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Fermento como um chassi para desenvolver ensaios funcionais para estudar p53 humano

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Cancer Research

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Summary

Aqui apresentamos quatro protocolos para construir e explorar cepas de levedura Saccharomyces cerevisiae reporter para estudar o potencial de transativação do p53 humano, impactos de suas várias mutações associadas ao câncer, proteínas interagindo coexpressas e os efeitos de moléculas pequenas específicas.

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Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

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Abstract

A constatação de que a conhecida proteína p53 de mamíferos pode atuar como fator de transcrição (TF) na levedura S. cerevisiae permitiu o desenvolvimento de diferentes ensaios funcionais para estudar os impactos de 1) local de ligação [i.e., elemento de resposta (re)] variantes da seqüência na especificidade da transativação p53 ou 2) mutações TP53 , cofactores co-expressados, ou moléculas pequenas na atividade da transativação p53. Diferentes aplicações de pesquisa de base e translacional foram desenvolvidas. Experimentalmente, essas abordagens exploram duas grandes vantagens do modelo de levedura. Por um lado, a facilidade de edição do genoma permite a construção rápida de sistemas de repórter qualitativos ou quantitativos, explorando cepas isogênicas que diferem apenas ao nível de um específico p53-RE para investigar a especificidade da seqüência de p53-dependente transactivacao. Por outro lado, a disponibilidade de sistemas regulamentados para a expressão ectópica do p53 permite a avaliação da transativação em uma ampla gama de expressão protéica. Revisados neste relatório são amplamente utilizados sistemas que são baseados em genes de repórter de cor, luciferase, e o crescimento de levedura para ilustrar suas principais etapas metodológicas e para avaliar criticamente o seu poder preditivo. Além disso, a extrema versatilidade dessas abordagens pode ser facilmente explorada para estudar diferentes TFs, incluindo P63 e p73, que são outros membros da família gene TP53 .

Introduction

A transcrição é um processo extremamente complexo envolvendo a organização dinâmica, espacial e temporal de fatores de transcrição (TFs) e cofatores para o recrutamento e modulação de polimerases de RNA em regiões de cromatina em resposta a estímulos específicos1 . A maioria dos TFs, incluindo o supressor do tumor p53 humano, reconhecem elementos específicos de ação cis na forma de seqüências de DNA chamados elementos de resposta (REs), que consistem em únicos (ou múltiplos) motivos únicos ~ 6-10 nucleotídeos longos. Dentro desses motivos, posições individuais podem mostrar vários graus de variabilidade2, geralmente resumidos por matrizes de peso de posição (PWM) ou logotipos3,4.

O fermento S. cerevisiae é um sistema modelo adequado para o estudo de diferentes aspectos das proteínas humanas através de ensaios de complementação, expressão ectópica e ensaios funcionais, mesmo quando um gene de levedura ortologica não está presente5, 6 anos de , 7. devido à conservação evolutiva dos componentes basais do sistema transcricional8, muitos TFs humanos (quando ectopicamente expressos em células de levedura) pode modular a expressão de um gene repórter, agindo através de promotores projetados para contêm REs apropriados. O sistema de modelo de transcrição aqui apresentado para a p53 humana é caracterizado por três grandes variáveis cujos efeitos podem ser modulados: 1) a modalidade de expressão e tipo de p53,2) a seqüência RE controlando a transcrição dependente do p53, e 3) o tipo de gene repórter (Figura 1a).

Em relação à modalidade de expressão da p53, S. cerevisiae possibilita a escolha de promotores indutivos, represáveis ou constituintes9,10,11. Em particular, o promotor GAL1 induzível permite basal (usando rafinose como uma fonte de carbono) ou variável (alterando a quantidade de galactose na mídia) expressão de um TF em levedura. De fato, a expressão finamente sintonável representa um desenvolvimento crítico para estudar não apenas o p53 propriamente dito, mas também outras proteínas da família p5312,13.

Em relação ao tipo de REs que controla a expressão dependente do p53, S. cerevisiae permite a construção de diferentes cepas de repórter possuindo diferenças únicas no re de interesse em um fundo isogênico de outra forma. Esse objetivo é atingido por meio de uma adaptação de uma abordagem de edição de genoma particularmente versátil desenvolvida em S. cerevisiae, denominada Delitto Perfetto12,14,15,16.

Além disso, diferentes genes de repórter (i.e., URA3, HIS3 e ADE2) podem ser usados para avaliar qualitativamente e quantitativamente as atividades transcricional do TFs humano em S. cerevisiae, cada uma com características específicas que podem ser adaptados às necessidades experimentais17,18,19,20,21. A expressão destes genes do repórter confere o uracil, o histidine, e o prototrophy do adenina, respectivamente. O URA3 reporter não permite o crescimento de células na presença de 5-Foa também, e, portanto, pode ser contraselecionado. O sistema ADE2 reporter tem a vantagem de que, além da seleção nutricional, permite a identificação de células de levedura que expressam Wild-Type (ou seja, funcional na expressão ADE2 ) ou mutante (ou seja,não funcional em ADE2 ) P53 da cor da colônia.

Por exemplo, as células de levedura que expressam o gene ADE2 geram colônias brancas normalmente dimensionadas em placas contendo quantidades limitantes de adenina (2,5-5,0 mg/L), enquanto aquelas que mal ou não transtranscriam aparecem na mesma placa que o vermelho menor (ou rosa) Colônias. Isto é devido ao acúmulo de um intermediário na via de adenina biossintética (i.e., P-ribosylamino-imidazol, que tem sido anteriormente chamado de amino-imidazol aminoimidazole ou ar), que é convertido para formar um pigmento vermelho. A cor qualitativa baseada ADE2 gene do repórter foi substituída já com o Firefly quantitativo Photinus Tânia (LUC1)12,22. Mais recentemente, o repórter ADE2 foi combinado com o repórter de lacZ em um fácil-à-contagem, semi-quantitativo, ensaio dobro do repórter que pode ser explorado para subclassificar os mutantes p53 de acordo com seu nível residual de funcionalidade a 23.

Os repórteres fluorescentes tais como EGFP (proteína fluorescente verde aumentada) ou dsred (proteína fluorescente vermelha de discosoma SP.) foram usados igualmente para a avaliação quantitativa da atividade do transactivacao associada com todas as mutações missense possíveis no TP53 seqüência de codificação24. Por fim, a chance de combinar promotores sintonáveis para a expressão do alelo p53 com cepas de levedura isogênicas diferindo para o gene RE e/ou repórter levou ao desenvolvimento de uma matriz de dados que gera uma classificação refinada de câncer associado e germline alelos p53 do mutante25,26,27.

As abordagens descritas acima são usadas para medir a atividade transcricional da proteína p53. No entanto, a expressão de p53 do tipo Wild no fermento S. cerevisiae28 e Schizosaccharomyces pombe29 pode causar retardo de crescimento, que tem sido associado à parada do ciclo celular28,30 ou morte celular31. Em ambos os casos, a inibição do crescimento do fermento é desencadeada pela expressão p53 elevada e foi correlacionada com a modulação transcricional potencial de genes endógenos do fermento envolvidos no crescimento da pilha. Suportando esta hipótese, o mutante da perda--função p53 R273H não interferiu com crescimento da pilha do fermento quando expressado em níveis similares como selvagem-tipo p5332. Inversamente, a expressão no fermento do mutante tóxico p53 V122A (sabido para uma atividade transcricional mais elevada comparada ao selvagem-tipo p53) causou um efeito inibitório do crescimento mais forte do que o selvagem-tipo p5332.

Adicionalmente, demonstrou-se que a MDM2 humana foi capaz de inibir a atividade transcricional p53 humana em levedura, promovendo sua ubiquitinação e subsequente degradação33. Conformemente, a habilidade do Mdm2 humano e do MDMX de inibir a inibição p53-induzida do crescimento do fermento foi demonstrada32,34. Em um estudo adicional, estabeleceu-se uma correlação entre a atividade transcricional p53 e os níveis de expressão de actina, com a identificação de uma putativa p53 RE upstream no gene Act1 em levedura32. Consistentemente, a expressão do actínio foi aumentada pelo selvagem-tipo p53 e ainda mais por p53 V122A, mas não pelo mutante p53 R273H. Inversamente, a expressão do actina pelo p53 diminuiu na copresença de inibidores p53 Mdm2, MDMX, ou pifithrin-α (um inibidor da pequeno-molécula da atividade transcricional p53), consistente com os resultados baseados no ensaio do fermento-crescimento. É importante ressaltar que esses resultados estabeleceram uma correlação entre a inibição do crescimento induzida pela p53 e o grau de sua atividade na levedura, que também foi explorada para identificar e estudar pequenas moléculas modulando as funções p5328,34 , 35.

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Protocol

1. construção de cepas de levedura ADE2 ou LUC1 repórter contendo um re específico (Yafm-re ou ylfm-re)

  1. Raia uma estirpe yafm-iCore ou ylfm-iCore12,14 (iCore = i, ISCe-i endonuclease GAL1 promotor; CO = contador selecionável URA3; RE = repórter KanMX4 conferindo resistência à kanamicina; Tabela 1) de um estoque de glicerol a 15% armazenado em-80 ° c em uma placa de agar YPDA (tabela 2). Deixe crescer por 2-3 dias a 30 ° c.
  2. Tomar uma colônia de levedura a partir da placa fresca (não mais de 3 semanas de idade) e colocá-lo em um pequeno frasco contendo 5 mL de YPDA (tabela 2). Incubar a 30 ° c durante a noite, agitando em 150-200 rpm.
  3. No dia seguinte, para remover todos os vestígios de dextrose, pellet as células por 2 min em 3.000 x g e descartar o sobrenadante por inversão do tubo.
    Nota: realize todas as centrifugações neste protocolo à temperatura ambiente (RT).
  4. Ressuscite a pelota da pilha em 30-50 mL de CM pre-aquecido (meios completos) que contêm o galactose (tabela 2) e incubar para 4 h em 30 ° c, agitando em 150-200 rpm (necessário para a indução de I-SCEI).
  5. Centrifugue as células durante 2 min a 3.000 x g e descarte o sobrenadante por inversão do tubo.
  6. Resuspend a pelota da pilha em 30-50 mL da água estéril. Repita o passo 1,5.
  7. Ressuscitem o pellet celular em 10 mL de água estéril. Repita o passo 1,5.
  8. Ressuscitar o pellet celular em 5 mL de LiAcTE estéril (tabela 3), uma solução iónica que favorece a captação de DNA. Repita o passo 1,5.
  9. Ressuscitar o pellet celular em 250 μL de LiAcTE estéril e transferir as células para um tubo de 1,5 mL. Repita o passo 1,5 e ressuscite o pellet celular em 300-500 μL de Liacta estéril.
  10. Durante as lavas, desnaturam uma solução de 10 mg/mL de portador de DNA de esperma de salmão por 10 min a 100 ° c e resfrie imediatamente no gelo para mantê-lo como DNA de uma única fita.
  11. Num tubo separado de 1,5 mL, adicione 500 picomoles do oligonucleotídeo pretendido (tabela 3), 5 ΜL do ADN do portador de esperma de salmão cozido, 300 ΜL de Peg LiAcTE estéril (tabela 3) e 50 μL da suspensão da célula de levedura (a partir do passo 1,9).
  12. Vórtice dos tubos para 10 s para misturar e incubar por 30 min a 30 ° c, agitando a 150-200 rpm. Coloque os tubos de 1,5 mL no lado para favorecer a agitação.
  13. Choque térmico as células de levedura para 15 min a 42 ° c em um bloco de aquecimento, em seguida, Centrifugar as células para 20 s em 10.000 x g. Retire o sobrenadante e ressuscitem as células em 1 mL de água estéril.
  14. Distribuir 100 μL da suspensão da célula na placa de agar YPDA e incubar (de cabeça para baixo) durante 1 dia a 30 ° c. Para garantir colônias bem separadas são obtidos, também espalhar 100 μL de uma diluição 1:10.
  15. No dia seguinte, placa de réplica usando veludos estéreis na placa de agar CM contendo dextrose e 5-FOA (tabela 2). Considere uma segunda placa da réplica em uma placa nova se muitas pilhas são transferidas (isto é, algum crescimento de URA3 pilhas).
  16. Três dias depois, placa de réplica em YPDA não seletivo e YPDA contendo placas de ágar G418 (um antibiótico aminoglicídeo semelhante ao canamicina) (tabela 2), marcando cada placa para facilitar sua comparação subsequente. Incubar as placas durante a noite a 30 ° c.
  17. No dia seguinte, identifique as cepas de repórter candidatas de colônias que são G418 sensíveis, mas crescem em placas YPDA (por exemplo, colônias de yLFM ou yAFM-RE). Raia as colônias identificadas (3-6 colônias) em uma nova placa YPDA para obter isolados de colônia única e deixá-los crescer por 2 dias a 30 ° c.
  18. Remendo únicas colônias do fermento em uma placa de YPDA para isolar as colônias para umas análises mais adicionais. Após 24 h a 30 ° c, teste-os pelo chapeamento da réplica em uma placa de agar YPGA (tabela 2) que impedem o crescimento de mutantes Petite (isto é, mutantes respiratório-deficientes). Ao mesmo tempo, placa da réplica em uma placa nova do agar de YPDA.
  19. Teste os remendos corretos (isto é, crescimento em placas do agar de YPDA e de YPGA; 1-3 colônias) da etapa 1,18 para a presença de integração correta do oligonucleotide pelo PCR da colônia. Monte uma mistura de reacção adicionando 5 μL de tampão de 10x PCR (1,5 mM MgCl2), 2 μL de 10 primers de picomoles/ΜL (tabela 3), 4 μL de dntps de 2,5 mm, 0,25 μL de 5 U/μL de polimerase de Taq e água até um volume final de 50 μL. Multiplique a mistura de reação para o número de colônias de levedura que precisam ser rastreadas e alíquota 50 μL em cada tubo de PCR. Usando uma pipeta, adicione uma quantidade muito pequena de células de levedura da placa de agar YPDA em uma única mistura de reação de PCR.
  20. Realize a reação de PCR com o seguinte programa: 94 ° c por 8 min seguidos por 35 ciclos de desnaturação por 1 min a 94 ° c, primers recozimento por 1 min a 55 ° c e extensão por 2 min a 72 ° c.
  21. Depois que a reação é terminada, carregue uma alíquota da reação do PCR (aproximadamente um décimo do volume) em um gel do agarose para verific o tamanho correto (~ 500 BP).
  22. Sequencia o produto do PCR após a purificação com um jogo comercial para confirmar a integração da seqüência desejada do RE usando os mesmos primers da etapa 1,19.
  23. Após a validação da seqüência correta, faça um estoque de glicerol de 15% da cultura de estirpe yAFM-RE ou yLFM-RE (em YPDA) e armazene-o em-80 ° c.

2. avaliação da capacidade de transativação da proteína p53 usando o ensaio de levedura ADE2 com base em cores qualitativa

  1. Repita os passos 1,1 e 1,2 utilizando a estirpe yAFM-RE (tabela 1).
  2. No dia a seguir, diluir a cultura celular (1:10) em 30-50 mL de YPDA pré-aquecido e continuar a incubar a 30 ° c agitando até que o OD600Nm atinja 0,8-1,0 (~ 2 h).
  3. Repita os passos 1.5-1.10.
  4. Em um tubo separado de 1,5 mL, adicione 300-500 ng de vetor de expressão de levedura p53 (ou controle) (tabela 4), 5 μl do portador de DNA de esperma de salmão cozido, 300 ΜL de Peg LiAcTE estéril e 50 μL de suspensão de células de levedura.
  5. Repita os passos 1,12 e 1,13, mas ressuscitem o pellet celular em 300 μL de água estéril.
  6. Espalhe 100 μL da suspensão celular em placas seletivas sintéticas (para a expressão ou controle do p53) contendo dextrose como fonte de carbono e alta quantidade de adenina (tabela 2), em seguida, incubar (de cabeça para baixo) a 30 ° c por 2-3 dias.
  7. Streak única levedura transformante colônias (2-6 estrias por placa) em uma nova placa seletiva e deixá-los crescer durante a noite a 30 ° c.
  8. O dia após, usando a placa estéril da réplica dos veludos em placas seletivas novas que permitem a avaliação do phenotype da cor (isto é, as placas que contêm a dextrose como a fonte do carbono mas limitando a quantidade de adenina; Tabela 2). Incubar as chapas de cabeça para baixo a 30 ° c durante 3 dias. Opcionalmente, para avaliar a sensibilidade à temperatura da proteína p53, incubar em três temperaturas diferentes por 3 dias: 24 ° c, 30 ° c e 37 ° c.
    Nota: a mesma raia pode ser revestida de réplica várias vezes.
  9. Para avaliar a habilidade da transativação da proteína p53, verific o phenotype cor-baseado de colônias do fermento e compare o phenotype da proteína p53 com respeito ao selvagem-tipo p53 e aos phenotypes vazios do vetor.

3. avaliação da capacidade de transativação da proteína p53 utilizando a luminescência quantitativa baseada no ensaio de levedura LUC1

  1. Transforme células de levedura com vetores de expressão p53 (ou controle) (tabela 4) usando o método baseado em Liac descrito no protocolo 2. Use a estirpe de yLFM-RE (tabela 1).
  2. Remende únicos transformantes em uma placa seletiva nova com a quantidade elevada de adenina que contem a glicose como a fonte do carbono e deixe-as crescer em 30 ° c durante a noite. Para cada tipo de transformação, faça 5-7 patches diferentes.
  3. Após o crescimento durante a noite, ressuscitem uma pequena quantidade de células de levedura usando uma ponta de palito ou pipeta estéril da placa em meio seletivo sintético contendo dextrose ou rafinose como a fonte de carbono (200 μL de volume final em uma placa de poço transparente 96, com uma rodada ou fundo plano). Se o experimento necessitar de expressão p53 induzível, acrescente galactose ao meio de rafinose para modular o nível de indução (tabela 2).
    Nota: estas suspensões da pilha devem ter um OD600Nm de aproximadamente 0,4 e não mais altamente do que 1.
  4. Meça a absorvência de cada poço em OD600Nm após a expressão p53 induzível (4-8 h em 30 ° c com agitação de 150-200 rpm) usando um leitor de placa Multilabel. Certifique-se de que as suspensões celulares são homogêneas misturando cada poço com uma pipeta multicanal.
  5. Transferir 10-20 μL de suspensão celular da placa de poço transparente 96 para uma placa branca de 384 (ou 96) e misturar com um volume igual (10-20 μL) de tampão de Lise. Incubar por 10-15 min em RT em uma coqueteleira (150-200 rpm) para atingir a permeabilização da célula ao substrato da luciferase.
  6. Adicionar 10-20 μL de substrato de luciferase de Firefly e medir as unidades de luz (LU) por um leitor de placas com vários rótulos.
  7. Para determinar a capacidade da transativação da proteína p53, normalizar os Lus de cada poço ao OD correspondente600Nm (unidade clara relativa, RLU). Calcule a média de RLU e desvio padrão de 3-4 patches de colônias transformante levedura.
  8. Comparar os dados de transativação da proteína p53 com relação ao tipo selvagem p53 e vetor vazio, subtraindo os valores obtidos com o vetor vazio ou dividindo-se pelos valores obtidos com o vetor vazio (i.e., dobra computacional de indução).
    Nota: a atividade de transativação do p53 também pode ser avaliada usando a mesma set-up experimental na presença de proteínas que interagem com p53 (i.e., MDM2 e MDMX) e/ou incluindo tratamento medicamentoso.

4. avaliação da inibição do crescimento da proteína p53 utilizando o ensaio fenotípico de levedura

  1. Transforme células de levedura com vetores de expressão p53/MDM2/MDMX (ou controle) (tabela 4) usando o método baseado em Liac descrito na seção 2. Use a cepa CG379 (tabela 1) e espalhe os transformantes de levedura em placas seletivas mínimas (tabela 2).
  2. Cresça pilhas transformadas no meio seletivo mínimo (tabela 2) a aproximadamente 1 OD600Nm.
  3. Diluir as células de levedura para 0, 5 OD600Nm no meio de indução seletiva (tabela 2) e, opcionalmente, adicionar uma pequena molécula escolhida à concentração apropriada (ou somente solvente) para testar sua eficácia na reativação do mutante p53 ou na inibição da Mdm2- /MDMX-P53 interações.
  4. Incubar as células a 30 ° c agitação orbital contínua (200 rpm) por aproximadamente 42 h (tempo exigido pela levedura de controle negativo para atingir a fase mid-log, cerca de 0,45 OD600Nm).
  5. Spot 100 μL de alíquotas de culturas de células de levedura em placas seletivas mínimas (tabela 2).
  6. Incubar durante 2 dias a 30 ° c.
  7. Meça o crescimento do fermento contando o número de colônias obtidas nas gotas da cultura 100 μL (unidade de formação de colônia, contagens de CFU). Por exemplo, calcule o efeito de reativação mutante de compostos Considerando o crescimento do tipo selvagem p53 expressando levedura como o efeito máximo possível (definido para 100%), enquanto o crescimento de células que expressam o mutante p53 (mas expostos ao controle de solvente) representa o nível zero de reativação.

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Representative Results

Construção de ADE2 ou LUC1 cepas de levedura repórter

ODelitto perfettoapproach12,14,15,16 foi adaptado para possibilitar a construção de cepas de levedura de repórter p53 (Figura 1b). O método emprega oligonucleotídeos single-ou duplo-encalhado que contem, em ambas as extremidades, pelo menos 30 nucleotídeos homólogo ao Locus escolhido da integração. Especificamente, o homologia corresponde às seqüências que flanqueam o local da integração da gaveta dobro do marcador iCore, contendo o KlURA3 e o kanMX4 (gene do repórter que fornece a resistência ao Geneticin, G418) posicionado previamente em o local de destino desejado15,16. Esta gaveta igualmente contem a seqüência da codificação do endonuclease do I-SCEI do fermento, o promotor GAL1 induzível e seu local cognato do alvo. Conseqüentemente, um interruptor no direito Médio decontenção-contendo antes da transformação de pilhas de fermento com a seqüência desejada conduz à expressão I-SceI e à geração conseqüente de uma única ruptura da dobro-Costa (DSB) no local da integração de ICORE. A presença de um DSB estimula altamente a frequência de eventos de segmentação, com mais de 1.000 substituições obtidas com uma única transformação.

No final do processo de segmentação e seleção com base na resistência adquirida a 5-FOA e sensibilidade a G418, os clones candidatos são confirmados por PCR de colônia baseada na amplificação do locus modificado e sequenciamento de Sanger para verificar a correta integração do p53 desejado (Figura 1C). No final do protocolo de construção de estirpes, que pode ser concluído em cerca de uma semana, um painel de cepas de levedura de repórter isogênica são obtidos que podem ser usados para avaliar como as diferenças na seqüência de REs influenciam a capacidade de transativação da p53 Proteína.

Mutante funcionalmente heterogêneo P53s

Em tumores humanos, o gene TP53 é afetado principalmente por únicas mutações missense que envolvem geralmente seis resíduos principais do hotspot (R175, G245, R248, R249, R273, e R282) situados no domínio DNA-obrigatório central (DBD) da proteína p53. No entanto, mais de 2.000 substituições de aminoácidos p53 únicas foram registradas, incluindo algumas que são raramente observadas27. O mutante P53s pode ser classificado como contato de DNA ou mutantes estruturais, dependendo dos efeitos da substituição do aminoácido no contato DNA-proteico (por exemplo, R273H) ou estrutura proteica (por exemplo, R175H)36. As únicas mutações missense TP53 impactam as funções p53, gerando uma escala larga da diversidade funcional, que possa influenciar características clínicas importantes tais como a agressividade do tumor, a quimio-resistência, e o potencial metastático37, 38 , 39.

O conceito de que os mutantes p53 são funcionalmente heterogêneos claramente emergiu nos últimos 15 anos através de uma grande quantidade de dados experimentais disponíveis em bancos de dados de mutação TP53 (por exemplo, < p53. Free. fr//>)27. Foram desenvolvidos diferentes ensaios funcionais baseados em sistemas de levedura e/ou de repórter de mamíferos, destacando-se as diferentes propriedades dos mutantes P53s (i.e., transativação, sensibilidade à temperatura, potencial dominante-negativo, interferência com o Membros da família p53 e interações com outros TFs)13,24,40,41,42,43,44. O estudo funcional mais abrangente examinou mais de 2.300 mutantes em um ensaio à base de levedura, caracterizando sua atividade de transativação em direção a oito diferentes p53 REs24.

Os dados confirmaram que quase todos os P53s do mutante que envolvem resíduos do hotspot são perda--função (isto é, perderam completamente a atividade do transactivacao). Inversamente, o mutante P53s que bateu outras posições da proteína p53 e é encontrado geralmente em moderado-à-baixa freqüência no cancer45 é Mutants da função parcial, que mantêm algum nível de atividade do transactivacao em p53 res13, 17. um exemplo de utilização do ensaio ADE2 para estudar a heterogeneidade funcional das proteínas p53 descritas é apresentado na Figura 2a. Na verdade, enquanto R175H é uma perda de função mutante produzindo colônias vermelhas em todas as condições testadas, R282W mostrou sensibilidade à temperatura que era mais evidente usando a expressão p53 galactose-dependente (i.e., o setor vermelho a 37 ° c na cepa P21-5 ' RE no placa contendo galactose inferior, que se torna rosa na placa de galactose superior). A Figura 2b apresenta um resumo dos resultados de um painel ampliado de mutantes p53 e cepas de repórter.

A existência desta heterogeneidade funcional p53 alertou a exploração de se tal heterogeneidade paralelizou a heterogeneidade observada a nível clínico nos assuntos com mutações do germline TP53 . As mutações do germline TP53 fundamentam a base molecular de um grupo de desordens da predisposição do cancro, incluindo as síndromes mais severas de Li-Fraumeni (LFS) e de Li-Fraumeni-like (LFL), e as predisposições não-syndromic menos severas com (FH) ou sem (sem FH) história da família46.

O protocolo destacou as correlações genótipo-fenótipo combinando as habilidades de transativação com base no ensaio de levedura de todos os alelos mutantes de TP53 germline com dados clínicos correspondentes do banco de dados iarc < http://www-p53.IARC.fr/germline.html >. Mutantes da perda--função p53 foram encontrados em umas síndromes mais severas do propensão do cancro, quando os mutantes parciais da função p53 forem encontrados em condições menos severas do propensão do cancro. Isto indica que a habilidade residual da transativação p53 influencia o phenotype clínico nos pacientes que herdaram mutações TP53 e desenvolveram o cancro25,26.

Variações de sequências de nucleotídeo dentro de res regem p53 potencial de transativação

Humano p53 é um tetramérica (dímero de dímeros) TF. Cada dímero p53 reconhece um RE constituído por 10 nucleotídeos (RRRCWWGYYY, R = A ou G; W = A ou T; Y = C ou T)47,48. Dois tais meios-locais podem ser adjacentes ou espaçados distante por até 13-20 nucleotides, constituindo um p53 funcional RE. No entanto, as res p53 com espaçador são caracterizadas por menor afinidade p53 e transativação do que p53 res sem espaçador49,50, em diferentes ensaios funcionais de vários sistemas.

Demonstrou-se recentemente que metade-locais podem recrutar tetrâmeros p53 que são encadernados hemispecificamente51, junto com ensaios funcionais e estudos da imunoprecipitação da cromatina, estes resultados indicam que p53 pode igualmente actuar em res não-canônicos, Compreendendo Half-sites e sites de três quartos48,52. Além disso, o fato de que o motivo completo do consenso p53 re é muito degenerado (rrrcwwgyyy)2 prefigura a possibilidade que os res individuais podem substancialmente diferir na seqüência e na afinidade obrigatória. Considerando que centenas de genes alvo p53 foram identificados no genoma humano41,48, virtualmente todas as res p53 mostraram seqüência não idêntica entre si. Além disso, foi supor que os res com uma afinidade de ligação do ADN distinta são selecionados nos promotores de genes p53 do alvo envolvidos na apreensão do ciclo celular ou no apoptose53.

A análise no fermento de muitas variações do re p53 em uma posição genomic constante estabeleceu o impacto das variações do nucleotide, do espaçador e da organização de Half-sites do re na capacidade do transactivacao49. Conduziu mesmo à descoberta de res polimórficos de p53 com os dois alelos que diferem marcada na compreensibilidade de um promotor associado a p5314,54,55. Recentemente, as informações derivadas das características da sequência p53 RE e do potencial de transativação à base de levedura foram codificadas no p53 Retriever, um algoritmo de busca de padrões que é capaz de localizar e classificar REs canônicos e não canônicos, de acordo com seus potenciais de transativação previstos em todo o genoma humano52.

Como exemplo do uso do ensaio para o estudo do potencial de transativação p53 específico à seqüência, aqui apresentado é uma comparação entre o tipo selvagem p53 humano e a proteína p53 evolutiva distante de elegans de Caenorhabditis (Figura 3). Estes resultados são um seguimento de um estudo recente em que a divergência evolutiva da especificidade da transativação entre as proteínas p53 foi explorada56. As estirpes isogénicas do repórter de yLFM-RE foram desenvolvidas como descrito no protocolo. Especificamente, o CEP-1 p53 RE derivado do gene ced13 57, e quatro variantes (v1-v4) foram comparados (Figura 3a). As variantes do re foram construídas para examinar o impacto de variar o comprimento do espaçador que separa os dois motivos decameric (que em ced13, é de 28 nucleotídeos) e para examinar as mudanças nos nucleotídeos que flanqueiam o motivo do núcleo de cwwg (que em ced13, são ricos de A/T; enquanto na mais alta afinidade humana p53 REs, são G/C rico)58. Os resultados mostram claramente como a Cep1 e a p53 humana divergem em termos de especificidade da transativação. De fato, enquanto a transativação mediada pelo p53 humana é fortemente inibida pela presença de um espaçador (Figura 3B), a atividade do CEP-1 é inibida pela remoção do espaçador (Figura 3C). Além disso, a transativação mediada pelo CEP-1 é abolida quando a RE é modificada de a/T-em G/C-Rich. Nem p53 humano nem CEP-1 podem transacionar de um único decâmeros derivado do ced13 re.

À procura de pequenos disruptores de moléculas de interações p53-MDM2/MDMX e reativadores da atividade p53 mutante

A correlação estabelecida entre o efeito inibitório de crescimento do p53 humano e o grau de sua atividade na levedura levou a um ensaio de triagem simplificado com base em medidas de crescimento de células de levedura para analisar o impacto de fatores interferentes na atividade da p53 (Figura 4 ). A eficácia do ensaio fenotípico de levedura para a tela para potenciais agentes anticâncer foi demonstrada em várias obras. Usando células de levedura coexpressando p53 e seus inibidores MDM2 e/ou MDMX, novos disruptores dessas interações foram identificados por sua capacidade de inibir o efeito negativo de MDMs na p53, reestabelecendo assim a inibição do crescimento de levedura induzida pelo tipo selvagem p53 ( Figura 4a). Em particular, este ensaio conduziu à descoberta de 1) pyranoxanthone 1 como o primeiro inibidor da interação p53-MDM2 com um andaime de xanthone34 e 2) nervos inibidores de oxazoloisoindolinone da interação p53-Mdm259. Adicionalmente, com este ensaio, o α-Mangostin e o ácido fruto foram descritos para a primeira vez como os nervos inibidores potenciais da interação p53-Mdm230.

Mais tarde, o mesmo ensaio demonstrou que o Prenilação dos chalconas realçou sua habilidade de interromper a interação p53-Mdm260. Curiosamente, este ensaio de levedura também levou à descoberta de dois inibidores das interações p53-MDM2/MDMX: o oxazolopiperidona OXAZ-161 derivado de triptphanol e oxazoloisoindolinona derivado de TRIPTPHANOL DIMP53-162.

O impacto reduzido da perda de função do mutante p53 no crescimento de células de levedura também tem sido explorado para a tela de drogas de reativação do mutante p53, caracterizada pela capacidade de restaurar a atividade inibitória do crescimento tipo selvagem para o mutante p53 (Figura 4B). Com este ensaio do fermento, um Reativador do mutante p53 R280K, o enantiopure tryptophanol-derivado oxazoloisoindolinone SLMP53-163, foi identificado. A Figura 4C,D mostra resultados representativos obtidos em leveduras com a expressão de p53 ou tratamentos com o inibidor da interação p53-Mdm2 nutlin-3A ou com o Reativador do mutante p53 Y220C PhiKan083.

Validação do mecanismo molecular de ação desses compostos como agentes ativadores da p53, bem como sua atividade antitumoral, tanto em linhagens celulares tumorais humanas34,60,61,62,63 e os modelos animais62,63, atesta ao grande potencial do ensaio fenotípico da levedura na descoberta da droga.

Figure 1
Figura 1 : Características de leveduras baseadas em ensaios de transativação p53 e fluxo de trabalho para a construção de cepas de levedura de repórter p53. (A) a facilidade de manipulação do genoma e a expressão gênica ectópica controlada tornam o fermento semelhante a um "tubo de ensaio in vivo", no qual várias variáveis relevantes para examinar as funções de Transativação do p53 são rigorosamente exploradas. Essas variáveis incluem os níveis de expressão de uma proteína p53 de tipo selvagem ou mutante, a sequência do RE, e o tipo de gene repórter [qualitativo/semiquantitativo (por exemplo, ADE2 e lacZ) ou quantitativo (por exemplo, LUC1)]. A sequência de RE de consenso é altamente degenerada (RE = RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R = Purina; W = A/T; Y = pirimidina; CWWG = seqüência CORE, n = 0-13 bps espaçador). Os números de desencontros em relação ao consenso, a sequência CORE e o número de espaçadores de pares de base influenciarão a atividade de transativação. Este painel foi modificado de uma publicação anterior64. (B) esquema da aproximação do Perfetto do Delitto para introduzir um p53 desejado re a montante do promotor mínimo que conduz a expressão do gene do repórter de ADE2 ou de LUC1 . O protocolo foi adaptado de publicações anteriores12,15,16. (C) exemplo dos resultados da amplificação do PCR da colônia da levedura da região que circunda o local da integração de oligo re. A imagem da electroforese apresenta o resultado da amplificação de duas colônias positivas putativo (URA3 menos e G418 sensíveis) com o controle correspondente do negativo do PCR ao lado da escada do ADN de 1 KB (Promega). A faixa de ~ 500 NT esperada usando primers descritos na tabela 3 pode ser seqüenciada para confirmar a edição correta do promotor, como mostrado no electropherogram. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : As proteínas p53 mostram potencial de transativação re-specific e sensível à temperatura. O selvagem-tipo p53 e as mutações missense TP53 indicadas foram testadas usando o ensaio de cor-baseado qualitativo do repórter no fermento e explorando as tensões do repórter que abrigam diferentes res p53 que controlam a expressão de gene ADE2 . (A) um exemplo do phenotype da cor da colônia para o selvagem-tipo p53, o R175H, e o R282W com o puma (BBC3) e o P21-5 ' res em 30 ° c e 37 ° c são mostrados. Moderada (0, 8% galactose) e alta (0,12% galactose) p53 expressão é comparada. (B) resultados obtidos com um conjunto prolongado de mutantes p53 e cepas de repórter de levedura examinadas para o fenótipo de cor da colônia dependente de p53 em três temperaturas (24 ° c, 30 ° c e 37 ° c). Os resultados exemplificam a heterogeneidade funcional dos alelos do mutante p53 e são resumidos em um formato de tabela. Por exemplo, R175H é uma perda de função mutante, enquanto G199H é selvagem-tipo p53-like. K139E e R282W mantêm a função parcial e exibem a sensibilidade fria e a sensibilidade ao calor, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : O humano p53 e o ortólogo creditado CEP-1 exibem a especificidade altamente divergida do transactivacao. (A) seqüências do: seqüência de consenso humano de p53 re, CEP-1 p53 re derivado do gene ced13 , e quatro variantes (v1-v4) que foram testadas nos ensaios funcionais. (B) a transativação foi mensurada após indução da expressão p53 humana por 8 h, utilizando três diferentes fontes de carbono para atingir expressão baixa, moderada e alta (0, 8%, 0, 32%, 0,12% de galactose adicionada ao meio seletivo contendo 2% de raffinose). Os resultados são expressos como unidades de luz relativa média (RLU) e erro padrão de quatro repetições. A atividade do repórter para a pilha transformada com vetor vazio da expressão foi subtraída para fora. (C) especificidade da transativação de Cep1, medida em (B). Para ambas as proteínas, os níveis de transativação foram proporcionais à quantidade de galactose. As unidades luminosas mais elevadas medidas quando o p53 humano é expressado podem ser dependentes dos níveis diferentes de quantidades da proteína produzidas, devido à diferença no comprimento da proteína e potencial também no uso do Codon. As duas proteínas são caracterizadas pela especificidade diferente do transactivacao para os res diferentes testados e esta propriedade não é afetada por diferenças possíveis na quantidade relativa da proteína. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Ativadores pequenos da molécula de p53 identificados usando o ensaio fenotípico da levedura. (A) as pilhas de levedura que coexpressam o selvagem-tipo humano p53 e Mdm2 ou MDMX foram usadas para procurarar por nervos inibidores das interações p53-Mdm2 e p53-MDMX. Neste sistema, os inibidores da interação restauram a inibição p53-induzida do crescimento do fermento em pilhas de fermento que coexpressam p53 e MDM2 ou MDMX. Esta abordagem permitiu a identificação de inibidores da interação p53-MDM2 e identificação de inibidores duplos das interações p53-MDM2 e p53-MDMX. (B) as células de levedura que expressam o mutante humano p53 têm sido usadas para procurar reativadores do mutante p53 e são capazes de restaurar a inibição do crescimento de levedura induzida pelo tipo selvagem p53 no mutante p53-expressando células de levedura. (C) imagens representativas do ensaio de mancha de placa mostrando o impacto do tipo selvagem p53 ou mutante Y220C no crescimento da colônia de levedura em comparação com o vetor vazio (ver etapa 4,5). (D) resultados quantitativos do ensaio de crescimento: 10 ΜM nutlin-3a restaura a inibição do crescimento de levedura induzida por p53 em células coexpressando Mdm2; 50 μM PhiKan083 restaura a inibição do crescimento de levedura induzida pelo tipo selvagem p53 para o mutante p53 Y220C. Ambos os efeitos são plotados em relação ao efeito inibitório do crescimento do fermento do selvagem-tipo p53, que foi ajustado como um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome da estirpe e genótipo Uso específico Número do protocolo
Yafm-ICORE: mata leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 CAN1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2 É utilizado para a construção da cepa Yafm-re (mata leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 CAN1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2) que é explorado no ensaio qualitativo, baseado em cor ADE2. Protocolos 1, 2
Ylfm-ICORE: mata leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 CAN1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: LUC1 É utilizado para a construção da cepa Ylfm-re (mata leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 CAN1-100; ura3-1; RE::p Cyc1:: LUC1) que é explorado no ensaio quantitativo de LUC1 baseado em luminescência. Protocolos 1, 3
CG379: mata, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [Kil-O] É utilizado para o ensaio de crescimento fenotípico. Protocolo n º 4

Tabela 1: Cepas de levedura.

Nome da mídia e receita Uso específico Número do protocolo
Ypda (2% extrato de levedura, 2% peptona, 2% dextrose, 200 mg/L adenina) + 2% de agar YPDA sem agar é esterilizado preferencialmente por filtração. YPDA + agar é esterilizado por autoclavagem; é possível omitir a dextrose da receita e adicionar dextrose de um filtro de 20% solução esterilizada em água antes de derramar as placas. Protocolos 1-4
Cm [0,17% levedura base de nitrogênio sem AA e sulfato de amônio, 0,5% sulfato de amônio, 5% (volume/volume, v/v) solução de aminoácidos não essenciais, 20 mg/l de histidina, 20 mg/l de triptofano, 20 mg/l de uracil, 30 mg/l de lisina, 100 mg/l de leucina, 200 mg/l de adenina] + 2% de galactose A mídia é esterilizada por filtragem. As seguintes soluções de ações estéreis são preparadas em água (com exceção do uracil, que é dissolvido em NaOH 0,1 M) por filtração: solução de aminoácidos não essenciais (0, 4% arginina, 0, 4% metionina, 0, 6% isoleucina, 0,1% fenilalanina, 0,2% glutâmico ácido, 0,2% ácido aspático, 0,3% valina, 0,4% treonina, 0,8% serina), 1% histidina, 1% triptofano, 1% uracil, 1% lisina, 1% leucina, 0,5% adenina, 20% galactose. A solução conservada em estoque de Adenine não deve ser armazenada no refrigerador devido à formação e à sedimentação dos cristais. A solução de triptofano deve ser armazenada no escuro. Protocolo n º 1
Cm (veja acima) + 2% dextrose + 1G/L 5-Foa + 2% Agar A mídia (contendo base de nitrogênio de levedura sem AA e sulfato de amônio, sulfato de amônio e Agar) é esterilizada por autoclavagem. Os outros componentes são adicionados após autoclavagem para preservar os ingredientes calor-lábeis; o pó de 5 FOA pode ser adicionado diretamente na mídia, uma vez que esfriou para cerca de 55 ° c. Protocolo n º 1
Ypda + 400 μg/ml G418 + 2% Agar G418 deve ser adicionado após o autoclavagem uma vez que a mídia esfriou para cerca de 55 ° c. Se a partir do pó, uma solução de 50 mg/mL G418 pode ser preparada em água e esterilizada por filtração. Protocolo n º 1
YPGA [2% extrato de levedura, 2% peptona, 2% glicerol (v/v), 200 mg/L adenina] + 2% de agar A mídia é esterilizada por autoclavagem. Protocolo n º 1
Placa seletiva sintética: [0,17% base de nitrogênio levedura sem AA e sulfato de amônio, 0,5% sulfato de amônio, 5% (v/v) solução de aminoácidos não essenciais (0, 4% arginina, 0, 4% metionina, 0, 6% isoleucina, 0,1% fenilalanina, 0,2% ácido glutâmico, 0,2% ácido aspático, 0,3% valina, 0,4% treonina, 0,8% serina), 20 mg/L de histidina, 20 mg/L de uracile, 20 mg/L de triptofano (dependendo do marcador de seleção vetorial), 30 mg/L de lisina, 100 mg/mL de leucina (dependendo do marcador de seleção vetorial), 5 mg/L ou 200 mg/L adenina] + 2% dextrose + 2% A mídia (contendo base de nitrogênio de levedura sem AA e sulfato de amônio, sulfato de amônio e Agar) é esterilizada por autoclavagem. Os outros componentes são adicionados após autoclavagem para preservar os ingredientes calor-lábeis. Ao usar vetores baseados em pLS e pLSG, prepare placas sem leucina. Ao usar os vetores baseados em pTS e pTSG, prepare placas sem triptofano. Protocolos 2-3
Meios seletivos sintéticos: [0,17% base de nitrogênio levedura sem AA e sulfato de amônio, 0,5% sulfato de amônio, 5% (v/v) solução de aminoácidos não essenciais (0, 4% arginina, 0, 4% metionina, 0, 6% isoleucina, 0,1% fenilalanina, 0,2% ácido glutâmico, 0,2% ácido aspático, 0,3% valina, 0,4% treonina, 0,8% serina), 20 mg/l de histidina, 20 mg/l de uracile, 20 mg/l de triptofano (dependendo do marcador de seleção vetorial), 30 mg/l lisina, 100 mg/ml de leucina (dependendo do marcador de seleção vetorial), 200 mg/l adenina] + 2% dextrose ou rafinose + 0-2% galactose  A mídia é esterilizada por filtração. Ao usar vetores baseados em pLS ou pTS no tratamento medicamentoso, prepare meios de comunicação sem leucina ou triptofano, respectivamente, mas contendo 2% de dextrose. Ao usar o vetor plsg-ou ptsg-baseado na expressão p53 induzível com ou sem tratamento da droga Prepare meios sem leucina ou triptofano, respectivamente mas contendo o rafinose de 2% e a quantidade variável de galactose para modular a expressão p53. A extensão da indução p53 também pode ser modulada variando o tempo de incubação. Protocolo n º 3
Placas seletivas mínimas: glicose de 2%, base do nitrogênio de fermento de 0,7% (sem aminoácidos e sulfato de amônio), 50 mg/l adenina, 50 mg/l uracil, 50 mg/l histidina, 50 mg/l triptofano (dependendo do marcador de seleção vetorial), 50 mg/l de leucina (dependendo marcador de seleção vetorial), 2% Agar O meio é esterilizado por autoclavagem. Ao usar vetores baseados em pLS89 preparar meio sem triptofano. Use o vetor pLS89-Empty (não expressando nenhuma proteína) como o controle negativo. Ao usar vetores pLS89-based e pGADT7-MDM2 (coexpressão de p53 e MDM2), prepare o meio sem leucina e triptofano. Use pLS89-Empty e pGADT7 (ambos não expressando nenhuma proteína) como controles negativos. Ao usar vetores baseados em pLS76 preparar meio sem leucina. Use o vetor pRS315 (não expressando nenhuma proteína) como o controle negativo. Protocolo n º 4
Meio seletivo mínimo: como placas seletivas mínimas mas sem Agar O meio é esterilizado por filtração. Protocolo n º 4
Meio seletivo da indução: como o meio seletivo mínimo mas que contem a galactose de 2% em vez da glicose O meio é esterilizado por filtração. Protocolo n º 4

Tabela 2: meios de levedura.

Nome da solução e receita ou nome e sequência da cartilha Características e uso específicos Número do protocolo
Liac/te: 10 mm Tris-HCl, pH 8,0, com 1 mm de EDTA e 0,1 m de acetato de lítio As seguintes soluções de ações estéreis em água são preparadas por autoclavagem: 1M de acetato de lítio pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE buffer 10X). Protocolos 1-4
Peg/LiAc/te: 40% polietileno glicol (PEG) em 10 mm Tris-HCl, pH 8,0, com 1 mm de EDTA e 0,1 M de acetato de lítio As seguintes soluções de ações estéreis em água são preparadas por autoclavagem: 1 M de acetato de lítio pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE buffer 10X), 50% PEG (peso molecular ~ 3350). Protocolos 1-4
Caudas de homologia para o RE oligonucleotides:
5 '-gcggaattgactttttcttgaataatacat-RE-gcagatccgccaggcgtgtatatagcgtgg-3 '
Fornecido é a seqüência das caudas da homologia, correspondendo às seqüências cromossomáticas que flanqueam a gaveta integrada de ICORE; RE = sequência RE. Protocolo n º 1
Primers: Ade2 FW: 5 '-AAGTTGCCTAGTTTCATGAA-3 ';
Ade2 RV: 5 '-GGAGCCATTAACGTGGTCAT-3 ';
Luc1-RV: 5 '-CATAGCTTCTGCCAACCGAA-3 '
Para a estirpe yAFM-RE (PCR e sequenciamento) combine Ade2 FW com Ade2 RV primer. Para a estirpe de yLFM-RE (PCR e arranjar em seqüência) combine Ade2 FW com o primer Luc1-RV. Protocolo n º 1

Tabela 3: soluções e oligonucleotides.

Tipos de vetores Controles positivos e negativos Número do protocolo
Vetores p53 (ou controle).
pLS-ou plsg-baseou: expressão da proteína p53 o promotor constitutivo de ADH1 ou o promotor induzível GAL1 do galactose, respectivamente (LEU2 como o marcador da seleção).
pTS-ou ptsg-based: expressão da proteína p53 o promotor ADH1 constitutivo ou o promotor GAL1 induzível do galactose, respectivamente (TRP1 como o marcador da seleção)
pLS-e pLSG-baseou: use como o controle positivo o pLS76 e os vetores de pLSG-p53 (expressando o tipo selvagem p53), respectivamente; usar como controle negativo pRS315 vector (não expressar qualquer proteína).
pTS-e pTSG-based: use como controle positivo o pTS76 e os vetores pTSG-p53 (expressando o tipo selvagem p53), respectivamente; usar como controle negativo pRS314 vector (não expressar qualquer proteína).
Protocolo 2, 3
Vetores p53 e MDM2 (ou controle).
pLS89-based: expressão selvagem da proteína p53 do tipo o promotor induzível GAL1 do galactose (TRP1 como o marcador da seleção).
pLS76-based: expressão da proteína p53 do mutante o promotor ADH1 constitutivo (LEU2 como marcador de seleção).
pGADT7-based: MDM2 expressão protéica o promotor ADH1 constitutivo (LEU2 como marcador de seleção)
pLS89-based: use como controle positivo o vetor pLS89-p53 (expressando o tipo selvagem p53); usar como controle negativo pLS89-Empty (não expressar qualquer proteína).
pLS76-based: use como controle positivo o vetor p53 do pLS76-mutante (expressando o mutante p53); usar como controle negativo pRS315 vector (não expressar qualquer proteína).
pGADT7-based: use como controle positivo o vetor pGADT7-MDM2 (expressando o tipo selvagem MDM2); usar como controle negativo pGADT7 vector (não expressar qualquer proteína).
Protocolo n º 4

Tabela 4: vetores de expressão de levedura.

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Discussion

Os ensaios baseados em leveduras provaram ser úteis para investigar vários aspectos das funções da proteína p53. Esses ensaios são particularmente sensíveis para avaliar o potencial de transativação do p53 em relação a variantes de sítios alvo de RE, incluindo a avaliação de polimorfismos funcionais. O uso de repórteres de cor, bem como a miniaturização do resultado do ensaio luciferase em ensaios de custo-benefício e relativamente escalável. Além disso, o teste de inibição do crescimento é potencialmente capaz de ser utilizado na triagem de bibliotecas químicas, automatizando a quantificação da viabilidade de células de levedura através da mensuração da absorvência. Quando a permeabilidade limitada devido à parede e à ação de pilha de transportadores do ABC for considerada uma limitação em usar o fermento para a seleção da droga, as modificações genéticas para melhorar a tomada foram desenvolvidas com sucesso22,65.

Em comparação com os ensaios baseados em células de mamíferos, o ensaio p53 à base de levedura pode melhorar a identificação de acertos diretos, uma vez que a p53 é isolada da incrível complexidade de cofatores e sinalização de vias em cascata que modulam suas funções em eucariotas superiores. Os ensaios funcionais baseados em leveduras também têm sido parcialmente bem-sucedidos no monitoramento da interação da p53 com cofatores proteicos (ou seja, Mdm2 e MDMX22,32,33,34) e impacto de pequenas moléculas (como Nutlin-3a) nessas interações. No entanto, a sensibilidade e o poder preditivo de ensaios à base de levedura para investigar a conversa cruzada entre p53 e proteínas interagindo podem ser um pouco limitados, dependendo de como essas interações dependem in vivo de modificações pós-translacionais e cascatas de sinalização específicas de espécies.

Os sistemas descritos aqui podem ser facilmente adaptados a outros TFs. De fato, os ensaios funcionais de levedura foram desenvolvidos para proteínas P63 e p73 relacionadas ao p5342,49 bem como membros da família NF-κB66,67 [ou mesmo para alguns homeobox e hélice-loop-hélice básica (bhlh) TFs68,69]. Receptores nucleares humanos também foram expressos em levedura e comprovada para trabalhar como ligand-dependente, seqüência específica TFs70. Um fator limitante foi identificado na fraca capacidade de algum domínio de transativação de mamíferos (TAD) para interagir com a maquinaria de transcrição basal de levedura8, uma lacuna que pode ser superada usando construções quiméricas, incluindo um ativo Tad heterólogo68,69.

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Disclosures

Os autores não declaram conflito de interesses.

Acknowledgments

Agradecemos à União Europeia (FEDER funds POCI/01/0145/FEDER/007728 através do programa operacional factores de competitividade-competir) e fundos nacionais (FCT/MEC, Fundação para a ciência e tecnologia e Ministério da educação e ciência) a Acordo de parceria PT2020 UID/QUI/50006/2019 e os projetos (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. Bolsas FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Este trabalho foi apoiado pela Compagnia S. Paolo, Turim, Itália (projeto 2017, 526) e Ministério da saúde, (projeto 5X1000, 2015 e 2016; pesquisa atual 2016). Agradecemos profundamente ao Dr. Teresa López-Arias Montenegro (Universidade de Trento, laboratórios de ensino de ciências experimentais) para assistência com gravação de vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13, (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26, (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41, (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231, (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3, (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20, (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3, (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26, (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22, (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100, (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102, (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19, (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20, (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92, (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29, (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59, (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18, (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6, (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45, (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100, (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9, (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41, (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12, (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378, (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76, (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8, (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280, (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3, (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85, (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8, (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265, (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192, (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33, (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5, (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10, (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22, (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21, (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279, (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1, (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41, (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114, (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119, (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155, (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10, (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12, (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109, (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11, (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7, (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16, (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74, (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10, (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14, (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17, (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27, (8), 1875-1881 (1999).

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