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ヒトP53を研究する機能アッセイを開発するシャーシとしての酵母

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Summary

ここでは、ヒトP53トランス活性化の可能性、その様々な癌関連変異の影響、共発現相互作用タンパク質、および酵母サッカロマイセスセレビシエレポーター株を構築し、利用するための4つのプロトコルを示します。特定の低分子の効果。

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Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

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Abstract

よく知られている哺乳動物P53タンパク質が酵母S.セレビシエにおける転写因子(TF)として作用し得ることを知ることは、1)結合部位(すなわち、応答元素(RE)の影響を研究するための異なる機能的アッセイの開発を可能にした。P53トランス活性化特異性または2)TP53変異、共発現共起因子、またはP53トランス活性化活性上の小分子に関する配列変異。異なる基礎研究および翻訳研究アプリケーションが開発されました。実験的に、これらのアプローチは酵母モデルの2つの主要な利点を利用する。一方、ゲノム編集の容易さは、特定のP53-REのレベルでのみ異なるアイソジェニック株を利用して、P53依存性の配列特異性を調べることにより、定性的または定量的レポーターシステムの迅速な構築を可能にします。トランスアクティベーション。一方、異所性P53発現に対する調節システムの利用可能性は、広範囲のタンパク質発現におけるトランス活性化の評価を可能にする。この報告書でレビューされているのは、カラーレポーター遺伝子、ルシフェラーゼ、酵母の成長に基づく広範に使用されるシステムであり、その主な方法論的ステップを説明し、その予測力を批判的に評価する。さらに、これらのアプローチの極端な汎用性は、TP53遺伝子ファミリーの他のメンバーであるP63およびP73を含む異なるTFを研究するために容易に利用することができる。

Introduction

転写は、転写因子(TF)の動的、空間的、時間的組織を含む非常に複雑なプロセスであり、特定の刺激に応答してクロマチン領域におけるRNAポリメラーゼンの募集および変調のための共因子である1.ヒトP53腫瘍抑制剤を含むほとんどのTFは、単一(または複数の)ユニークなモチーフから成る応答要素(REs)と呼ばれるDNA配列の形で特定のシス作用要素を認識し、単一(または複数)のユニークなモチーフから成る〜6〜10ヌクレオチドを長くする。これらのモチーフの中で、個々の位置は、様々な程度の変動性2を示し、通常、位置重量行列(PWM)またはロゴ3、4によって要約される。

母S.セレビシエは、補体アッセイ、異所性発現、および機能アッセイを通じてヒトタンパク質の異なる側面を研究するための適切なモデルシステムであり、たとえ外来酵母遺伝子が存在しない場合でも5、6,7.転写系8の基底成分の進化的保存により、多くのヒトTF(酵母細胞で異所発現した場合)は、導約されたプロモーターを介して作用することによってレポーター遺伝子の発現を調節することができる。適切な R が含まれています。ヒトP53のためにここに提示された転写モデルシステムは、効果を変調することができる3つの主要な変数によって特徴付けられます:1)P53の発現とタイプのモダリティ、2)P53依存転写を制御するRE配列、および3)のタイプレポーター遺伝子(図1A)。

P53発現のモダリティに関して、S.cerevisiaeは、誘導性、抑圧性、または構成的プロモーター9、10、11の選択を可能にする。 特に、誘導性GAL1プロモーターは、酵母におけるTFの発現(炭素源としてラフィノースを用いる)または可変(培地中のガラクトースの量を変化させることによって)を可能にする。実際、微細に微細に微細に発現することは、P53自体だけでなく、他のP53ファミリータンパク質12、13を研究するための重要な開発を表す。

P53依存式を制御するREのタイプに関しては、S.cerevisiaeは、そうでなければ同種の背景に関心のあるREのユニークな違いを有する異なるレポーター株の構築を可能にする。この目標は、S.セレビシエで開発された特に汎用性の高いゲノム編集アプローチの適応を用いて達成され、デリット・パーフェット12、14、15、16呼ばれる。

さらに、異なるレポーター遺伝子(すなわち、URA3、HIS3、およびADE2)は、S.セレビシエにおけるヒトTFの転写活性を定性的かつ定量的に評価するために使用することができ、それぞれが特定の特徴を有する実験的ニーズに合わせて調整される17,18,19,20,21.これらのレポーター遺伝子の発現は、それぞれウラシル、ヒスチジン、アデニンプロトトロフィーを付与する。URA3レポーターは、5-FOAの存在下での細胞の増殖も許可しないため、逆選択することができます。ADE2レポーターシステムは、栄養選択に加えて、野生型(すなわち、ADE2発現で機能的)または変異体(すなわち、ADE2上では機能しない)を発現する酵母細胞の同定を可能にするという利点を有する。)コロニー色からP53。

えば、ADE2遺伝子を発現する酵母細胞は、制限量のアデニン(2.5-5.0 mg/L)を含むプレート上に通常サイズの白いコロニーを生成するが、不十分または転写しないものは、より小さい赤(またはピンク)と同じプレートに現れる。コロニー。これは、アデニン生合成経路における中間体の蓄積(すなわち、以前はアミノイミダゾールリボチドまたはAIRと呼ばれてきたP-リボシラミアミノアミノイミダゾール)に蓄積され、これは赤色顔料を形成するために変換される。定性的色ベースのADE2レポーター遺伝子は、その後、定量的なホタルホチホチピナスピラリス(LUC1)12、22に置き換えられました。最近では、ADE2レポーターはlacZレポーターと組み合わせることで、機能の残りのレベルに応じてP53変異体をサブ分類するために利用できる簡単に得点、半定量、ダブルレポーターアッセイを行っています。23.

EGFP(増強された緑色蛍光タンパク質)またはDsRed(ディスコスコスマsp. 赤色蛍光タンパク質)などの蛍光レポーターは、全ての誤解変異に関連するトランス活性化活性の定量評価にも使用されています。TP53コーディング シーケンス24.最後に、P53対立遺伝子発現の調節性プロモーターと、RE遺伝子および/またはレポーター遺伝子と異なる同種酵母株を組み合わせる可能性は、癌関連および生殖細胞系列の精製分類を生成するデータマトリックスの開発につながった。変異体P53ア列25、26、27.

上述のアプローチは、P53タンパク質の転写活性を測定するために使用される。しかしながら、酵母S.セレビシエ28およびシゾサッカロマイセスポンベ29における野生型P53の発現は、細胞周期停止28、30またはに関連している成長遅滞を引き起こす可能性がある。細胞死31.いずれの場合も、酵母増殖阻害は高いP53発現によって引き起こされ、細胞増殖に関与する内因性酵母遺伝子の転写変調の可能性と相関している。この仮説を支持して、機能喪失変異体P53 R273Hは、野生型P5332と同様のレベルで発現した場合、酵母細胞の増殖を妨げなかった。逆に、有毒変異体P53V122Aの酵母における発現(野生型P53と比較して転写活性が高いとして知られている)は、野生型P5332よりも強い増殖抑制効果を引き起こした。

さらに、ヒトMDM2が酵母におけるヒトP53転写活性を阻害し、そのユビキチン化およびその後の分解33を促進できることが実証された。従って、ヒトMDM2およびMDMXがP53誘発酵母増殖阻害を阻害する能力が32,34であった。追加の研究では、P53転写活性とアクチン発現レベルとの間に相関が確立され、酵母32におけるACT1遺伝子上流におけるP53 RE上流の同定が確立された。一貫して、アクチン発現は野生型P53によって増強され、さらにP53 V122Aによって強化されたが、変異型P53 R273Hでは増加しなかった。逆に、P53によるアクチン発現は、P53阻害剤MDM2、MDMX、またはピフィトリンα(P53転写活性の低分子阻害剤)の共存在において減少し、酵母増殖アッセイに基づく結果と一致する。重要なことに、これらの結果は、P53誘発成長阻害と酵母におけるその活性の程度との間に相関関係を確立し、P53機能を調節する小分子を同定し、研究することも利用されている28,34,35.

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Protocol

1. 特定のRE(yAFM-REまたはyLFM-RE)を含むADE2またはLUC1レポーター酵母株の構築

  1. yAFM-ICOREまたはyLFM-ICORE株12,14(ICORE=I、GAL1プロモーター下でのISce-Iエンドヌクレアーゼ;CO = カウンタ選択可能 URA3 ;RE = レポーター KanMX4カナマイシン耐性を与える;表 1)YPDA寒天プレート上の-80°Cで保存された15%のグリセロールストックから(表2)。30°Cで2〜3日間成長させてください。
  2. 新鮮なプレートから1つの酵母コロニー(生後3週間以内)を取り、YPDAの5mLを含む小さなフラスコに置きます(表2)。一晩30°Cでインキュベートし、150〜200 rpmで振ります。
  3. 翌日、デキストロースの痕跡をすべて除去し、3,000xgで2分間細胞をペレットし、チューブの反転により上清を廃棄する。
    注: このプロトコルのすべての遠心分離を室温(RT)で実行します。
  4. ガラクトース(表2)を含む予め温められたCM(完全な培地)の30〜50mLで細胞ペレットを再中断し、30°Cで4時間インキュベートし、150-200 rpmで振ります(I-SceIの誘導に必要)。
  5. 細胞を3,000 x gで2分間遠心分離し、チューブの反転によって上清を捨てます。
  6. 無菌水の30〜50 mLで細胞ペレットを再懸濁する。手順 1.5 を繰り返します。
  7. 無菌水の10mLで細胞ペレットを再懸濁する。手順 1.5 を繰り返します。
  8. 無菌LiAcTE(表3)の5mLで細胞ペレットを再懸濁し、DNA取り込みを好むイオン溶液である。手順 1.5 を繰り返します。
  9. 無菌LiAcTEの250 μLで細胞ペレットを再懸濁し、1.5 mLチューブに細胞を移します。ステップ1.5を繰り返し、無菌LiAcTEの300〜500 μLで細胞ペレットを再懸濁する。
  10. 洗浄中に、100°Cで10分間サケ精子DNAキャリアの10mg/mL溶液を変性し、一本鎖DNAとしてそれを維持するために氷の上ですぐに冷やします。
  11. 別の1.5mLチューブに、所望のオリゴヌクレオチドの500ピコモレ(表3)、沸騰したサケ精子キャリアDNAの5μL、無菌LiAcTE PEGの300μL(表3)、および酵母細胞懸濁液の50μL(ステップ1.9から)を加える。
  12. 10sのチューブを混ぜて30°Cで30分間インキュベートし、150-200 rpmで振ります。1.5 mLのチューブを側面に置き、揺れを好みます。
  13. 加熱ブロック内の42°Cで酵母細胞に15分間ヒートショックを与え、次いで10,000 x gで20sの細胞を遠心分離する。上清を取り出し、無菌水の1mLで細胞を再懸濁する。
  14. YPDA寒天プレート上の細胞懸濁液の100 μLを広げ、30°Cで1日インキュベート(逆さま)します。十分に分離されたコロニーが得られるように、また1:10希釈の100 μLを広げる。
  15. 翌日、デキストロースと5-FOAを含むCM寒天プレートに滅菌ビロードを使用したレプリカプレート(表2)。多くの細胞が転移した場合(URA3細胞の成長など)、新しいプレート上の2番目のレプリカプレートを検討してください。
  16. 3日後、G418を含む非選択的YPDAおよびYPDA上のレプリカプレート(カナマイシンに類似したアミノグリコシド系抗生物質)寒天板(表2)は、その後の比較を容易にする各プレートをマーキングする。プレートを30°Cで一晩インキュベートします。
  17. 翌日、G418感受性であるがYPDAプレート(例えば、yLFM-またはyAFM-REコロニー)上で成長するコロニーからの候補レポーター株を同定する。新しいYPDAプレート上で同定されたコロニー(3-6コロニー)をストリークして、単一のコロニー単離物を得て、30°Cで2日間成長させます。
  18. YPDAプレートに単一酵母コロニーをパッチし、コロニーを分離してさらなる分析を行います。30°Cで24時間後、小柄な変異体(すなわち、呼吸不全変異体)の増殖を防ぐYPGA寒天プレート(表2)上のレプリカめっきによってそれらをテストする。同時に、新しいYPDA寒天プレート上のレプリカプレート。
  19. 正しいパッチ(すなわち、YPDAおよびYPGA寒天プレートの成長;1-3コロニー)をステップ1.18からテストし、コロニーPCRによる正しいオリゴヌクレオチド統合の存在を調べます。10x PCRバッファーの5 μL(1.5 mM MgCl 2)、10ピコモレス/μLプライマーの2μL(表3)、2.5mMdNTPの4μL、5 U/μL Taqポリメラーゼの0.25 μL、および水を5μLの最終容積に加えて反応ミックスを組み立てます。スクリーニングする必要がある酵母コロニーの数に対する反応ミックスを乗算し、各PCRチューブに50 μLをアリコートします。ピペットを使用して、YPDA寒天プレートから非常に少量の酵母細胞を単一のPCR反応ミックスに加えます。
  20. 次のプログラムでPCR反応を行います:94 °C、94°Cで1分間の35サイクルの脱退、55°Cで1分間のプライマーアニーリング、72°Cで2分間延長。
  21. 反応が完了したら、PCR反応のアリコート(体積の約10分の1)をアガロースゲルにロードし、正しいサイズ(約500bp)を確認します。
  22. 市販キットで精製後のPCR産物を配列し、ステップ1.19の同じプライマーを使用して所望のRE配列の統合を確認する。
  23. 正しい配列の検証後、yAFM-REまたはyLFM-RE株培養物(YPDA)の15%グリセロールストックを作り、-80°Cに保存します。

2. 定性色系ADE2酵母アッセイを用いたP53タンパク質トランス活性化能の評価

  1. yAFM-RE ひずみを使用して手順 1.1 と 1.2 を繰り返します (1)。
  2. 翌日、予め温められたYPDAの30〜50mLで細胞培養(1:10)を希釈し、OD600nmが0.8〜1.0(〜2h)に達するまで振ることによって30°Cでインキュベートし続ける。
  3. 手順 1.5-1.10 を繰り返します。
  4. 別の1.5mLチューブに、300〜500ngの酵母P53(または対照)発現ベクター(表4)、沸騰したサケ精子DNAキャリアの5μL、無菌LiAcTE PEGの300μL、および酵母細胞懸濁液の50μLを加える。
  5. 手順1.12と1.13を繰り返しますが、無菌水の300 μLで細胞ペレットを再懸濁します。
  6. 合成選択的(P53発現または対照ベクター)プレート上の細胞懸濁液の100μLを炭素源および高量アデニン(表2)として含有し、次いで2〜3日間30°Cでインキュベート(逆さま)する。
  7. 新しい選択的プレート上の単一酵母形質転換コロニー(プレートあたり2-6ストリーク)をストリークし、それらが30°Cで一晩成長させます。
  8. 翌日、無菌ビロードのレプリカプレートを使用して、色表現型の評価を可能にする新しい選択的プレート(すなわち、デキストロースを炭素源として含有するが、アデニンの量を制限するプレート;2)プレートを30°Cで逆さまに3日間インキュベートします。必要に応じて、P53タンパク質の温度感受性を評価し、3日間3つの異なる温度でインキュベートする:24°C、30°C、および37°C。
    注: 同じストリークを複数回レプリケートできます。
  9. P53タンパク質トランス活性化能を評価するには、酵母コロニーの色ベースの表現型を確認し、P53野生型および空ベクター表現型に関してP53タンパク質表現型を比較する。

3. 定量発光系LUC1酵母アッセイを用いたP53タンパク質トランス活性化能の評価

  1. プロトコル2に記載のLiAcベースの方法を使用して、P53(または対照)発現ベクター(表4)を用いて酵母細胞を形質転換する。yLFM-RE ひずみ (表 1)使用します。
  2. 炭素源としてブドウ糖を含むアデニンを多量に含む新しい選択プレート上に単一形形をパッチし、一晩30°Cで成長させます。変換タイプごとに、5~7種類のパッチを作成します。
  3. 一晩の成長の後、カーボン源としてデキストロースまたはラフィノースを含む合成選択培地でプレートから無菌爪楊枝またはピペット先端を使用して少量の酵母細胞を再懸濁する(透明な96ウェルプレートの最終容積200μL、丸みを有する)または平らな底)。実験に誘導可能なP53発現が必要な場合は、ラフィノース培地にガラクトースを加えて誘導レベルを調節する(表2)。
    注:これらの細胞懸濁液は、約0.4のOD600nmを持ち、1より高くする必要があります。
  4. マルチラベルプレートリーダーを使用して、誘導可能なP53発現(30°Cで4-8時間、150-200rpm振る)後のOD 600nmで各井戸の吸光度を測定します。セルサスペンションがマルチチャンネルピペットとよく混合して均質であることを確認します。
  5. 透明な96ウェルプレートからセル懸濁液の10-20 μLを白い384(または96)ウェルプレートに移し、同量(10-20 μL)のリシスバッファーと混合します。シェーカー(150〜200rpm)上のRTで10〜15分間インキュベートし、ルシフェラーゼ基板への細胞の透過性を達成する。
  6. ホタルルシフェラーゼ基板の10-20 μLを追加し、マルチラベルプレートリーダーで光単位(LU)を測定します。
  7. P53タンパク質トランス活性化能を決定するには、対応するOD600nm(相対光単位、RLU)に各ウェルのLUを正規化する。酵母形質転換コロニーの3-4パッチからの平均RLUと標準偏差を計算します。
  8. P53野生型および空ベクターに対するP53タンパク質トランス活性化データを比較し、空ベクターで得られた値を減算するか、空ベクターで得られた値で除算することによって(すなわち、誘導の計算倍)。
    注:P53トランス活性化活性は、P53相互作用タンパク質(すなわち、MDM2およびMDMX)および/または薬物治療を含む同じ実験セットアップを使用して評価することもできる。

4. 酵母表現性アッセイを用いたP53タンパク質増殖抑制の評価

  1. セクション2で説明するLiAcベースの方法を使用して、P53/MDM2/MDMX(または制御)発現ベクター(表4)を用いて酵母細胞を変換します。CG379株(表1)を使用し、最小選択プレートに酵母形質転換体を広げます(表2)。
  2. 変換細胞を最小選択培地(表2)で約1OD600nmに成長させる。
  3. 選択的誘導培地中の0.05 OD600nmに希釈酵母細胞(表2)、オプションで、選択した小分子を適切な濃度(または溶媒のみ)に添加し、変異体P53を活性化またはMDM2を阻害する場合にその有効性を試験する。/MDMX-P53 相互作用。
  4. 連続軌道揺れ(200rpm)下で30°Cで細胞をインキュベートし、約42時間(陰性対照酵母が中対数相に達するのに必要な時間、約0.45 OD600nm)。
  5. 最小選択プレート上の酵母細胞培養物の100 μLアリコートをスポット(表2)。
  6. 30°Cで2日間インキュベートします。
  7. 100μL培養滴(コロニー形成単位、CFUカウント)で得られたコロニーの数を数えることによって酵母の成長を測定する。例えば、酵母を発現する野生型P53の増殖を考慮した化合物の変異型再活性化効果を算出し(100%に設定)、変異型P53を発現する細胞の増殖(溶媒制御にさらされる)を表す。再アクティブ化のゼロレベル。

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Representative Results

の建設ADE2またはリュック1レポーター酵母株

デリト・ペルフェットアプローチ12、14、15、16は、P53レポーター酵母株の構築を可能にするように適合された(図1B)。この方法は、両端に、選択された統合の軌跡に相同である少なくとも30個のヌクレオチドを含む単鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを採用する。具体的には、相同性は、以前に位置づけられたKlURA3およびkanMX4(遺伝性に対する耐性を提供するレポーター遺伝子)を含む二重マーカーカセットICOREの統合部位に隣接する配列に対応する。目的のターゲット サイト15,16.このカセットはまた、誘導性GAL1プロモーターおよびその歯車標的部位の下で、酵母I-SceIエンドヌクレアーゼコード配列を含む。したがって、所望の配列を持つ酵母細胞の形質転換の直前にガラクトース含有培地のスイッチは、ICORE統合部位におけるI-SceI発現および結果的に単二本鎖破断(DSB)の生成をもたらす。DSB の存在は、1 回の変換で 1,000 を超える置換が得られるターゲティング イベントの頻度を高く刺激します。

5-FOAに対する後天性およびG418に対する感度に基づくターゲティングおよび選択プロセスの終わりに、候補クローンは、修飾された軌跡およびサンガーシーケンシングのコロニーPCRベースの増幅によって確認され、正しい統合を検証する。所望のP53 RE(図1C)。株構築プロトコルの終わりに、約1週間で完了することができ、Rの配列の違いがP53のトランス活性化能力にどのように影響するかを評価するために使用することができる同種生成レポーター酵母株のパネルが得られるタンパク質。

機能的に異種変異体P53s

ヒト腫瘍において、TP53遺伝子は、P53タンパク質の中央DNA結合ドメイン(DBD)に位置する6つの主要なホットスポット残元(R175、G245、R248、R249、R273、およびR282)を含む単一のミスセンス変異の影響を主に受ける。しかしながら、2,000以上の単一のP53アミノ酸置換が記録されており、27は観察されないものも含まれる。変異体P53sは、DNA接触または構造変異体として分類することができ、DNAタンパク質接触(例えば、R273H)またはタンパク質構造(例えば、R175H)36に対するアミノ酸置換の影響に応じて分類することができる。単一のTP53誤知覚変異はP53機能に影響を与え、腫瘍の攻撃性、化学耐性、転移電位37などの重要な臨床特徴に影響を与える機能的多様性の広い範囲を生成し、38歳,39.

変異体P53が機能的に異種であるという概念は、TP53突然変異データベース(例えば、)27で利用可能な大量の実験データを通じて、過去15年間に明らかに出現した。酵母および/または哺乳類レポーターシステムに基づく異なる機能的アッセイが開発され、変異体P53sの異なる特性を強調している(すなわち、トランス活性化、温度感受性、優勢な負の可能性、および干渉P53ファミリーのメンバーと他のTFとの相互作用)13,24,40,41,42,43,44.最も包括的な機能的研究は、8つの異なるP53 REs24に向かってそのトランス活性化活性を特徴付けることによって、酵母ベースのアッセイで2,300以上の変異体を調べた。

データは、ホットスポット残渣を含むほぼすべての変異型P53sが機能の喪失(すなわち、完全にトランスアクティベーション活性を失った)であることを確認した。逆に、P53タンパク質の他の位置に当たって、一般的に癌45の中程度から低い頻度で見られる変異体P53sは、P53 REs13上のトランス活性化活性のいくつかのレベルを保持する部分機能変異体であり、図17. ADE2アッセイを用いて記載されたP53タンパク質の機能的不均一性を研究する例を図2Aに示す。実際、R175Hは、試験試験中に赤色コロニーを産生する機能失変異体であるが、R282Wはガラクトース依存性P53発式を用してより明らかな温度感受性を示した(すなわち、P21-5'RE株中の赤色イオン重イオン化より高いガラクトースプレートでピンクになる下部ガラクトースを含むプレート)。図2Bは、P53変異体およびレポーター株の拡張パネルの結果の概要を提示する。

このP53機能的不均一性の存在は、そのような不均一性がTP53生殖細胞変異を有する被験者の臨床レベルで観察される不均一性と一致しているかどうかの探索を促した。TP53生殖細胞変異は、より重篤なLi-Fraumeni(LFS)およびLi-Fraumeni(LFL)症候群、および(FH)またはより重篤でない非発着素因を含む癌素因障害のグループの分子基盤の基礎を有する。(FHなし) 家族歴史なし 46.

プロトコルは、すべてのTP53生殖細胞変異体アエレの酵母アッセイベースのトランス活性化能力をIARCデータベースの対応する臨床データと一致させることによって、遺伝子型-フェノタイプ相関を強調した。機能喪失P53変異体は、より重篤な癌傾向症候群で見出され、一方、部分的な機能P53変異体は、より重篤な癌傾向状態で見出されている。これは、P53残留トランス活性化能がTP53変異を継承し癌25,26を発症した患者における臨床表現型に影響を及ぼすことを示している。

ヌクレオチド配列の変化は、REsの中でP53を支配するトランスアクティベーションの可能性

ヒトP53は、四面体(ダイマーのダイマー)TFである。各P53ダイマーは、10ヌクレオチドからなるREを認識します(RRRCWGYYY、R =AまたはG;W = A または T;Y = C または T)4748.このような2つの半部位は、最大13〜20ヌクレオチドによって隣接または間隔を設けることができるか、機能的P53 REを構成する。それにもかかわらず、スペーサーを持つP53 REsは、スペーサー49、50を持たないP53 REsよりもP53親和性およびトランスアクティベーションが低いことを特徴とし、様々なシステムからの異なる機能アッセイにおいて。

最近、半部位がヘミに結合したP53四量体を募集できることが最近実証され、機能アッセイおよびクロマチン免疫沈殿研究と共に、これらの知見はP53が非正規性RSでも作用できることを示している。ハーフサイトと3四半期のサイト48、52を含む。さらに、完全なコンセンサスP53 REモチーフが非常に退化しているという事実(RRRCWGYYY)2は、個々のREが配列および結合親和性において実質的に異なる可能性を予見する。ヒトゲノム41、48において数百個のP53標的遺伝子が同定されたことを考えると、事実上すべてのP53 RAは互いに非同一配列を示した。また、細胞周期停止またはアポトーシス53に関与するP53標的遺伝子のプロモーターにおいて、明確なDNA結合親和性を有するRが選択されていると仮定されている。

一定のゲノム位置におけるP53 REの多くの変異体の酵母における分析は、トランス活性化能力49に対するヌクレオチド変異体、スペーサーおよび組織の影響を確立した。それはP53 14、54、55に関連するプロモーターの応答性に著しく異なる2つの対肢を持つ多形P53REの発見につながった。最近では、P53 RE配列の特徴と酵母ベースのトランス活性化電位から派生した情報は、p53 Retrieverでコード化されており、正規と非正規の両方のREをローカライズしてランク付けすることができるパターン検索アルゴリズムです。ヒトゲノム全体を通じて予測されたトランス活性化の可能性52.

配列特異的P53トランス活性化電位を研究するためにアッセイを用いる例として、ここで提示されるヒト野生型P53とカエオルハブディスティスエレガンス由来の進化遠いP53タンパク質との比較(図3)。これらの結果は、P53タンパク質間のトランス活性化特異性の進化的発散が56を探索した最近の研究のフォローアップである。等元性yLFM-REレポーター株は、プロトコルに記載されているように開発された。具体的には、ced13遺伝子57に由来するCep-1 P53 REと、4つの変異体(V1-V4)を比較した(図3A)。REバリアントは、2つのデキャメリックモチーフ(ced13では28ヌクレオチド)を分離するスペーサーの長さを変化させる影響を調べ、CWWGコアモチーフ(ced13ではA/Tリッチ)に隣接するヌクレオチドの変化を調べるために構築されました。最も親和性の高いヒトP53 REsでは、G/Cリッチ)58である。この結果は、Cep1とヒトP53がトランス活性化特異性の点でどのように発散するかを明確に示している。実際、ヒトP53媒介トランス活性化はスペーサーの存在によって強く阻害されるが(図3B)、Cep-1活性はスペーサーの除去によって阻害される(図3C)。さらに、ReがA/T-からG/Cリッチに変更されると、Cep-1媒介トランスアクティベーションは廃止されます。ヒトP53もCep-1も、ced13 REに由来する単一のデキャメルから転移することはできません。

P53-MDM2/MDMX相互作用および変異型P53活性の再活性化剤の低分子破壊剤の探索

ヒトP53の増殖抑制効果と酵母におけるその活性の程度との間に確立された相関関係は、P53活性に対する干渉因子の影響を分析するために酵母細胞増殖の測定に基づく簡略化されたスクリーニングアッセイにつながった(図4)).潜在的な抗癌剤のスクリーニングに対する酵母表現型アッセイの有効性は、いくつかの研究で実証されている。P53とその阻害剤であるP53とその阻害剤MDM2および/またはMDMXを用いて、これらの相互作用の新しい破壊因子は、P53に対するMDMの負の効果を阻害する能力によって同定され、したがって野生型P53誘発酵母増殖阻害(( 4A)。特に、このアッセイは、P53-MDM2相互作用59のキサントーン足場34および2)オキサゾロイソインドリノン阻害剤を伴う最初のP53-MDM2相互作用阻害剤としての1)ピラノキサントノン1の発見につながった。さらに、このアッセイにより、αマンゴスチンおよびガンボジック酸がP53-MDM2相互作用30の潜在的阻害剤として初めて記載された。

その後、同じアッセイは、カルコーンの前駆がP53-MDM2相互作用60を破壊する能力を高めたことを実証した。興味深いことに、この酵母アッセイはまた、P53-MDM2/MDMX相互作用の2つの阻害剤の発見につながった:トリプトファノール由来オキサゾロピピリドンラクタムOXAZ-161およびトリプトファノール由来オキサゾロイソインドリン酸DIMP53-162。

また、酵母細胞増殖に対する機能喪失変異体P53の減少影響は、変異型変異型増殖阻害活性を変異型P53に回復させる能力を特徴とする変異型P53-活性化薬のスクリーニングにも検討されている(図4B)。この酵母アッセイにより、変異型P53 R280Kの再活性化剤、エナンチオピュアトリプトファノール由来のオキサゾロイソインドリンSLMP53-163が同定された。図4C、Dは、P53-MDM2相互作用Nutlin-3aまたはP53変異体Y220C PhiKan083の再活性化剤を用いたP53または治療の発現を伴う酵母で得られた代表的な結果を示す。

P53-活性化剤としてのこれらの化合物の作用の分子機構の検証と抗腫瘍活性、ヒト腫瘍細胞株34、60、61、62、63の両方動物モデル62、63は、創薬における酵母表現型アッセイの大きな可能性を証明する。

Figure 1
図 1:酵母ベースのP53トランス活性化アッセイの特徴とP53レポーター酵母株の構築のためのワークフロー。(A)ゲノム操作の容易さと制御された異所性遺伝子発現は、P53トランス活性化機能を調べるために関連するいくつかの変数が厳密に調べられ、酵母を「インインビボ試験管」に似ています。これらの変数は、野生型または変異体P53タンパク質の発現レベル、REの配列、およびレポーター遺伝子の種類[質的/半定量的(例えば、ADE2およびLACZ)または定量的(例えば、LUC1)]を含む。コンセンサスRE配列は高度に退化している(RE = RRRCWGYYY-n-RRRCWGYYY;R = プリン;W = A/T;Y = ピリミジン;CWWG = コアシーケンス、n = 0-13 bpsスペーサ)。コンセンサス、CORE シーケンス、および基本ペアスペーサーの数に関する不一致の数は、トランスアクティベーションアクティビティに影響します。このパネルは、以前のパブリケーション64から変更されています。(B)ADE2またはLUC1レポーター遺伝子発現を駆動する最小プロモーターの所望のP53 RE上流を導入するデリット・ペルフェットアプローチのスキーム。プロトコルは、以前の出版物12、15、16から適応されました。(C)オリゴRE統合部位を取り巻く領域の酵母コロニーPCR増幅の結果の例。電気泳動の画像は、1 kb DNAはしご(プロメガ)の隣に対応するPCR陰性制御を有する2つの陽性コロニー(URA3マイナスおよびG418感受性)の増幅結果を提示する。表3に記載のプライマーを用いて期待される〜500 ntバンドは、エレクトロフェログラムに示すように、正しいプロモーター編集を確認するために配列を決定することができる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: P53タンパク質は、RE特異的および温度感受性トランス活性化電位を示す。野生型P53および示されたTP53ミスセンス変異は、酵母における定性的色ベースのレポーターアッセイを用いて試験し、ADE2遺伝子発現を制御する異なるP53 REsを保有するレポーター株を利用した。 (A) P53ワイルドタイプ、R175H、およびR282Wのコロニーカラー表現型の例を、PUMA(BBC3)とP21-5'REsを30°Cおよび37°Cで示す。中等度(0.008%ガラクトース)と高(0.12%ガラクトース)P53発現が比較される。(B)P53変異体および酵母レポーター株の拡張セットで得られた結果は、3つの温度(24°C、30°C、および37°C)でP53依存性コロニー色表現型について調べた。結果は、変異型P53対遺症の機能的不均一性を例示し、表形式で要約される。例えば、R175Hは機能喪失変異体であり、G199Hは野生型P53のような。K139EおよびR282Wは部分的な機能を保持し、それぞれ冷たい感受性および熱感受性を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3:ヒトP53およびクレジットされたオルトログCep-1は、非常に発散的なトランス活性化特異性を示す。(A)の配列:ヒトP53 REコンセンサス配列、cep-1 P53 REはced13遺伝子に由来し、機能アッセイで試験した4つの変異体(V1-V4)である。 (B)トランス活性化は、低、中等度および高発現を達成するために3つの異なる炭素源を用いて8時間のヒトP53発現を誘導した後に測定した(0.008%、0.032%、0.12%ガラクトースを2%ラフィノースを含む選択的培地に添加した)。結果は、平均相対光単位(RLU)と4回の反復の標準誤差として表されます。空の式ベクトルで変換されたセルのレポーター活動を減算した。(C)(B)で測定したCep1の活性化特異性。両方のタンパク質について、トランス活性化レベルはガラクトースの量に比例した。ヒトP53が発現されたときに測定される高い光単位は、タンパク質の長さの違いとコドンの使用にも起因して、生成されるタンパク質量の異なるレベルに依存することができます。2つのタンパク質は、試験された異なるRに対する異なるトランス活性化特異性によって特徴付けられており、この性質は相対タンパク質量の可能な差の影響を受けません。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4:酵母表現性アッセイを用いて同定されたP53の低分子活性化剤。(A)ヒト野生型P53およびMDM2またはMDMXを共発現する酵母細胞は、P53-MDM2およびP53-MDMX相互作用の阻害剤を探索するために使用されてきた。このシステムでは、相互作用阻害剤は、P53およびMDM2またはMDMXを共発現する酵母細胞におけるP53誘発酵母増殖阻害を回復させる。このアプローチにより、P53-MDM2相互作用の阻害剤の同定とP53-MDM2およびP53-MDMX相互作用の二重阻害剤の同定が可能になった。(B)ヒト変異体P53を発現する酵母細胞は、変異型P53反応器の探索に用いられており、変異型P53発現酵母細胞における野生型P53誘導酵母増殖抑制を回復することができる。(C)野生型P53または変異体Y220Cが空ベクターと比較して酵母コロニーの成長に及ぼす影響を示すプレートスポットアッセイの代表的な画像(ステップ4.5参照)。(D)増殖アッセイの定量的結果: 10 μM Nutlin-3a は、MDM2 を共発現する細胞におけるP53誘発酵母増殖抑制を回復させる;50 μM PhiKan083は、野生型のP53誘導酵母増殖抑制を変異型P53 Y220Cに復元する。いずれの効果も、1つとして設定された野生型P53の酵母増殖抑制効果に対してプロットされる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ひずみ名と遺伝子型 特定の用途 プロトコル番号
yAFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1;ICORE::pサイク1::ADE2 これは、yAFM-RE株の構築に使用されます (MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1;ICORE::pCyc1::ADE2)は、定性的な色ベースのADE2アッセイで利用されています。 プロトコル 1,2
yLFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1;ICORE::pサイク1::LUC1 これは、yLFM-RE株の構築に使用されます (MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1;定量発光ベースのLUC1アッセイで利用されるRE::pCyc1:LUC1)。 プロトコル 1,3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [キル-O] 表現性成長アッセイに使用されます。 プロトコル 4

表 1:酵母株。

メディア名とレシピ 特定の用途 プロトコル番号
YPDA(2% 酵母エキス, 2% ペプトン, 2% デキストロース, 200 mg/L アデニン)+ 2% 寒天 寒天を伴わないYPDAは濾過により好ましくは殺菌される。YPDA +寒天は、オートクレーブによって殺菌されます。レシピからデキストロースを省略し、プレートを注ぐ前に水に20%フィルター殺菌溶液からデキストロースを追加することが可能です。 プロトコル 1-4
CM [0.17% AAと硫酸アンモニウムのない酵母窒素ベース, 0.5% 硫酸アンモニウム, 5% (体積,v/v) 非必須アミノ酸溶液, 20 mg/L ヒスチジン, 20 mg/L トリプトファン, 20 mg/L ウラシル, 30 mg/L リジン, 100 mg/L ロイシン, 200 mg/L アデニン] +2% ガラクトース 媒体はろ過によって殺菌される。以下の滅菌ストック溶液は、濾過によって水中(0.1M NaOHに溶解されるウラシルを除く)で調製されます:非必須アミノ酸溶液(0.04%アルギニン、0.04%メチオニン、0.06%イソレウシン、0.1%フェニラニン、0.2%グルミニック)酸, 0.2% アスパラギン酸, 0.3% バリン, 0.4% スレオニン, 0.8% セリン), 1% ヒスチジン, 1% トリプトファン, 1% ウラシル, 1% リジン, 1% ロイシン, 0.5% アデニン, 20% ガラクトース.アデニンストック溶液は、結晶の形成と堆積のために冷蔵庫に保存してはなりません。トリプトファンストック溶液は、暗闇の中で保存する必要があります。. プロトコル 1
CM (上記参照) + 2% デキストロース+ 1g/L 5-FOA + 2% 寒天 媒体(AAおよび硫酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび寒天を含む酵母窒素ベースを含む)は、オートクレーブによって殺菌される。他の成分は、熱変動成分を維持するためにオートクレーブ後に追加されます。5-FOA粉末は、約55°Cに冷却した後、メディアに直接添加することができます。 プロトコル 1
YPDA + 400 μg/mL G418 + 2% 寒天 G418は、メディアが約55°Cに冷却された後、オートクレーブ後に追加する必要があります。粉末から始める場合は、50mg/mL G418ストック溶液を水中で調製し、濾過により殺菌することができる。 プロトコル 1
YPGA[2% 酵母エキス, 2% ペプトン, 2% グリセロール (v/v), 200 mg/L アデニン]+ 2% 寒天 メディアはオートクレーブによって殺菌される。 プロトコル 1
合成選択プレート:[0.17% AAと硫酸アンモニウムのない酵母窒素ベース, 0.5% 硫酸アンモニウム, 5% (v/v) 非必須アミノ酸溶液 (0.04% アルギニン, 0.04% メチオニン, 0.06% イソロイシン, 0.1% フェニルアラニン, 0.2% グルタミン酸, 0.2% アスパラチン, 0.3% バリン, 0.4%スレオニン, 0.8% セリン), 20 mg/L ヒスチジン, 20 mg/L ウラシル, 20 mg/L トリプトファン (ベクター選択マーカーに応じて), 30 mg/L リジン, 100 mg/mL ロイシン (ベクター選択マーカーに応じて), 5 mg/L または 20 mg/L アデニン + アデニン + 2 媒体(AAおよび硫酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび寒天を含む酵母窒素ベースを含む)は、オートクレーブによって殺菌される。他の成分は、熱変動成分を維持するためにオートクレーブ後に添加されます。pLS-およびpLSGベースのベクターを使用する場合、ロイシンなしでプレートを調製する。pTS-およびpTSGベースのベクターを使用する場合は、トリプトファンなしでプレートを調製する。 プロトコル 2-3
合成選択メディア:[0.17% AAと硫酸アンモニウムのない酵母窒素ベース, 0.5% 硫酸アンモニウム, 5% (v/v) 非必須アミノ酸溶液 (0.04% アルギニン, 0.04% メチオニン, 0.06% イソリューシン, 0.1% フェニルアラニン, 0.2% グルタミン酸, 0.2% アスパラチン酸, 0.3% バリン, 0.3%スレオニン, 0.8% セリン), 20 mg/L ヒスチジン, 20 mg/L ウラシル, 20 mg/L トリプトファン (ベクター選択マーカーに応じて), 30 mg/L リジン, 100 mg/mL ロイシン (ベクター選択マーカーに応じて), 200 mg/L アデニン] + 2% デキストローズ + 2% デキストローズ 培体は濾過によって殺菌される。薬物治療にpLS-またはpTSベースのベクターを使用する場合は、それぞれロイシンまたはトリプトファンを含まない培剤を調製するが、2%デキストロースを含有する。薬物治療の有無にかかわらず薬物治療の有無にかかわらず誘導性P53発現でpLSG-またはpTSGベースベクターを使用する場合、それぞれ、2%のラフィノースおよび可変量のガラクトースを含有するが、P53発現を調節するガラクトースを含有する。P53誘導の程度は、インキュベーションの時間を変化させることによって変調することもできる。 プロトコル 3
最小選択プレート:2%グルコース、0.7%酵母窒素ベース(アミノ酸および硫酸アンモニウムなし)、50mg/Lアデニン、50mg/Lウラシル、50mg/Lヒスチジン、50mg/Lトリプトファン(ベクター選択マーカーに応じて)、50mg/Lロイシン(依存)ベクトル選択マーカー)、2%寒天 培地はオートクレーブによって殺菌される。pLS89ベースのベクターを使用する場合は、トリプトファンを含まない培地を調製する。pLS89空のベクター(タンパク質を一切発現しない)を負の対照として使用します。pLS89ベースおよびpGADT7-MDM2ベクター(P53およびMDM2の共発現)を使用する場合は、ロイシンおよびトリプトファンを含まない培地を調製する。pLS89 空と pGADT7 (いずれもタンパク質を発現しない) を負のコントロールとして使用します。pLS76系ベクターを用いた場合は、ロイシンを含まない培地を調製する。pRS315 ベクター(タンパク質を一切発現しない)を陰性対照として使用します。 プロトコル 4
最小選択媒体:最小選択版として、しかし寒天なし 培地は濾過により殺菌される。 プロトコル 4
選択的誘導培地:最小選択培地として、ブドウ糖の代わりに2%ガラクトースを含有する 培地は濾過により殺菌される。 プロトコル 4

表2:酵母メディア。

ソリューション名とレシピまたはプライマー名と順序 特定の機能と使用 プロトコル番号
LiAc/TE: 10 mM トリス-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA と 0.1M 酢酸リチウム 水中の以下の滅菌ストック溶液は、オートクレーブによって調製されます:1M酢酸リチウムpH 7.5、1Mトリス-HCl/0.1 M EDTA pH 8.0(TEバッファ10X)。 プロトコル 1-4
PEG/LiAc/TE: 10 mMトリス-HCl、pH 8.0、1 mM EDTAおよび0.1M酢酸リチウムで40%ポリエチレングリコール(PEG) 水中の以下の滅菌ストック溶液は、オートクレーブによって調製されます:1M酢酸リチウムpH 7.5、1MトリスHCl/0.1 M EDTA pH 8.0(TEバッファー10X)、50%PEG(分子量〜3350)。 プロトコル 1-4
REオリゴヌクレオチドの相同学尾:
5'-gcggaattttttttttttttttttataatacat-RE-gcagatcgcggggggtagtaggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg
提供される相同尾の配列は、統合されたICOREカセットを横切る染色体配列に対応する。RE = RE シーケンス。 プロトコル 1
プライマー:Ade2 Fw: 5'-AAGTTGGTTTTCATGAA-3';
Ade2 Rv: 5'-GGAGCCATTAGTGTTCAT-3';
Luc1-Rv: 5'-CATAGCTCTCTCAACCGAA-3'
yAFM-RE 株(PCR およびシーケンス)の場合は、Ade2 Fw と Ade2 Rv プライマーを組み合わせます。yLFM-RE 株(PCR およびシーケンス)の場合は、Ade2 Fw と Luc1-Rv プライマーを組み合わせます。 プロトコル 1

表3:溶液およびオリゴヌクレオチド。

ベクトルの種類 正と負のコントロール プロトコル番号
P53(または制御)ベクトル。
pLS−またはpLSGベース:構成的ADH1プロモーターまたはガラクトース誘導GAL1プロモーター下でのP53タンパク質発現は、それぞれ(選択マーカーとしてのLEU2)。
pTS-またはpTSGベース:構成的ADH1プロモーターまたはガラクトース誘導GAL1プロモーター下でのP53タンパク質発現、それぞれ(選択マーカーとしてのTRP1)
pLS-およびpLSGベース:pLS76とpLSG-P53ベクトル(野生型P53を表す)を正の制御として使用します。陰性制御pRS315ベクターとして使用する(タンパク質を発現しない)。
pTS-およびpTSGベース:pTS76とpTSG-P53ベクトル(野生型P53を表す)を正の制御として使用します。陰性制御pRS314ベクターとして使用する(タンパク質を発現しない)。
プロトコル 2,3
P53 および MDM2 (または制御) ベクトル。
pLS89系:ガラクトース誘導GAL1プロモーター下で野生型P53タンパク質発現(選択マーカーとしてTRP1)を用いる。
pLS76系:構成的ADH1プロモーター下で変異型P53タンパク質発現(選択マーカーとしてのLEU2)を有する。
pGADT7ベース:構成的ADH1プロモーター下でのMDM2タンパク質発現(選択マーカーとしてのLEU2)
pLS89ベース:pLS89-P53ベクトル(野生型P53を表現する)を正の制御として使用します。負の対照pLS89-空(タンパク質を発現しない)として使用する。
pLS76ベース:pLS76変異体P53ベクトル(変異型P53を発現する)を正の制御として使用する。陰性制御pRS315ベクターとして使用する(タンパク質を発現しない)。
pGADT7 ベース: pGADT7-MDM2 ベクトル (野生型 MDM2 を表現する) を正のコントロールとして使用します。陰性対照pGADT7ベクターとして使用する(タンパク質を発現しない)。
プロトコル 4

表 4: 酵母式ベクトル。

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Discussion

酵母ベースのアッセイは、P53タンパク質機能の様々な側面を調べるのに有用であることが証明されています。これらのアッセイは、機能性多型の評価を含むRE標的部位の変異体に対するP53トランス活性化電位を評価するために特に敏感である。カラーレポーターの使用とルシフェラーゼアッセイの小型化は、費用対効果が高く、比較的スケーラブルなアッセイをもたらす。また、増殖抑制試験は、化学ライブラリースクリーニングに使用される可能性があり、吸光度の測定を通じて酵母細胞の生存率の定量を自動化します。ABCトランスポーターの細胞壁および作用による透過性は限られているが、薬物スクリーニングのために酵母を使用する場合の制限と考えられてきたが、取り込み性を改善するための遺伝子改変は22、65に成功して開発された。

哺乳類の細胞ベースのアッセイと比較して、酵母ベースのP53アッセイは、P53がより高い真核生物でその機能を調節する補因子およびシグナル伝達カスケード経路の驚くべき複雑さから分離していることを考えると、直接的な打撃の同定を改善する可能性がある。酵母ベースの機能アッセイは、P53とタンパク質共因子(すなわちMDM2およびMDMX 22、32、33、34)との相互作用および小さい影響のモニタリングにも部分的に成功している。これらの相互作用上の分子(Nutlin-3aなど)。しかし、P53と相互作用タンパク質の間のクロストークを調査する酵母ベースのアッセイの感度と予測力は、生体内での相互作用が翻訳後の修飾にどのように依存するかによって、いくぶん制限される可能性があります。種固有のシグナリングカスケード。

ここで説明するシステムは、他の TF に簡単に適合させることができます。確かに、酵母機能アッセイは、P53関連のP63およびP73タンパク質42、49、ならびにNF-κBファミリー66、67のメンバーのために開発された[またはいくつかのホメオボックスおよび基本的ならせんループ-らせん(bHLH)のためにさえ。TFs68,69] .ヒト核受容体はまた、酵母で発現され、リガンド依存性、配列特異的TFs70として働くことが証明されている。一つの制限因子は、酵母基底転写機械8と相互作用するいくつかの哺乳類トランス活性化ドメイン(TAD)の弱い容量で同定されている、 活性を含むキメラ構造を使用して克服することができる欠点ヘテロロゴス TAD68,69.

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Disclosures

著者は利益相反を宣言しない。

Acknowledgments

我々は、欧州連合(FEDERファンドPOCI/01/0145/FEDER/007728プログラプラオペラファクターデ・コンペティティビダード-コンペティシダード-コンペティシダード)と国家基金(FCT/MEC、ファンダサン・パラ・ア・シエンシア・エ・テクノロジア、ミニステリオ・ダ・エドゥカサオ・エ・シエンシア)に感謝します。パートナーシップ契約 PT2020 UID/QUI/50006/2019 およびプロジェクト (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581。FCTフェローシップ:SFRH/BD/96189/2013(S.ゴメス)この研究は、コンパニア・S・パオロ、トリノ、イタリア(プロジェクト2017.0526)と保健省(プロジェクト5x1000、2015、2016;現在の研究2016)によってサポートされました。テレサ・ロペス=アリアス・モンテネグロ博士(トレント大学実験科学教育研究所)に対し、ビデオ録画の支援に深く感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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