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酵母作为开发功能分析研究人类P53的机箱

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Cancer Research

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Summary

这里提出的四个协议,以构造和利用酵母糖糖酶报告菌株,以研究人类P53转活化潜力,其各种癌症相关突变的影响,共同表达的相互作用蛋白,和特定小分子的影响。

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Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

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Abstract

发现著名的哺乳动物P53蛋白可以作为酵母S.cerevisae的转录因子(TF),使得开发不同的功能测定来研究1结合位点的影响[即反应元素(RE)]。P53转活特异性或2)TP53突变、共表达辅助因子或P53转活活性小分子的序列变异。开发了不同的基础研究和翻译研究应用。在实验中,这些方法利用了酵母模型的两个主要优点。一方面,基因组编辑的简便性,通过利用仅在特定P53-RE水平上不同的同源菌株来调查P53依赖性的序列特异性,从而快速构建定性或定量报告系统转换。另一方面,对于异位P53表达的调节系统的可用性,可以评估各种蛋白质表达的转能。本报告综述了基于色重报告基因、荧光素酶和酵母生长的广泛使用的系统,以说明其主要方法步骤,并批判性地评估其预测能力。此外,这些方法的极端多功能性可以很容易地用于研究不同的TF,包括P63和P73,它们是TP53基因家族的其他成员。

Introduction

转录是一个极其复杂的过程,涉及对染色质区域RNA聚合量的招募和调制的转录因子(TF)和辅助因子的动态、空间和时间组织,以响应特定的刺激1.大多数TF,包括人类P53肿瘤抑制剂,以称为反应元素(REs)的DNA序列的形式识别特定的cis-行为元素,这些元素由单(或多种)独特的图案+6-10核苷酸长组成。在这些主题中,个别位置可能显示不同程度的变异2,通常用位置权重矩阵 (PWM) 或徽标 3、4 汇总。

母S.cerevisiae是一个合适的模型系统,通过补充测定、异位表达和功能测定来研究人类蛋白质的不同方面,即使不存在正交酵母基因56,7.由于转录系统8的基础成分的进化保存,许多人类TF(当在酵母细胞中异位表达时)可以通过工程的启动子来调节报告基因的表达。包含适当的 R。此处为人类 P53 提供的转录模型系统具有三个主要变量的特征,其效果可以调制:1) P53 的表达方式和类型,2) RE 序列控制 P53 依赖转录,3) 类型记者基因 (图 1A).

关于P53表达的方式,S.cerevisae允许选择诱导的、可抑制的或构成的促进者9,10,11。特别是,诱导的GAL1启动子允许酵母中的TF的基底(使用拉菲诺作为碳源)或变量(通过改变介质中的乳糖量)表达TF。事实上,精细可调的表达代表了一个关键的发展,不仅P53本身,但也研究其他P53家族蛋白质12,13。

关于控制P53依赖性表达的RE类型,S.cerevisae允许构建不同的报告器菌株,这些菌株在其它异源背景中具有感兴趣的RE的独特差异。这一目标是通过适应一种特别通用的基因组编辑方法,在S.cerevisiae开发,称为delitto perfetto 12,14,15,16。

此外,不同的报告基因(即URA3、HIS3和ADE2)可用于定性和定量评估S.cerevisae中人类TF的转录活动,每个基因具有特定特征, 应以适应实验需要17,18,19,20,21。这些报告基因的表达分别赋予了尿原体、组氨酸和阿丁原体。URA3报告器不允许在存在5-FOA的情况下细胞生长,因此可以反选择。ADE2报告器系统的优点是,除了营养选择外,它还允许识别表达野生型(即ADE2表达功能)或突变体(即ADE2上不起作用)的酵母细胞) P53 来自殖民地颜色。

例如,表达ADE2基因的酵母细胞在含有限制定量的阿丁鱼(2.5-5.0mg/L)的板上产生正常大小的白色菌落,而那些质量差或没有转录的细胞则在同一块板上出现较小的红色(或粉红色)殖民地。这是由于在脱胶生物合成通路(即P-ribosylamino-imidazole,以前称为氨基-依米达索核糖酸或AIR)中积累的中间体,该中间体被转换成红色颜料。基于定性颜色的ADE2报告基因已被用定量的萤火虫Photinuspyralis(LUC1)12、22所取代。最近,ADE2记者与lacZ记者进行了一个易于评分、半定量、双报机分析的合并,可以根据P53突变体的残余功能水平对其进行子分类。23.

荧光报告机,如EGFP(增强的绿色荧光蛋白)或DsRed(迪斯科索玛sp.红色荧光蛋白)也被用于定量评估与所有可能的误感突变相关的变活活性。TP53编码序列24.最后,P53等位基因表达的可调启动子与RE和/或报告基因的异源酵母菌株相结合的机会,导致开发一个数据矩阵,生成癌症相关和生殖系的精细分类突变P53等位电25,26,27 。

上述方法用于测量P53蛋白的转录活性。然而,在酵母S.cerevisiae28和Schizosaccharis pombe29中野生型P53的表达可能导致生长迟缓,这与细胞周期阻滞28、30或细胞死亡31。在这两种情况下,酵母生长抑制由高P53表达触发,并与参与细胞生长的内源酵母基因的潜在转录调制相关。支持这一假设,功能丧失突变体P53 R273H在以与野生型P5332相似的水平表示时,不会干扰酵母细胞的生长。相反,在酵母中表达的有毒突变体P53 V122A(已知比野生型P53的转录活性更高)比野生型P533产生更强的生长抑制作用。

此外,证明人类MDM2能够抑制人类P53转录活性在酵母,促进其普及和随后的降解33。因此,人类MDM2和MDMX抑制P53诱导酵母生长抑制的能力被证明为32,34。在另外一项研究中,建立了P53转录活性与反应性表达水平之间的相关性,在酵母32中的ACT1基因上鉴定了假定的P53 RE上游。始终,行为蛋白表达由野生型P53增强,P53 V122A更增强,但突变P53 R273H更增强。相反,P53的活性素表达在P53抑制剂MDM2、MDMX或pifithrin-α(P53转录活性的小分子抑制剂)的共存在中减少,与基于酵母生长测定的结果一致。重要的是,这些结果建立了P53诱导的生长抑制与其在酵母中的活性程度之间的相关性,也用于识别和研究调节P53功能的小分子28,34,35.

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Protocol

1. 构建含有特定RE(yAFM-RE或yLFM-RE)的ADE2或LUC1报告酵母菌株

  1. GAL1促进剂下,可分得 yAFM-ICORE 或 yLFM-ICORE 菌株 12、14(ICORE = I,ISce-I 内分糖;CO = 计数器可选URA3;RE = 记者KanMX4授予卡那霉素耐药性;表 1)从15%甘油储存在-80°C在YPDA琼脂板上(表2)。让它在30°C下生长2-3天。
  2. 从新鲜板(不超过3周)取一个酵母菌群,并将其放入含有5 mL YPDA的小瓶中(表2)。在 30°C 孵育过夜,在 150-200 rpm 下摇动。
  3. 第二天,为了去除所有脱胶的痕迹,在3,000 x g下粒细胞2分钟,并通过管的倒置丢弃上清液。
    注:在室温 (RT) 下执行此协议中的所有离心。
  4. 将细胞颗粒悬浮在含有角质酶的预加热CM(完整介质)的30-50 mL中,并在30°C下孵育4小时,在150-200rpm下摇动(对I-SceI的诱导是必要的)。
  5. 在 3,000 x g下将细胞离心 2 分钟,并通过管的反转丢弃上清液。
  6. 在30-50 mL的无菌水中重新悬浮细胞颗粒。重复步骤 1.5。
  7. 将细胞颗粒重新悬浮在10 mL的无菌水中。重复步骤 1.5。
  8. 将细胞颗粒重新悬浮在5 mL的无菌LiAcTE(表3),一种有利于脱氧核糖核酸的离子溶液。重复步骤 1.5。
  9. 在250μL无菌LiAcTE中重新悬浮细胞颗粒,并将细胞转移到1.5 mL管中。重复步骤1.5,在300-500μL无菌LiAcTE中重新悬浮细胞颗粒。
  10. 在哺乳期间,在100°C下变性鲑鱼精子DNA载体的10mg/mL溶液10分钟,并立即在冰上冷却,将其保持为单链DNA。
  11. 在单独的1.5 mL管中,加入所需的寡核苷酸(表3)、5 μL的煮鲑鱼精子载体DNA、300μL无菌LiAcTE PEG(表3)和酵母细胞悬浮液50μL(从步骤1.9开始)。
  12. 涡旋管10秒混合和孵育30分钟,在30°C,在150-200rpm下摇动。将 1.5 mL 管放在侧面,以有利于摇动。
  13. 热冲击酵母细胞在加热块42°C下15分钟,然后在10,000 x g下将细胞离心20秒。去除上清液,在1 mL无菌水中重新悬浮细胞。
  14. 在YPDA琼脂板上将细胞悬浮液100μL扩散,并在30°C下孵育(倒置)1天。为了确保获得分离良好的菌落,也传播100μL的1:10稀释。
  15. 第二天,复制板使用无菌天鹅绒到CM琼脂板含有德克斯罗斯和5-FOA(表2)。如果转移了许多细胞(即 URA3 细胞的某些生长),请考虑在新板上的第二个复制板。
  16. 三天后,复制板在非选择性YPDA和YPDA含有G418(一种类似于卡那霉素的氨基糖苷抗生素)琼脂板(表2),标记每个板,以方便其后续比较。在30°C下孵育板。
  17. 第二天,识别来自G418敏感但在YPDA板块(例如,yLFM-或yAFM-RE菌落)上生长的菌落的候选报告株。在新的YPDA板上对已识别的菌落(3-6个菌落)进行划线,以获得单菌落分离物,并在30°C下生长2天。
  18. 在YPDA板上修补单酵母菌落,分离菌落,以便进一步分析。在30°C下24小时后,通过在YPGA琼脂板上复制电镀(表2)进行测试,防止小突变体(即呼吸缺陷突变体)的生长。同时,复制板上新的YPDA琼脂板。
  19. 测试步骤1.18中的正确斑块(即YPDA和YPGA琼脂板上的生长;1-3个菌落),以检测菌落PCR是否存在正确的寡核苷酸整合。加入5 μL的10x PCR缓冲液(1.5 mM MgCl2),2 μL的10片皮莫洛/μL底漆(表3),4μL的2.5 mM dNTP,0.25 μL的5U/μL塔克聚合酶,水到50μL的最终体积。将需要筛选的酵母菌群的数量的反应混合物相乘,并将50μL等分成每个PCR管。使用移液器,从YPDA琼脂板中加入非常少量的酵母细胞到单个PCR反应混合物中。
  20. 使用以下程序执行 PCR 反应:94 °C 8 分钟,随后在 94°C 下进行 35 次变性 1 分钟,引水退火在 55°C 下退火 1 分钟,在 72°C 下延长 2 分钟。
  21. 反应完成后,在胶凝剂凝胶上加载PCR反应的等分(约体积的十分之一),以检查正确的尺寸(+500 bp)。
  22. 使用商业套件对纯化后的 PCR 产品进行序列化,以使用步骤 1.19 的相同引物确认所需 RE 序列的集成。
  23. 验证正确序列后,制作 15% 的甘油,储存 yAFM-RE 或 yLFM-RE 菌株培养(在 YPDA 中),并将其储存在 -80°C。

2. 使用基于定性的ADE2酵母测定评估P53蛋白转活能力

  1. 使用 yAFM-RE 应变(表 1) 重复步骤 1.1 和 1.2。
  2. 后天,在预加热YPDA的30-50 mL中稀释细胞培养(1:10),通过摇动继续在30°C下孵育,直到OD600nm达到0.8-1.0(±2小时)。
  3. 重复步骤 1.5-1.10。
  4. 在单独的1.5 mL管中,加入300-500纳克的酵母P53(或对照)表达载体(表4),5μL的煮鲑鱼精子DNA载体,300μL无菌LiAcTE PEG,和50μL的酵母细胞悬浮液。
  5. 重复步骤1.12和1.13,但将细胞颗粒重新悬浮在300μL无菌水中。
  6. 将细胞悬浮液的100μL扩散到含有德克斯罗作为碳源和高量阿地宁(表2)的合成选择性(P53表达或对照载体)板上,然后在30°C孵育(倒置)2-3天。
  7. 在新的选择性板上,在单酵母转化菌落(每板2-6条条纹)上,让它们在30°C下生长过夜。
  8. 第二天,使用无菌天鹅绒复制板到新的选择性板,允许评估颜色表型(即,含有德克斯罗斯的板作为碳源,但限制阿丁的量;表 2)。在30°C下倒置孵育板3天。可选,为了评估P53蛋白的温度敏感性,在三种不同的温度下孵育3天:24°C、30°C和37°C。
    注: 相同的条纹可以多次复制。
  9. 要评价P53蛋白的转化能力,请检查酵母菌落的基于颜色的表型,比较P53蛋白表型与P53野生型和空载体表型。

3. 使用基于定量发光的LUC1酵母测定评估P53蛋白转活能力

  1. 使用协议2中描述的基于LiAc的方法,使用P53(或对照)表达载体(表4)转换酵母细胞。使用 yLFM-RE 应变 (表 1.
  2. 在新的选择性板上修补单转化剂,以含有高含量的葡萄糖作为碳源,让它们在30°C生长过夜。对于每种转换类型,制作 5-7 个不同的修补程序。
  3. 在一夜的生长后,使用无菌牙签或移液器尖端从板中重新悬浮少量酵母细胞,其中含有德克斯罗斯或拉菲诺丝作为碳源(透明96孔板中的200μL最终体积,带圆形或平底)。如果实验需要诱导的P53表达,在拉菲诺西中加入加乳糖以调节感应水平(表2)。
    注:这些细胞悬浮液的OD600nm应为约0.4,且不得高于1。
  4. 使用多标签板读片器在可诱导的 P53 表达式(30°C 时 4-8 小时,150-200 rpm 晃动)后,在 OD600nm下测量每个孔的吸光度。通过将每个孔与多通道移液器混合,确保电池悬架均匀。
  5. 将10-20 μL的细胞悬浮液从透明96孔板转移到白色384(或96)孔板中,并与相同体积(10-20 μL)的液化缓冲液混合。在摇床(150-200 rpm)上在RT下孵育10-15分钟,实现细胞向荧光素酶基底的渗透。
  6. 加入 10-20 μL 的萤火素荧光素基板,并通过多标签板读取器测量光单元 (LU)。
  7. 要确定 P53 蛋白质转换能力,请将每口井的 LU 标准化到相应的 OD600nm(相对光单位,RLU)。计算3-4个酵母转化菌落块的平均RLU和标准偏差。
  8. 比较 P53 蛋白质与 P53 野生型和空矢量的换活化数据,方法是减去使用空矢量获得的值,或者除以使用空矢量获得的值(即计算感应折叠)。
    注:P53转活活性也可在存在P53相互作用蛋白(即MDM2和MDMX)和/或包括药物治疗的情况下使用相同的实验设置进行评估。

4. 使用酵母型皮测定评估P53蛋白生长抑制

  1. 使用第 2 节中描述的基于 LiAc 的方法,使用 P53/MDM2/MDMX(或对照)表达载体(4) 转换酵母细胞。使用CG379菌株(表1),在最小选择性板上传播酵母转化剂(表2)。
  2. 在最小选择性培养基(表2)中生长转化细胞,约1个OD600nm。
  3. 在选择性诱导介质中将酵母细胞稀释至0.05 OD600nm(表2),并可选择将选定的小分子添加到适当的浓度(或仅溶剂),以测试其在重新激活突变P53或抑制MDM2方面的有效性。/MDMX-P53 交互。
  4. 在连续轨道晃动(200 rpm)下,在30°C下孵育细胞约42小时(负对照酵母达到中对数阶段所需的时间,约0.45 OD600nm)。
  5. 在最小选择性板上点100μL等分的酵母细胞培养物(表2)。
  6. 在30°C孵育2天。
  7. 通过计算在100μL培养液滴中获得的菌落数量(菌落形成单位,CFU计数)来测量酵母生长。例如,计算化合物的突变重新激活效果,考虑野生型P53表达酵母的生长作为最大可能效果(设置为100%),而表达突变P53(但暴露于溶剂控制)的细胞的生长表示零级别的重新激活。

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Representative Results

建造ADE2LUC1记者 酵母菌株

Delitto perfetto 方法12、14、15、16已经过改造,可实现 P53 报告酵母菌株的构造 (图1B)。该方法采用单链或双链寡核苷酸,两端至少含有30个核苷酸,与选定的积分点一同源。具体来说,同源性对应于双标记盒ICORE集成部位的序列,包含KlURA3和kanMX4(报告基因提供抗遗传,G418)之前定位在期望的目标站点15,16。此盒还包含酵母 I-SceI 内糖酶编码序列,在可诱导的GAL1启动子及其共生目标位点下。因此,在酵母细胞转化之前,在具有所需序列的含乳酸酶介质中切换可产生I-SceI表达,并随后在ICORE集成位点产生单双链断裂(DSB)。DSB 的存在高度刺激了定位事件的频率,通过一次转换获得 1,000 多个替换。

在基于获得对5-FOA的抗性和对G418的敏感性的靶向和选择过程结束时,候选克隆通过基于聚位PCR的增聚和桑格测序来确认,以验证所需的 P53 RE (图 1C)。在菌株构建协议结束时,大约一周后即可完成,获得一组同源性报告酵母菌株,可用于评估 REs 序列的差异如何影响 P53 的转活能力蛋白。

功能异质突变P53s

在人类肿瘤中,TP53基因主要受单个误感突变的影响,这些突变通常涉及六个主要热点残留物(R175、G245、R248、R249、R273和R282),位于P53蛋白的中央DNA结合域(DBD)。然而,超过2000个单P53氨基酸替代已被记录,包括一些不常观察到27。突变P53可以分为DNA接触或结构突变体,这取决于氨基酸替代对DNA-蛋白质接触(例如,R273H)或蛋白质结构(例如,R175H)36的影响。单TP53错感突变影响P53功能,产生广泛的功能多样性,影响肿瘤攻击性、化学抗药性和转移电位等重要临床特征3738,39.

突变体P53在功能上异质的概念在过去15年中通过TP53突变数据库中的大量实验数据(例如)27明显出现了。开发了基于酵母和/或哺乳动物报告器系统的不同功能检测,突出了突变体 P53 的不同特性(即,转能、温度敏感性、显性负电位、对P53家族的成员,与其他TF的互动13,24,40,41,42,43,44。最全面的功能研究通过描述其转因活性对8个不同的P53 REs24,在酵母基的测定中检查了2,300多个突变体。

数据证实,几乎所有涉及热点残留物的突变P53都失去功能(即,它们完全失去了转化活性)。相反,在癌症45中,一般在中低频发现、中低频率的突变P53是部分功能突变体,在P53 REs13上保留一定程度的转化活性。17.图2A中给出了使用ADE2测定来研究所述P53蛋白质功能异质性的例子。事实上,虽然R175H是一种功能丧失的突变体,在测试的每个条件下产生红色菌落,R282W显示的温度敏感性,使用依赖角质酶的P53表达(即,在P21-5' RE应变中的37°C下的红色扇区)含有下半乳酸的板,在较高的半乳酸片中变成粉红色)。图 2B显示了 P53 突变体和报告菌株扩展面板的结果摘要。

这种P53功能异质性的存在促使人们探索这种异质性是否与TP53生殖系突变受试者在临床水平上观察到的异质性平行。TP53生殖系突变是一组癌症易感性障碍的分子基础,包括更严重的利弗劳梅尼(LFS)和利弗劳梅尼型(LFL)综合征,以及较不严重的非合成性易感性(FH)或没有(无FH)家族史46。

该协议通过将所有TP53生殖系突变等位基因的基于酵母测定的转活能力与IARC数据库的相应临床数据匹配来突出基因型-表型相关性。"不,http://www-p53.iarc.fr/Germline.html>;在更严重的癌症易发综合征中发现功能丧失的P53突变体,而在不太严重的癌症易发性条件下发现部分功能P53突变体。这表明P53残留转活能力影响遗传TP53突变并发展为癌症的患者临床表型25、26。

REs 内的核苷酸序列变异控制 P53转换潜力

人P53是四元体(二分器)TF。每个 P53 二聚体识别由 10 个核苷酸组成的 RE(RRRCWWGYYY、R = A 或 G;W = A 或 T;Y = C 或 T)47,48.两个这样的半位点可以相邻或间隔多达13-20个核苷酸,构成一个功能性的P53 RE。然而,具有垫板的P53 RE具有比P53 RE更低的P53亲和力和跨激活性,没有间隔49,50,在不同的系统中有不同的功能测定。

最近证明,半位点可以招募P53四联体,结合功能测定和染色质免疫沉淀研究,这些发现表明P53也可以作用于非规范的R,包括半地点及四季地点48、52。此外,完全一致P53 RE主题是非常退化(RRRCWWGYYY)2这一事实预预表示,个别RE在顺序和结合亲和力上可能有很大差异。考虑到人类基因组41、48中已识别了数百个P53靶基因,几乎所有P53 REs都表现出彼此间的相似序列。此外,据推测,具有独特DNA结合亲和力的RE是在P53靶基因的启动子中选择的,这些基因涉及细胞周期抑制或凋亡53。

在恒定的基因组位置对P53 RE的许多变异体进行酵母分析,确定了核苷酸变异、间隔和组织RE半位点对转活能力的影响49。它甚至导致发现多态P53 RE与两个等位点明显不同的相关启动子到P53 14,54,55的响应能力。最近,从 P53 RE 序列特征和基于酵母的转活电位派生的信息已编码在 p53 检索器中,这是一种模式搜索算法,能够根据其规范和非规范的 RE 进行本地化和排名。预测整个人类基因组的转能潜力52。

作为使用测定来研究序列特异性P53转活电位的示例,这里介绍了人类野生型P53和来自Caenorhabdis elegans的进化远型P53蛋白的比较(图3)。这些结果是最近一项研究的后续结果,该研究探讨了P53蛋白中转活化特异性的进化差异56。如协议所述,共生yLFM-RE报告菌株被开发出来。具体来说,从ced13基因57和四个变异(V1-V4)衍生的Cep-1 P53 RE进行了比较(图3A)。RE变型的构造是为了检查分离两个分子图案(在ced13中为28个核苷酸)的间隔器长度的变化,并检查CWWG核心图案两侧的核苷酸的变化(在ced13中,其为A/T富;而在最高的亲和力人类P53 RE,是G/C丰富)58。结果清楚地表明了Cep1和人类P53在转能特异性方面是如何分化的。事实上,虽然人类P53介导的换因被垫板的存在(图3B)强烈抑制,但Cep-1活性则被拆卸间隔器所抑制(图3C)。此外,当 RE 从 A/T-修改为 G/C 富时,Cep-1 介导的转因被废除。人类P53和Cep-1都不能从从ced13 RE派生的单个decamer转用。

寻找P53-MDM2/MDMX相互作用和突变P53活性的再激活器的小分子干扰物

人类P53的生长抑制作用与其在酵母中的活性程度之间的既定相关性导致基于酵母细胞生长测量的简化筛选测定,以分析干扰因子对P53活性的影响(图4).酵母型荧型测定对筛选潜在抗癌剂的有效性已在多项作品中得到证明。使用酵母细胞共同表达P53及其抑制剂MDM2和/或MDMX,通过它们抑制MDMM对P53的负面影响的能力,确定了这些相互作用的新干扰,从而重新建立野生型P53诱导的酵母生长抑制(图 4A.特别是,这一测定结果发现1号苯丙酮1作为第一个P53-MDM2相互作用抑制剂,与Xanthone支架34和2)奥克索索索林酮抑制剂的P53-MDM2相互作用59。此外,通过这种测定,β-芒果素和甘博吉酸首次被描述为P53-MDM2相互作用30的潜在抑制剂。

后来,同样的测定表明,对角孔的先发增强了它们破坏P53-MDM2相互作用60的能力。有趣的是,这种酵母测定也导致了P53-MDM2/MDMX相互作用的两种抑制剂的发现:色氨酸醇衍生的奥他拉多利酮乳糖OXAZ-161和色氨酸醇衍生的奥萨洛索索多利酮DIMP53-162。

功能丧失突变P53对酵母细胞生长的影响减少,也已经探索筛选突变P53-复活药物,其特点是能够恢复野生型生长抑制活性突变P53(图4B)。通过这种酵母测定,确定了突变P53 R280K的再活化剂,即苯丙酮醇衍生的奥萨索索索多利诺SLMP53-163。图4C,D显示了在酵母中获得具有代表性的结果,用P53的表达或用P53-MDM2相互作用的抑制剂Nutlin-3a或用P53突变体Y220CPhiKan083的再激活剂进行治疗。

验证这些化合物作为P53活化剂的分子机制及其抗肿瘤活性,在人类肿瘤细胞系34,60,61,62,63和动物模型62,63,证明了酵母型样测定在药物发现的巨大潜力。

Figure 1
图 1:基于酵母的P53转活化测定的特点和用于P53报告酵母菌株构造的工作流程。(A)基因组操作的简便性和受控的异位基因表达使酵母类似于"体内试管",其中严格探讨了与检查P53转能功能相关的几个变量。这些变量包括野生型或突变性P53蛋白的表达水平、RE的序列和报告基因的类型[定性/半定量(如ADE2和LACZ)或定量(如LUC1)]。 共识RE序列是高度退化的(RE = RRRCWWYYY-n-RRRCWWGYYYy;R = 紫菜;W = A/T;Y = 苯丙胺;CWWG = CORE 序列,n = 0-13 bps 间隔器)。共识、CORE 序列和基对间隔器数不匹配的数量将影响转换活动。此面板已由以前的出版物64中修改。(B)采用德尔托perfetto方法的方案,在驱动ADE2或LUC1报告基因表达的最小启动子上游引入所需的P53 RE。该协议改编自以前的出版物12,15,16。(C)寡聚物RE整合部位周围区域酵母菌群PCR扩增结果的例子。电泳图像显示两个假定阳性菌落(URA3减和G418敏感)的扩增结果,在1kbDNA阶梯(Promega)旁边对应的PCR阴性对照。使用表 3中描述的引种的预期 ±500 nt 频段可以排序,以确认正确的启动子编辑,如电图所示。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:P53蛋白显示RE特异性和温度敏感转活电位。野生型P53和指示TP53误感突变在酵母中使用基于质量的彩色检测器检测,并利用含有不同P53 REs控制ADE2基因表达的报子菌株。(A) 显示了 P53 野生型、R175H 和 R282W 的菌落颜色表型示例,该图与 PUMA (BBC3) 和 P21-5' REs 一起,在 30°C 和 37°C 下。比较中度(0.008%加托塞)和高(0.12%加乳酸)P53表达。(B) 在三个温度下(24°C、30 °C和37°C)对P53依赖性菌落颜色表型进行了扩展的P53突变体和酵母报告菌株检查的结果。结果为突变P53等位基因的功能异质性进行了举例说明,并采用表格式进行总结。例如,R175H 是功能损失突变体,而 G199H 是野生型 P53 样。K139E 和 R282W 分别保持部分功能,并表现出冷灵敏度和热灵敏度。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:人类P53和功劳正交Cep-1表现出高度分化的特异性。(A) 序列:人类 P53 RE 共识序列、从ced13基因派生的 Cep-1 P53 RE,以及功能测定中测试的四个变体 (V1-V4)。(B) 在利用三种不同的碳源诱导人体P53表达8小时后进行转活,以达到低、中度和高表达(0.008%、0.032%、0.12%加糖,在含有2%的拉菲诺的选择性介质中加入0.12%的乳糖)。结果表示为平均相对光单位 (RLU) 和四个复制的标准误差。使用空表达式向量转换的单元格的单元的单元的单元活动被减去。(C) Cep1的转活特异性,如(B)中所测量的。对于这两种蛋白质,转活化水平与加乳酸酶的量成正比。当人类P53表示时测量的较高光单位可能取决于不同水平的蛋白质量产生,由于蛋白质长度的差异,并且可能也发生在柯顿使用中。这两种蛋白质的特点是对测试的不同R的跨活化特异性不同,并且该特性不受相对蛋白质量可能差异的影响。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:使用酵母型皮测定鉴定的P53小分子活化剂。(A)酵母细胞共同表达人类野生型P53和MDM2或MDMX,用于寻找P53-MDM2和P53-MDMX相互作用的抑制剂。在此系统中,相互作用抑制剂恢复酵母细胞中P53诱导的酵母生长抑制,共同表达P53和MDM2或MDMX。这种方法允许识别P53-MDM2相互作用的抑制剂,并识别P53-MDM2和P53-MDMX相互作用的双重抑制剂。(B)表达人类突变P53的酵母细胞已用于寻找突变P53重新激活剂,并能够恢复突变P53表达酵母细胞中野生型P53诱导的酵母生长抑制。(C)板点测定的代表性图像,显示野生型P53或突变Y220C对酵母菌群生长的影响与空载体相比(参见步骤4.5)。(D)生长测定的定量结果:10 μM Nutlin-3a在共同表达MDM2的细胞中恢复P53诱导的酵母生长抑制;50 μM PhiKan083 将野生型 P53 诱导酵母生长抑制还原到突变 P53 Y220C。这两种效应都绘制相对于野生型P53的酵母生长抑制效应,它被设置为一。请点击此处查看此图的较大版本。

应变名称和基因型 具体用途 协议编号
yAFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 他 3-11,15 罐1-100;ICORE::pCyc1::ADE2 它用于构建yAFM-RE 应变(MATaleu2-3,112 trp1-1-1 他的 3-11,15 罐1-100;ICORE::pCyc1::ADE2),在定性的基于颜色的ADE2测定中加以利用。 协议 1,2
yLFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 他 3-11,15 罐1-100;ICORE::pCyc1::LUC1 它用于构建yLFM-RE 应变(MATaleu2-3,112 trp1-1-1 他的 3-11,15 罐1-100;RE::pCyc1::LUC1),在基于定量发光的LUC1测定中加以利用。 协议 1,3
CG379: MATa, ade5 他的 7-2 leu2-112 trp1-289ura3-52 [基尔-O] 它用于型型生长测定。 协议4

表 1:酵母菌株。

媒体名称和配方 具体用途 协议编号
YPDA(2%酵母提取物,2%肽,2%德克斯罗,200毫克/L阿丁)• 2% 琼脂 无琼脂的YPDA最好通过过滤进行灭菌。YPDA + 琼脂通过高压灭菌消毒;在浇注盘子之前,可以从配方中省略去电糖,并在水中加入20%的过滤灭菌溶液中的德克斯罗。 协议 1-4
CM [0.17% 酵母氮碱无AA和硫酸铵,0.5%硫酸铵,5%(体积/体积,v/v)非必需氨基酸溶液,20毫克/L硫氨酸,20毫克/升色氨酸,20毫克/升尿素,20毫克/升尿素,30毫克/L赖氨酸,100毫克/L氧化铝,200毫克/L-2% 半乳酸 介质通过过滤进行灭菌。以下无菌库存溶液在水中制备(尿素除外,即溶解于0.1M NaOH)通过过滤:非必需氨基酸溶液(0.04%精氨酸,0.04%蛋氨酸,0.06%无独氨酸,0.1%苯丙氨酸,0.2%谷氨酸酸, 0.2% 阿斯巴酸, 0.3% 甘氨酸, 0.4% 三丁胺, 0.8% 丝氨酸), 1% 分氨酸, 1% 锥体, 1% 尿素, 1% 赖氨酸, 1% 亮氨酸, 0.5% 脱氨酸, 20% 甘油素.由于晶体的形成和沉淀,阿丁酸盐溶液不得储存在冰箱中。色氨酸库存溶液必须储存在黑暗中。 协议1
CM(见上文) = 2% 德克斯罗斯= 1g/L 5-FOA = 2% 琼脂 介质(含有不含AA和硫酸铵、硫酸铵和Agar的酵母氮基)通过高压灭菌进行灭菌。其他成分在高压灭菌后添加,以保存热性抗性成分;5-FOA 粉末冷却至约 55°C 后可直接添加到介质中。 协议1
YPDA = 400 μg/mL G418 = 2% 琼脂 一旦介质冷却到约 55°C,必须在高压灭菌后添加 G418。如果从粉末开始,50 mg/mL G418 库存溶液可在水中制备,并通过过滤进行灭菌。 协议1
YPGA[2%酵母提取物,2%肽,2%甘油(v/v),200毫克/L阿丁宁]• 2% 琼脂 介质通过高压灭菌进行灭菌。 协议1
合成选择性板:[0.17% 酵母氮碱,不含AA和硫酸铵, 0.5% 硫酸铵,5%(v/v)非必需氨基酸溶液(0.04%精氨酸,0.04%蛋氨酸,0.06%硫磷,0.1%苯丙氨酸,0.2%谷氨酸,0.2%阿斯巴酸,0.3%迷氨酸,0.4%三叶素, 0.8% 丝氨酸), 20 毫克/L 血氨酸, 20 毫克/L 尿素, 20 毫克/L 色氨酸 (取决于载体选择标记), 30 毫克/L 赖氨酸, 100 毫克/mL 亮氨酸 (取决于矢量选择标记), 5 毫克/升或 200 毫克/L 阿丁素* = 2% 德西龙 + 2% 琼脂 介质(含有不含AA和硫酸铵、硫酸铵和Agar的酵母氮基)通过高压灭菌进行灭菌。其他成分在高压灭菌后添加,以保存热性成分。当使用基于pLS和pLSG的载体准备板时,不含亮氨酸。当使用基于pTS和pTSG的载体准备板没有锥子。 协议 2-3
合成选择性介质:[0.17% 酵母氮碱,不含AA和硫酸铵, 0.5% 硫酸铵,5%(v/v)非必需氨基酸酸溶液(0.04%精氨酸,0.04%蛋氨酸,0.06%冰氨酸,0.1%苯丙氨酸,0.2%谷氨酸,0.2%阿斯巴酸,0.3%迷幻素,0.4%三叶素, 0.8% 丝氨酸), 20 毫克/L 肾上腺素, 20 毫克/L 尿素, 20 毫克/L 色氨酸 (取决于载体选择标记), 30 mg/L 赖氨酸, 100 mg/mL 亮氨酸 (取决于矢量选择标记), 200 毫克/L 阿地宁] = 2% 德克斯或拉菲诺斯 = 0-2% 乳酸 介质通过过滤进行灭菌。在药物治疗中使用基于pLS或pTS的载体时,培养不含亮氨酸或锥度丹的培养基,但分别含有2%的dextrose。当使用pLSG-或pTSG基载体在诱导P53表达与或不药物治疗准备培养基培养基,分别无亮氨酸或色氨酸,但分别含有2%的乳糖和可变量的乳糖调节P53表达。P53诱导的程度也可以通过改变孵育时间来调节。 协议 3
最小选择性板:2%葡萄糖,0.7%酵母氮碱(不含氨基酸和硫酸铵),50毫克/L阿丁,50毫克/L尿素,50毫克/L异氨酸,50毫克/L色氨酸(取决于载体选择标记),50毫克/升亮氨酸(取决于矢量选择标记),2% 琼脂 介质通过高压灭菌进行灭菌。当使用基于pLS89的向量时,准备不含锥子的介质。使用 pLS89 空载体(不表达任何蛋白质)作为阴性对照。当使用基于pLS89和pGADT7-MDM2的载体(P53和MDM2的共同表达)时,制备不含亮氨酸和锥度胺的培养基。使用 pLS89 空和 pGADT7(均不表达任何蛋白质)作为负对照。当使用基于pLS76的载体准备不含亮氨酸的培养基。使用pRS315载体(不表达任何蛋白质)作为阴性对照。 协议4
最小选择性介质:作为最小选择性板,但没有琼脂 介质通过过滤进行灭菌。 协议4
选择性诱导培养基:作为最小选择性培养基,但含有2%的加糖,而不是葡萄糖 介质通过过滤进行灭菌。 协议4

表2:酵母介质。

解决方案名称和配方或引种名称和顺序 特定功能和使用 协议编号
LiAc/TE: 10 mM Tris-HCl,pH 8.0,带 1 mM EDTA 和 0.1M 醋酸锂 以下水中无菌库存溶液通过高压灭菌制备:1M 醋酸锂 pH 7.5,1 M Tris-HCl / 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE 缓冲液 10X)。 协议 1-4
PEG/LiAc/TE:40%聚乙烯乙二醇(PEG),10 mM Tris-HCl,pH 8.0,带1 mM EDTA和0.1M醋酸锂 以下水中无菌库存溶液通过高压灭菌制备:1M 醋酸锂 pH 7.5,1 M Tris-HCl / 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE 缓冲液 10X),50% PEG(分子量 +3350)。 协议 1-4
RE 寡核苷酸的同源尾:
5' gggatatatattttatatatatatat-RE-gagatgccggttagggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg'
提供同源尾部的序列,对应于集成 ICORE 盒的两侧染色体序列;RE = RE 序列。 协议1
引性:Ade2 Fw: 5'-AAGTGCCTTTCATGAA-3';
Ade2 Rv: 5'-GGAGCCATATGGT-3';
Luc1-Rv: 5'-CATAGCTCTGCCAA-3'
对于 yAFM-RE 菌株(PCR 和测序),将 Ade2 Fw 与 Ade2 Rv 引热相结合。对于 yLFM-RE 菌株(PCR 和测序),将 Ade2 Fw 与 Luc1-Rv 引热剂相结合。 协议1

表3:溶液和寡核苷酸。

矢量类型 正控制与负控制 协议编号
P53(或控制)矢量。
基于pLS-或pLSG:P53蛋白表达在构成性ADH1促进剂或巨细胞诱导GAL1启动子下,分别(LEU2作为选择标记)。
基于pTS-或pTSG:P53蛋白表达在构成性ADH1促进剂或甘蔗素诱导GAL1启动子下,分别(TRP1作为选择标记)
基于pLS和pLSG:分别用作正对照的pLS76和pLSG-P53向量(表示野生型P53);用作阴性对照pRS315载体(不表达任何蛋白质)。
基于pTS和pTSG:分别用作正对照的pTS76和pTSG-P53向量(表示野生型P53);用作阴性对照pRS314载体(不表达任何蛋白质)。
协议2,3
P53 和 MDM2(或对照)矢量。
基于pLS89:野生型P53蛋白表达下可诱导的GAL1启动子(TRP1作为选择标记)。
基于pLS76:在构成性ADH1启动子(LEU2作为选择标记)下突变P53蛋白表达。
基于pGADT7:MDM2蛋白表达在构成性ADH1启动子(LEU2作为选择标记)
基于pLS89:用作正控制pLS89-P53向量(表示野生型P53);用作阴性对照 pLS89-空(不表达任何蛋白质)。
基于pLS76:用作正对照的pLS76突变P53载体(表达突变P53);用作阴性对照pRS315载体(不表达任何蛋白质)。
基于pGADT7:使用作为正对照的pGADT7-MDM2载体(表示野生型MDM2);用作阴性对照pGADT7载体(不表达任何蛋白质)。
协议4

表4:酵母表达向量。

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Discussion

基于酵母的检测已被证明对研究P53蛋白功能的各个方面是有用的。这些测定对于评估P53对RE目标位点的变异性(包括功能多态性评价)特别敏感。彩色检测器的使用以及荧光酶测定的小型化,可产生成本效益和相对可扩展的测定。此外,生长抑制试验可能适用于化学库筛选,通过测量吸收性自动定量酵母细胞活力。虽然由于ABC运输机的细胞壁和作用而限制渗透性被认为是使用酵母进行药物筛选的一个限制,但基因改造,以改善接受能力已经成功地开发了22,65。

与哺乳动物细胞为基础的测定相比,基于酵母的P53测定可以改善直接命中的识别,因为P53与辅助因子和信号级联通路的惊人复杂性分离,这些辅助因子和信号级联路径调节其在较高真核生物中的功能。基于酵母的功能测定也部分成功地监测了P53与蛋白质辅助因子(即MDM2和MDMX 22、32、33、34)的相互作用,以及小分子(如Nutlin-3a)在这些相互作用。然而,基于酵母的检测对P53和相互作用蛋白之间的串扰的研究的敏感性和预测能力可能有些有限,这取决于体内的相互作用如何依赖于翻译后的修改和物种特定的信级联。

此处描述的系统可轻松适应其他 TF。事实上,酵母功能测定已经开发P53相关P63和P73蛋白42,49以及NF-+B系列66,67 [甚至一些家庭盒和基本螺旋环螺旋(bHLH)的成员TFs68,69*人类核受体也用酵母表达,并证明是依配体依赖的,序列特异性的TFs70。一个限制因素已经发现,一些哺乳动物的转活域(TAD)的能力弱,与酵母基础转录机械8相互作用,这一缺陷可以通过使用嵌合结构,包括活性异质TAD68,69.

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Disclosures

提交人声明没有利益冲突。

Acknowledgments

我们感谢欧洲联盟(FEDER基金POCI/01/0145/FEDER/007728通过竞争歌剧因素方案)和国家基金(FCT/MEC,发展基金和埃杜卡奥省)下伙伴关系协议 PT2020 UID/QUI/50006/2019 和项目 (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581。FCT研究金:SFRH/BD/96189/2013(S. Gomes)。这项工作得到了意大利都灵的Compagnia S. Paolo(项目 2017.0526)和卫生部的支持(项目 5x1000、2015 和 2016;2016 年当前研究)。我们深切感谢特雷莎·洛佩斯-阿里亚斯·黑山博士(特伦托大学实验科学教学实验室)协助进行录像。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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