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Il lievito come telaio per lo sviluppo di saggi funzionali per studiare l'Uomo P53

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Cancer Research

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Summary

Sono presentati quattro protocolli per costruire e sfruttare i ceppi di reporter del lievito Saccharomyces cerevisiae per studiare il potenziale di trassessione umano P53, gli impatti delle sue varie mutazioni associate al cancro, le proteine interagenti co-espresse e gli effetti di piccole molecole specifiche.

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Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

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Abstract

La scoperta che la nota proteina P53 mammifera può fungere da fattore di trascrizione (TF) nel lievito S. cerevisiae ha permesso lo sviluppo di diversi saggi funzionali per studiare l'impatto del sito di legame [cioè, elemento di risposta (RE)] varianti di sequenza sulla specificità di trasattivazione P53 o 2) mutazioni di TP53, co-espressi co-espressi co-espressi o piccole molecole sull'attività di trasattivazione P53. Sono state sviluppate diverse applicazioni di ricerca di base e traslazionali. Sperimentalmente, questi approcci sfruttano due grandi vantaggi del modello di lievito. Da un lato, la facilità di editing del genoma consente una rapida costruzione di sistemi qualitativi o quantitativi di reporter sfruttando ceppi isogenici che differiscono solo a livello di uno specifico P53-RE per studiare la specificità della sequenza dipendente da P53 trasattivazione. D'altra parte, la disponibilità di sistemi regolamentati per l'espressione ectopica P53 consente la valutazione della trasattivazione in una vasta gamma di espressioni proteiche. Rivisti in questa relazione sono ampiamente utilizzati sistemi che si basano sui geni dei reporter di colore, luciferase, e la crescita del lievito per illustrare i loro principali passi metodologici e per valutare criticamente il loro potere predittivo. Inoltre, l'estrema versatilità di questi approcci può essere facilmente sfruttata per studiare diversi TF tra cui P63 e P73, che sono altri membri della famiglia genica TP53.

Introduction

La trascrizione è un processo estremamente complesso che coinvolge l'organizzazione dinamica, spaziale e temporale dei fattori di trascrizione (TF) e dei cofattori per il reclutamento e la modulazione delle polimerasi dell'RNA sulle regioni della cromatina in risposta a stimoli specifici1 . La maggior parte dei TF, incluso il soppressore umano del tumore P53, riconosce specifici elementi cis-agire sotto forma di sequenze di DNA chiamate elementi di risposta (RE), che consistono in singoli (o multipli) motivi unici lunghi 6-10 nucleotidi. All'interno di questi motivi, singole posizioni possono mostrare vari gradi di variabilità2, di solito riassunti da matrici di peso posizione (PWM) o loghi3,4.

Il lievito S. cerevisiae è un sistema modello adatto per studiare diversi aspetti delle proteine umane attraverso saggi di complemento, espressione ectopica e saggi funzionali, anche quando non è presente un gene di lievito ortologo5, 6 È possibile: , 7. A causa della conservazione evolutiva dei componenti basali del sistema trascrizionale8, molti TF umani (espressi ectopicamente in cellule di lievito) possono modulare l'espressione di un gene reporter agendo attraverso promotori progettati per contengono RE appropriate. Il sistema del modello di trascrizione qui presentato per l'uomo P53 è caratterizzato da tre variabili principali i cui effetti possono essere modulati: 1) la modalità di espressione e il tipo di P53, 2) la sequenza RE che controlla la trascrizione dipendente da P53 e 3) il tipo di gene reporter (Figura 1A).

Per quanto riguarda la modalità di espressione P53, S. cerevisiae permette la scelta di promotori inducibili, repressivi o imtenziari9,10,11. In particolare, il promotore inducibile GAL1 consente basale (utilizzando raffinose come fonte di carbonio) o variabile (cambiando la quantità di galactose nei media) espressione di un TF in lievito. Infatti, l'espressione finemente regolabile rappresenta uno sviluppo critico per lo studio non solo della P53 stessa, ma anche di altre proteine familiari P5312,13.

Per quanto riguarda il tipo di RE che controlla noto all'espressione dipendente da P53, S. cerevisiae consente la costruzione di diversi ceppi di reporter in possesso di differenze uniche nella RE di interesse in un contesto altrimenti isogenico. Questo obiettivo è raggiunto utilizzando l'adattamento di un approccio di editing del genoma particolarmente versatile sviluppato in S. cerevisiae, chiamato delitto12,14,15,16.

Inoltre, diversi geni reporter (ad esempio URA3, HIS3 e ADE2) possono essere utilizzati per valutare qualitativamente e quantitativamente le attività trascrizionali dei TF umani in S. cerevisiae, ciascuno con caratteristiche specifiche che possono essere su misura per le esigenze sperimentali17,18,19,20,21. L'espressione di questi geni reporter conferisce uracil, istidina e prototrofia adenina, rispettivamente. Il reporter URA3 non consente la crescita delle cellule in presenza di 5-FOA pure, e quindi può essere controselezionato. Il sistema di reporter ADE2 ha il vantaggio che, oltre alla selezione nutrizionale, consente l'identificazione di cellule di lievito che esprimono di tipo selvaggio (cioè, funzionale su espressione ADE2) o mutanti (cioè,non funzionali su ADE2 ) P53 dal colore della colonia.

Ad esempio, le cellule di lievito che esprimono il gene ADE2 generano colonie bianche di dimensioni normali su lastre contenenti quantità limitanti di adenina (2,5-5,0 mg/L), mentre quelle che non si trascrivono male o non la trascrivono appaiono sulla stessa piastra del rosso più piccolo (o rosa) Colonie. Ciò è dovuto all'accumulo di un intermedio nel percorso biosintetico adenino (ad esempio, P-ribosylamino-imidazole, precedentemente chiamato ribotide amino-imidazole o AIR), che viene convertito per formare un pigmento rosso. Da allora il gene qualitativo del reporter ADE2 basato sul colore è stato sostituito dal quantitativo Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Più di recente, il reporter di ADE2 è stato combinato con il reporter lacz in un'analisi del doppio reporter facile da segnare, semi-quantitativa, che può essere sfruttata per sottoclassificare i mutanti P53 in base al loro livello residuo di funzionalità 23.

Reporter fluorescenti come EGFP (proteina fluorescente verde avanzata) o DsRed (Discosoma sp. proteina fluorescente rossa) sono stati utilizzati anche per la valutazione quantitativa dell'attività di trasattivazione associata a tutte le possibili mutazioni di Sequenza di codifica TP5324. Infine, la possibilità di combinare promotori regolabili per l'espressione allele P53 con ceppi di lievito isogenici diversi per il gene RE e/o reporter ha portato allo sviluppo di una matrice di dati che genera una classificazione raffinata di lieviti associati al cancro e germinale mutante P53 alleli25,26,27.

Gli approcci sopra descritti sono utilizzati per misurare l'attività trascrizionale della proteina P53. Tuttavia, l'espressione di P53 di tipo selvaggio nel lievito S. cerevisiae28 e Schizosaccharomyces pombe29 può causare ritardo della crescita, che è stato associato con l'arresto del ciclo cellulare28,30 o morte cellulare31. In entrambi i casi, l'inibizione della crescita del lievito è innescata da un'elevata espressione P53 ed è stata correlata con la potenziale modulazione trascrizionale dei geni del lievito endogeno coinvolti nella crescita cellulare. A sostegno di questa ipotesi, il mutante P53 R273H della perdita di funzione non ha interferito con la crescita delle cellule di lievito quando espresso a livelli simili a P5332di tipo selvaggio. Al contrario, l'espressione nel lievito del mutante tossico P53 V122A (noto per una maggiore attività trascrizionale rispetto al selvaggio P53) ha causato un effetto inibitorio della crescita più forte rispetto al tipo selvaggio P5332.

Inoltre, è stato dimostrato che l'MDM2 umano è stato in grado di inibire l'attività trascrizionale umana P53 nel lievito, promuovendone l'ubiquitinazione e la conseguente degradazione33. Di conseguenza, la capacità dell'uomo MDM2 e MDMX di inibire l'inibizione della crescita del lievito indotta da P53 è stata dimostrata32,34. In uno studio aggiuntivo, è stata stabilita una correlazione tra l'attività trascrizionale P53 e i livelli di espressione dell'actina, con l'identificazione di un putativo P53 RE a monte sul gene ACT1 nel lievito32. Coerentemente, l'espressione di actin è stata potenziata da P53 wild-tipo e ancora di più da P53 V122A, ma non dal mutante P53 R273H. Al contrario, l'espressione di actina da P53 è diminuita nella co-presenza di inibitori P53 MDM2, MDMX, o pifithrin- s (un inibitore di piccole molecole dell'attività trascrizionale P53), coerente con i risultati basati sul saggio di crescita del lievito. È importante sottolineare che questi risultati hanno stabilito una correlazione tra l'inibizione della crescita indotta da P53 e il grado della sua attività nel lievito, che è stato sfruttato anche per identificare e studiare piccole molecole che modulano le funzioni P5328,34 , 35.

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Protocol

1. Costruzione di ceppi di lievito reporter ADE2 o LUC1 contenenti un RE specifico (yAFM-RE o yLFM-RE)

  1. Streak un ceppo yAFM-ICORE o yLFM-ICORE12,14 (ICORE - ICORE - ISce-I endonuclease sotto promotore di GAL1; CO - contatore selezionabile URA3; RE - reporter KanMX4 conferendo la resistenza alla kanamycin; Tabella 1) da un 15% di brodo di glicerolo immagazzinato a -80 gradi centigradi su una piastra di agar YPDA (Tabella 2). Lasciarlo crescere per 2-3 giorni a 30 gradi centigradi.
  2. Prendere una colonia di lievito dal piatto fresco (non più di 3 settimane) e metterlo in una piccola fiaschetta contenente 5 mL di YPDA (Tabella 2). Incubare a 30 gradi durante la notte, agitando a 150-200 giri/min.
  3. Il giorno successivo, per rimuovere tutte le tracce di destrosio, pellet le cellule per 2 min a 3.000 x g e scartare il supernatante per inversione del tubo.
    NOTA: Eseguire tutte le centrifughe in questo protocollo a temperatura ambiente (RT).
  4. Risospendere il pellet cellulare in 30-50 mL di CM preriscaldato (media completo) contenente galactose (Tabella 2) e incubare per 4 h a 30 gradi centigradi, agitando a 150-200 rpm (necessario per l'induzione di I-SceI).
  5. Centrifugare le cellule per 2 min a 3.000 x g e scartare il supernatante per inversione del tubo.
  6. Risospendere il pellet cellulare in 30-50 mL di acqua sterile. Ripetere il passaggio 1.5.
  7. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di acqua sterile. Ripetere il passaggio 1.5.
  8. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di LiAcTE sterile (Tabella 3), una soluzione ionica che favorisce l'assorbimento del DNA. Ripetere il passaggio 1.5.
  9. Risospendere il pellet cellulare a 250 gradi di LiAcTE sterile e trasferire le cellule in un tubo da 1,5 mL. Ripetere il passaggio 1.5 e risospendere il pellet cellulare a 300-500 - L di sterile LiAcTE.
  10. Durante i lavamenti, denaturare una soluzione da 10 mg/mL di portaTENdi di DNA spermatozoi di salmone per 10 min a 100 gradi centigradi e raffreddare immediatamente sul ghiaccio per mantenerlo come DNA a filamento singolo.
  11. In un tubo separato da 1,5 mL aggiungere 500 picomoli dell'oligonucleotide desiderato (Tabella 3), 5 -L del DNA del portamalo del salmone bollito, 300 l di PEG LiAcTE sterile (Tabella 3) e 50 -L della sospensione della cella di lievito (dal punto 1.9).
  12. Vorticare i tubi per 10 s per mescolare e incubare per 30 min a 30 gradi centigradi, agitando a 150-200 rpm. Posizionare i tubi da 1,5 mL sul lato per favorire lo scuotimento.
  13. Il calore scuote le cellule di lievito per 15 minuti a 42 gradi centigradi in un blocco di riscaldamento, quindi centrifichezzano le cellule per 20 s a 10.000 x g. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di acqua sterile.
  14. Stendere 100 l della sospensione cellulare sulla piastra di agar YPDA e incubare (a testa in giù) per 1 giorno a 30 gradi centigradi. Per garantire che si ottengano colonie ben separate, spalmare anche 100 - L di una diluizione 1:10.
  15. Il giorno successivo, piastra replica utilizzando velluti sterili su CM agar piatto contenente dextrose e 5-FOA (Tabella 2). Si consideri una seconda piastra di replica su una nuova piastra se vengono trasferite molte cellule (ad esempio, una certa crescita delle cellule URA3).
  16. Tre giorni dopo, piastra di replica su piastre di agar non selettive YPDA e YPDA contenentiG418 (un antibiotico aminoglycoside simile alla kanamicicina) piastre di agar (tabella 2), marcatura di ciascuna piastra per facilitare il loro successivo confronto. Incubare le piastre durante la notte a 30 .
  17. Il giorno successivo, identificare i ceppi di reporter candidati da colonie che sono G418-sensibile ma crescono su piastre YPDA (ad esempio, colonie yLFM- o yAFM-RE). Streak le colonie identificate (3-6 colonie) su una nuova piastra YPDA per ottenere isolati singola colonia e lasciarli crescere per 2 giorni a 30 gradi centigradi.
  18. Patch singole colonie di lieviti su una piastra YPDA per isolare le colonie per ulteriori analisi. Dopo 24 h a 30 , testarli mediante la placcatura replica su una piastra di agar YPGA (Tabella 2) che impediscono la crescita di mutanti piccoli (cioè mutanti respiratori carenti). Allo stesso tempo, piastra di replica su un nuovo YPDA agar piastra.
  19. Testare le patch corrette (cioè la crescita sulle piastre di agar YPDA e YPGA; 1-3 colonie) dal punto 1.18 per la presenza di una corretta integrazione oligonucleotide da parte della colonia PCR. Assemblare una miscela di reazione aggiungendo 5 ll l una di 10m di buffer PCR (1,5 mM MGCl2), 2 -L di 10 picomole/l primer (tabella 3), 4 lun di 2,5 m dNTP, 0,25 L di 5 Polymerase U/L L e acqua a un volume finale di 50 . Moltiplicare il mix di reazione per il numero di colonie di lieviti che devono essere sottoposte a screening e 50 - L in ogni tubo PCR. Utilizzando una pipetta, aggiungere una piccola quantità di cellule di lievito dalla piastra di agar YPDA in un singolo mix di reazione PCR.
  20. Eseguire la reazione PCR con il seguente programma: 94 s per 8 min seguito da 35 cicli di denaturazione per 1 min a 94 gradi centigradi, primer che fissano per 1 min a 55 gradi centigradi, ed estensione per 2 min a 72 .
  21. Una volta completata la reazione, caricare una della reazione PCR (circa un decimo del volume) su un gel di agarose per verificare la dimensione corretta (500 bp) .
  22. Sequenziare il prodotto PCR dopo la purificazione con un kit commerciale per confermare l'integrazione della sequenza RE desiderata utilizzando gli stessi primer del passaggio 1.19.
  23. Dopo la convalida della sequenza corretta, fare uno stock di glicerolo del 15% di cultura di deformazione yAFM-RE o yLFM-RE (in YPDA) e conservarlo a -80 gradi centigradi.

2. Valutazione della capacità di trasattivazione della proteina P53 utilizzando il saggio qualitativo di lievito ADE2 basato sul colore

  1. Ripetere i passaggi 1.1 e 1.2 utilizzando la deformazione yAFM-RE (Tabella 1).
  2. Il giorno dopo, diluire la coltura cellulare (1:10) in 30-50 mL di YPDA preriscaldato e continuare a incubare a 30 gradi centigradi agitando fino a quando l'OD600nm raggiunge 0,8-1,0 .
  3. Ripetere i passaggi da 1.5 a 1.10.
  4. In un tubo separato da 1,5 mL, aggiungere 300-500 ng di lievito P53 (o controllo) vettore di espressione (tabella 4), 5 l del supporto di DNA dello sperma di salmone bollito, 300 l of sterile LiAcTE PEG e 50 .L di sospensione delle cellule di lievito.
  5. Ripetere i passaggi 1.12 e 1.13, ma sospendere nuovamente il pellet cellulare in 300 - L di acqua sterile.
  6. Stendere 100 l delle sospensioni cellulari su piastre sintetiche selettive (per l'espressione P53 o il vettore di controllo) contenenti dexrose come fonte di carbonio e un'elevata quantità di adenina (Tabella 2), quindi incubare (capovolto) a 30 gradi centigradi per 2-3 giorni.
  7. Streak colonie trasformanti di lievito singolo (2-6 strisce per piastra) su una nuova piastra selettiva e lasciarli crescere durante la notte a 30 gradi centigradi.
  8. Il giorno dopo, utilizzando velluti sterili replica piastra su nuove piastre selettive che consentono la valutazione del fenotipo di colore (cioè, piastre contenenti dextrose come fonte di carbonio, ma limitando la quantità di adenina ; Tabella 2). Incubare le piastre a testa in giù a 30 gradi centigradi per 3 giorni. Facoltativamente, per valutare la sensibilità alla temperatura della proteina P53, incubare a tre temperature diverse per 3 giorni: 24 , 30 gradi centigradi e 37 gradi centigradi.
    NOTA: la stessa striscia può essere replicata più volte.
  9. Per valutare la capacità di trasattivazione della proteina P53, controllare il fenotipo a base di colore delle colonie di lieviti e confrontare il fenotipo della proteina P53 rispetto ai fenotipi vettoriali vuoti e di tipo selvatico P53.

3. Valutazione della capacità di trasattivazione della proteina P53 utilizzando il saggio di lievito LUC1 basato sulla luminescenza quantitativa

  1. Trasformare le celle di lievito con vettori di espressione P53 (o controllo) (Tabella 4) utilizzando il metodo basato su LiAc descritto nel protocollo 2. Utilizzare la deformazione yLFM-RE (Tabella 1).
  2. Applicare patch a singoli trasformatori su una nuova piastra selettiva con l'elevata quantità di adenina contenente glucosio come fonte di carbonio e lasciarli crescere a 30 gradi durante la notte. Per ogni tipo di trasformazione, effettuare 5-7 patch diverse.
  3. Dopo una crescita durante la notte, risospendere una piccola quantità di cellule di lievito utilizzando uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta dalla piastra in un mezzo selettivo sintetico contenente dextrose o raffinose come fonte di carbonio (200 l volume finale in una piastra trasparente 96, con un o fondo piatto). Se l'esperimento richiede un'espressione P53 inducibile, aggiungere la galactose al mezzo raffinose per modulare il livello di induzione (Tabella 2).
    NOTA: Queste sospensioni cellulari devono avere un OD600nm di circa 0,4 e non superiore a 1.
  4. Misurare l'assorbimento di ogni pozzo a OD600nm dopo espressione P53 inducibile (4-8 h a 30oC con 150-200 rpm agitazione) utilizzando un lettore di piastre multi-label. Assicurarsi che le sospensioni cellulari siano omogenee mescolando ogni pozzo con una pipetta multicanale.
  5. Trasferire 10-20 L di sospensione cellulare dalla piastra trasparente 96 ben in una piastra bianca 384 (o 96) bene e mescolare con un volume uguale (10-20 L) di tampone di lisi. Incubare per 10-15 min a RT su uno shaker (150-200 rpm) per ottenere la permeabilizzazione della cellula al substrato luciferale.
  6. Aggiungere 10-20 l'l di substrato lucidferase di lucciola e misurare le unità di luce (LU) da un lettore di lamiere multi-label.
  7. Per determinare la capacità di trasattivazione della proteina P53, normalizzare i LU di ogni pozzo al corrispondente OD600nm (unità di luce relativa, RLU). Calcola RLU media e deviazione standard da 3-4 patch di colonie trasformatiri di lievito.
  8. Confrontare i dati di trasattivazione della proteina P53 rispetto al tipo selvatico P53 e al vettore vuoto, sottraendo i valori ottenuti con il vettore vuoto o dividendo per i valori ottenuti con il vettore vuoto (cioè, calcolando la piega dell'induzione).
    NOTA: l'attività di trasattivazione P53 può essere valutata anche utilizzando lo stesso set-up sperimentale in presenza di proteine interagenti P53 (ad esempio, MDM2 e MDMX) e/o incluso il trattamento farmacologico.

4. Valutazione dell'inibizione della crescita proteica P53 utilizzando il saggio fenotipica del lievito

  1. Trasformare le celle di lievito con vettori di espressione P53/MDM2/MDMX (o controllo) (Tabella 4) utilizzando il metodo basato su LiAc descritto nella sezione 2. Utilizzare la deformazione CG379 (Tabella 1) e i trasformatori di lievito stendere su piastre selettive minime (Tabella 2).
  2. Far crescere le celle trasformate in un mezzo selettivo minimo (Tabella 2) a circa 1 OD600nm.
  3. Diluire le cellule di lievito a 0,05 OD600nm nel mezzo di induzione selettiva (Tabella 2), e, facoltativamente, aggiungere una piccola molecola scelta alla concentrazione appropriata (o solo al solvente) per testarne l'efficacia nel riattivare il Mutantp P53 o nell'inibire MDM2- Interazioni /MDMX-P53.
  4. Incubare le cellule a 30 gradi centigradi in continuo scuotimento orbitale (200 rpm) per circa 42 h (tempo richiesto dal lievito di controllo negativo per raggiungere la fase intermedia del log, circa 0,45 OD600nm).
  5. Individuare 100 aliquote di colture cellulari di lievito su piastre selettive minime (Tabella 2).
  6. Incubare per 2 giorni a 30 gradi centigradi.
  7. Misurare la crescita del lievito contando il numero di colonie ottenute nelle 100 gocce di coltura l.l (unità di formazione della colonia, conteggio CFU). Ad esempio, calcolare l'effetto mutante riattivando dei composti considerando la crescita del lievito selvaggeP53 che esprime come effetto massimo possibile (impostato al 100%), mentre la crescita di cellule che esprimono Il P53 mutante (ma esposte al controllo dei solventi) rappresenta il livello zero di riattivazione.

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Representative Results

Costruzione di ADE2 o o LUC1 ceppi di lievito reporter

Ildelitto perfettoapproach12,14,15,16 è stato adattato per consentire la costruzione di ceppi di lievito reporter P53 ( Figura1B). Il metodo impiega oligonucleotidi a singolo o doppio filamento contenenti, su entrambe le estremità, almeno 30 nucleotidi omologi al locus di integrazione scelto. In particolare, l'omologia corrisponde a sequenze che fiancheggiano il sito di integrazione della cassetta a doppio pennare ICORE, contenente il KlURA3 e il kanMX4 (gene reporter che fornisce resistenza alla Geneticin, G418) precedentemente posizionato a il sito di destinazione desiderato15,16. Questa cassetta contiene anche il lievito I-SceI endonuclease sequenza di codifica, sotto il promotore inducibile GAL1 e il suo sito di destinazione cognate. Pertanto, un interruttore nel mezzo contenente galactose prima della trasformazione delle cellule di lievito con la sequenza desiderata genera l'espressione I-SceI e la conseguente generazione di una singola interruzione a doppio filamento (DSB) nel sito dell'integrazione ICORE. La presenza di un DSB stimola fortemente la frequenza degli eventi di targeting, con oltre 1.000 sostituzioni ottenute con un'unica trasformazione.

Al termine del processo di targeting e selezione basato sulla resistenza acquisita a 5-FOA e la sensibilità al G418, i cloni candidati sono confermati dall'amplificazione basata sulla COLONIA PCR del locus modificato e dal sequenziamento di Sanger per verificare la corretta integrazione P53 RE desiderato (Figura 1C). Alla fine del protocollo di costruzione del ceppo, che può essere completato in circa una settimana, si ottiene un pannello di ceppi di lievito reporter isogenici che possono essere utilizzati per valutare come le differenze nella sequenza delle RE influenzano la capacità di trasattivazione del P53 proteina.

P53 mutanti funzionalmente eterogenei

Nei tumori umani, il gene TP53 è principalmente influenzato da mutazioni di singolo senso che generalmente coinvolgono sei principali residui di hotspot (R175, G245, R248, R249, R273 e R282) situati nel dominio centrale di legame del DNA (DBD) della proteina P53. Tuttavia, sono state registrate più di 2.000 sostituzioni di aminoacidi P53 singole, tra cui alcune che sono osservate raramente27. I P53 mutanti possono essere classificati come contatto con il DNA o mutanti strutturali, a seconda degli effetti della sostituzione degli amminoacidi sul contatto DNA-proteina (ad esempio, R273H) o sulla struttura proteica (ad esempio, R175H)36. Le singole mutazioni missense TP53 influenzano le funzioni P53, generando una vasta gamma di diversità funzionale, che può influenzare importanti caratteristiche cliniche come l'aggressività tumorale, la resistenza alla chemio-resistenza e il potenziale metastatico37, 38 Mi lasa , 39.

Il concetto che i mutanti P53 siano funzionalmente eterogenei è emerso chiaramente negli ultimi 15 anni attraverso una grande quantità di dati sperimentali disponibili nei database di mutazione TP53 (ad esempio, )27. Sono stati sviluppati diversi saggi funzionali basati su sistemi di segnalazione di lieviti e/o mammiferi, evidenziando le diverse proprietà dei mutanti P53 (cioè la trasattivazione, la sensibilità alla temperatura, il potenziale dominante-negativo, l'interferenza con il membri della famiglia P53 e interazioni con altri TF)13,24,40,41,42,43,44. Lo studio funzionale più completo ha esaminato più di 2.300 mutanti in un saggio basato su lievito caratterizzando la loro attività di trasattivazione verso otto diverse P53 RE24.

I dati hanno confermato che quasi tutti i P53 mutanti che coinvolgono residui di hotspot sono perdita di funzione (cioè, hanno completamente perso l'attività di trasattivazione). Al contrario, i P53 mutanti che colpiscono altre posizioni della proteina P53 e si trovano generalmente a frequenza da moderata a bassa nel cancro45 sono mutanti a funzione parziale, che mantengono un certo livello di attività di trasattivazione su P53 RE13, 17. Un esempio di utilizzo dell'analisi ADE2 per studiare l'eterogeneità funzionale delle proteine P53 descritte è presentato nella Figura 2A. Infatti, mentre R175H è un mutante di perdita di funzione che produce colonie rosse in ogni condizione testata, R282W ha mostrato una sensibilità alla temperatura che era più evidente usando l'espressione P53 dipendente dalla galactose (cioè, il settore rosso a 37 gradi centigradi nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P21-5' nel ceppo RE P piatto contenente galactose inferiore, che diventa rosa nella piastra di galactose superiore). La figura 2B presenta un riepilogo dei risultati per un gruppo esteso di mutanti P53 e ceppi di reporter.

L'esistenza di questa eterogeneità funzionale P53 ha portato all'esplorazione se tale eterogeneità parallela all'eterogeneità osservata a livello clinico nei soggetti con mutazioni germinali TP53. Le mutazioni germinali TP53 sono alla base della base molecolare di un gruppo di disturbi della predisposizione al cancro, tra cui le più gravi sindromi Li-Fraumeni (LFS) e Li-Fraumeni-like (LFL), e le predisposizioni non sindromiche meno gravi con (FH) o senza (nessun FH) storia familiare46.

Il protocollo ha evidenziato le correlazioni genotipo-fenotipo confrontando le capacità di trasattivazione basate sull'analisi del lievito di tutti gli alleli mutanti germinali TP53 con i dati clinici corrispondenti dal database IARC . I mutanti P53 con perdita di funzione sono stati trovati in sindromi più gravi della malattia da cancro, mentre i mutanti P53 a funzione parziale sono stati trovati in condizioni di pronetà tumorale meno gravi. Ciò indica che la capacità di trasattivazione residua P53 influenza il fenotipo clinico nei pazienti che hanno ereditato mutazioni TP53 e sviluppato il cancro25,26.

Le variazioni delle sequenze nucleotidiche all'interno delle RE governano P53 potenziale di trasattivazione

Umano P53 è un TF tetramerico (dimero di dimeri). Ogni dimero P53 riconosce un RE costituito da 10 nucleotidi (RRRCWWGYYY, R - A o G; W - A o T; Y : C o T)47,48. Due di questi semi-siti possono essere adiacenti o distanziati da un massimo di 13-20 nucleotidi, che costituiscono un P53 RE funzionale. Tuttavia, P53 RE con un distanziale sono caratterizzati da una minore affinità P53 e trassessione rispetto ai P53 RE senza un distanziale49,50, in diversi test funzionali provenienti da vari sistemi.

È stato recentemente dimostrato che i semi-siti possono reclutare tetrameri P53 che sono legati all'emispecifico51, insieme a saggi funzionali e studi di immunoprecipitazioni della cromatina, questi risultati indicano che P53 può agire anche a RE non canoniche, comprendenti semi-siti e tre trimestri di siti48,52. Inoltre, il fatto che il motivo P53 RE sia molto degenerato (RRRCWWGYYY)2 prefigura la possibilità che i singoli RE possano differire sostanzialmente per affinità di sequenza e vincolante. Considerando che centinaia di geni bersaglio P53 sono stati identificati nel genoma umano41,48, praticamente tutti i P53 RE hanno mostrato una sequenza non identica tra loro. Inoltre, è stato ipotizzato che le RE con una distinta affinità di legame del DNA siano selezionate nei promotori di geni bersaglio P53 coinvolti nell'arresto del ciclo cellulare o nell'apoptosi53.

L'analisi in lievito di molte varianti del P53 RE in una posizione genomica costante ha stabilito l'impatto delle varianti nucleotidiche, distanziale e l'organizzazione di semi-siti RE sulla capacità di trasattivazione49. Ha anche portato alla scoperta di P53 Polimorfici con i due alleli notevolmente diversi nella reattività di un promotore associato a P5314,54,55. Recentemente, le informazioni derivanti dalle funzionalità della sequenza RE P53 e dal potenziale di trasattivazione basato su lievito sono state codificate in p53 Retriever, un algoritmo di ricerca di pattern in grado di localizzare e classificare sia le RE canoniche che non canoniche, in base alle predisse i potenziali di trasattivazione in tutto il genoma umano52.

Come esempio di utilizzo del saggio per studiare il potenziale di trasattivazione P53 specifico della sequenza, presentato qui è un confronto tra l'uomo wild-type P53 e la proteina P53 lontana evolutiva da Caenorhabditis elegans (Figura 3). Questi risultati sono un follow-up di un recente studio in cui è stata esplorata la divergenza evolutiva della specificità della trasattivazione tra le proteine P5356. Sono stati sviluppati ceppi di reporter isogenici yLFM-RE come descritto nel protocollo. In particolare, sono stati confrontati il Cep-1 P53 RE derivato dal gene ced13 57e sono state confrontate quattro varianti (V1-V4) (Figura 3A). Le varianti RE sono state costruite per esaminare l'impatto di variare la lunghezza del distanziale che separa i due motivi decameri (che in ced13, è di 28 nucleotidi) e per esaminare i cambiamenti nei nucleotidi che fiancheggiano il motivo centrale CWWG (che in ced13, sono ricchi di A/T; mentre nella massima affinità umana P53 RE, sono ricchi di G/C)58. I risultati mostrano chiaramente come Cep1 e P53 umano divergono in termini di specificità di trasattivazione. Infatti, mentre la trasattivazione mediata da P53 umano è fortemente inibita dalla presenza di un distanziale (Figura 3B), l'attività di Cep-1 è inibita dalla rimozione del distanziale (Figura 3C). Inoltre, la trasattivazione mediata da Cep-1 viene abolita quando la RE viene modificata da A/T- a C-rich. Né l'uomo P53 né Cep-1 possono trasattivare da un singolo decamer derivato dal ced13 RE.

Ricerca di piccoli interferenti molecolari di interazioni P53-MDM2/MDMX e riattivatori di attività P53 mutate

La correlazione stabilita tra l'effetto inibitorio della crescita dell'uomo P53 e il grado della sua attività nel lievito ha portato a un saggio di screening semplificato basato sulle misurazioni della crescita cellulare del lievito per analizzare l'impatto dei fattori interferenti sull'attività P53 (Figura4 ). L'efficacia del saggio fenotipica del lievito per lo screening di potenziali agenti anticancro è stata dimostrata in diverse opere. Utilizzando le cellule di lievito che co-esprimevano P53 e i suoi inibitori MDM2 e/o MDMX, nuovi interferenti di queste interazioni sono stati identificati dalla loro capacità di inibire l'effetto negativo delle MDM su P53, ristabilendo così l'inibizione della crescita del lievito indotta da P53 di tipo selvatico ( Figura 4A). In particolare, questo saggio ha portato alla scoperta di 1) piroxanthone 1 come primo inibitore dell'interazione P53-MDM2 con un scaffold xantro34 e 2) inibitori di oxazoloisoinone dell'interazione P53-MDM259. Inoltre, con questo saggio, per la prima volta sono stati descritti l'acido z-mangostin e gambogic come potenziali inibitori dell'interazione P53-MDM230.

Più tardi, lo stesso assay ha dimostrato che la prenilazione dei chalcones ha migliorato la loro capacità di interrompere l'interazione P53-MDM260. È interessante notare che questo saggio di lievito ha portato anche alla scoperta di due inibitori delle interazioni P53-MDM2/MDMX: il tritoo oxazolopiper lactam OX-161 e l'oxazoloisoinone DIMP53-1 62 derivato da tritofalo e il tritofino-oxazoloisoinone DIMP53-162.

Il ridotto impatto della perdita di funzione mutante P53 sulla crescita delle cellule di lievito è stato anche esplorato per lo screening per i farmaci mutanti p53 riattivando, caratterizzato dalla capacità di ripristinare l'attività inibitoria della crescita wild-type-like al P53 mutante (Figura4B). Con questo analisi del lievito, un riattivatore del mutante P53 R280K, è stato identificato l'oxazoloisoindolinonno SLMP53-163,derivato dal tipo enantiopure. Figura 4C,D mostra risultati rappresentativi ottenuti nel lievito con l'espressione di P53 o trattamenti con l'inibitore del P53-MDM2 interazione Nutlin-3a o con il riattivatore di P53 mutante Y220C PhiKan083.

Convalida del meccanismo molecolare di azione di questi composti come agenti che attivano P53, nonché la loro attività antitumorale, sia nelle linee cellulari tumorali umane34,60,61,62,63 e modelli animali62,63, attesta il grande potenziale del saggio fenotipica lievito nella scoperta di farmaci.

Figure 1
Figura 1 : Caratteristiche dei saggi di trasfusione P53 basati su lievito e flusso di lavoro per la costruzione di ceppi di lievito reporter P53. (A) La facilità di manipolazione del genoma e l'espressione genica ectopica controllata rende il lievito simile a una "provetta in vivo", in cui diverse variabili rilevanti per esaminare le funzioni di trasattivazione P53 sono rigorosamente esplorate. Queste variabili includono i livelli di espressione di una proteina P53 selvatica o mutante, la sequenza della RE e il tipo di gene reporter [qualitativo/semi-quantitativo (ad esempio, ADE2 e LAC)o quantitativo (ad esempio, LUC1)]. La sequenza di consenso RE è altamente degenerata (RE - RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R - purina; W - A/T; Y - pirimidina; CWWG - Sequenza CORE, n - distanziale da 0 a 13 bps). Il numero di disallineamenti rispetto al consenso, alla sequenza CORE e al numero di distanziali delle coppie di basi influenzerà l'attività di trasattivazione. Questo pannello è stato modificato da una precedente pubblicazione64. (B) Schema dell'approccio delitto perfetto per introdurre un desiderato P53 RE a monte del promotore minimo alla guida dell'espressione genica del reporter ADE2 o LUC1. Il protocollo è stato adattato dalle precedenti pubblicazioni12,15,16. (C) Esempio dei risultati della colonia di lievito, amplificazione PCR della regione che circonda il sito di integrazione oligo RE. L'immagine dell'elettroforesi presenta il risultato di amplificazione di due colonie positive putative (URA3 minus e G418 sensibili) con il corrispondente controllo negativo PCR accanto alla scala del DNA da 1 kb (Promega). La banda nt da 500 dollari prevista utilizzando i primer descritti nella Tabella 3 può essere sequenziata per confermare la corretta modifica del promotore, come mostrato nell'elettroperoigramma. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Le proteine P53 mostrano un potenziale di trasattivazione specifico per la RE e sensibile alla temperatura. P53 di tipo selvaggio e le mutazioni missense TP53 indicate sono stati testati utilizzando il saggio qualitativo basato sul colore del reporter nel lievito e sfruttando ceppi di reporter che ospitano diversi P53 RE che controllano l'espressione genica ADE2. (A) Viene mostrato un esempio del fenotipo del colore della colonia per il tipo selvatico P53, R175H e R282W con il PUMA (BBC3) e il P21-5' REs a 30 e 37 gradi centigradi. Vengono confrontati l'espressione P53 moderata (0,008% galactose) e alta (0,12%) di galactose. (B) I risultati ottenuti con un insieme esteso di ceppi di mutanti e di lieviti esaminati per il fenotipo del colore della colonia dipendente da P53 a tre temperature (24, 30 gradi centigradi e 37 gradi centigradi). I risultati esemplificano l'eterogeneità funzionale degli alleli P53 mutanti e sono riassunti in un formato tabella. Per esempio, R175H è un mutante di perdita di funzione, mentre G199H è wild-tipo P53-like. K139E e R282W mantengono la funzione parziale e presentano rispettivamente sensibilità al freddo e sensibilità al calore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Umano P53 e accreditato ortologo Cep-1 mostrano specificità di trasattivazione altamente divergenza. (A) Sequenze della sequenza di consenso P53 RE umana, Cep-1 P53 RE derivata dal gene ced13 e quattro varianti (V1-V4) che sono state testate nei saggi funzionali. (B) La trasattivazione è stata misurata dopo aver indotto l'espressione umana P53 per 8 h utilizzando tre diverse fonti di carbonio per ottenere un'espressione bassa, moderata e alta (0,008%, 0,032%, 0,12% galactose aggiunto al mezzo selettivo contenente 2% raffino). I risultati sono espressi come unità di luce relativa media (RLU) e errore standard di quattro repliche. L'attività del reporter per la cella trasformata con vettore di espressione vuoto è stata sottratta. (C) Specificità di trasattivazione di Cep1 misurata in (B). Per entrambe le proteine, i livelli di trasattivazione erano proporzionali alla quantità di galactosi. Le unità di luce più elevate misurate quando si esprime l'umano P53 possono dipendere da diversi livelli di quantità di proteine prodotte, a causa della differenza nella lunghezza delle proteine e potenzialmente anche nell'uso di codoni. Le due proteine sono caratterizzate da una diversa specificità di trasattivazione nei confronti delle diverse RE testate e questa proprietà non è influenzata da possibili differenze nella quantità relativa di proteine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Piccoli attivatori molecolari di P53 identificati utilizzando il saggio fenotipica del lievito. (A) Le cellule di lievito che co-esprimono p53 e MDM2 o MDMX di tipo selvatico umano sono state utilizzate per cercare inibitori delle interazioni P53-MDM2 e P53-MDMX. In questo sistema, gli inibitori dell'interazione ripristinano l'inibizione della crescita del lievito indotta da P53 nelle cellule di lievito che co-esprime P53 e MDM2 o MDMX. Questo approccio ha permesso l'identificazione degli inibitori dell'interazione P53-MDM2 e l'identificazione dei doppi inibitori delle interazioni P53-MDM2 e P53-MDMX. (B) Le cellule di lievito che esprimono il mutante umano P53 sono state usate per la ricerca di riattivatori mutanti P53 e sono in grado di ripristinare l'inibizione della crescita del lievito indotta da P53 indotta da P53. (C) Immagini rappresentative del saggio plate spot che mostrano l'impatto di P53 di tipo selvatico o Y220C mutante sulla crescita della colonia di lieviti rispetto al vettore vuoto (vedi passo 4.5). (D) Risultati quantitativi del test di crescita: 10 M Nutlin-3a ripristina l'inibizione della crescita del lievito indotta da P53 nelle cellule che co-esprime MDM2; 50 PhiKan083 ripristina l'inibizione della crescita del lievito indotta da P53 indotta da p53 selvatici al mutante P53 Y220C. Entrambi gli effetti sono tracciati rispetto all'effetto inibitorio della crescita del lievito di tipo selvaggio P53, che è stato impostato come uno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome della deformazione e genotipo Uso specifico Numero protocollo
yAFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::ADE2 Viene utilizzato per la costruzione del ceppo yAFM-RE (MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::ADE2) che viene sfruttato nell'esempio ADE2 qualitativo basato sul colore. Protocolli 1,2
yLFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::LUC1 Viene utilizzato per la costruzione del ceppo yLFM-RE (MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; RE::pCyc1::LUC1) che viene sfruttato nell'analisi LUC1 basata sulla luminescenza quantitativa. Protocolli 1,3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [Kil-O] Viene utilizzato per il saggio di crescita fenotipica. Protocollo 4

Tabella 1: Ceppi di lievito.

Nome e ricetta del supporto Uso specifico Numero protocollo
YPDA (2% estratto di lievito, 2% peptone, 2% dextrose, 200 mg/L adenina) - 2% agar YPDA senza agar è sterilizzato preferibilmente dalla filtrazione. YPDA - agar è sterilizzato da autoclaving; è possibile omettere il dextrose dalla ricetta e aggiungere il destrosio da una soluzione sterilizzata a filtro del 20% in acqua prima di versare le piastre. Protocolli 1-4
CM [0,17% Base di lievito senza AA e Solfato di ammonio, 0,5% Solfato di Ammonio, 5% (volume/volume, v/v) soluzione di aminoacidi non essenziali, 20 mg/L istidina, 20 mg/L di mitolo, 20 mg/L uracil, 30 mg/L lisina, 100 mg/L leucina, 200 mg/L adenina] 2% di galactosi Il supporto viene sterilizzato filtrando. Le seguenti soluzioni sterili vengono preparate in acqua (ad eccezione dell'uracile, che viene sciolto in 0,1M NaOH) filtrando: soluzione di amminoacidi non essenziali (0,04% arginina, 0,04% methionina, 0,06% isolelalina, 0,1% fenilalanina, 0,2% glutamico acido, 0,2% acido aspartico, 0,3% valine, 0,4% di trena, 0,8% di serini, 1% istidina, 1% di metatofano, 1% uraclino, 1% lisina, 1% leucina, 0,5% adenina, 20% galactose. La soluzione dello stock di adenina non deve essere conservata in frigorifero a causa della formazione e della sedimentazione dei cristalli. La soluzione di riserva di metatono deve essere conservata al buio. Protocollo 1
CM (vedi sopra) - 2% Dextrose - 1g/L 5-FOA - 2% agar Il supporto (contenente base di lievito senza AA e Solfato di ammonio, solfato d'ammonio e Agar) è sterilizzato dall'autoclaving. Gli altri componenti vengono aggiunti dopo l'autoclaving per preservare gli ingredienti termo-labile; la polvere 5-FOA può essere aggiunta direttamente nel supporto una volta che si è raffreddato a circa 55 gradi centigradi. Protocollo 1
YPDA - 400 g/mL G418 - 2% agar G418 deve essere aggiunto dopo l'autoclaving una volta che i supporti si sono raffreddati a circa 55 gradi centigradi. Se partendo dalla polvere, una soluzione di riserva 50 mg/mL G418 può essere preparata in acqua e sterilizzata per filtrazione. Protocollo 1
YPGA [2% estratto di lievito, 2% peptone, 2% glicerolo (v/v), 200 mg/L adenina] - 2% agar I media vengono sterilizzati dall'autoclaving. Protocollo 1
Piastra selettiva sintetica: [0,17% Base di lievito senza AA e Solfato di ammonio, 0,5% di acido ammoniaco, 5% (v/v) soluzione di amminoacido essenziale (0,04% arginina, 0,04% methionina, 0,06% isoleuina, 0,1% fenilalanina, 0,2% acido glutammico, 0,2% acido aspartico, 0,3% di valine, 0,4% trionina, 0,8% serina), 20 mg/L istidina, 20 mg/L uracile, 20 mg/L di mitofano (a seconda del marcatore di selezione vettoriale), 30 mg/L lisina, 100 mg/mL leucina (a seconda del marcatore di selezione vettoriale), 5 mg/L o 200 mg/L adenina] Il supporto (contenente base di lievito senza AA e Solfato di ammonio, solfato d'ammonio e Agar) è sterilizzato dall'autoclaving. Gli altri componenti vengono aggiunti dopo l'autoclaving per preservare gli ingredienti termo-labile. Quando si utilizzano vettori basati su pLS e pLSG, preparare piastre senza leucina. Quando si utilizzano vettori basati su pTS e pTSG preparare piastre senza tryptofano. Protocolli 2-3
Supporti selettivi sintetici: [0,17% Base di lievito senza AA e Solfato di ammonio, 0,5% di acido ammoniaco, 5% (v/v) soluzione di amminoacidi non essenziali (0,04% arginina, 0,04% methionina, 0,06% isoleucina, 0,1% fenilalanina, 0,2% acido glutammico, 0,2% acido aspartico, 0,3% di valine, 0,4% trionina, 0,8% serina), 20 mg/L istidina, 20 mg/L uracile, 20 mg/L di tritotono (a seconda del marcatore di selezione vettoriale), 30 mg/L lisina, 100 mg/mL di leucina (a seconda del marcatore di selezione vettoriale), 200 mg/L adenina] - 2% di deforme o rafse  Il supporto è sterilizzato dalla filtrazione. Quando si utilizzano vettori a base di pLS o pTS nel trattamento farmacologico, preparare i supporti senza leucina o tritofano, rispettivamente ma contenente il 2% di dextrose. Quando si utilizza un vettore basato su pLSG o pTSG in espressione P53 inducibile o senza trattamento farmacologico, preparare i supporti senza leucina o triptofano, rispettivamente, ma contenente il 2% di raffinose e quantità variabile di galactosi per modulare l'espressione P53. L'estensione dell'induzione di P53 può anche essere modulata variando il tempo di incubazione. Protocollo 3
Piastre selettive minime: 2% glucosio, 0,7% base di lievito (senza aminoacidi e solfato di ammonio), 50 mg/L di adenina, 50 mg/l uracil, 50 mg/L istidina, 50 mg/l di metatofano (a seconda del marcatore di selezione vettoriale), 50 mg/L leuci (a seconda marcatore di selezione vettoriale), 2% agar Il mezzo viene sterilizzato dall'autoclaving. Quando si utilizzano vettori basati su pLS89 preparare medio senza tryptophan. Utilizzare il vettore vuoto pLS89 (non esprimendo alcuna proteina) come controllo negativo. Quando si utilizzano vettori pLS89 e pGADT7-MDM2 (co-espressione di P53 e MDM2), preparare il supporto senza leucina e tryptophan. Utilizzare pLS89-vuoto e pGADT7 (entrambi non esprimono alcuna proteina) come controlli negativi. Quando si utilizzano vettori basati su pLS76 preparare medio senza leucina. Utilizzare il vettore pRS315 (senza esprimere alcuna proteina) come controllo negativo. Protocollo 4
Minimo mezzo selettivo: come piastre selettive minime ma senza agar Il mezzo è sterilizzato dalla filtrazione. Protocollo 4
Mezzo di induzione selettiva: come mezzo selettivo minimo ma contenente il 2% di galactose invece del glucosio Il mezzo è sterilizzato dalla filtrazione. Protocollo 4

Tabella 2: Supporti di lievito.

Nome della soluzione e ricetta o nome del primer e sequenza Caratteristiche specifiche e utilizzo Numero protocollo
LiAc/TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, con 1 mM EDTA e acetato di litio da 0,1 M Le seguenti soluzioni di stock sterile in acqua sono preparate da autoclaving: 1M acetato di litio pH 7.5, 1 M Tris-HCl / 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE buffer 10X). Protocolli 1-4
PEG/LiAc/TE: 40% Glicolo polietilene (PEG) in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, con 1 mM EDTA e acetato di litio da 0,1 M Le seguenti soluzioni di stock sterile in acqua sono preparate da autoclaving: 1 M acetato di litio pH 7.5, 1 M Tris-HCl / 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE buffer 10X), 50% PEG (peso molecolare 3350). Protocolli 1-4
Code homologia per le oligonucleotidi RE:
5'-gcggaatttactttttcttgaataatacat-RE-gcagatccgccaggcgtatatagcgtgggg-3'
Fornito è la sequenza delle code di omologia, corrispondente alle sequenze cromosomiche che fiancheggiano la cassetta ICORE integrata; SEQUENZa RE - RE. Protocollo 1
Primer: Ade2 Fw: 5'-AAGTTGCCTAGTTTCATGAA-3';
Ade2 Rv: 5'-GGACCATTAACGTGGTCAT-3';
Luc1-Rv: 5'-CATAGCTCTCTGCCAACCGAA-3'
Per la deformazione yAFM-RE (PCR e sequenziamento) combinare Ade2 Fw con Ade2 Rv primer. Per la deformazione yLFM-RE (PCR e sequenziamento) combinare Ade2 Fw con Primer Luc1-Rv. Protocollo 1

Tabella 3: Soluzioni e oligonucleotidi.

Tipi di vettori Controlli positivi e negativi Numero protocollo
vettori P53 (o controllo).
PLS- o pLSG-based: espressione della proteina P53 sotto promotore conforme ADH1 o promotore GALactose inducibile GAL1, rispettivamente (LEU2 come marcatore di selezione).
pTS- o pTSG-based: espressione della proteina P53 sotto promotore conforme ADH1 o galactose inducibile promotore GAL1, rispettivamente (TRP1 come marcatore di selezione)
basato su pLS e pLSG: utilizzare rispettivamente come controllo positivo il pLS76 e i vettori pLSG-P53 (esprimendo il tipo selvaggio P53); utilizzare come vettore di controllo negativo pRS315 (senza esprimere alcuna proteina).
pTS- e pTSG-based: utilizzare come controllo positivo il pTS76 e i vettori pTSG-P53 (esprimendo tipo selvaggio P53), rispettivamente; utilizzare come vettore di controllo negativo pRS314 (senza esprimere alcuna proteina).
Protocollo 2,3
vettori P53 e MDM2 (o controllo).
Basato su pLS89: espressione proteina P53 di tipo selvaggio sotto promotore galactose inducibile GAL1 (TRP1 come marcatore di selezione).
PLS76-based: espressione della proteina P53 mutante sotto promotore di ADH1 di perstitutive (LEU2 come marcatore di selezione).
basato su pGADT7: espressione proteica MDM2 sotto promotore di ADH1 di aptitutive (LEU2 come marcatore di selezione)
basato su pLS89: utilizzare come controllo positivo il vettore pLS89-P53 (esprimendo il tipo selvaggio P53); utilizzare come controllo negativo pLS89-vuoto (senza esprimere alcuna proteina).
basato su pLS76: utilizzare come controllo positivo il vettore P53 pLS76-mutant (esprimendo il P53 mutato); utilizzare come vettore di controllo negativo pRS315 (senza esprimere alcuna proteina).
basato su pGADT7: utilizzare come controllo positivo il vettore pGADT7-MDM2 (esprimendo il tipo selvaggio MDM2); utilizzare come vettore di controllo negativo pGADT7 (senza esprimere alcuna proteina).
Protocollo 4

Tabella 4: vettori di espressione di lievitto.

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Discussion

I saggi basati sul lievito si sono dimostrati utili per studiare vari aspetti delle funzioni proteiche P53. Questi saggi sono particolarmente sensibili per valutare il potenziale di trasattivazione P53 verso varianti di siti target RE, compresa la valutazione dei polimorfismi funzionali. L'uso di giornalisti di colore e la miniaturizzazione del saggio luciferasi si traducono in analisi convenienti e relativamente scalabili. Inoltre, il test di inibizione della crescita è potenzialmente suscettibile di essere utilizzato nello screening della libreria chimica, automatizzando la quantificazione della vitalità cellulare del lievito attraverso la misurazione dell'assorbimento. Mentre la permeabilità limitata dovuta alla parete cellulare e all'azione dei trasportatori ABC è stata considerata una limitazione nell'uso del lievito per lo screening farmacologico, le modifiche genetiche per migliorare l'assorbimento sono state sviluppate con successo22,65.

Rispetto ai saggi basati sulle cellule dei mammiferi, il saggio P53 basato sul lievito può migliorare l'identificazione dei colpi diretti, dato che P53 è isolato dalla straordinaria complessità dei cofattori e delle vie a cascata di segnalazione che modulano le sue funzioni in eucarioti superiori. Anche i saggi funzionali basati sul lievito sono stati parzialmente riusciti a monitorare l'interazione del P53 con i cofattori proteici (vale a dire MDM2 e MDMX22,32,33,34) e l'impatto dei piccoli molecole (come Nutlin-3a) su tali interazioni. Tuttavia, la sensibilità e il potere predittivo dei saggi basati sul lievito per studiare il crosstalk tra P53 e le proteine interagenti possono essere in qualche modo limitati, a seconda di come tali interazioni in vivo dipendono da modifiche post-traduzionali e cascate di segnalazione specifiche delle specie.

I sistemi qui descritti possono essere facilmente adattati ad altri TF. Infatti, sono stati sviluppati saggi funzionali per lieviti sono stati sviluppati per le proteine P63 e P73 correlate a P53 e P7342,49 e per i membri della famiglia NF-B66,67 [o anche per alcuni omeobox e elica-ciclo-elica di base (bHLH) TF68,69]. Recettori nucleari umani sono stati espressi anche in lievito e dimostrato di funzionare come ligando-dipendente, TFs sequenza-specifica70. Un fattore limitante è stato identificato nella debole capacità di qualche dominio di trasattivazione dei mammiferi (TAD) di interagire con il meccanismo di trascrizione basale del lievito8, una carenza che può essere superata utilizzando costrutti chimerici tra cui un attivo TAD68,69.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Ringraziamo l'Unione europea (fondi FEDER POCI/01/0145/FEDER/007728 attraverso Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) e i Fondi Nazionali (FCT/MEC, Fundao para a Ciància e Tecnologia e Ministério da Educaa Accordo di partenariato PT2020 UID/QUI/50006/2019 e i progetti (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Borse di studio FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Questo lavoro è stato sostenuto dalla Compagnia S. Paolo, Torino, Italia (Progetto 2017.0526) e dal Ministero della Salute, (Progetto 5x1000, 2015 e 2016; ricerca in corso 2016). Ringraziamo profondamente la Dott.ssa Teresa Lopez-Arias Montenegro (Università di Trento, laboratori sperimentali di insegnamento delle scienze) per l'assistenza con la registrazione video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

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References

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