामिल हैं। . मानव P53 ट्यूमर suppressor सहित अधिकांश TFs, डीएनए दृश्यों के रूप में विशिष्ट cis अभिनय तत्वों को पहचान प्रतिक्रिया तत्वों (आरईएस) कहा जाता है, जो एकल (या एकाधिक) अद्वितीय रूपांकनों से मिलकर बनता है -6-10 nucleotides लंबे समय. इन रूपांकनों के भीतर, व्यक्तिगत पदों परिवर्तनशीलता2के विभिन्न डिग्री दिखा सकते हैं, आमतौर पर स्थिति वजन matrices (PWM) या लोगो3,4द्वारा संक्षेप.

खमीर एस cerevisiae पूरक परख के माध्यम से मानव प्रोटीन के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली है, अस्थानिक अभिव्यक्ति, और कार्यात्मक परख, यहां तक कि जब एक orthologous खमीर जीन मौजूद नहीं है5, 6 , 7. प्रतिलेखन प्रणाली8के बेसल घटकों के विकास के संरक्षण के कारण , कई मानव TFs (जब खमीर कोशिकाओं में अस्थानिक रूप से व्यक्त) प्रमोटरों के माध्यम से अभिनय द्वारा एक पत्रकार जीन की अभिव्यक्ति को व्यवस्थित कर सकते हैं उपयुक्त रीस होते हैं. मानव P53 के लिए यहाँ प्रस्तुत प्रतिलेखन मॉडल प्रणाली तीन प्रमुख चर जिसका प्रभाव संग्राहक किया जा सकता द्वारा विशेषता है: 1) अभिव्यक्ति और P53 के प्रकार की आधुनिकता, 2) पुन: अनुक्रम P53-निर्भर प्रतिलेखन को नियंत्रित करने, और 3) के प्रकार रिपोर्टर जीन (चित्र 1A)

P53 अभिव्यक्ति की मोडलिटी के बारे में, एस सेरेविएसिया ईनड्यूज , दमनकारी, या संरचक प्रमोटरों9,10,11के चुनाव की अनुमति देता है . विशेष रूप से, inducible GAL1 प्रमोटर बेसल की अनुमति देता है (एक कार्बन स्रोत के रूप में रैफिनोस का उपयोग कर) या चर (मीडिया में गैलिक्टोज की मात्रा को बदलने के द्वारा) खमीर में एक TF की अभिव्यक्ति. वास्तव में , पतले टूनाबल अभिव्यक्ति न केवल P53 का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण विकास का प्रतिनिधित्व करता है , बल्कि अन्य P53 परिवार प्रोटीन12,13.

P53-निर्भर अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए रीज़ के प्रकार के बारे में, एस cerevisiae एक अन्यथा isogenic पृष्ठभूमि में ब्याज की आरई में अद्वितीय मतभेद रखने वाले विभिन्न रिपोर्टर उपभेदों के निर्माण की अनुमति देता है। यह लक्ष्य एस सेरेविसियामें विकसित एक विशेष रूप से बहुमुखी जीनोम संपादन दृष्टिकोण के अनुकूलन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है , जिसे डेलिटो परफेटो12,14,15,16कहा जाता है .

इसके अलावा, विभिन्न रिपोर्टर जीन (यानी, URA3, HIS3, और ADE2) का उपयोग एस सेरेविसियामें मानव TFs की गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से प्रतिलिपिकारी गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है, जो विशिष्ट विशेषताओं के साथ प्रत्येक कर सकते हैं प्रायोगिक आवश्यकताओं के अनुरूप होना17,18,19,20,21. इन रिपोर्टर जीनों की अभिव्यक्ति क्रमशः यूरासिल, हिटिडीन और ऐडेनीन प्रोटोट्रोफी प्रदान करती है। URA3 रिपोर्टर 5-FOA की उपस्थिति में कोशिकाओं के विकास की अनुमति नहीं है के रूप में अच्छी तरह से, और इस प्रकार यह counterselected जा सकता है. ADE2 रिपोर्टर प्रणाली लाभ है कि, पोषण चयन के अलावा, यह खमीर कोशिकाओं है कि जंगली प्रकार व्यक्त की पहचान की अनुमति देता है (यानी, ADE2 अभिव्यक्ति पर कार्यात्मक) या उत्परिवर्ती (यानी,ADE2 पर कार्यात्मक नहीं ) कॉलोनी रंग से P53.

उदाहरण के लिए, ADE2 जीन व्यक्त खमीर कोशिकाओं adenine की मात्रा सीमित युक्त प्लेटों पर सामान्य रूप से आकार सफेद कालोनियों उत्पन्न (2.5-5.0 mg/L), जबकि उन है कि खराब या प्रतिलेखन नहीं है यह छोटे लाल के रूप में एक ही थाली पर दिखाई देते हैं (या गुलाबी) कालोनियों. यह एडेनिन बायोसिंथेटिक मार्ग (यानी, पी-रिबोसिलेमिनो-इमिडाज़ोल, जिसे पहले एमिनो-इमिडाज़ोल राइबोटाइड या एआईआर कहा जाता है) में मध्यवर्ती के संचय के कारण होता है, जो लाल वर्णक के रूप में परिवर्तित हो जाता है। गुणात्मक रंग आधारित ADE2 रिपोर्टर जीन के बाद से मात्रात्मक जुगनू Photinus pyralis (LUC1)12,22के साथ बदल दिया गया है . हाल ही में, ADE2 रिपोर्टर एक आसान करने के लिए स्कोर, अर्द्ध मात्रात्मक, डबल रिपोर्टर परख है कि कार्यक्षमता के अपने अवशिष्ट स्तर के अनुसार उप वर्गीकृत P53 म्यूटेंट के लिए शोषण किया जा सकता है में लाख रिपोर्टर के साथ संयुक्त किया गया है 23.

ऐसे EGFP के रूप में फ्लोरोसेंट पत्रकारों (बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) या DsRed (डिस्कोसोमा सपा लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन) भी सभी संभव missense उत्परिवर्तनों के साथ जुड़े ट्रांसएक्टिवेशन गतिविधि के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया है TP53 कोडिंग अनुक्रम24| अंत में, RE और/या रिपोर्टर जीन के लिए भिन्न isogenic खमीर उपभेदों के साथ P53 allele अभिव्यक्ति के लिए टूनाबल प्रमोटरों के संयोजन का मौका एक डेटा मैट्रिक्स है कि कैंसर से जुड़े और germline के एक परिष्कृत वर्गीकरण उत्पन्न के विकास के लिए नेतृत्व किया है उत्परिवर्ती P53 alleles25,26,27.

ऊपर वर्णित दृष्टिकोण P53 प्रोटीन की प्रतिलेखन गतिविधि को मापने के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, खमीर एस cerevisiae28 और Schizosaccharomyces pombe29 में जंगली प्रकार P53 की अभिव्यक्ति विकास मंदता पैदा कर सकता है, जो सेल चक्र गिरफ्तारी के साथ संबद्ध किया गया है28,30 या सेल मौत31| दोनों ही मामलों में, खमीर विकास निषेध उच्च P53 अभिव्यक्ति से शुरू होता है और अंतर्जात खमीर सेल विकास में शामिल जीन की संभावित प्रतिलेखनीय मॉडुलन के साथ सहसंबद्ध किया गया है. इस परिकल्पना का समर्थन करते हुए, हानि के समारोह उत्परिवर्ती P53 R273H खमीर सेल विकास के साथ हस्तक्षेप नहीं किया जब जंगली प्रकार P5332के रूप में इसी तरह के स्तर पर व्यक्त किया. इसके विपरीत, विषाक्त उत्परिवर्ती P53 V122A के खमीर में अभिव्यक्ति (जंगली प्रकार P53 की तुलना में उच्च प्रतिलेखनात्मक गतिविधि के लिए जाना जाता है) जंगली प्रकार P5332की तुलना में एक मजबूत विकास निरोधात्मक प्रभाव का कारण बना.

इसके अतिरिक्त, यह दिखा दिया गया था कि मानव DD2 खमीर में मानव P53 प्रतिलेखन गतिविधि को बाधित करने में सक्षम था, इसकी सर्वव्यापकता और बाद में गिरावट33को बढ़ावा देने . तदनुसार, मानव एमडीएम 2 और MDMX की क्षमता P53 प्रेरित खमीर विकास निषेध को बाधित करने के लिए32,34का प्रदर्शन किया गया था. एक अतिरिक्त अध्ययन में, P53 ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि और actin अभिव्यक्ति के स्तर के बीच एक संबंध स्थापित किया गया था, खमीर32में ACT1 जीन पर एक putative P53 RE अपस्ट्रीम की पहचान के साथ. लगातार, actin अभिव्यक्ति जंगली प्रकार P53 द्वारा बढ़ाया गया था और भी अधिक तो P53 V122A द्वारा, लेकिन उत्परिवर्ती P53 R273H द्वारा नहीं. इसके विपरीत, P53 द्वारा actin अभिव्यक्ति P53 inhibitors DD2, MDMX, या pifithrin-जेड (P53 ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के एक छोटे अणु अवरोध करनेवाला) के सह-उपस्थिति में कमी आई, खमीर वृद्धि परख के आधार पर परिणामों के अनुरूप. महत्वपूर्ण बात यह है कि इन परिणामों ने P53-प्रेरित विकास अवरोध और खमीर में अपनी गतिविधि की डिग्री के बीच एक सहसंबंध की स्थापना की, जिसे छोटे अणुओं की पहचान करने और अध्ययन करने के लिए भी शोषण किया गया है P53 फ़ंक्शन28,34 , 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ADE2 या LUC1 रिपोर्टर खमीर एक विशिष्ट आरई (yAFM-RE या yLFM-RE) युक्त उपभेदों का निर्माण

  1. स्ट्रीक एक yAFM-ICORE या yLFM-ICORE तनाव12,14 (ICORE ] I, ISce-I endonuclease के तहत GAL1 प्रमोटर; सीओ ] काउंटर चयन URA3; रे ] रिपोर्टर KanMX4 प्रदान kanamycin प्रतिरोध; तालिका 1) एक 15% ग्लिसरोल स्टॉक से एक YPDA agar प्लेट पर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत (तालिका 2) . इसे 30 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिनों तक बढ़ने दें।
  2. ताजा थाली से एक खमीर कॉलोनी ले लो (कोई अधिक से अधिक 3 सप्ताह पुराने) और यह YPDA के 5 एमएल युक्त एक छोटे से फ्लास्क में जगह (तालिका2). 30 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट, 150-200 आरपीएम पर मिलाते हुए।
  3. अगले दिन, डेक्सट्रोज के सभी निशान ों को हटाने के लिए, 3,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को गोली गोली और ट्यूब के व्युत्क्रम द्वारा supernatant त्यागें.
    नोट: कमरे के तापमान (RT) पर इस प्रोटोकॉल में सभी centrifugations निष्पादित करें।
  4. पूर्व-गर्म मुख्यमंत्री (पूर्ण मीडिया) के 30-50 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें जिसमें गैलैक्टोज (तालिका 2) और 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए इनक्यूबेट, 150-200 आरपीएम पर मिलाते हुए (आई-एस-सीआई को शामिल करने के लिए आवश्यक)।
  5. 3,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और ट्यूब के व्युत्क्रम द्वारा सुपरनेट को त्याग दें।
  6. बाँझ पानी के 30-50 एमएल में सेल गोली को पुन: निलंबित करें। चरण 1.5 दोहराएँ.
  7. बाँझ पानी के 10 एमएल में सेल गोली को पुन: निलंबित करें। चरण 1.5 दोहराएँ.
  8. कोशिका गोली को 5 एमएल में बाँझ LiAcTE (तालिका 3) में पुन: स्फूर्ति दें , एक आयनिक समाधान जो डीएनए तेज करने के पक्ष में है। चरण 1.5 दोहराएँ.
  9. बाँझ LiAcTE के 250 डिग्री एल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और कोशिकाओं को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। चरण 1.5 दोहराएँ और बाँझ LiAcTE के 300-500 0 $L में सेल गोली resuspend.
  10. washes के दौरान, 100 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सामन शुक्राणु डीएनए वाहक के एक 10 mg/mL समाधान विकृत और बर्फ पर तुरंत ठंडा यह एकल-stranded डीएनए के रूप में बनाए रखने के लिए।
  11. एक अलग 1.5 एमएल ट्यूब में, वांछित ओलिगोन्यूक्लिओटाइड (तालिका3) के 500 पिकोमोल जोड़ें , उबले हुए सामन शुक्राणु वाहक डीएनए के 5 डिग्री एल, बाँझ LIAcTE PEG के 300 $L (तालिका 3), और खमीर सेल निलंबन के 50 डिग्री एल (चरण 1.9 से)।
  12. भंवर 10 s के लिए ट्यूब मिश्रण और 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट, 150-200 आरपीएम पर मिलाते हुए। मिलाते हुए पक्ष के लिए पक्ष पर 1.5 एमएल ट्यूब रखें.
  13. ताप ताप खंड में 42 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए खमीर कोशिकाओं को झटका, फिर 10,000 x gपर 20 s के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रण. सुपरनेंट निकालें और बाँझ पानी के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
  14. YPDA agar प्लेट पर सेल निलंबन के 100 डिग्री सेल्सियस बिखरा हुआ है और इनक्यूबेट (ऊपर नीचे) 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 दिन के लिए। अच्छी तरह से अलग कालोनियों प्राप्त कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए, यह भी एक 1:10 कमजोर पड़ने के 100 $L फैल गया.
  15. अगले दिन, प्रतिकृति प्लेट डेक्सट्रोज और 5-FOA ( तालिका2)युक्त सीएम आगर प्लेट पर बाँझ मखमल का उपयोग कर। यदि कई कोशिकाओं को स्थानांतरित कर रहे हैं एक नई प्लेट पर एक दूसरी प्रतिकृति प्लेट पर विचार करें (यानी, URA3 कोशिकाओं के कुछ विकास).
  16. तीन दिन बाद, गैर चयनात्मक YPDA और YPDA युक्त G418 पर प्रतिकृति प्लेट (एक aminoglycoside एंटीबायोटिक kanamycin के समान) agar प्लेटें (तालिका2), प्रत्येक प्लेट अंकन उनके बाद की तुलना की सुविधा के लिए. प्लेटों को रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  17. अगले दिन, G418 संवेदनशील हैं, लेकिन YPDA प्लेटों पर बढ़ने (जैसे, yLFM- या yAFM-RE कालोनियों) कि कालोनियों से उम्मीदवार रिपोर्टर उपभेदों की पहचान. एकल कॉलोनी अलग प्राप्त करने के लिए एक नई YPDA प्लेट पर पहचान की कालोनियों (3-6 कालोनियों) को स्ट्रीक करें और उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए बढ़ने दें।
  18. आगे विश्लेषण के लिए कालोनियों को अलग करने के लिए एक YPDA प्लेट पर एकल खमीर कालोनियों पैच। 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के बाद, उन्हें एक YPGA agar प्लेट पर प्रतिकृति चढ़ाना द्वारा परीक्षण (तालिका 2) कि खूबसूरत म्यूटेंट (यानी, श्वसन की कमी म्यूटेंट) के विकास को रोकने के. एक ही समय में, एक नया YPDA agar प्लेट पर प्रतिकृति प्लेट.
  19. कॉलोनी पीसीआर द्वारा सही ओलिगोन्यूक्लिओटाइड एकीकरण की उपस्थिति के लिए चरण 1.18 से सही पैच (यानी, YPDA और YPGA agar प्लेटों पर वृद्धि; 1-3 कालोनियों) का परीक्षण करें। 10x पीसीआर बफर (1.5 एमएम एमजीसीएल2) के 5 डिग्री एल को जोड़कर प्रतिक्रिया मिश्रण कोइकट्ठा करें , 10 पिकोमोल्स के 2 डिग्री एल / प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में जांच की और aliquot 50 डिग्री सेल्सियस की जरूरत है कि खमीर कालोनियों की संख्या के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण गुणा। एक पिपेट का उपयोग करना, एक एकल पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण में YPDA agar प्लेट से खमीर कोशिकाओं की एक बहुत छोटी राशि जोड़ें.
  20. निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन: 94 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के लिए विकृतीकरण के 35 चक्र के बाद 94 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए, प्राइमर 55 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए annealing, और विस्तार के लिए 2 मिनट पर 72 डिग्री सेल्सियस.
  21. प्रतिक्रिया के पूरा होने के बाद, सही आकार ($500 बीपी) की जांच करने के लिए एक agarose जेल पर पीसीआर प्रतिक्रिया (लगभग एक दसवें मात्रा) के एक aliquot लोड।
  22. चरण 1.19 का एक ही प्राइमर का उपयोग कर वांछित आरई अनुक्रम के एकीकरण की पुष्टि करने के लिए एक वाणिज्यिक किट के साथ शुद्धि के बाद पीसीआर उत्पाद अनुक्रम।
  23. सही अनुक्रम के सत्यापन के बाद, yAFM-RE या yLFM-RE तनाव संस्कृति (YPDA में) का 15% ग्लिसरोल स्टॉक करें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. गुणात्मक रंग आधारित ADE2 खमीर परख का उपयोग कर P53 प्रोटीन ट्रांसएक्टिवेशन क्षमता का मूल्यांकन

  1. दोहराएँ चरण 1.1 और 1.2 yAFM-RE तनाव का उपयोग कर (तालिका 1).
  2. दिन के बाद, सेल संस्कृति को पतला (1:10) पूर्व-गर्म YPDA के 30-50 एमएल में और OD600nm तक मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए जारी रखने के लिए 0.8-1.0 ($2 एच) तक पहुँचता है।
  3. 1.5-1.10 चरणों को दोहराएँ.
  4. एक अलग 1.5 एमएल ट्यूब में, खमीर P53 (या नियंत्रण) अभिव्यक्ति वेक्टरके 300-500 एनजी जोड़ें (तालिका 4), उबला हुआ सामन शुक्राणु डीएनए वाहक के 5 डिग्री एल, बाँझ LiAcTE खूंटी के 300 डिग्री एल, और खमीर सेल निलंबन के 50 डिग्री एल।
  5. 1ण्12 तथा 1ण्13 के चरणों को दोहराएँ परंतु कोशिका गोली को 300 दL रीयल जल में पुन: स्फूर्ति दें।
  6. सिंथेटिक चयनात्मक (P53 अभिव्यक्ति या नियंत्रण वेक्टर के लिए) प्लेटों पर सेल निलंबन के 100डिग्री सेल्सियस फैलाएका है जिसमें कार्बन स्रोत के रूप में डेक्सट्रोज युक्त प्लेटें और एडेनीन की उच्च मात्रा (तालिका 2), फिर 2-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट (ऊपर)।
  7. एक नई चयनात्मक प्लेट पर एकल खमीर रूपांतरक कालोनियों (2-6 धारियाँ प्रति प्लेट) को खींचें और उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने दें।
  8. दिन के बाद, नए चयनात्मक प्लेटों पर बाँझ मखमल प्रतिकृति प्लेट का उपयोग कर कि रंग phenotype के आकलन के लिए अनुमति देते हैं (यानी, कार्बन स्रोत के रूप में डेक्सट्रोज युक्त प्लेटें लेकिन adenine की मात्रा को सीमित; तालिका 2) प्लेटों को 3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक रूप से, P53 प्रोटीन के तापमान संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, 3 दिनों के लिए तीन अलग-अलग तापमान पर इनक्यूबेट करें: 24 डिग्री सेल्सियस, 30 डिग्री सेल्सियस, और 37 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: एक ही लकीर प्रतिकृति एकाधिक बार चढ़ाया जा सकता है।
  9. P53 प्रोटीन ट्रांसएक्टिवेशन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, खमीर कालोनियों के रंग आधारित phenotype की जाँच करें और P53 जंगली प्रकार और खाली वेक्टर phenotypes के संबंध में P53 प्रोटीन phenotype की तुलना करें.

3. मात्रात्मक संदीप्ति आधारित LUC1 खमीर परख का उपयोग कर P53 प्रोटीन रूपांतरण क्षमता का मूल्यांकन

  1. प्रोटोकॉल 2 में वर्णित LiAc आधारित विधि का उपयोग करके P53 (या नियंत्रण) व्यंजक सदिशों (तालिका 4) के साथ खमीर कक्षों को रूपांतरित करें. yLFM-RE तनाव का प्रयोग करें (तालिका 1) .
  2. कार्बन स्रोत के रूप में ग्लूकोज युक्त एडेनिन की उच्च मात्रा के साथ एक नई चयनात्मक प्लेट पर एकल ट्रांसफॉर्मेंट पैच करें और उन्हें रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दें। प्रत्येक परिवर्तन प्रकार के लिए, 5-7 अलग पैच बनाते हैं.
  3. रात भर के विकास के बाद, सिंथेटिक चयनात्मक माध्यम में प्लेट से एक बाँझ टूथपिक या पिपेट टिप का उपयोग करके खमीर कोशिकाओं की एक छोटी राशि को फिर से चालू करें जिसमें कार्बन स्रोत के रूप में डेक्सट्रोज या रैफिनोस युक्त (200 डिग्री सेल्सियस अंतिम मात्रा एक पारदर्शी 96 अच्छी प्लेट में, एक दौर के साथ या फ्लैट नीचे). यदि प्रयोग को प्रेरण के स्तर (तालिका2) को मॉड्युलेट करने के लिए रैफिनोस माध्यम में गैलैक्टोस की आवश्यकता है।
    नोट: इन सेल निलंबन के बारे में 0.4 की एक OD600nm और कोई 1 से अधिक होना चाहिए.
  4. एक multilabel प्लेट रीडर का उपयोग कर inducible P53 अभिव्यक्ति (4-8 एच 150-200 आरपीएम मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर) के बाद OD600nm में प्रत्येक अच्छी तरह से अवशोषण को मापने। सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रण से सजातीय हैं।
  5. पारदर्शी 96 अच्छी तरह से प्लेट से सेल निलंबन के 10-20 डिग्री सेल्सियस को एक सफेद 384 (या 96) अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें और lysis बफर के बराबर मात्रा (10-20 $L) के साथ मिलाएं। ल्यूसिफेरेस सब्सट्रेट के लिए सेल के permebilization प्राप्त करने के लिए एक शेकर (150-200 आरपीएम) पर आरटी में 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  6. जुगनू luciferase सब्सट्रेट के 10-20 $L जोड़ें और एक बहु लेबल प्लेट रीडर द्वारा प्रकाश इकाइयों (LU) को मापने।
  7. P53 प्रोटीन ट्रांसएक्टिवेशन क्षमता का निर्धारण करने के लिए, संबंधित OD600nm (संबंधित प्रकाश इकाई, RLU) के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से एलयू सामान्यीकृत। खमीर रूपांतरक कालोनियों के 3-4 पैच से औसत RLU और मानक विचलन की गणना करें।
  8. P53 जंगली प्रकार और खाली वेक्टर के संबंध में P53 प्रोटीन ट्रांसएक्टिवेशन डेटा की तुलना करें, या तो खाली वेक्टर के साथ प्राप्त मूल्यों को घटाकर या खाली वेक्टर (यानी, प्रेरण की कंप्यूटिंग गुना) के साथ प्राप्त मूल्यों से विभाजित करके।
    नोट: P53 ट्रांसएक्टिवेशन गतिविधि भी P53-इंटरैक्टिंग प्रोटीन (यानी, MDM2 और MDMX) और /

4. खमीर phenotypic परख का उपयोग कर P53 प्रोटीन विकास अवरोध का मूल्यांकन

  1. P53/MDM2/MDMX (या नियंत्रण) अभिव्यक्ति सदिशों के साथ खमीर कोशिकाओं को ट्रांसफ़ॉर्म करें (तालिका 4) खंड 2 में वर्णित LiAc-आधारित विधि का उपयोग कर। सीजी 379 विकृति का प्रयोग करें (सारणी 1) और न्यूनतम चयनात्मक प्लेटों (सारणी 2) पर खमीर रूपांतरकों का प्रसार करें ।
  2. रूपांतरित कोशिकाओं को न्यूनतम चयनात्मक माध्यम (सारणी 2) से लगभग 1 ओड600nmतक बढाएं .
  3. चयनात्मक प्रेरण माध्यम में 0.05 OD600nm करने के लिए खमीर कोशिकाओं को पतला (तालिका 2), और वैकल्पिक रूप से, उपयुक्त एकाग्रता के लिए एक चुना छोटे अणु जोड़ें (या केवल विलायक) उत्परिवर्ती P53 reactivating में अपनी प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए या MDM2 बाधा में /MDMX-P53 बातचीत.
  4. लगभग 42 एच (ऋणात्मक नियंत्रण खमीर द्वारा आवश्यक समय मध्य लॉग चरण तक पहुंचने के लिए, लगभग 0.45 ओड600nm)तक पहुंचने के लिए निरंतर कक्षीय मिलाते हुए (200 आरपीएम) के अंतर्गत 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं।
  5. न्यूनतम चयनात्मक प्लेटों पर खमीर सेल संस्कृतियों के 100 $L aliquots स्पॉट (तालिका 2) .
  6. 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट।
  7. 100 $L संस्कृति बूंदों में प्राप्त कालोनियों की संख्या की गणना करके खमीर विकास को मापने (कोलोनी बनाने इकाई, CFU मायने रखता है). उदाहरण के लिए, जंगली प्रकार P53 के विकास पर विचार यौगिकों के उत्परिवर्ती reactivating प्रभाव की गणना अधिकतम संभव प्रभाव के रूप में खमीर व्यक्त (सेट करने के लिए 100%), जबकि उत्परिवर्ती P53 व्यक्त कोशिकाओं के विकास (लेकिन विलायक नियंत्रण के संपर्क में) का प्रतिनिधित्व करता है पुनः सक्रियण का शून्य स्तर.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

का निर्माण एडीई2 या LUC1 रिपोर्टर खमीर उपभेदों

डेलिटो परफेटोप्रोच12,14,15,16 को पी 53 रिपोर्टर खमीर उपभेदों के निर्माण को सक्षम बनाने के लिए अनुकूलित किया गया है ( चित्र 1) . विधि एकीकरण के चुने हुए स्थान के लिए कम से कम 30 न्यूक्लिओटाइड समजात, दोनों सिरों पर युक्त एकल या डबल-स्रेड ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स को रोजगार देता है। विशेष रूप से, होमोलोजी डबल मार्कर कैसेट ICORE के एकीकरण की साइट flanking दृश्यों से मेल खाती है, Klura3 और kanMX4 युक्त (रिपोर्टर जीन Geneticin के लिए प्रतिरोध प्रदान, G418) पहले पर तैनात वांछित लक्ष्य साइट15,16. इस कैसेट भी खमीर मैं-Scei endonuclease कोडिंग अनुक्रम शामिल हैं, induible GAL1 प्रमोटर और उसके cognate लक्ष्य साइट के तहत. इसलिए, I-SceI अभिव्यक्ति में वांछित अनुक्रम परिणाम के साथ खमीर कोशिकाओं के परिवर्तन से पहले galactose युक्त मध्यम में एक स्विच और ICORE एकीकरण की साइट पर एक एकल डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) के परिणामस्वरूप पीढ़ी। एक DSB की उपस्थिति अत्यधिक एक परिवर्तन के साथ प्राप्त 1,000 से अधिक प्रतिस्थापन के साथ, लक्षित घटनाओं की आवृत्ति को उत्तेजित करता है.

5-FOA और G418 के लिए संवेदनशीलता के लिए अधिग्रहीत प्रतिरोध के आधार पर लक्ष्यीकरण और चयन प्रक्रिया के अंत में, उम्मीदवार क्लोन कॉलोनी पीसीआर द्वारा संशोधित टिड्डी और Sanger अनुक्रमण के प्रवर्धन द्वारा की पुष्टि कर रहे हैं के सही एकीकरण की पुष्टि करने के लिए वांछित P53 RE (चित्र 1C) तनाव निर्माण प्रोटोकॉल के अंत में, कि के बारे में एक सप्ताह में पूरा किया जा सकता है, isogenic रिपोर्टर खमीर उपभेदों का एक पैनल प्राप्त कर रहे हैं कि कैसे REs के अनुक्रम में मतभेद P53 के रूपांतरण क्षमता को प्रभावित का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रोटीन.

कार्यात्मक विषमांगी उत्परिवर्ती P53s

मानव ट्यूमर में, TP53 जीन मुख्य रूप से एक missense उत्परिवर्तनों कि आम तौर पर छह प्रमुख हॉटस्पॉट अवशेषों (R175, G245, R248, R249, R273, और R282) शामिल से प्रभावित है केंद्रीय डीएनए बाध्यकारी डोमेन (DBD) P53 प्रोटीन के. तथापि, 2,000 से अधिक एकल P53 एमिनो-एसिड प्रतिस्थापन दर्ज किया गया है, कुछ है कि बार बार मनाया जाता है सहित27. उत्परिवर्ती P53s डीएनए संपर्क या संरचनात्मक उत्परिवर्ती के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, डीएनए प्रोटीन संपर्क पर एमिनो-एसिड प्रतिस्थापन के प्रभाव पर निर्भर करता है (जैसे, R273H) या प्रोटीन संरचना (जैसे, R175H)36. एकल TP53 missense उत्परिवर्तनों प्रभाव P53 कार्यों, कार्यात्मक विविधता की एक विस्तृत श्रृंखला है, जो इस तरह के ट्यूमर आक्रामकता, chemo प्रतिरोध, और metastatic क्षमता37के रूप में महत्वपूर्ण नैदानिक सुविधाओं को प्रभावित कर सकते हैं पैदा, 38 , 39.

अवधारणा है कि उत्परिवर्ती P53 कार्यात्मक विषम स्पष्ट रूप से कर रहे हैं पिछले 15 वर्षों में TP53 उत्परिवर्तन डेटाबेस में उपलब्ध प्रयोगात्मक डेटा की एक बड़ीराशि के माध्यम से उभरा है (उदा., और lt;p53.free.fr/ खमीर और / या स्तनधारी रिपोर्टर सिस्टम पर आधारित विभिन्न कार्यात्मक परख विकसित किया गया है, उत्परिवर्ती P53s के विभिन्न गुणों पर प्रकाश डाला (यानी, रूपांतरण, तापमान संवेदनशीलता, प्रमुख नकारात्मक क्षमता, के साथ हस्तक्षेप P53 परिवार के सदस्य और अन्य टीएफ के साथ बातचीत )13,24,40,41,42,43,44. सबसे व्यापक कार्यात्मक अध्ययन आठ अलग P53 आरई24की ओर उनके रूपांतरण गतिविधि की विशेषता द्वारा एक खमीर आधारित परख में 2,300 से अधिक म्यूटेंट की जांच की .

डेटा की पुष्टि की है कि लगभग सभी उत्परिवर्ती P53s हॉटस्पॉट अवशेषों को शामिल नुकसान के समारोह (यानी, वे पूरी तरह से transactivation गतिविधि खो रहे हैं). इसके विपरीत, उत्परिवर्ती P53s कि P53 प्रोटीन के अन्य पदों मारा और आम तौर पर कैंसर में मध्यम से कम आवृत्ति पर पाए जाते हैं45 आंशिक समारोह उत्परिवर्ती, जो P53 REs13 पर रूपांतरण गतिविधि के कुछ स्तर को बनाए रखने , 17. वर्णित P53 प्रोटीनकार्यात्मक विषमता का अध्ययन करने के लिए ADE2 परख का उपयोग करने का एक उदाहरण चित्र 2Aमें प्रस्तुत किया गया है . वास्तव में, जबकि R175H एक नुकसान के समारोह उत्परिवर्ती हर हालत में लाल कालोनियों का उत्पादन परीक्षण किया है, R282W तापमान संवेदनशीलता है कि अधिक स्पष्ट galactose-निर्भर P53 अभिव्यक्ति का उपयोग कर दिखाया गया था (यानी, P21-5 में 37 डिग्री सेल्सियस में लाल क्षेत्र ' RE तनाव में निचले गैलाक्टोस युक्त प्लेट, जो उच्च गैलिक्टोज प्लेट में गुलाबी हो जाती है)। चित्रा 2B P53 म्यूटेंट और रिपोर्टर उपभेदों की एक विस्तारित पैनल के लिए परिणामों का एक सारांश प्रस्तुत करता है.

इस P53 कार्यात्मक विषमता के अस्तित्व की खोज के लिए प्रेरित किया कि क्या इस तरह विषमता TP53 gerline उत्परिवर्तनों के साथ विषयों में नैदानिक स्तर पर मनाया विषमता समानांतर. TP53 gerline उत्परिवर्तन कैंसर की गड़बड़ी विकारों के एक समूह के आणविक आधार को रेखांकित, अधिक गंभीर ली-Fraumeni (एलएफएस) और ली-Fraumeni की तरह (LFL) सिंड्रोम सहित, और कम गंभीर गैर-syndromic पूर्वाग्रहों के साथ (FH) या बिना (कोई FH) परिवार के इतिहास46|

प्रोटोकॉल IARC डेटाबेस से इसी नैदानिक डेटा के साथ सभी TP53 germline उत्परिवर्ती alleles के खमीर परख-आधारित transactivation क्षमताओं मिलान करके जीनोटाइप-phenotype सहसंबंध पर प्रकाश डाला;http://www-p53.iarc.fr/Germline.html हानि के समारोह P53 म्यूटेंट अधिक गंभीर कैंसर प्रवणता सिंड्रोम में पाया गया है, जबकि आंशिक समारोह P53 म्यूटेंट कम गंभीर कैंसर प्रवणता की स्थिति में पाया गया है. इससे पता चलता है कि पी 53 अवशिष्ट सक्रियण क्षमता उन रोगियों में नैदानिक फीनोटाइप को प्रभावित करती है , जिन्होंने टीपी 53 उत्परिवर्तनों को विरासत में दिया और कैंसर25,26विकसित किया .

न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम ों में परिवर्तन के भीतर REs P53 शासन पुन: सक्रियण विभव

मानव P53 एक tetrameric (dimers के डिमर) TF है. प्रत्येक P53 dimer 10 न्यूक्लिओटाइड (RRRCWWYY, R ] A या G; डब्ल्यू जेड ए या टी; Y ] सी या टी)47,48. ऐसे दो अर्ध-स्थल या तो 13-20 न्यूक्लिओटाइड तक के निकट या स्थान के साथ हो सकते हैं, जो एक कार्यात्मक P53 RE का गठन कर सकते हैं। फिर भी, एक स्पेसर के साथ P53 आरईएक spacer49,50के बिना कम P53 आत्मीयता और transactivation द्वारा विशेषता है, विभिन्न प्रणालियों से विभिन्न कार्यात्मक परख में.

यह हाल ही में प्रदर्शन किया गया था कि आधा साइटों P53 tetramers कि बाध्य हेमी विशेष रूप से51कर रहे हैं भर्ती कर सकते हैं, कार्यात्मक परख और क्रोमैटिन इम्यूनोप्रीसेप्शन अध्ययन के साथ, इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि P53 भी गैर-कैनोनिकल आरई एस पर कार्य कर सकते हैं, जिसमें अर्ध-स्थल और तीन-चौथाई स्थल48,52शामिल हैं . इसके अलावा, तथ्य यह है कि पूर्ण आम सहमति P53 RE आकृति बहुत खराब है (RRRCWWGYYY)2 संभावना है कि व्यक्तिगत री काफी अनुक्रम और बाध्यकारी संबंध में भिन्न हो सकते हैं prefigures. यह देखते हुए कि मानव जीनोम41,48में पी 53 लक्ष्य जीनों के सैकड़ों की पहचान की गई है, लगभग सभी P53 रीस ने एक-दूसरे के बीच गैर-पहचान अनुक्रम दिखाया है। इसके अलावा, यह परिकल्पना की गई है कि एक अलग डीएनए बाध्यकारी संबंध के साथ आरईएस का चयन सेल चक्र गिरफ्तारी या एपोप्टोसिस53में शामिल पी 53 लक्ष्य जीनों के प्रमोटरों में किया जाता है।

एक निरंतर जीनोमिक स्थान पर P53 RE के कई वेरिएंट के खमीर में विश्लेषण न्यूक्लिओटाइड वेरिएंट, स्पेसर और ट्रांसएक्टिवेशन क्षमता49पर आरई आधा साइटों के संगठन के प्रभाव की स्थापना की। इसके परिणामस्वरूप बहुरूपी पी53 आरई की खोज भी हुई , जिसमें दो एलेल्स पी 5314,54,55के लिए संबद्ध प्रवर्तक की जवाबदेही में बिल्कुल भिन्न थे . हाल ही में, P53 RE अनुक्रम सुविधाओं और खमीर आधारित transactivation क्षमता से प्राप्त जानकारी p53 Retriver में कोडित किया गया है, एक पैटर्न खोज एल्गोरिथ्म है कि स्थानीयऔर दोनों विहित और गैर-कैनोनिकल आरई रैंक करने में सक्षम है, उनके अनुसार संपूर्ण मानव जीनोम52में सक्रियण क्षमता की भविष्यवाणी की गई है .

अनुक्रम-विशिष्ट P53 रूपांतरण क्षमता का अध्ययन करने के लिए परख का उपयोग करने का एक उदाहरण के रूप में, यहाँ प्रस्तुत मानव जंगली प्रकार P53 और Caenorhabditis elegans से विकासवादी दूर P53 प्रोटीन के बीच एक तुलना है (चित्र 3). ये परिणाम हाल ही में एक अध्ययन का अनुवर्ती अध्ययन है जिसमें P53 प्रोटीनकेबीच ट्रांसएक्टिवेशन विशिष्टता के विकासवादी विचलन का पता लगाया गया 56 . Isogenic yLFM-RE रिपोर्टर उपभेदों प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में विकसित किए गए थे. विशेष रूप से सीड13 जीन57से व्युत्पन्न सेप-1 पी53 आरई तथा चार प्रकार (व्1-V4) की तुलना की गई थी ( चित्र3क)। RE वेरिएंट दो decameric रूपांकनों अलग है कि दो decameric रूपांकनों अलग की लंबाई के प्रभाव की जांच करने के लिए निर्माण किया गया (जो ced13 में, 28 न्यूक्लिओटाइड की है) और CWWG कोर आकृति के बगल में न्यूक्लिओटाइड में परिवर्तन की जांच करने के लिए (जो ced13 में, A/ जबकि उच्चतम संबंध में मानव P53 री,जी / परिणाम स्पष्ट रूप से बताते हैं कि कैसे Cep1 और मानव P53 ट्रांसएक्टिवेशन विशिष्टता के मामले में भिन्न. वास्तव में, जबकि मानव P53-मध्यस्थ परिवर्तन एक स्पेसर की उपस्थिति से दृढ़ता से बाधित है (चित्र 3B), Cep-1 गतिविधि स्पेसर को हटाने से बाधित है (चित्र 3C) . इसके अलावा, CEp-1-मध्यस्थ transactivation समाप्त कर दिया है जब आरई A/T से जी / न तो मानव P53 और न ही Cep-1 एक एकल decamer से transactivate कर सकते हैं ced13 RE से व्युत्पन्न.

P53-MDM2/MDMX बातचीत और उत्परिवर्ती P53 गतिविधि के reactivators के छोटे अणु disruptors के लिए खोज

मानव P53 के विकास निरोधात्मक प्रभाव और खमीर में अपनी गतिविधि की डिग्री के बीच स्थापित सहसंबंध खमीर सेल विकास की माप के आधार पर एक सरलीकृत स्क्रीनिंग परख के लिए नेतृत्व के लिए P53 गतिविधि पर हस्तक्षेप कारकों के प्रभाव का विश्लेषण (चित्र4 ). संभावित कैंसर विरोधी एजेंटों के लिए स्क्रीन करने के लिए खमीर phenotypic परख की प्रभावशीलता कई कार्यों में प्रदर्शन किया गया है. खमीर कोशिकाओं सह-एक्सप्रेसिंग P53 और उसके inhibitors DD2 और/या MDMX का उपयोग करना, इन बातचीत के नए disrupters P53 पर एमडीएम के नकारात्मक प्रभाव को बाधित करने की क्षमता द्वारा पहचान की गई, इस प्रकार फिर से स्थापित जंगली प्रकार P53 प्रेरित खमीर विकास निषेध ( चित्र 4A). विशेष रूप से, इस परख की खोज करने के लिए नेतृत्व 1) pyranoxanthone 1 के रूप में पहले P53-MDM2 एक जैनथोन पाड़34 और 2)oxazoloisoindolinone inhibitors के साथ एक xanthone पाड़ अवरोधक 59 . इसके अतिरिक्त, इस परख के साथ, $ mangostin और gambogic एसिड P53-MDM2 बातचीत30के संभावित अवरोधकों के रूप में पहली बार के लिए वर्णित किया गया.

बाद में, एक ही परख का प्रदर्शन किया है कि chalcones के prenylation P53-MDM2 बातचीत60को बाधित करने की क्षमता में वृद्धि हुई. दिलचस्प है, इस खमीर परख भी P53-MDM2/MDMX बातचीत के दो inhibitors की खोज करने के लिए नेतृत्व किया: tryptophanol व्युत्पन्न oxazolopiperidone lactam OXAz-161 और tryptophanol-derived oxazolosoindolindoone DIMP53-162.

खमीर सेल विकास पर हानि के समारोह उत्परिवर्ती P53 के कम प्रभाव भी उत्परिवर्ती P53-reactivating दवाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए पता लगाया गया है, उत्परिवर्ती P53 के लिए जंगली प्रकार की तरह विकास निरोधात्मक गतिविधि को बहाल करने की क्षमता की विशेषता (चित्र 4B)। इस खमीर परख के साथ, उत्परिवर्ती P53 R280K के एक reactivator, enantiopure tryptophanol व्युत्पन्न oxazoloisoindolinone SLMP53-163, की पहचान की गई थी. चित्रा 4C,डी P53 की अभिव्यक्ति या P53-MDM2 बातचीत Nutlin-3a के अवरोधक के साथ या P53 उत्परिवर्ती Y220C PhiKan083 के reactivator के साथ उपचार की अभिव्यक्ति के साथ खमीर में प्राप्त प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है.

इन यौगिकों की क्रिया के आण्विक तंत्र का सत्यापन P53-सक्रिय एजेंटों के साथ-साथ उनके एंटीट्यूमर गतिविधि, दोनों मानव ट्यूमर सेल लाइनों में34,60,61,62,63 और पशु मॉडल62,63, दवा की खोज में खमीर phenotypic परख की महान क्षमता को attests.

Figure 1
चित्र 1 : P53 रिपोर्टर खमीर उपभेदों के निर्माण के लिए खमीर आधारित P53 रूपांतरण परख और कार्यप्रवाह की विशेषताएं. (क) जीनोम हेरफेर और नियंत्रित अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति की आसानी खमीर को एक "इन विवो टेस्ट ट्यूब" के समान प्रस्तुत करती है, जिसमें P53 रूपांतरण कार्यों की जांच करने के लिए प्रासंगिक कई चरों का कड़ाई से पता लगाया जाता है। इन चरों में एक जंगली-प्रकार या उत्परिवर्ती P53 प्रोटीन की अभिव्यक्ति का स्तर, आरई का अनुक्रम, और रिपोर्टर जीन का प्रकार [गुणात्मक/अर्द्ध-मात्रात्मक (उदा., ADE2 और LAC])या मात्रात्मक (उदा., LUC1) शामिल हैं। आम सहमति पुन: अनुक्रम अत्यधिक अपभ्रष्ट है (आरआरआरसीडब्ल्यूजीवाई-एन-आरआरआरसीडब्ल्यूजीवाईवाई; आर जेड प्यूरीन; W ] A/T; वाई जेड पाइरिमिडीन; CWWG - कोर अनुक्रम, n ] 0-13 बीपीएस स्पेसर). आम सहमति के संबंध में बेमेल की संख्या, कोर अनुक्रम, और आधार जोड़ी spacers की संख्या transactivation गतिविधि को प्रभावित करेगा. इस पैनल को पिछले प्रकाशन64से संशोधित किया गया है. (बी) ADE2 या LUC1 रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति ड्राइविंग न्यूनतम प्रमोटर के ऊपर एक वांछित P53 RE अपस्ट्रीम शुरू करने के लिए delitto perfetto दृष्टिकोण की योजना. इस प्रोटोकॉल को पिछलेप्रकाशनों 12,15,16से अनुकूलित किया गया था . (सी) ओलिगो आरई एकीकरण साइट के आसपास के क्षेत्र के खमीर कॉलोनी पीसीआर प्रवर्धन के परिणामों का उदाहरण। इलेक्ट्रोफोरोसिस की छवि 1 केबी डीएनए सीढ़ी (Promega) के बगल में इसी पीसीआर नकारात्मक नियंत्रण के साथ दो putative सकारात्मक कालोनियों (URA3 ऋण और G418 संवेदनशील) के प्रवर्धन परिणाम प्रस्तुत करता है। तालिका 3 में वर्णित प्राइमर का उपयोग करके अपेक्षित $500 nt बैंड को सही प्रमोटर संपादन की पुष्टि करने के लिए अनुक्रम किया जा सकता है, जैसा कि इलेक्ट्रोफेरोग्राम में दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : P53 प्रोटीन पुनः विशिष्ट और तापमान के प्रति संवेदनशील सक्रियण क्षमता दिखाते हैं. जंगली प्रकार P53 और संकेत TP53 missense उत्परिवर्तनों खमीर में गुणात्मक रंग आधारित रिपोर्टर परख का उपयोग कर परीक्षण किया गया और रिपोर्टर उपभेदों कि बंदरगाह विभिन्न P53 RES ADE2 जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित. () P53 जंगली प्रकार के लिए कॉलोनी रंग phenotype का एक उदाहरण, R175H, और Puma के साथ R282W (BBC3) और P21-5 ' 30 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस पर P21-5' रीस दिखाया गया है. मध्यम (0.008% गैलाक्टोज) और उच्च (0.12% गैलिक्टोज) P53 अभिव्यक्ति की तुलना में है। (बी) तीन तापमान (24 डिग्री सेल्सियस, 30 डिग्री सेल्सियस, और 37 डिग्री सेल्सियस) पर P53-निर्भर कॉलोनी रंग phenotype के लिए जांच की P53 म्यूटेंट और खमीर रिपोर्टर उपभेदों की एक विस्तारित सेट के साथ प्राप्त परिणाम। परिणाम उत्परिवर्ती P53 alleles के कार्यात्मक विषमता का उदाहरण है और एक तालिका प्रारूप में संक्षेप कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, R175H एक हानि के समारोह उत्परिवर्ती है, जबकि G199H जंगली प्रकार P53 की तरह है. K139E और R282W आंशिक समारोह को बनाए रखने और प्रदर्शन ठंड संवेदनशीलता और गर्मी संवेदनशीलता, क्रमशः. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : मानव P53 और श्रेय ऑर्थोलॉग Cep-1 प्रदर्शन अत्यधिक भिन्न transactivation विशिष्टता. (ए) के अनुक्रम: मानव P53 RE आम सहमति अनुक्रम, Cep-1 P53 RE ced13 जीन से व्युत्पन्न, और चार वेरिएंट (V1-V4) कि कार्यात्मक परख में परीक्षण किया गया. () सक्रियण कम, मध्यम और उच्च अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए तीन अलग अलग कार्बन स्रोतों का उपयोग कर 8 एच के लिए मानव P53 अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के बाद मापा गया था (0.008%, 0.032%, 0.12% galactose 2% raffinos युक्त चयनात्मक माध्यम में जोड़ा). परिणाम औसत सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (RLU) और चार प्रतिकृतिकेके मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. रिक्त व्यंजक वेक्टर के साथ रूपांतरित कक्ष के लिए रिपोर्टर गतिविधि घटाई गई. (ग) (बी) में मापे गए के रूप में Cep1 की सक्रियण विशिष्टता। दोनों प्रोटीन के लिए, सक्रियण स्तर गैलिक्टोज की मात्रा के लिए आनुपातिक थे. उच्च प्रकाश इकाइयों मापा जब मानव P53 व्यक्त की है प्रोटीन मात्रा का उत्पादन के विभिन्न स्तरों पर निर्भर किया जा सकता है, प्रोटीन लंबाई में अंतर के कारण और संभवतः भी codon उपयोग में. दो प्रोटीन विभिन्न REs परीक्षण की दिशा में विभिन्न transactivation विशिष्टता की विशेषता है और इस संपत्ति रिश्तेदार प्रोटीन राशि में संभव अंतर से प्रभावित नहीं है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : P53 के छोटे अणु उत्प्रेरक खमीर phenotypic परख का उपयोग कर की पहचान की. (क) खमीर कोशिकाओं सह मानव जंगली प्रकार P53 और MDM2 या MDMX P53-MDM2 और P53-MDMX बातचीत के inhibitors के लिए खोज करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रणाली में, बातचीत inhibitors P53 प्रेरित खमीर विकास निषेध खमीर कोशिकाओं में बहाल सह-एक्स्प्रेसिंग P53 और DD2 या MDMX. इस दृष्टिकोण P53-MDM2 बातचीत के inhibitors की पहचान और P53-MDM2 और P53-MDMX बातचीत के दोहरे inhibitors की पहचान की अनुमति दी है. (बी) खमीर कोशिकाओं मानव उत्परिवर्ती P53 व्यक्त करने के लिए उत्परिवर्ती P53 reactivators के लिए खोज करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और उत्परिवर्ती P53-expressing खमीर कोशिकाओं में जंगली प्रकार की तरह P53 प्रेरित खमीर विकास अवरोध को बहाल करने में सक्षम हैं. (सी) प्लेट स्पॉट परख के प्रतिनिधि छवियों खाली वेक्टर की तुलना में खमीर कॉलोनी विकास पर जंगली प्रकार P53 या उत्परिवर्ती Y220C के प्रभाव दिखा (चरण 4.5 देखें). (डी) वृद्धि परख के मात्रात्मक परिणाम: 10 डिग्री एम नटलिन-3a कोशिकाओं में P53 प्रेरित खमीर विकास अवरोध को बहाल करता है सह-अभिव्यक्त एमडीएम2; 50 डिग्री M PhiKan083 उत्परिवर्ती P53 Y220C करने के लिए जंगली प्रकार की तरह P53 प्रेरित खमीर विकास निषेध पुनर्स्थापित करता है। दोनों प्रभाव एक के रूप में स्थापित किया गया था, जो जंगली प्रकार P53, के खमीर विकास निरोधात्मक प्रभाव के सापेक्ष प्लॉट किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तनाव का नाम और जीनोटाइप विशिष्ट उपयोग प्रोटोकॉल संख्या
yAFM-ICORE: MATA leu2-3,112 trp1-1 उसकी3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::ADE2 यह yAFM-RE तनाव के निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है (MATAleu2-3,112 trp1-1 उसके3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::ADE2) कि गुणात्मक, रंग आधारित ADE2 परख में शोषण किया जाता है. प्रोटोकॉल 1,2
yLFM-ICORE: MATA leu2-3,112 trp1-1 उसकी3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::LUC1 यह yLFM-RE तनाव के निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है (MATaleu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; RE::pCyc1::LUC1) कि मात्रात्मक luminscence आधारित LUC1 परख में शोषण किया है. प्रोटोकॉल 1,3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [किल-ओ] यह phenotypic विकास परख के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रोटोकॉल 4

तालिका 1: खमीर उपभेदों.

मीडिया का नाम और नुस्खा विशिष्ट उपयोग प्रोटोकॉल संख्या
वाईपीडीए (2% खमीर निकालने, 2% पेपटोन, 2% डेक्सट्रोज, 200 मिलीग्राम / + 2% agar agar के बिना YPDA निस्पंदन द्वारा अधिमानतः बाँझ है. YPDA + agar autoclaving द्वारा बाँझ है; यह नुस्खा से डेक्सट्रोज छोड़ और प्लेटों डालने से पहले पानी में एक 20% फिल्टर बाँझ समाधान से डेक्सट्रोज जोड़ने के लिए संभव है। प्रोटोकॉल 1-4
सीएम [0.17% ए.ए. और अमोनियम सल्फेट के बिना खमीर नाइट्रोजन बेस, 0.5% अमोनियम सल्फेट, 5% (मात्रा/मात्रा, v/v) गैर-आवश्यक एमिनो-एसिड समाधान, 20 मिलीग्राम/एल हिस्टोडाइन, 20 मिलीग्राम/एल ट्रिप्टोफान, 20 मिलीग्राम/एलसिल यूरा, 30/ 2% गैलाक्टोस मीडिया फ़िल्टरिंग द्वारा बाँझ है. निम्नलिखित बाँझ शेयर समाधान पानी में तैयार कर रहे हैं (uracil के अपवाद के साथ, कि 0.1M NaOH में भंग कर दिया है) फ़िल्टरिंग द्वारा: गैर-आवश्यक एमिनो-एसिड समाधान (0.04% arginine, 0.04% methionine, 0.06% isoleucine, 0.1% फेनिलएलनीन, 0.2% glutamic एसिड, 0.2% aspartic एसिड, 0.3% valine, 0.4% threonine, 0.8% serine, 1% histidine, 1% tryptophan, 1% uracil, 1% lysine, 1% leucine, 0.5% adenine, 20% galactose. Adenine स्टॉक समाधान गठन और क्रिस्टल के अवसादन के कारण फ्रिज में संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए. Tryptophan शेयर समाधान अंधेरे में संग्रहीत किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल 1
मुख्यमंत्री (ऊपर देखें) + 2% डेक्सट्रोज + 1g/L 5-FOA + 2% agar मीडिया (ए.ए. और अमोनियम सल्फेट, अमोनियम सल्फेट और आगर के बिना खमीर नाइट्रोजन बेस युक्त) autoclaving द्वारा बाँझ है. अन्य घटकों को गर्मी-लेबिल सामग्री को संरक्षित करने के लिए ऑटोक्लेविंग के बाद जोड़ा जाता है; 5-FOA पाउडर सीधे मीडिया में जोड़ा जा सकता है एक बार यह 55 डिग्री सेल्सियस के बारे में ठंडा हो गया है. प्रोटोकॉल 1
YPDA + 400 [g/mL G418 + 2% agar G418 autoclaving के बाद जोड़ा जाना चाहिए एक बार मीडिया के बारे में 55 डिग्री सेल्सियस ठंडा हो गया है. यदि पाउडर से शुरू, एक 50 mg/mL G418 शेयर समाधान पानी में तैयार किया जा सकता है और निस्पंदन द्वारा बाँझ. प्रोटोकॉल 1
वाईपीजीए [2% खमीर निकालने, 2% पेपटोन, 2% ग्लिसरॉल (v/v), 200 mg/ + 2% agar मीडिया autoclaving द्वारा बाँझ है. प्रोटोकॉल 1
सिंथेटिक चयनात्मक प्लेट: $0.17% ए.ए. और अमोनियम सल्फेट के बिना खमीर नाइट्रोजन बेस, 0.5% अमोनियम सल्फेट, 5% (v/v) गैर-आवश्यक एमिनो एसिड समाधान (0.04% arginine, 0.04% methionine, 0.06% आइसोल्यूसिन, 0.1% फेनिलएलनिन, 0.2% ग्लूटामिक एसिड, 0.2% aspartic एसिड, 0.3% valine, 0.4% थ्रेओनिन, 0.8% सेरीन, 20 मिलीग्राम/एल हिस्टाइडीन, 20 मिलीग्राम/एल यूरेसिल, 20 मिलीग्राम/एल ट्रिप्टोफान (वेक्टर चयन मार्कर पर निर्भर करता है), 30 मिलीग्राम/एल लाइसिन, 100 मिलीग्राम/एमएल ल्यूसिन (वेक्टर चयन मार्कर पर निर्भर करता है), 5 मिलीग्राम/एल या 200 मिलीग्राम/एल एडिनेन 2% एगरएक्सटीएक्स 2% मीडिया (ए.ए. और अमोनियम सल्फेट, अमोनियम सल्फेट और आगर के बिना खमीर नाइट्रोजन बेस युक्त) autoclaving द्वारा बाँझ है. अन्य घटकों को गर्मी-लेबिल सामग्री को संरक्षित करने के लिए ऑटोक्लेविंग के बाद जोड़ा जाता है। पीएलएस- और पीएलएसजी-आधारित सदिशों का उपयोग करते समय ल्यूकोइन के बिना प्लेटें तैयार करते हैं। पीटीएस- और पीटीएसजी आधारित सदिशों का उपयोग करते समय ट्रिप्टोफान के बिना प्लेटें तैयार करते हैं। प्रोटोकॉल 2-3
सिंथेटिक चयनात्मक मीडिया: $0.17% ए.ए. और अमोनियम सल्फेट के बिना खमीर नाइट्रोजन बेस, 0.5% अमोनियम सल्फेट, 5% (v/v) गैर-आवश्यक एमिनो-एसिड समाधान (0.04% arginine, 0.04% methionine, 0.06% आइसोल्यूसिन, 0.1% फेनिलएलनिन, 0.2% ग्लूटामिक एसिड, 0.2% aspartic एसिड, 0.3% valine, 0.4% थ्रेनोइन, 0.8% सेरीन, 20 मिलीग्राम/एल हिस्टाइन, 20 मिलीग्राम/एल यूरासिल, 20 मिलीग्राम/एल ट्रिप्टोफान (वेक्टर चयन मार्कर पर निर्भर करता है), 30 मिलीग्राम/एल लाइसिन, 100 मिलीग्राम/एमएल ल्यूसिन (वेक्टर चयन मार्कर पर निर्भर), 200 मिलीग्राम/एल एडेनीन + 2% डीरोस या रैफ्टोस-0एक्सटी  मीडिया निस्पंदन द्वारा बाँझ है. दवा उपचार में पीएलएस- या पीटीएस-आधारित वेक्टर का उपयोग करते समय क्रमशः ल्यूकोइन या ट्रिप्टोफान के बिना मीडिया तैयार करते हैं, लेकिन जिसमें 2% डेक्सट्रोज होता है। PLSG- या pTSG आधारित वेक्टर के साथ या दवा उपचार के बिना inducible P53 अभिव्यक्ति का उपयोग करते समय क्रमशः ल्यूकोइन या ट्रिप्टोफान के बिना मीडिया तैयार करते हैं, लेकिन जिसमें 2% रैफिनोस और गैलेक्टोस की चर राशि P53 अभिव्यक्ति को मॉड्युलेट करने के लिए होती है। P53 प्रेरण की सीमा भी ऊष्मायन के समय अलग से संग्राहक किया जा सकता है. प्रोटोकॉल 3
न्यूनतम चयनात्मक प्लेटें: 2% ग्लूकोज, 0.7% खमीर नाइट्रोजन आधार (एमिनो-एसिड और अमोनियम सल्फेट के बिना), 50 mg/L adenine, 50 mg/L uracil, 50 mg/L हिस्टोडाइन, 50 mg/L ट्रिप्टोफान (वेक्टर चयन मार्कर पर निर्भर करता है), 50 mg/ सदिश चयन मार्कर), 2% agar माध्यम autoclaving द्वारा बाँझ है. PLS89-आधारित सदिशों का उपयोग करते समय tryptophan बिना मध्यम तैयार करते हैं। PLS89 खाली वेक्टर का प्रयोग करें (किसी भी प्रोटीन व्यक्त नहीं) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में. PLS89-आधारित और pGADT7-MDM2 वेक्टर (P53 और MDM2 के सह-अभिव्यक्ति) का उपयोग करते समय, ल्यूकोइन और ट्रिप्टोफान के बिना माध्यम तैयार करें। pLS89 खाली और pGADT7 का प्रयोग करें (दोनों किसी भी प्रोटीन व्यक्त नहीं) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में. PLS76-आधारित सदिशों का उपयोग करते समय ल्यूकोइन के बिना मध्यम तैयार करते हैं। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में pRS315 वेक्टर (किसी भी प्रोटीन व्यक्त नहीं) का प्रयोग करें. प्रोटोकॉल 4
न्यूनतम चयनात्मक माध्यम: कम से कम चयनात्मक प्लेटों के रूप में लेकिन agar के बिना माध्यम निस्पंदन द्वारा बाँझ है. प्रोटोकॉल 4
चयनात्मक प्रेरण माध्यम: कम से कम चयनात्मक माध्यम के रूप में लेकिन ग्लूकोज के बजाय 2% गैलाक्टोज युक्त माध्यम निस्पंदन द्वारा बाँझ है. प्रोटोकॉल 4

तालिका 2:East मीडिया.

समाधान नाम और नुस्खा या प्राइमर नाम और अनुक्रम विशिष्ट सुविधाओं और उपयोग प्रोटोकॉल संख्या
LiAc/TE: 10 m Tris-HCl, पीएच 8.0, 1 एमएम EDTA और 0.1M लिथियम एसीटेट के साथ पानी में निम्नलिखित बाँझ स्टॉक समाधान autoclaving द्वारा तैयार कर रहे हैं: 1M लिथियम एसीटेट पीएच 7.5, 1 एम Tris-HCl / 0.1 एम EDTA पीएच 8.0 (टी बफर 10X). प्रोटोकॉल 1-4
PEG/LiAc/TE: 40% पॉलीथीन ग्लाइकोल (PEG) में 10 m Tris-HCl, पीएच 8.0, 1 एमएम EDTA और 0.1 M लिथियम एसीटेट के साथ पानी में निम्नलिखित बाँझ स्टॉक समाधान autoclaving द्वारा तैयार कर रहे हैं: 1 एम लिथियम एसीटेट पीएच 7.5, 1 एम Tris-HCl / 0.1 एम EDTA पीएच 8.0 (टी बफर 10X), 50% खूंटी (परमाणु वजन $3350). प्रोटोकॉल 1-4
आरई ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स के लिए होमियोलॉजी पूंछ:
5'-gcgaattgacttttgaataatacat-RE-gcagatccgcgcgtgttaggg-3'
परंतु, समाविज्ञान पूंछ का अनुक्रम है, एकीकृत ICORE कैसेट के बगल में गुणसूत्र दृश्यों के लिए इसी; RE ] RE अनुक्रम. प्रोटोकॉल 1
प्राइमर: Ade2 Fw: 5'-AAGTTGCCTAGTCATGAA-3';
Ade2 Rv: 5'-GGAGCCATAGTGGTCAT-3';
Luc1-Rv: 5'-कैटगसीटीजीसीएACCGAA-3'
yAFM-RE तनाव (पीसीआर और अनुक्रमण) के लिए Ade2 Fw Ade2 Rv प्राइमर के साथ गठबंधन. YLFM-RE तनाव (पीसीआर और अनुक्रमण) के लिए Luc1-Rv प्राइमर के साथ Ade2 Fw गठबंधन. प्रोटोकॉल 1

तालिका 3: समाधान और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स।

सदिशों के प्रकार सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रोटोकॉल संख्या
P53 (या नियंत्रण) सदिश.
pLS- या PLSG आधारित: गठन ADH1 प्रमोटर या galactose प्रेरक GAL1 प्रमोटर के तहत P53 प्रोटीन अभिव्यक्ति, क्रमशः (LEU2 चयन मार्कर के रूप में).
पीटीएस- या पीटीएसजी आधारित: गठन ADH1 प्रमोटर या गैलाक्टोज प्रेरक के तहत P53 प्रोटीन अभिव्यक्ति, क्रमशः (TRP1 चयन मार्कर के रूप में)
pLS- और pLSG-आधारित: सकारात्मक नियंत्रण pLS76 और pLSG-P53 वेक्टर के रूप में उपयोग करें (जंगली प्रकार P53) क्रमशः; नकारात्मक नियंत्रण pRS315 वेक्टर के रूप में उपयोग (किसी भी प्रोटीन व्यक्त नहीं).
pTS- और pTSG आधारित: सकारात्मक नियंत्रण pTS76 और pTSG-P53 वेक्टर के रूप में उपयोग करें (जंगली प्रकार P53) क्रमशः, नकारात्मक नियंत्रण pRS314 वेक्टर के रूप में उपयोग (किसी भी प्रोटीन व्यक्त नहीं).
प्रोटोकॉल 2,3
P53 और MDM2 (या नियंत्रण) सदिश.
pLS89 आधारित: जंगली प्रकार P53 प्रोटीन अभिव्यक्ति के तहत galactose प्रेरक GAL1 प्रमोटर (TRP1 चयन मार्कर के रूप में).
pLS76 आधारित: उत्परिवर्ती P53 प्रोटीन अभिव्यक्ति के तहत संरचक ADH1 प्रमोटर (LEU2 चयन मार्कर के रूप में).
pGADT7-आधारित: संरचक ADH1 प्रमोटर के तहत MDM2 प्रोटीन अभिव्यक्ति (LEU2 चयन मार्कर के रूप में)
pLS89-आधारित: सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग pLS89-P53 वेक्टर (जंगली प्रकार P53 को व्यक्त); नकारात्मक नियंत्रण pLS89 खाली के रूप में उपयोग करें (किसी भी प्रोटीन व्यक्त नहीं).
pLS76 आधारित: सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग pLS76-म्यूटेंट P53 वेक्टर (उत्परिवर्ती P53 व्यक्त); नकारात्मक नियंत्रण pRS315 वेक्टर के रूप में उपयोग (किसी भी प्रोटीन व्यक्त नहीं).
pGADT7-आधारित: सकारात्मक नियंत्रण pGADT7-MDM2 वेक्टर के रूप में उपयोग करें (जंगली प्रकार DD2 को व्यक्त करना); नकारात्मक नियंत्रण pGADT7 वेक्टर के रूप में उपयोग करें (किसी भी प्रोटीन व्यक्त नहीं).
प्रोटोकॉल 4

तालिका 4: खमीर अभिव्यक्ति सदिश.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

खमीर आधारित परख P53 प्रोटीन कार्यों के विभिन्न पहलुओं की जांच करने के लिए उपयोगी साबित कर दिया है. ये परख विशेष रूप से कार्यात्मक बहुरूपता के मूल्यांकन सहित आरई लक्ष्य स्थलों के भिन्न रूपों की ओर P53 रूपांतरण क्षमता के मूल्यांकन के लिए संवेदनशील हैं। रंग पत्रकारों के उपयोग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से luciferase परख के miniaturization लागत प्रभावी और अपेक्षाकृत स्केलेबल परख में परिणाम. इसके अलावा, विकास निषेध परीक्षण संभावित रासायनिक पुस्तकालय स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जा रहा करने के लिए सक्षम है, अवशोषण की माप के माध्यम से खमीर सेल व्यवहार्यता के परिमाणीकरण स्वचालित. जबकि सेल दीवार और एबीसी ट्रांसपोर्टरों की कार्रवाई के कारण सीमित पारगम्यता दवा स्क्रीनिंग के लिए खमीर का उपयोग करने में एक सीमा माना गया है, आनुवंशिक संशोधनों को तेजी में सुधार करने के लिए सफलतापूर्वक विकसित किया गया है22,65.

स्तनधारी सेल आधारित परख की तुलना में, खमीर आधारित P53 परख प्रत्यक्ष हिट की पहचान में सुधार हो सकता है, यह देखते हुए कि P53 cofactors की अद्भुत जटिलता से अलग है और झरना रास्ते संकेत है कि उच्च यूकैरियोट में अपने कार्यों को modulate. खमीर आधारित कार्यात्मक परख भी प्रोटीन cofactors के साथ P53 की बातचीत की निगरानी में आंशिक रूप से सफल रहा है (नामD2 और MDMX22,32,33,34) और छोटे के प्रभाव अणुओं (जैसे Nutlin-3a के रूप में) उन बातचीत पर. हालांकि, संवेदनशीलता और खमीर आधारित परख की भविष्यवाणी की शक्ति P53 और बातचीत प्रोटीन के बीच crosstalk जांच करने के लिए कुछ हद तक सीमित हो सकता है, कैसे विवो में उन बातचीत के बाद अनुवाद संशोधनों पर निर्भर करता है और प्रजाति-विशिष्ट संकेतन झरना।

यहाँ वर्णित सिस्टम आसानी से अन्य TFs के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. वास्तव में, खमीर कार्यात्मक परख P53 से संबंधित P63 और P73 प्रोटीन42,49 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से NF-जेडबी परिवार के सदस्यों के लिए विकसित किया गया है66,67 या भी कुछ homeobox और बुनियादी हेलिक्स-लूप-हेलिक्स (bHLH) के लिए TFs68,69]. मानव परमाणु रिसेप्टर्स भी खमीर में व्यक्त किया गया है और लिगन्ड पर निर्भर, अनुक्रम विशिष्ट टीएफएस70के रूप में काम करने के लिए सिद्ध . एक सीमित कारक कुछ स्तनधारी ट्रांसएक्टिवेशन डोमेन (टीएडी) की कमजोर क्षमता में पहचान की गई है खमीर बेसल प्रतिलेखन मशीनरी8के साथ बातचीत करने के लिए , एक कमी है कि एक सक्रिय सहित झंकार निर्माण का उपयोग करके दूर किया जा सकता है विषमलोलोगी टीएडी68,69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम यूरोपीय संघ (FEDER funds POCI/01/0145/FEDER/007728 के माध्यम से Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) और नेशनल फंड (FCT/MEC, Funda]o para a Cincia e Tecnologia और मिनिस्ट्री दा एडकूई ई सिएनसिया के तहत धन्यवाद देते हैं साझेदारी करार PT2020 UID/QUI/50006/2019 और परियोजनाओं (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT फैलोशिप: SFRH/BD/96189/2013 (एस. गोम्स). यह काम Compagnia एस पाओलो, ट्यूरिन, इटली (परियोजना 2017.0526) और स्वास्थ्य मंत्रालय, (परियोजना 5x1000, 2015 और 2016; वर्तमान अनुसंधान 2016) द्वारा समर्थित किया गया था। हम गहराई से वीडियो रिकॉर्डिंग के साथ सहायता के लिए डॉ टेरेसा लेपेज़-Arias मोंटेनेग्रो (ट्रेंटो विश्वविद्यालय, प्रयोगात्मक विज्ञान शिक्षण प्रयोगशालाओं) का शुक्र है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13, (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26, (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41, (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231, (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3, (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20, (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3, (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26, (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22, (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100, (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102, (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19, (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20, (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92, (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29, (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59, (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18, (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6, (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45, (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100, (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9, (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41, (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12, (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378, (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76, (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8, (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280, (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3, (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85, (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8, (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265, (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192, (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33, (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5, (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10, (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22, (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21, (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279, (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1, (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41, (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114, (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119, (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155, (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10, (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12, (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109, (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11, (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7, (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16, (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74, (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10, (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14, (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17, (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27, (8), 1875-1881 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics