Author Produced

Gjær som et chassis for å utvikle funksjonelle analyser for å studere Human P53

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Presentert her er fire protokoller for å konstruere og utnytte gjær Saccharomyces cerevisiae reporter stammer å studere menneskelig P53 transactivation potensial, virkninger av sine ulike kreft-tilknyttede mutasjoner, co-uttrykt samspill proteiner, og virkningene av spesifikke små molekyler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Funnet at den velkjente pattedyr P53 protein kan fungere som en transkripsjon faktor (TF) i gjær S. cerevisiae har tillatt for utvikling av ulike funksjonelle analyser for å studere virkningene av 1) bindende nettsted [dvs. respons element (re)] sekvens varianter på P53 transactivation spesifisitet eller 2) TP53 mutasjoner, co-uttrykt kofaktorer, eller små molekyler på P53 transactivation aktivitet. Ulike grunnleggende og translational forskningsprogrammer er utviklet. Eksperimentelt, disse tilnærmingene utnytte to store fordeler av gjær modellen. På den ene siden, den enkle Genova redigering muliggjør rask bygging av kvalitative eller kvantitative reporter systemer ved å utnytte isogenic stammer som avviker bare på nivå med en bestemt P53-RE for å undersøke sekvensen-spesifisitet av P53-avhengige transactivation. På den annen side tillater tilgjengeligheten av regulerte systemer for P53-uttrykk utenfor livmoren evalueringen av transactivation i et bredt spekter av protein uttrykk. Gjennomgått i denne rapporten er mye brukt systemer som er basert på farge reporter gener, luciferase, og veksten av gjær for å illustrere deres viktigste metodisk skritt og for å kritisk vurdere sin prediktiv makt. Dessuten, det ekstrem allsidighet av disse tilnærmelser kan lett utnyttes å studere annerledes TFs inkluderer P63 og P73, hvilke er annet medlemmer av TP53 Gene slekt.

Introduction

Transkripsjon er en svært kompleks prosess som involverer dynamisk, romlig og timelig organisering av transkripsjon faktorer (TFs) og kofaktorer for rekruttering og modulering av RNA polymerases på kromatin regioner som svar på bestemte stimuli1 . De fleste TFs, inkludert den menneskelige P53 tumor Suppressor, gjenkjenne bestemte CIS-fungerende elementer i form av DNA-sekvenser som kalles respons elementer (REs), som består av enkle (eller flere) unike motiver ~ 6-10 nukleotider lang. Innenfor disse motivene, kan individuelle posisjoner viser ulike grader av variasjon2, vanligvis oppsummert etter posisjon vekt matriser (PWM) eller logoer3,4.

Den gjær S. cerevisiae er et egnet modell system for å studere ulike aspekter av humane proteiner gjennom komplementering analyser, svangerskap utenfor livmoren, og funksjonelle analyser, selv når en orthologous gjær genet ikke er tilstede5, 6 andre priser , 7. på grunn av den evolusjonære bevaring av basal komponenter av transcriptional system8, mange menneskelige TFs (når jektopicheski uttrykt i gjærceller) kan modulere uttrykk for en reporter genet ved å handle gjennom arrangører konstruert for å inneholder passende REs. Den transkripsjon modellen systemet presenteres her for menneskelig P53 er preget av tre store variabler som effekter kan modulert: 1) den modalitet av uttrykk og type P53) på RE sekvensen kontrollerende P53-avhengige transkripsjon, og 3) type et reporter gen (figur 1a).

Om modalitet av P53 uttrykk, S. cerevisiae tillater valg av induserbart, repressible, eller konstituerende arrangører9,10,11. Spesielt den induserbart GAL1 arrangøren tillater basal (ved hjelp raffinose som en karbon kilde) eller variabel (ved å endre mengden galaktose i Media) uttrykk for en TF i gjær. Faktisk representerer fint tunable uttrykk en kritisk utvikling for å studere ikke bare P53 seg selv, men også andre P53 familie proteiner12,13.

Når det gjelder type REs kontrollere det P53-avhengige uttrykket, S. cerevisiae tillater bygging av ulike reporter stammer inneha unike forskjeller i re av interesse i en ellers isogenic bakgrunn. Dette målet er nådd ved hjelp av en tilpasning av en spesielt allsidig Genova redigering tilnærming utviklet i S. cerevisiae, kalt delitto perfetto12,14,15,16.

Videre kan ulike reporter gener (dvs. URA3, HIS3, og ADE2) brukes til kvalitativt og kvantitativt evaluere Transcriptional aktiviteter av menneskelig TFs i S. cerevisiae, hver med bestemte funksjoner som kan skreddersys til eksperimentelle behov17,18, 19,20,21. Uttrykket av disse reporter gener gir henholdsvis uracil, histidin og adenine prototrophy. Den URA3 reporter tillater ikke veksten av celler i nærvær av 5-Foa også, og dermed kan det være counterselected. Den ADE2 reporter systemet har den fordelen at, foruten ernæringsmessige utvalg, tillater det identifisering av gjærceller som uttrykker vill-type (dvs. funksjonell på ADE2 Expression) eller mutant (dvs.ikke funksjonell på ADE2 ) P53 fra kolonien farge.

For eksempel, gjærceller uttrykker ADE2 genet generere normalt størrelse hvite kolonier på plater som inneholder begrensende mengder adenine (2.5-5.0 mg/L), mens de som dårlig eller ikke transkribere det vises på samme plate som mindre rød (eller rosa) Koloniene. Dette skyldes akkumulering av en mellomliggende i adenine biosyntetiske veien (dvs. P-ribosylamino-imidazole, som tidligere har blitt kalt amino-imidazole ribotide eller AIR), som er konvertert til å danne en rød pigment. Den kvalitative farge basert ADE2 reporter genet har siden blitt erstattet med den kvantitative Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Flere nylig har ADE2 reporter blitt kombinert med lacZ reporter i en lett-å-score, semi-kvantitative, Double reporter analysen som kan utnyttes til sub-klassifisere P53 mutanter i henhold til deres gjenværende nivå av funksjonalitet 23på.

Fluorescerende journalister som EGFP (forbedret grønt fluorescerende protein) eller DsRed (Discosoma Sp. rødt fluorescerende protein) har også blitt brukt til den kvantitative evalueringen av transactivation aktivitet forbundet med alle mulige missense mutasjoner i TP53 koding sekvens24. Endelig, sjansen for å kombinere tunable arrangører for P53 allel uttrykk med isogenic gjær stammer ulik for RE og/eller reporter genet har ført til utviklingen av en data matrise som genererer en raffinert klassifisering av kreft-assosiert og germline mutant P53 alleler25,26,27.

Fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, brukes til å måle den transcriptional aktiviteten til P53-proteinet. Men uttrykket av Wild-type P53 i gjær S. cerevisiae28 og Schizosaccharomyces pombe29 kan forårsake vekst retardasjon, som har vært forbundet med celle syklus arrest28,30 eller celle død31. I begge tilfeller, gjær veksthemming utløses av høy P53 uttrykk og har vært korrelert med potensielle transcriptional modulering av endogene gjær gener involvert i cellevekst. Støtter denne hypotesen, tap-of-Function mutant P53 R273H ikke forstyrrer gjær cellevekst når uttrykt på lignende nivåer som vill-type P5332. Omvendt, uttrykket i gjær av giftige mutant P53 V122A (kjent for høyere transcriptional aktivitet i forhold til vill-type P53) forårsaket en sterkere veksthemmende effekt enn vill-type P5332.

I tillegg ble det demonstrert at menneskelige MDM2 var i stand til å hemme den menneskelige P53 transcriptional aktivitet i gjær, fremme sin ubiqitinering og påfølgende degradering33. Følgelig, evne til menneskelig MDM2 og MDMX å hemme P53-indusert gjær veksthemming ble demonstrert32,34. I en ekstra studie ble en sammenheng mellom P53 transcriptional aktivitet og utgangen uttrykks nivåer etablert, med identifisering av en antatte P53 RE oppstrøms på ACT1 genet i gjær32. Konsekvent, utgangen uttrykk ble forsterket av vill-type P53 og enda mer av P53 V122A, men ikke av mutant P53 R273H. Omvendt, utgangen uttrykk ved P53 redusert i co-tilstedeværelsen av P53-hemmere MDM2, MDMX, eller pifithrin-α (en liten-molekyl hemmer av P53 transcriptional aktivitet), i samsvar med resultater basert på gjær-vekst analysen. Viktigst, disse resultatene etablerte en sammenheng mellom P53-indusert veksthemming og graden av sin aktivitet i gjær, som også har blitt utnyttet til å identifisere og studere små molekyler modulerende P53 funksjoner28,34 , i 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bygging av ADE2 eller LUC1 reporter gjær stammer som inneholder en bestemt RE (YAFM-RE eller yLFM-re)

  1. Strek en yAFM-ICORE eller yLFM-ICORE belastning12,14 (ICORE = I, ISce-I endonuclease under GAL1 promoter; CO = Counter valgbar URA3; RE = reporter KanMX4 overdragelse kanamycin motstand; Tabell 1) fra en 15% glyserol aksjer lagret ved-80 ° c på en YPDA agar plate (tabell 2). La det vokse for 2-3 dager ved 30 ° c.
  2. Ta en gjær koloni fra den friske platen (ikke mer enn 3 uker gammel) og legg den i en liten kolbe som inneholder 5 mL YPDA (tabell 2). Ruge ved 30 ° c over natten, risting ved 150-200 rpm.
  3. Neste dag, for å fjerne alle spor av druesukker, pellet cellene i 2 min ved 3 000 x g og forkaste supernatanten ved inversjon av røret.
    Merk: Utfør alle centrifugations i denne protokollen ved romtemperatur (RT).
  4. Resuspend celle pellet i 30-50 mL pre-varmet CM (komplett Media) som inneholder galaktose (tabell 2) og ruge for 4 timer ved 30 ° c, risting ved 150-200 RPM (nødvendig for induksjon av i-SceI).
  5. Sentrifuger cellene i 2 min ved 3 000 x g og kast supernatanten ved inversjon av røret.
  6. Resuspend celle pellet i 30-50 mL sterilt vann. Gjenta trinn 1,5.
  7. Resuspend celle pellet i 10 mL sterilt vann. Gjenta trinn 1,5.
  8. Resuspend celle pellet i 5 mL sterilt LiAcTE (tabell 3), en ioniske løsning som favoriserer DNA-opptak. Gjenta trinn 1,5.
  9. Resuspend celle pellet i 250, μL av sterile LiAcTE og Overfør cellene til et 1,5 mL rør. Gjenta trinn 1,5 og resuspend celle pellet i 300-500 μL av sterile LiAcTE.
  10. Under vasken, denaturere en 10 mg/mL løsning av laks sperm DNA carrier i 10 min ved 100 ° c og chill umiddelbart på isen for å opprettholde den som enkelt-strandet DNA.
  11. I et separat 1,5 mL rør, tilsett 500 picomoles av den ønskede oligonukleotid (tabell 3), 5 μL av den kokte laksen SPERM carrier DNA, 300 μL av STERIL LiAcTE Peg (tabell 3), og 50 μL av gjær celle suspensjon (fra trinn 1,9).
  12. Vortex rørene i 10 s for å blande og ruge i 30 min ved 30 ° c, risting ved 150-200 rpm. Plasser 1,5 mL rør på siden for å favorisere risting.
  13. Heat sjokk gjær cellene i 15 min ved 42 ° c i en varme blokk, deretter sentrifuger cellene for 20 s ved 10 000 x g. Fjern supernatanten og resuspend cellene i 1 mL sterilt vann.
  14. Spre 100 μL av celle fjæringen på YPDA agar plate og ruge (opp ned) for 1 dag ved 30 ° c. For å sikre godt adskilte kolonier er innhentet, også spre 100 μL av en 1:10 fortynning.
  15. Neste dag, kopi plate ved hjelp av sterile Velvets på CM agar plate som inneholder druesukker og 5-FOA (tabell 2). Vurdere en annen kopi plate på en ny plate Hvis mange celler er overført (dvs. noen vekst av URA3 celler).
  16. Tre dager senere, kopi plate på ikke-selektiv YPDA og YPDA inneholder G418 (en aminoglykosid antibiotika lik kanamycin) agar plater (tabell 2), merking hver plate for å lette deres påfølgende sammenligning. Ruge platene over natten ved 30 ° c.
  17. Neste dag, identifisere kandidat reporteren stammer fra kolonier som er G418-sensitive, men vokser på YPDA plater (f. eks yLFM-eller yAFM-RE kolonier). Stripe de identifiserte koloniene (3-6 kolonier) på en ny YPDA plate for å få enkelt koloni isolerer og la dem vokse i 2 dager ved 30 ° c.
  18. Patch enkelt gjær kolonier på en YPDA plate for å isolere koloniene for videre analyser. Etter 24 h ved 30 ° c, teste dem ved kopi plating på en YPGA agar plate (tabell 2) som hindrer vekst av Petite mutanter (dvs. respiratoriske-mangelfull mutanter). På samme tid, kopi plate på en ny YPDA agar plate.
  19. Test riktig patcher (dvs. vekst på YPDA og YPGA agar plater; 1-3 kolonier) fra trinn 1,18 for tilstedeværelsen av riktig oligonukleotid integrering av kolonien PCR. Sett sammen en reaksjons miks ved å legge til 5 μL av 10x PCR-buffer (1,5 mM MgCl2), 2 μL av 10 Picomoles/μL-primere (tabell 3), 4 μL av 2,5 mm dNTPs, 0,25 μL av 5 U/μL Taq-polymerase og vann til et endelig volum på 50 μL. Multipliser reaksjonsblandingen for antall gjær kolonier som må undersøkes og alikvot 50 μL i hvert PCR-rør. Ved hjelp av en pipette, legge til en svært liten mengde gjærceller fra YPDA agar plate i en enkelt PCR reaksjon mix.
  20. Utfør PCR-reaksjonen med følgende program: 94 ° c i 8 min etterfulgt av 35 sykluser med denaturering i 1 min ved 94 ° c, primere annealing i 1 min ved 55 ° c, og forlengelse i 2 minutter ved 72 ° c.
  21. Etter at reaksjonen er fullført, kan du laste inn en alikvot av PCR-reaksjonen (omtrent en tiendedel av volumet) på en agarose gel for å kontrollere riktig størrelse (~ 500 BP).
  22. Sekvens av PCR-produktet etter rensing med en kommersiell Kit for å bekrefte integreringen av ønsket RE sekvensen bruker samme grunning av trinn 1,19.
  23. Etter validering av riktig rekkefølge, gjør en 15% glyserol lager av yAFM-RE eller yLFM-RE belastning kultur (i YPDA) og lagre det på-80 ° c.

2. evaluering av P53 protein transactivation evne ved hjelp av kvalitativ farge-baserte ADE2 gjær analysen

  1. Gjenta trinn 1,1 og 1,2 ved hjelp av yAFM-RE-belastningen (tabell 1).
  2. Dagen etter, fortynne celle kulturen (1:10) i 30-50 mL pre-varmet YPDA og fortsette å ruge ved 30 ° c ved risting til OD600nm når 0.8-1,0 (~ 2 h).
  3. Gjenta trinn 1.5-1.10.
  4. I en egen 1,5 mL tube, tilsett 300-500 ng av gjær P53 (eller kontroll) uttrykk vektor (Tabell 4), 5 μL av kokt laks sperm DNA carrier, 300 μL av STERIL LiAcTE Peg, og 50 μL av gjær celle suspensjon.
  5. Gjenta trinn 1,12 og 1,13, men resuspend celle pellet i 300 μL av sterilt vann.
  6. Spre 100 μL av celle fjæringen på syntetisk selektiv (for P53 uttrykk eller kontroll vektor) plater som inneholder druesukker som en karbon kilde og høy mengde adenine (tabell 2), deretter ruge (opp ned) ved 30 ° c for 2-3 dager.
  7. Strek enkelt gjær transformant kolonier (2-6 striper per plate) på en ny selektiv plate og la dem vokse over natten ved 30 ° c.
  8. Dagen etter, ved hjelp av sterile Velvets kopi plate på nye selektive plater som gir mulighet for vurdering av fargen fenotype (dvs. plater som inneholder druesukker som karbon kilde, men begrenser mengden av adenine; Tabell 2). Ruge platene opp ned ved 30 ° c i 3 dager. Alternativt, for å evaluere temperatur følsomhet på P53 protein, ruge ved tre forskjellige temperaturer i 3 dager: 24 ° c, 30 ° c og 37 ° c.
    Merk: samme strek kan være kopi belagt flere ganger.
  9. For å evaluere P53 protein transactivation evne, sjekk farge-baserte fenotype av gjær kolonier og sammenligne P53 protein fenotype med hensyn til P53 vill-type og tomme vektor fenotyper.

3. evaluering av P53 protein transactivation evne ved hjelp av kvantitative luminescence basert LUC1 gjær analysen

  1. Transformer gjærceller med P53 (eller kontroll) uttrykk vektorer (Tabell 4) ved hjelp av LiAc basert metode beskrevet i protokoll 2. Bruk yLFM-RE-belastning (tabell 1).
  2. Patch enkelt transformants på en ny selektiv plate med den høye mengden av adenine som inneholder glukose som karbon kilde og la dem vokse ved 30 ° c over natten. For hver transformasjon type, gjør 5-7 forskjellige patcher.
  3. Etter over natten vekst, resuspend en liten mengde gjærceller ved hjelp av en steril tannpirker eller pipette spissen fra platen i syntetisk selektivt medium som inneholder druesukker eller raffinose som karbon kilde (200 μL endelige volum i en gjennomsiktig 96 brønn plate, med en rund eller flat bunn). Hvis eksperimentet krever induserbart P53-uttrykk, legger du til galaktose i raffinose medium for å modulere nivået for induksjon (tabell 2).
    Merk: disse celle suspensjoner bør ha en OD600nm på ca 0,4 og ikke høyere enn 1.
  4. Mål absorbansen av hver brønn på OD600nm etter induserbart P53 uttrykk (4-8 h ved 30 ° c med 150-200 RPM risting) ved hjelp av en multilabel plate leser. Kontroller at celle fjæringen er homogen ved å blande hver brønn med en flerkanals pipette.
  5. Overfør 10-20 μL av celle fjæring fra den gjennomsiktige 96 brønn platen til en hvit 384 (eller 96) brønn plate og bland med et lik volum (10-20 μL) av lyseringsbuffer. Ruge for 10-15 min ved RT på en shaker (150-200 RPM) for å oppnå permeabilization av cellen til luciferase substrat.
  6. Tilsett 10-20 μL av Firefly-luciferase substrat og mål Lysenhetene (LU) med en flerledds plate leser.
  7. For å bestemme P53 protein transactivation evne, normalisere LUs av hver brønn til tilsvarende OD600nm (relativ lys enhet, RLU). Beregn gjennomsnittlig RLU og standardavvik fra 3-4 flekker av gjær transformant kolonier.
  8. Sammenlign P53 protein transactivation data med hensyn til P53 vill-type og tomme vektor, enten ved å trekke verdiene innhentet med den tomme vektoren eller ved å dele av verdiene innhentet med den tomme vektoren (dvs. databehandling fold av induksjon).
    Merk: P53 transactivation aktivitet kan også evalueres ved hjelp av samme eksperimentelle oppsett i nærvær av P53-samspill proteiner (dvs. MDM2 og MDMX) og/eller inkludert behandling.

4. evaluering av P53 protein veksthemming bruker gjær fenotypiske analysen

  1. Transformer gjærceller med P53/MDM2/MDMX (eller kontroll) uttrykks vektorer (Tabell 4) ved hjelp av den LiAc-baserte metoden som er beskrevet i avsnitt 2. Bruk CG379-stammen (tabell 1) og spre gjær transformants på minimale selektive plater (tabell 2).
  2. Grow forvandlet celler i minimal selektiv medium (tabell 2) til ca 1 OD600nm.
  3. Fortynne gjærceller til 0,05 OD600nm i selektiv induksjon medium (tabell 2), og eventuelt legge til et valgt lite molekyl til riktig konsentrasjon (eller løsemiddel bare) for å teste sin effekt i reaktivere mutant P53 eller i hemme MDM2- /MDMX-P53 interaksjoner.
  4. Ruge celler ved 30 ° c under kontinuerlig orbital risting (200 RPM) for ca 42 h (tid som kreves av negativ kontroll gjær å nå midten av loggen fase, ca 0,45 OD600nm).
  5. Spot 100 μL alikvoter av gjær cellekulturer på minimale selektive plater (tabell 2).
  6. Ruge for 2 dager ved 30 ° c.
  7. Måle gjær vekst ved å telle antall kolonier innhentet i 100 μL kultur dråper (koloni forming enhet, CFU teller). For eksempel beregne mutant reaktivere effekten av forbindelser med tanke på veksten av vill-type P53 uttrykke gjær som maksimal mulig effekt (satt til 100%), mens veksten av celler som uttrykker mutant P53 (men eksponert for løsemiddel kontroll) representerer null nivået for reaktivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Byggingen av ADE2 eller LUC1 reporter gjær stammer

Dendelitto perfettoapproach12,14,15,16 er blitt tilpasset for å muliggjøre bygging av P53 reporter gjær stammer (figur 1B). Metoden sysselsetter enkelt-eller dobbel-strandet oligonukleotider inneholder, på begge ender, minst 30 nukleotider homologe til den valgte geometrisk punkt for integrering. Nærmere bestemt tilsvarer homologi sekvenser flankerer stedet for integrering av dobbel markør kassett ICORE, som inneholder KlURA3 og kanMX4 (reporter Gene gir motstand mot Geneticin, G418) tidligere posisjonert på den ønskede målområdet15,16. Denne kassetten inneholder også gjær I-SceI endonuclease koding sekvens, under induserbart GAL1 arrangøren og dens beslektet målområdet. Derfor, en bryter i galaktose som inneholder medium rett før transformasjonen av gjærceller med ønsket sekvens resulterer i i-SceI uttrykk og påfølgende generasjon av en enkelt dobbel-strand Break (DSB) på stedet av ICORE integrering. Tilstedeværelsen av en DSB sterkt stimulerer hyppigheten av målretting hendelser, med mer enn 1 000 erstatninger oppnådd med en enkelt transformasjon.

På slutten av målrettingen og utvelgelsesprosessen basert på ervervet motstand mot 5-FOA og følsomhet for G418, kandidat kloner er bekreftet av kolonien PCR basert forsterkning av endret geometriske og sanger sekvensering å verifisere riktig integrering av ønsket P53 RE (figur 1C). På slutten av belastningen konstruksjon protokollen, som kan gjennomføres i ca en uke, et panel av isogenic reporter gjær stammer er innhentet som kan brukes til å evaluere hvordan forskjeller i sekvensen av REs påvirke transactivation kapasitet på P53 Protein.

Funksjonelt heterogen mutant P53s

I menneskelige svulster, er TP53 genet hovedsakelig påvirket av enkelt missense mutasjoner som vanligvis involverer seks store hotspot rester (R175, G245, R248, R249, R273 og R282) ligger i det sentrale DNA-bindende domene (dbd) av P53 protein. Men mer enn 2 000 enkelt P53 amino-acid erstatninger har blitt registrert, inkludert noen som er sjelden observert27. Mutant P53s kan klassifiseres som DNA kontakt eller strukturelle mutanter, avhengig av virkningene av aminosyre substitusjon på DNA-protein kontakt (f. eks, R273H) eller protein struktur (f. eks, R175H)36. Single TP53 missense mutasjoner innvirkning P53 funksjoner, genererer et bredt spekter av funksjonelt mangfold, som kan påvirke viktige kliniske funksjoner som tumor aggressivitet, kjemoterapi-motstand, og metastatisk potensial37, 38 for alle , i 39.

Konseptet som mutanter P53 er funksjonelt heterogen klart har dukket opp i de siste 15 årene gjennom en stor mengde eksperimentelle data tilgjengelig i TP53 mutasjon databaser (f. eks < P53. Free. fr//>)27. Ulike funksjonelle analyser basert på gjær og/eller pattedyr reporter systemer har blitt utviklet, fremhever de ulike egenskapene til mutanter P53s (dvs. transactivation, temperatur følsomhet, dominerende-negativt potensial, interferens med medlemmer av P53 familie og interaksjoner med andre TFs)13,24,40,41,42,43,44. Den mest omfattende funksjonell studie undersøkt mer enn 2 300 mutanter i en gjær-basert analysen av karakteriserer deres transactivation aktivitet mot åtte forskjellige P53 REs24.

Dataene bekreftet at nesten alle mutant P53s involverer hotspot rester er tap-of-funksjon (dvs. de helt mistet transactivation aktivitet). Omvendt, mutant P53s som rammet andre posisjoner i P53 protein og er generelt funnet på moderat til lav frekvens i kreft45 er delvis funksjon mutanter, som beholder noen grad av transactivation aktivitet på P53 res13, 17. et eksempel på bruk av ADE2 analysen for å studere de beskrevne P53 proteiner funksjonell heterogenitet er presentert i figur 2a. Faktisk, mens R175H er et tap-av-funksjon mutant produsere røde kolonier i hver tilstand testet, R282W viste temperatur følsomhet som var mer tydelig ved hjelp av galaktose-avhengige P53 uttrykk (dvs. den røde sektor ved 37 ° c i P21-5 ' RE belastningen i plate som inneholder lavere galaktose, som blir rosa i høyere galaktose plate). Figur 2b presenterer et sammendrag av resultatene for en utvidet panel av P53 mutanter og reporter stammer.

Eksistensen av denne P53 funksjonelle heterogenitet bedt om utforskning av om slike heterogenitet parallelle heterogenitet observert på klinisk nivå hos forsøkspersoner med TP53 germline mutasjoner. TP53 germline mutasjoner ligger til grunn det molekylære grunnlaget for en gruppe av kreft predisposisjon lidelser, inkludert de mer alvorlige Li-FRAUMENI (LFS) og Li-Fraumeni-like (LFL) syndromer, og de mindre alvorlige ikke-syndromisk predisposisjoner med (FH) eller uten (ingen FH) slektshistorie46.

Protokollen fremhevet genotype-fenotype sammenhenger ved å matche gjær analysen-baserte transactivation evner av alle TP53 germline mutant alleler med tilsvarende kliniske data fra IARC database < http://www-p53.IARC.fr/germline.html >. Tap-av-funksjon P53 mutanter har blitt funnet i mer alvorlig kreft proneness syndromer, mens delvis funksjon P53 mutanter er funnet i mindre alvorlige kreft proneness forhold. Dette indikerer at P53 gjenværende transactivation evne påvirker klinisk fenotype hos pasienter som arvet TP53 mutasjoner og utviklet kreft25,26.

Nukleotid sekvenser variasjoner innenfor res regulerer P53 transactivation potensial

Human P53 er en tetramerisk (dimer av dimers) TF. Hver P53-dimer gjenkjenner en RE bestående av 10 nukleotider (RRRCWWGYYY, R = A eller G; W = A eller T; Y = C eller T)47,48. To slike halv-steder kan enten være ved siden av eller avstand fra hverandre med opptil 13-20 nukleotider, utgjør en funksjonell P53 RE. Likevel er P53 res med en spacer karakterisert ved lavere P53 affinitet og transactivation enn P53 res uten en spacer49,50, i ulike funksjonelle analyser fra ulike systemer.

Det ble nylig demonstrert at halv-nettsteder kan rekruttere P53 tetramers som er bundet hemispecifically51, sammen med funksjonelle analyser og kromatin immunutfelling studier, disse funnene tyder på at P53 kan også opptre på ikke-kanoniske res, bestående av halv-nettsteder og tre kvartal48,52. Videre er det faktum at full konsensus P53 RE motivet er svært fordervet (RRRCWWGYYY)2 prefigures muligheten for at enkelte res kan vesentlig variere i rekkefølge og bindende affinitet. Tatt i betraktning at hundrevis av P53 mål gener har blitt identifisert i den menneskelige Genova41,48, nesten alle P53 res viste ikke-identiske sekvens mellom hverandre. Videre har det vært hypotetisk gjennomsnitt at REs med en distinkt DNA bindende affinitet er valgt i arrangører av P53 mål gener involvert i celle syklus arrest eller apoptose53.

Analysen i gjær av mange varianter av P53 RE på en konstant genomisk beliggenhet etablerte virkningen av nukleotid varianter, spacer og organisering av RE halv-steder på transactivation kapasitet49. Det selv førte til oppdagelsen av polymorfe P53 res med de to alleler markert ulik i respons av en tilknyttet promoter å P5314,54,55. Nylig, informasjon som stammer fra P53 RE sekvens funksjoner og gjær-baserte transactivation potensialet har blitt kodet i P53 Retriever, et mønster søk algoritme som er i stand til å lokalisere og rangere både kanoniske og ikke-kanoniske REs, i henhold til deres spådd transactivation potensialer gjennom hele menneskelige Genova52.

Som et eksempel på bruk av analysen for å studere sekvens-spesifikke P53 transactivation potensial, presenteres her er en sammenligning mellom menneskelig vill-type P53 og evolusjonære fjernt P53 protein fra Caenorhabditis elegans (Figur 3). Disse resultatene er en oppfølging av en fersk studie der evolusjonære forskjellene av transactivation spesifisitet blant P53 proteiner ble utforsket56. Isogenic yLFM-RE reporter stammer ble utviklet som beskrevet i protokollen. Nærmere bestemt ble Cep-1 P53 RE avledet fra ced13 Gene57, og fire varianter (v1-v4) ble sammenlignet (figur 3a). RE-variantene ble konstruert for å undersøke virkningen av å variere lengden på avstandsstykket som skiller de to decameric motivene (som i ced13, er av 28 nukleotider) og å undersøke endringer i nukleotider flankerer CWWG kjerne motiv (som i ced13, er A/T rik; mens i den høyeste affinitet menneskelige P53 REs, er G/C rike)58. Resultatene viser tydelig hvordan Cep1 og menneskelig P53 avvike i form av transactivation spesifisitet. Faktisk, mens menneskelige P53-mediert transactivation er sterkt hemmet av tilstedeværelsen av en spacer (figur 3b), er Cep-1 aktivitet hemmet av fjerning av spacer (figur 3c). Videre er Cep-1-mediert transactivation avskaffet når RE er modifisert fra A/T-til G/C-rik. Verken menneskelig P53 eller Cep-1 kan transactivate fra en enkelt decamer avledet fra ced13 RE.

Søker etter små molekyl disruptors av P53-MDM2/MDMX interaksjoner og reactivators av mutant P53 aktivitet

Den etablerte sammenhengen mellom veksthemmende effekten av menneskelig P53 og graden av sin aktivitet i gjær førte til en forenklet screening analysen basert på målinger av gjær cellevekst å analysere effekten av forstyrrende faktorer på P53 aktivitet (Figur 4 ). Effektiviteten av gjær fenotypiske analysen til skjermen for potensielle anticancer agenter har blitt demonstrert i flere verker. Bruke gjærceller co-uttrykker P53 og hemmere MDM2 og/eller MDMX, nye disruptors av disse interaksjoner ble identifisert ved deres evne til å hemme den negative effekten av MDMs på P53, og dermed reetablere vill-type P53-indusert gjær veksthemming ( Figur 4a). Spesielt denne analysen førte til oppdagelsen av 1) pyranoxanthone 1 som den første P53-MDM2 interaksjon inhibitor med et xanthone stillas34 og 2) oxazoloisoindolinone hemmere av P53-MDM2 interaksjon59. I tillegg, med denne analysen, ble α-mangostin og gambogic acid beskrevet for første gang som potensielle hemmere av P53-MDM2 interaksjon30.

Senere, den samme analysen demonstrerte at prenylation av kalkoner forbedret deres evne til å forstyrre P53-MDM2 interaksjon60. Interessant, dette gjær analysen førte også til oppdagelsen av to hemmere av P53-MDM2/MDMX interaksjoner: den tryptophanol-avledet oxazolopiperidone Laktam OXAZ-161 og tryptophanol-AVLEDET oxazoloisoindolinone DIMP53-162.

Den reduserte effekten av tap-of-Function mutant P53 på gjær cellevekst har også blitt utforsket til skjermen for mutant P53-reaktivere narkotika, karakterisert ved evnen til å gjenopprette vill-type-lignende veksthemmende aktivitet til mutant P53 (figur 4b). Med denne gjær analysen, en reactivator av mutant P53 R280K, den enantiopure tryptophanol-avledet oxazoloisoindolinone SLMP53-163, ble identifisert. Figur 4c, viserD representative resultater oppnådd i gjær med uttrykk for P53 eller behandlinger med HEMMER av P53-MDM2 interaksjon Nutlin-3a eller med REACTIVATOR av P53 mutant Y220C PhiKan083.

Validering av molekylær virkningsmekanismen av disse forbindelsene som P53-aktivering agenter så vel som deres antitumor aktivitet, både i menneskets tumor cellelinjer34,60,61,62,63 og dyremodeller62,63, vitner om til det store potensialet i gjær fenotypiske analysen i stoffet funnet.

Figure 1
Figur 1 : Funksjoner av gjær basert P53 transactivation analyser og arbeidsflyt for bygging av P53 reporter gjær stammer. (A) den enkle Genova manipulasjon og kontrollert svangerskap utenfor livmoren uttrykk gjengir gjær beslektet til en "in vivo test tube", der flere variabler relevant å undersøke P53 transactivation funksjoner er omhyggelig utforsket. Disse variablene inkluderer nivåene av uttrykk for en vill-type eller mutant P53 protein, sekvensen av RE, og type reporter genet [kvalitativ/semi-kvantitative (f. eks ADE2 og LACZ) eller kvantitativ (f. eks, LUC1)]. Den konsensus RE sekvensen er svært utartet (RE = RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R = purine; W = A/T; Y = pyrimidin; CWWG = kjerne sekvens, n = 0-13 bps spacer). Antall uoverensstemmelser med hensyn til konsensus, CORE sekvensen, og antall Base pair avstandsstykker vil påvirke transactivation aktivitet. Dette panelet er endret fra en tidligere publikasjon64. (B) ordningen med delitto perfetto tilnærming for å innføre en ønsket P53 re oppstrøms av minimal promoter kjører ADE2 eller LUC1 reporter Gene Expression. Protokollen ble tilpasset fra tidligere publikasjoner12,15,16. (C) eksempel på resultatene av GJÆR koloni PCR forsterkning av regionen rundt oligo re integrering området. Bildet av elektroforese presenterer forsterkningen resultatet av to antatte positive kolonier (URA3 minus og G418 følsom) med tilsvarende PCR negativ kontroll ved siden av 1 kb DNA stigen (Promega). Den ~ 500 NT bandet forventet å bruke primere beskrevet i tabell 3 kan være sekvensert for å bekrefte riktig promoter redigering, som vist i elektroferogrammet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : P53 proteiner viser re-spesifikke og temperaturfølsomme transactivation potensiale. Wild-type P53 og indikerte TP53 missense mutasjoner ble testet ved hjelp av kvalitativ farge-baserte reporter analysen i gjær og utnytte reporteren stammer som Harbor ulike P53 res kontrollere ADE2 genuttrykk. (A) et eksempel på kolonien farge fenotype for P53 vill-type, R175H og R282W med Puma (BBC3) og P21-5 ' res ved 30 ° c og 37 ° c vises. Moderat (0,008% galaktose) og høy (0,12% galaktose) P53 uttrykk sammenlignes. (B) resultater oppnådd med et utvidet sett med P53 mutanter og gjær reporter stammer undersøkt for P53-avhengige koloni farge fenotype ved tre temperaturer (24 ° c, 30 ° c og 37 ° c). Resultatene er eksempler på funksjonell heterogenitet av mutant P53 alleler og er oppsummert i en tabellformat. For eksempel, R175H er en tap-av-funksjonen mutant, mens G199H er vill-type P53-like. K139E og R282W beholder delvis funksjon og viser henholdsvis kald følsomhet og varme følsomhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Human P53 og kreditert Ortholog Cep-1 utstillingen svært skilt transactivation spesifisitet. (A) sekvenser av: Human P53 re konsensus sekvens, Cep-1 P53 re avledet fra ced13 genet, og fire varianter (v1-v4) som ble testet i funksjonelle analyser. (B) Transactivation ble målt etter inducing menneskelige P53 uttrykk for 8 h bruker tre forskjellige karbon kilder for å oppnå lave, moderate og høye uttrykk (0,008%, 0,032%, 0,12% galaktose lagt til selektiv medium som inneholder 2% raffinose). Resultatene uttrykkes som gjennomsnittlige relative lys enheter (RLU) og standard feil av fire replikerer. Reporter aktivitet for celle transformert med tomme uttrykk vektor ble trukket ut. (C) Transactivation spesifisitet av Cep1 målt i (B). For begge proteinene var transactivation nivåer proporsjonal med mengden av galaktose. De høyere lys enheter målt når menneskelige P53 uttrykkes kan være avhengig av ulike nivåer av protein mengder produsert, på grunn av forskjell i protein lengde og potensielt også i Codon bruk. De to proteinene er preget av ulike transactivation spesifisitet mot de ulike REs testet og denne egenskapen er ikke påvirket av mulige forskjeller i relative protein beløp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Små molekyl aktivator av P53 identifisert ved hjelp av gjær fenotypiske analysen. (A) gjærceller co-uttrykker menneskelig vill-type P53 og MDM2 eller MDMX har blitt brukt til å søke etter hemmere av P53-MDM2 og P53-MDMX interaksjoner. I dette systemet, interaksjon hemmere gjenopprette P53-indusert gjær veksthemming i gjærceller co-uttrykker P53 og MDM2 eller MDMX. Denne tilnærmingen har tillatt identifisering av hemmere av P53-MDM2 samhandling og identifisering av doble hemmere av P53-MDM2 og P53-MDMX interaksjoner. (B) gjærceller som uttrykker menneskelige mutant P53 har blitt brukt til å søke etter mutant P53 reactivators og er i stand til å gjenopprette vill-type-lignende P53-indusert gjær veksthemming i mutant P53-uttrykker gjærceller. (C) representative bilder av platen flekk analysen viser virkningen av vill-type P53 eller mutant Y220C på gjær koloni vekst i forhold til den tomme vektoren (se trinn 4,5). (D) kvantitative resultater av vekst analysen: 10 μM Nutlin-3a gjenoppretter P53-indusert gjær veksthemming i cellene co-uttrykker MDM2; 50 μM PhiKan083 gjenoppretter vill-type-lignende P53-indusert gjær veksthemming til mutant P53 Y220C. Begge effektene er plottet i forhold til gjær veksthemmende effekten av vill-type P53, som ble satt som en. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Stamme navn og genotype Spesifikk bruk Protokollnummer
yAFM-ICORE: MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2 Den brukes til bygging av yAFM-re-stammen (MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: ADE2) som utnyttes i den kvalitative, farge-baserte ADE2-analysen. Protokoller 1, 2
yLFM-ICORE: MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; ICORE::p Cyc1:: LUC1 Den brukes til bygging av yLFM-re-stammen (MATa leu2-3112 trp1-1 his3-11, 15 can1-100; ura3-1; RE::p Cyc1:: LUC1) som utnyttes i den kvantitative luminescence-baserte LUC1-analysen. Protokoller 1, 3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [Kil-O] Den brukes for fenotypiske vekst analysen. Protokoll 4

Tabell 1: Gjær stammer.

Medienavn og-oppskrift Spesifikk bruk Protokollnummer
YPDA (2% gjærekstrakt, 2% peptone, 2% druesukker, 200 mg/L adenine) + 2% agar YPDA uten agar er sterilisert fortrinnsvis ved filtrering. YPDA + agar er sterilisert av autoklavering; Det er mulig å utelate druesukker fra oppskriften og tilsett druesukker fra en 20% filter sterilisert løsning i vann før helle platene. Protokoller 1-4
Cm [0,17% av gjær nitrogen base uten AA og ammonium sulfat, 0,5% ammonium sulfat, 5% (volum/volum, v/v) ikke-essensielle aminosyre-løsning, 20 mg/l histidin, 20 mg/l tryptofan, 20 mg/l uracil, 30 mg/l lysin, 100 mg/l leucine, 200 mg/l adenine] + 2% galaktose Mediene steriliseres ved filtrering. Følgende sterile lager løsninger er utarbeidet i vann (med unntak av uracil, som er oppløst i 0,1 M NaOH) ved filtrering: ikke-essensielle aminosyre-løsning (0,04% arginin, 0,04% metionin, 0,06% isoleucin, 0,1% fenylalanin, 0,2% Glutaminsyre syre, 0,2% aspartic syre, 0,3% Valin, 0,4% threonin, 0,8% Serine), 1% histidin, 1% tryptofan, 1% uracil, 1% lysin, 1% leucine, 0,5% adenine, 20% galaktose. Adenine lagerløsning må ikke oppbevares i kjøleskap på grunn av dannelse og sedimentering av krystaller. Tryptofan lagerløsning må lagres i mørket. Protokoll 1
Cm (se ovenfor) + 2% druesukker + 1G/L 5-Foa + 2% agar Mediene (som inneholder gjær nitrogen base uten AA og ammonium sulfat, ammonium sulfat og agar) er sterilisert med autoklavering. De andre komponentene er lagt til etter autoklavering for å bevare varme labilt ingredienser; 5-FOA pulver kan legges direkte i Media når den er avkjølt til ca 55 ° c. Protokoll 1
YPDA + 400 μg/ml G418 + 2% agar G418 må tilsettes etter autoklavering når mediet er avkjølt til ca. 55 ° c. Hvis du starter fra pulver, kan en 50 mg/mL G418 lagerløsning fremstilles i vann og steriliseres ved filtrering. Protokoll 1
YPGA [2% gjærekstrakt, 2% peptone, 2% glyserol (v/v), 200 mg/L adenine] + 2% agar Mediene er sterilisert med autoklavering. Protokoll 1
Syntetisk selektiv plate: [0,17% av gjær nitrogen base uten AA og ammonium sulfat, 0,5% ammonium sulfat, 5% (v/v) ikke-essensielle aminosyre løsning (0,04% arginine, 0,04% metionin, 0,06% isoleucin, 0,1% fenylalanin, 0,2% Glutaminsyre syre, 0,2% aspartic syre, 0,3% Valin, 0,4% threonin, 0,8% Serine), 20 mg/L histidin, 20 mg/L uracile, 20 mg/L tryptofan (avhengig av vektor merkings markør), 30 mg/L lysin, 100 mg/mL leucine (avhengig av vektor merkings markør), 5 mg/L eller 200 mg/L adenine] + 2% druesukker + 2% agar Mediene (som inneholder gjær nitrogen base uten AA og ammonium sulfat, ammonium sulfat og agar) er sterilisert med autoklavering. De andre komponentene er lagt til etter autoklavering for å bevare varme labilt ingredienser. Når du bruker pLS-og pLSG-baserte vektorer forberede plater uten leucine. Når du bruker pTS-og pTSG-baserte vektorer, klargjør du plater uten tryptofan. Protokoller 2-3
Syntetiske, selektive medier: [0,17 til% gjær nitrogen base uten AA og ammonium sulfat, 0,5% ammonium sulfat, 5% (v/v) ikke-essensielle amino-acid løsning (0,04% arginine, 0,04% metionin, 0,06% isoleucin, 0,1% fenylalanin, 0,2% Glutaminsyre syre, 0,2% aspartic syre, 0,3% Valin, 0,4% threonin, 0,8% Serine), 20 mg/L histidin, 20 mg/L uracile, 20 mg/L tryptofan (avhengig av vektor merkings markør), 30 mg/L lysin, 100 mg/mL leucine (avhengig av valg markør for vektor), 200 mg/L adenine] + 2% druesukker eller raffinose + 0-2% galaktose  Mediene steriliseres ved filtrering. Ved bruk av pLS-eller pTS-baserte vektorer i legemiddel behandlingen, Forbered media uten leucine eller tryptofan, henholdsvis men inneholder 2% druesukker. Når du bruker pLSG-eller pTSG-basert vektor i induserbart P53 uttrykk med eller uten legemiddelbehandling forberede medier uten leucine eller tryptofan, henholdsvis men inneholder 2% raffinose og variabel mengde galaktose til modulere P53 uttrykk. Omfanget av P53 induksjon kan også bli modulert ved å variere tiden for inkubasjons. Protokoll 3
Minimale selektive plater: 2% glukose, 0,7% gjær nitrogen Base (uten aminosyrer og ammonium sulfat), 50 mg/l adenine, 50 mg/l uracil, 50 mg/l histidin, 50 mg/l tryptofan (avhengig av vektor markeringsmerke), 50 mg/l leucine (avhengig av vektor valg markør), 2% agar Mediet er sterilisert med autoklavering. Når du bruker pLS89-baserte vektorer forberede medium uten tryptofan. Bruk pLS89-Empty vektor (ikke uttrykker noe protein) som negativ kontroll. Når du bruker pLS89-baserte og pGADT7-MDM2 vektorer (co-uttrykk for P53 og MDM2), forberede medium uten leucine og tryptofan. Bruk pLS89-Empty og pGADT7 (begge ikke uttrykker noe protein) som negative kontroller. Når du bruker pLS76-baserte vektorer forberede medium uten leucine. Bruk pRS315 vektor (ikke uttrykker noe protein) som negativ kontroll. Protokoll 4
Minimal selektiv medium: som minimal selektive plater, men uten agar Mediet steriliseres ved filtrering. Protokoll 4
Selektiv induksjon medium: som minimal selektiv medium, men inneholder 2% galaktose i stedet for glukose Mediet steriliseres ved filtrering. Protokoll 4

Tabell 2: gjær medier.

Løsningsnavn og oppskrift eller primer navn og sekvens Spesifikke funksjoner og bruk Protokollnummer
LiAc/te: 10 mm Tris-HCL, pH 8,0, med 1 mm EDTA og 0,1 m litium acetate Følgende sterile lager løsninger i vann fremstilles ved autoklavering: 1M Lithium acetate pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE buffer 10X). Protokoller 1-4
Peg/LiAc/te: 40% polyetylen GLYKOL (PEG) i 10 mm Tris-HCL, pH 8,0, med 1 mm EDTA og 0,1 M litium acetate Følgende sterile lager løsninger i vann er utarbeidet av autoklavering: 1 M litium acetate pH 7,5, 1 M Tris-HCl/0,1 M EDTA pH 8,0 (TE buffer 10X), 50% PEG (molekylvekt ~ 3350). Protokoller 1-4
Homologi haler for RE oligonukleotider:
5 '-gcggaattgactttttcttgaataatacat-RE-gcagatccgccaggcgtgtatatagcgtgg-3 '
Forutsatt er sekvensen av homologi haler, som tilsvarer den kromosom sekvenser flankerer den integrerte ICORE kassetten; RE = RE sekvens. Protokoll 1
Primere: Ade2 FW: 5 '-AAGTTGCCTAGTTTCATGAA-3 ';
Ade2 RV: 5 '-GGAGCCATTAACGTGGTCAT-3 ';
Luc1-RV: 5 '-CATAGCTTCTGCCAACCGAA-3 '
For yAFM-RE belastning (PCR og sekvensering) kombinere Ade2 FW med Ade2 RV primer. For yLFM-RE belastning (PCR og sekvensering) kombinere Ade2 FW med Luc1-RV primer. Protokoll 1

Tabell 3: løsninger og oligonukleotider.

Typer av vektorer Positive og negative kontroller Protokollnummer
P53 (eller kontroll) vektorer.
pLS-eller pLSG-basert: P53 protein uttrykk under konstituerende ADH1 promoter eller galaktose induserbart GAL1 promoter, henholdsvis (LEU2 som markeringsmerke).
pTS-eller pTSG-basert: P53 protein uttrykk under konstituerende ADH1 promoter eller galaktose induserbart GAL1 promoter, henholdsvis (TRP1 som markeringsmerke)
pLS-og pLSG-basert: Bruk som positiv kontroll på pLS76 og pLSG-P53-vektorer (som uttrykker vill type P53), henholdsvis; Bruk som negativ kontroll pRS315 vektor (ikke uttrykker noe protein).
pTS-og pTSG-basert: Bruk som positiv kontroll på pTS76 og pTSG-P53-vektorer (som uttrykker vill type P53), henholdsvis; Bruk som negativ kontroll pRS314 vektor (ikke uttrykker noe protein).
Protokoll 2, 3
P53 og MDM2 (eller kontroll) vektorer.
pLS89-based: Wild type P53 protein uttrykk under galaktose induserbart GAL1 promoter (TRP1 som markeringsmerke).
pLS76-based: mutant P53 protein uttrykk under konstituerende ADH1 promoter (LEU2 som markeringsmerke).
pGADT7-based: MDM2 protein uttrykk under konstituerende ADH1 promoter (LEU2 som valg markør)
pLS89-basert: Bruk som positiv kontroll på pLS89-P53 vektor (uttrykker vill type P53); Bruk som negativ kontroll pLS89-Empty (ikke uttrykker noe protein).
pLS76-basert: Bruk som positiv kontroll pLS76-mutant P53 vektor (uttrykker mutant P53); Bruk som negativ kontroll pRS315 vektor (ikke uttrykker noe protein).
pGADT7-basert: Bruk som positiv kontroll på pGADT7-MDM2 vektor (uttrykker vill type MDM2); Bruk som negativ kontroll pGADT7 vektor (ikke uttrykker noe protein).
Protokoll 4

Tabell 4: gjær uttrykk vektorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gjær-baserte analyser har vist seg nyttig å undersøke ulike aspekter av P53 protein funksjoner. Disse analysene er spesielt følsomme for å evaluere P53 transactivation potensiale mot varianter av RE målområder, inkludert evaluering av funksjonell polymorfismer. Bruk av farge journalister samt miniatyrisering av luciferase analysen resultere i kostnadseffektiv og relativt skalerbar analyser. Dessuten er veksten hemming testen potensielt mottagelig for å bli brukt i kjemiske biblioteket screening, automatisere kvantifisering av gjær celle levedyktighet gjennom måling av absorbansen. Mens begrenset permeabilitet på grunn av celle veggen og handling av ABC transportører har blitt betraktet som en begrensning i bruk av gjær for narkotika screening, genetiske modifikasjoner for å forbedre opptaket har blitt utviklet22,65.

Sammenlignet med pattedyr celle-baserte analyser, gjær-baserte P53 analysen kan forbedre identifisering av direkte treff, gitt at P53 er isolert fra den fantastiske kompleksiteten i kofaktorer og signalering kaskade trasé som modulere sine funksjoner i høyere Landplantenes. Gjær-baserte funksjonelle analyser har også vært delvis vellykket i overvåkingen samspillet av P53 med protein kofaktorer (nemlig MDM2 og MDMX22,32,33,34) og virkningen av små molekyler (for eksempel Nutlin-3a) på disse interaksjoner. Følsomhet og prediktiv kraft av gjær-baserte analyser for å undersøke crosstalk mellom P53 og samspill proteiner kan imidlertid være noe begrenset, avhengig av hvordan disse interaksjoner i Vivo er avhengig av post-translational modifikasjoner og arter-spesifikke signalnettverk kaskader.

Systemene som beskrives her, kan enkelt tilpasses andre TFs. Faktisk har gjær funksjonelle analyser blitt utviklet for P53-relaterte P63 og P73 proteiner42,49 samt medlemmer av NF-KB familien66,67 [eller til og med for noen homeobox og grunnleggende Helix-loop-Helix (bHLH) TFs68,69]. Human kjernefysiske reseptorer har også blitt uttrykt i gjær og vist seg å fungere som ligand-avhengige, sekvens-spesifikke TFs70. En begrensende faktor har blitt identifisert i den svake kapasiteten til noen pattedyr transactivation domene (TAD) for å samhandle med gjær basal transkripsjon maskineri8, en brist som kan overvinnes ved hjelp av chimeric konstruksjoner inkludert en aktiv heterologous tad68,69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker EU (FEDER Funds POCI/01/0145/FEDER/007728 gjennom programa Operacional faktorer de Competitividade-KONKURRER) og nasjonale midler (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia og Ministério da Educação e Ciência) under Partnerskapsavtale PT2020 UID/QUI/50006/2019 og prosjektene (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT laug: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Dette arbeidet ble støttet av Compagnia S. Paolo, Torino, Italia (prosjekt 2017,0526) og Helsedepartementet, (prosjekt 5x1000, 2015 og 2016; aktuell forskning 2016). Vi takker dypt Dr. Teresa López-Arias Montenegro (Universitetet i Trento, eksperimentelle vitenskaper undervisning laboratorier) for å få hjelp med videoopptak.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13, (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26, (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41, (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231, (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3, (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20, (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3, (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26, (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22, (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100, (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102, (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19, (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20, (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92, (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29, (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59, (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18, (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6, (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45, (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100, (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9, (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41, (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12, (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378, (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76, (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8, (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280, (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3, (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85, (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8, (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265, (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192, (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33, (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5, (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10, (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22, (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21, (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279, (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1, (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41, (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114, (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119, (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155, (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10, (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12, (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109, (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11, (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7, (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16, (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74, (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10, (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14, (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17, (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27, (8), 1875-1881 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics