Метод микроэлектрода Impalement для записи Мембраны Потенциал из канналедированной средней мозговой артерии

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Основная цель этой статьи заключается в предоставлении подробной информации о том, как записывать мембранный потенциал (Vм) из средней мозговой артерии с помощью метода микроэлектрода impalement. Каннулированная средняя мозговая артерия уравновешивают, чтобы получить миогенный тон, и стенка сосуда пронзили с помощью микроэлектродов высокого сопротивления.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Reed, J. T., Sontakke, S. P., Pabbidi, M. R. Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery. J. Vis. Exp. (149), e59072, doi:10.3791/59072 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Мембранныйпотенциал (V м) сосудистых гладких мышечных клеток определяет тонус сосудов и, таким образом, приток крови к органу. Изменения в экспрессии и функции ионных каналов и электрогенных насосов, которые регулируют Vм в условиях заболевания потенциально может изменить Vм,сосудистый тон, и кровоток. Таким образом, необходимо базовое понимание электрофизиологии и методов, необходимых для точной записи Vм в здоровых и больных состояниях. Этот метод позволит модулировать Vm с помощью различных фармакологических агентов для восстановления Vм. Хотя Есть несколько методов, каждый со своими преимуществами и недостатками, эта статья предоставляет протоколы для записи Vм из каннуляющих сосудов сопротивления, таких как средняя мозговая артерия с помощью метода микроэлектродов impalement. Средние мозговые артерии могут получить миогенный тон в миографической камере, а стенка сосуда пронзили с помощью микроэлектродов высокого сопротивления. Сигнал Vm собирается с помощью электрометра, оцифровывается и анализируется. Этот метод обеспечивает точное считывание Vм стенки сосуда, не повреждая клетки и не изменяя мембранное сопротивление.

Introduction

Мембранный потенциал (Vм) клетки относится к относительной разнице ионного заряда по плазменной мембране и относительной проницаемости мембраны к этим ионам. Vm генерируется дифференциальным распределением ионов и поддерживается ионными каналами и насосами. Ионные каналы, такие как Kq, Na,и Clй внести существенный вклад в отдых Vм. Сосудистые гладкие мышечные клетки (VSMCs) выражают более четырех различных типов Каналов Kи 1, два типа напряжения-gated Ca2 "каналов (VGCC)2, более двух типов Cl- каналы3, 4 , 5, магазин-управляемые каналы Ca2 '6, растяжечныеканалы катионов7,8,и электрогенные насосы натрия-калия ATPase9 в их плазменных мембранах, все из которых могут быть участвует в регулировании Vм.

Vм VSMCs зависит от давления промена. В ненагерметиковых судах Vm варьируется от -50 до -65 мВ, однако в герметике артериальных сегментов В м колеблется от -37 до -47 мВ10. Повышение внутрисосудистого давления приводит к деполяризации ВСМК11,снижает порог открытия VGCC, и увеличивает приток кальция, способствующий развитию миногенного тона12. Напротив, в пассивных или ненагерметизированных сосудах мембранная гиперполяризация, из-за высокой активности канала K, предотвратит открытие VGCC, что приведет к ограниченному входу кальция и уменьшению внутриклеточного кальция, способствуя меньшему сосудистый тон13. Таким образом, Vm из-за изменений давления промена, как представляется, играют важную роль в развитии тонусов сосудов, и как VGCC и Kq каналы играют решающую роль в регулировании Vм.

Vm варьируется между типом судна и видом. Vм -54 - 1,3 мВ у морских свинок superior мезентериальных артериальных полос14, -45 и 1 мВ в крысиных средних мозговых артериях при давлении просвета60 мм рт. ст.12,и -35 - 1 мВ в крысиных паранхмальных артериях при давлении 40 мм рт. ст. Отдых Vм записано в нерастянутой крысиной лимфатической мышце -48 и 2 мВ16. Vм церебральных VSMCs является более негативным, чем в периферических артериях. Для сравнения, кошачьих средних мозговых артерий, как сообщается, Vм около -70 мВ, в то время как мезентерические и коронарные артерии, как сообщается, -49 и -58 мВ, соответственно17,18. Различия в Vм через сосудистые кровати могут отражать различия в экспрессии и функции ионных каналов и электрогенных натриево-калийных насосов.

Увеличение и уменьшение ВМ называют мембранной деполяризацией и гиперполярализацией, соответственно. Эти изменения в Vм играют центральную роль во многих физиологических процессах, включая ион-канал gating, сигнализация клеток, сокращение мышц, и действия потенциального распространения. При фиксированном давлении, многие эндогенные и синтетические сосудорасширяющие соединения, которые активируют каналы Kи вызывают мембранную гиперполяризацию, в результате чего вазодилатация1,13. И наоборот, устойчивая деполяризация мембран имеет жизненно важное значение в агонист-индуцированной или рецепторо-опосредованного сосудосуживание19. Vm является критической переменной, которая не только регулирует приток Ca2 "через VGCC13, но и влияет на выпуск Ca2" из внутренних магазинов20,21 и Ca 2"чувствительность контрактный аппарат22.

Хотя существует несколько методов записи Vм из различных типов клеток, данные, собранные из метода микроэлектрода прокола канналесора, как представляется, более физиологические, чем данные, полученные из изолированных VSMCs. При записи из изолированных VSMC с использованием текущих методов зажима, Vm рассматривается как спонтанные переходные гиперполяризации в VSMCs24. Изолированные VSMCs не находятся в синцитии, и изменения в устойчивости серии могут способствовать колебационному поведению Vm. С другой стороны, колебальное поведение не наблюдается, когда Vm записывается из нетронутых сосудов, вероятно, из-за контакта клеток между VSMCs, которые находятся в синцитии в артерии и суммируются по всему сосуду, ведущей к стабильной Vм 24. Таким образом, измерение Vм из под давлением сосудов с использованием стандартной методики микроэлектрода impalement относительно близко к физиологическим условиям.

Запись Vм из каннаулированных сосудов может обеспечить жизненно важную информацию, так как Vм VSMCs, которые находятся в синхронизации является одним из основных детерминантов сосудистого тона и кровотока, и модуляция Vм может обеспечить способ для разбавлять или сужают кровеносные сосуды. Таким образом, важно понимать методологию, связанную с записью Vm. В этой статье описывается внутриклеточная запись Vм из каннулялизных средних мозговых артерий (MCAs) с помощью метода микроэлектрода impalement. Этот протокол будет описывать, как подготовить MCAs, микроэлектроды, настроить электрометр и выполнить метод impalement для записи Vм. Также обсуждаются репрезентативные данные, общие проблемы, возникшие при использовании этого метода, и потенциальные проблемы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Самцы крыс были размещены в центре по уходу за животными в УГМК, который одобрен Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AAALAC). На протяжении всего исследования животные имели свободный доступ к пище и воде. Звери содержались в контролируемой среде с температурой 24 х 2 градусов по Цельсию, уровень влажности 60-80% и 12 ч светлых/темных циклов. Все протоколы были утверждены Комитетом по уходу за животными и использованию УГМК.

1. Подготовка оборудования

  1. Поместите двойной дифференциальный электрометр(см. ТаблицуМатериалов) близко к камере судна и в нужном месте.
  2. Подключите выход канала усилителя A или B к вхотворцу канала дигитайзера с помощью кабеля BNC-BNC.
  3. Установите зонд в микроманипулятор и поместите его рядом с микроскопом и миографом. Установка записи должна быть установлена на безвибрационном столе.
  4. Поместите ручки и переключатели на передней панели усилителя в положениях, которые настраиваются на этот эксперимент, как описано в руководстве.
  5. Соедините основу ванны с контурной площадкой усилителя с помощью соответствующего электрода. Аналогичным образом, убедитесь, что клетка приземляется на шасси усилителя.

2. Подготовка микроэлектродов и сборки

  1. Используйте боросиликатные стеклянные микроэлектроды (см. таблицу материалов) и потяните стеклянный наконечник, чтобы иметь конус диаметром 8-10 мм, диаметром 1 мкм и сопротивлением 80-120 МЗ при заполнении 3 М ККЛ.
    1. Используйте стандартный шкив для достижения короткого постепенного конуса, используя следующие настройки: тепло 650; скорость - 20; тянуть No 25; время 250 и петля дважды для более высоких сопротивлений и меньших кончиков. Посмотреть таблицу материалов, как настройки инструмент-специфических.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр наконечника злт;1 мкм нанесет минимальный ущерб клетке при проколе.
  2. Заполните микроэлектрод 3 M KCl с помощью шприца микроволокна (см. таблицу материалов).
    1. Медленно потяните поршень из шприца микроволокна вверх во время введения 3 M KCl в микроэлектрод, чтобы пространство для жидкости для заполнения и предотвратить образование пузырьков воздуха внутри микроэлектрода.
    2. Заполните микроэлектрод до полного и убедитесь, что Есть нет пузырьков воздуха, прежде чем поместить его в держатель микроэлектрода. Если пузырьки присутствуют, осторожно коснитесь микроэлектродой пальцем, чтобы удалить пузыри.
  3. Осуществляя уход, твердо нажмите электрод хвостовик в держатель через скучно отверстие. Если избыток жидкости присутствует, удалить его с тканью.
  4. Подключите сборку держателя электрода к зонду усилителя. Проведите тест на электрод, отрегулируйте смещение ввода, проверьте нулевую настройку и проверьте утечку ввода зонда в соответствии с руководством по усилителею.
  5. Измерьте сопротивление электродов с помощью теста на электрод, как показано в таблице1.
  6. Обратите внимание, что работающий электрод отображает положительный сдвиг напряжения ПОСТОЯННОГО ТОКа в 1 мВ/МЗ на выходе канала. С другой стороны, если большое напряжение появляется на выходе канала и на счетчике, это указывает на заблокированный или сломанный электрод.
  7. Откройте программное обеспечение для записи, присвоите имя файлу и сохраните его для дальнейшего анализа в программном обеспечении для хранения.

3. Изоляция и кануляция средней мозговой артерии

  1. Подготовка реагентов.
    1. Подготовка нормального и низкого кальция физиологического солевого раствора (PSS), как описано в таблице 2.
  2. Приготовьте миограф.
    1. Промыть миографную камеру (см. таблицуматериалов) с дистиллированной водой несколько раз, чтобы держать его свободным от мусора. Загрузите камеру с 5 мл нормального PSS.
    2. Заполните обе стеклянные канюли с отфильтрованным нормальным PSS с помощью шприца 5-10 мл. Тщательно заполните всю канюли и прикрепленные трубки без введения каких-либо пузырьков воздуха.
    3. Приготовьте два монофилоновых нейлоновых шва (10-0, 0,02 мм) с половиной узла каждый с помощью тупых щипц.
    4. Поместите частично закрытые узлы шва на обе канюлях немного от кончика, используя рассечение щипцы под микроскопом вскрытия. Позже эти узлы будут соскользнул и связаны тщательно на каниulated артериальных концов для обеспечения судна.
  3. Изолировать и канитулировать среднюю мозговую артерию.
    1. Индуцировать глубокую анестезию в Sprague Dawley крысы с помощью 2-4% вдыхаемых изофлуран.
    2. Обезглавить крысу с помощью гильотины под глубокой анестезией.
    3. Тщательно удалите череп с помощью костного резака и ножницами.
    4. Удалить мозг из черепа и поместить его в 5 мл низкого кальция PSS на льду.
    5. Определите и вскрывайте неразветвленный сегмент крысиной средней мозговой артерии (MCA) с внутренним диаметром 100-200 мкм от мозга с помощью пружинных ножниц и щипков.
    6. Установите MCA на стеклянные канюли с помощью тонких щипц и закрепите, затягивая швы в миографе, содержащем нормальный PSS.
    7. Закройте дистальной канюли, чтобы не было потока в РАМКАХ MCA.
    8. Подключите водоемную трубу к резервуару, удерживающего PSS, чтобы обеспечить контроль внутрилюмиального давления, которое будет контролироваться с помощью трансдуктора давления в линии.
    9. Визуализируйте cannulated MCA с помощью зарядной камеры устройства (см. Таблицаматериалов), установленной на перевернутом микроскопе и программном обеспечении для визуализации.
    10. Установите осевую длину MCA до приблизительной длины, где она должна появиться ни жесткой, ни вялой.
    11. Уравновесить раствор ванны с O2 (95%) и CO2 (5%) при температуре 37 градусов По Цельсию для обеспечения адекватной оксигенации, температуры и поддержания рН на уровне 7,4.
  4. Impale (проникает в клеточную плазменную мембрану) сосудистые гладкие мышечные клетки.
    1. Соедините молотый электрод и держите его погруженным в PSS миографа.
    2. Осветите камеру сосуда и посмотрите через микроскоп, чтобы визуализировать кончик микроэлектрода в растворе ванны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, можно визуализировать MCA и микроэлектрод на компьютере, имеющего программное обеспечение для визуализации.
    3. Используйте элементы управления микроманипулятора для перемещения кончика микроэлектрода близко к внешней стенке кровеносных сосудов. Микроманипулятор и кончик микроэлектрода должны находиться в стабильном положении по отношению к ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом экспериментов подтвердите, что напряжение мембраны стабилизировалось. Если измеренное напряжение нестабильно, связь между электродом и клеткой не запечатана, что указывает на утечку.
    4. Начните запись.
    5. Медленно двигайте кончик микроэлектрода к сосуду, нацеливаясь в центр сосуда, используя курс или тонкий контроль микроманипулятора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда, небольшое отклонение в записи может наблюдаться, когда микроэлектрод кончик контактов мембраны мышечного волокна.
    6. Когда наконечник приходит в непосредственной близости от сосуда, продвижение электрода вперед в одном быстром движении с помощью микроманипулятора, чтобы пронзить мембрану мышцы.
    7. На этом этапе можно начать наблюдать за изменениями в V m, записываемыми. Не прикасайтесь к микроманипулятору, когда микроэлектрод пронзает мембрану клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разница в напряжении между записью и эталонным электродом уменьшается от 0 мВ до -40 мВ до -75 мВ в зависимости от уровня внутрисосудистого давления или других возбуждающих или ингибирующих стимулов. Эти показания характеризуют трансмембранную потенциальную разницу текущей клетки.
    8. Выполните несколько проколов на одном судне в различных областях судна, не повреждая ВСМК, чтобы получить точные измерения.
    9. После записи используйте манипулятор для удаления микроэлектрода в одном быстром движении.
    10. Остановите запись и сохраните файлы данных для дальнейшего анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представленный метод можно надежно использовать для записи Vм в каниulated сосудах. Краткая процедура, описывающая, как изолировать MCA от мозга представлена на рисунке 1A. После отделения мозга от черепа, MCA был расчленен и помещен в чашку Петри, содержащую низкий уровень содержания кальция PSS. Часть соединительной ткани, которая была прикреплена была также расчленена вместе с MCA с помощью пружинных ножниц и щипцы, чтобы предотвратить повреждение MCA во время изоляции. Осторожно, соединительная ткань была также удалена, и расчлененный MCA был готов к передаче на миограф. MCA был установлен на канюлях и связан с помощью шовных узлов на обоих концах канюли в миографе. Схематическое представление типичной установки метода прокола микроэлектрода показано на рисунке 1B. Микроэлектрод, наполненный 3 M KCl, был подключен к электрометру через держатель в зонде. Выход канала электрометра был подключен к аналоговому входного каналу дигитайзера с помощью кабеля BNC-BNC. Выход Digitizer был дополнительно подключен к осциллоскопу для визуализации сигнала в программном обеспечении для записи. Земля устанавливается с помощью провода Гранул AgCl, который был расширен от шасси электрометра до раствора ванны в миографе. Наконец, цифровые следы были визуализированы в программном обеспечении для записи на мониторе компьютера.

MCA был затем инкубирован в свежеприготовленной теплой PSS и был под давлением до 60 мм рт. с. Для записи Vm использовались только сосуды, которые приобретают тон. После того, как судно приобрело значительный тон, микроэлектрод был продвинут в стенку сосуда. Артериальный диаметр и прокол артерии были визуализированы с помощью видеомикроскопии. Impalement считается успешным, когда есть быстрое отклонение от отрицательных значений, Vм является стабильным для 30 с, и напряжение возвращается резко до 0 мВ после удаления электрода, как показано на рисунке 212,15. Наши результаты показывают, что в MCA, который находится под давлением до 60 мм рт. ст., Vм составляет -43,2 и 2,9 мВ.

После успешного прокола и vm стабилизации, препараты, которые меняют Vm были perfused в ванне и изменения в Vм были записаны. Мы использовали 20 мМ KCl для деполяризации и 20 мкм NS1619, синтетический большой нож канала проводимости калия, чтобы гиперполяризовать мембрану. Наши результаты показывают, что перфузия камеры с KCl деполяризовала мембрану на 5,8 евро и 0,18 мВ. С другой стороны, перфузия с NS1619 гиперполяризовала мембрану на 3,8 евро и 0,4 мВ.

Figure 1
Рисунок 1: Иллюстрация изоляции средних мозговых артерий и записи мембранного потенциала с помощью метода микроэлектрода. (A) Использование пружинных ножниц, вырезать мозг или соединительной ткани вдоль пунктирных линий. Передача и монтаж MCA между двумя стеклянными канюлями и закрепите его с помощью швов в миографической камере, заполненной PSS. (B) Микроэлектрод заполнены 3 M KCl вставляется в держатель и подключен к зонду. Изменения в потенциальном переходе трансмембранного от зонда к электрометроу и к дигитайзеру через кабель BNC (кабель БНК соединен с выходом канала электрометра и аналоговым ввозам дигитайзера). Оцифрованный потенциал виден в программном обеспечении для записи на мониторе. Земля устанавливается с помощью провода Гранул AgCl, соединенного с электрометром к раствору ванны в миографе. MCA - средняя мозговая артерия; PSS - физиологический солевой раствор; AgCl й серебряный хлорид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Запись мембранного потенциала с использованием метода микроэлектрода impalement из каннулялизных средних мозговых артерий. Представительный след Vm. Impalement считается успешным, если есть резкое отклонение отрицательных значений при входе электрода, Vм является стабильным для 30 с, и напряжение возвращается резко до 0 мВ после удаления электрода. X-ось представляет время, а Оси Y представляет мембранный потенциал. Пунктирная линия представляет собой скорректированную базовую линию перед проколом судна. Сек и секунды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Запись изменений в мембранном потенциале с использованием метода микроэлектрода impalement, когда сосуды подвергаются воздействию вазоактивных агентов. Vm был записан с помощью метода микроэлектрода impalement из каннаулированных средних мозговых артерий до и после контакта с вазоактивными агентами. Образец трассировки представляет (A) деполяризация в ответ на 20 мМ KCl и (B) гиперполяризации в ответ на 20 мкм NS1619-большой агонист канала проводимости калия. (C) Сводка бар график изменений в Vм до и после применения KCl и NS1619. Пунктирная линия представляет собой отдых Vm. Число в скобках представляет количество сосудов, используемых в исследовании. Обратите внимание, что Vm достиг базового уровня, как только препарат вымывается. Панель ошибок представляет собой стандартную ошибку среднего значения. Сек и секунды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Настройки электрометра для измерения сопротивления электродов
Ввод метра Канал A или B
Позиция переключается В
Диапазон счетчиков переключатель до 200 мВ
Электрод В бане
Режим Работа на тест электрода
Метеоиндикатор 1 мВ/МЗ

Таблица 1: Настройки электрометра для измерения сопротивления электродов.

Химических веществ низкий уровень кальция PSS mM Нормальный PSS mM Компании Каталог
1 Nacl 119.00 (119.00) 119.00 (119.00) Sigma S7653
2 Kcl 4.70 0,3 4.70 0,3 Sigma P4504
3 MgSO4 1.17 1.17 Sigma M7506
4 CaCl2 0,05 1.60 Sigma C3881
5 ГЕПЕС 5.00 5.00 5.00 5.00 Sigma H7006
6 Глюкозы 10.00 До 10.00 10.00 До 10.00 Sigma G7021
7 (г. 2PO4 1.18 1.18 Sigma S0751
8 NaHCO3 18.00 До 18.00 18.00 До 18.00 Sigma S5761
рН: 7.4 рН: 7.4

Таблица 2: Реагенты, используемые при приготовлении низкокальциевого и нормального физиологического солевого раствора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта статья предоставляет необходимые шаги о том, как использовать острый метод микроэлектрода impalement для записи Vм от консервированной подготовки судна. Этот метод широко используется и предлагает высококачественные, последовательные записи Vm, которые отвечают на широкий спектр экспериментальных вопросов.

Некоторые критические соображения и шаги по устранению неполадок описаны здесь, чтобы обеспечить успех метода. Качество микроэлектрода (его резкость и устойчивость) и клеточный процесс, которыйон проникает, влияют на стабильность и точность V m. Если сигнал непрерывно дрейфует или находится выше или ниже диапазона записи усилителя, то, скорее всего, электрод блокируется или кончик нарушается. Если прокол является лишь частичным, недостаточным или повреждает ячейку, зарегистрированный потенциал поднимается обратно до 0 мВ, что приводит к нестабильному сигналу или отсутствию сигнала. В некоторых случаях содержимое ячейки может также блокировать электрод высокого сопротивления. Все эти проблемы можно преодолеть, просто заменив электрод на новый.

Для успешного прокола необходимо обеспечить, чтобы полное сопротивление клеточной мембраны оставалось неизменным, а размерный потенциал мембраны стабилен без утечек между электродом и мембраной. Очень важно, чтобы электрод продвигался к клетке стабильным микроманипулятором. При переходе к несколько микрометров клетки, наконечник потенциал будет меняться в результате небольшого отклонения в обнаруженном напряжении. Чтобы избежать повреждения кончика электрода или растяжения клеточной мембраны, требуется быстрое продвижение электрода. Успешное прокол характеризуется быстрым падением мембранного потенциала с последующей стабилизацией вокруг потенциала покоя мембраны. Если потенциальное чтение колеблется, вполне возможно, что кончик электрода нарушил мембрану вызывая утечки натрия в клетку и калий, чтобы просочиться из клетки, в результате чего прогрессивная деполяризация. Еще одна проблема в этом методе заключается в том, что возможности соединения и электродные наконечники могут добавить ненужный артефакт в запись Vm. Возможности соединения возникают при контакте различных проводников. Существуют два различных типа соединений потенциалов, жидко-металлический, и жидко-жидкой. Соединения жидкого металла образуются, когда кончик зонда контактирует с электролитом в микропипете. Соединения жидких жидкостей, также называемые потенциалом жидкого соединения, возникают при контакте двух растворов различной концентрации. Диффузия ионов между растворами способствует развитию потенциала. Кроме того, свойства стеклянного наконечника электрода, взаимодействующих с жидкостью, могут генерировать потенциал наконечника. Чтобы свести к минимуму соединение, а также наконечник потенциалов, обнуление измеряется потенциал в ванне может уменьшить нежелательные смещения. Во время прокола, нельзя исключать возможность того, что эндотелиальные, а не гладкие мышцы, Vм может быть непреднамеренно отобраны в некоторых экспериментах. Тем не менее, исследования показывают, что эндотелий и VSMC слоев электрически связаны в небольших артериол и обладают аналогичными Vм ответы23.

В конечном счете, три этапа этого процесса имеют решающее значение для достижения успешной записи. Во-первых, суда должны быть надлежащим образом подготовлены, обеспечивая, чтобы они не были повреждены в процессе. Во-вторых, микроэлектроды должны быть вытянуты в нужное электрическое свойство. Наконец, быстрое прокол мембраны, не нарушая кончик имеет решающее значение для точных результатов. Следователь должен понимать электрофизиологию, как создавать жизнеспособные микроэлектроды, и как настроить и использовать электрометр.

Несмотря на свою важность, этот метод имеет различные ограничения. Во-первых, совокупные затраты на закупку всего оборудования высоки (30-40 000 долл. США). Во-вторых, для всех этих экспериментов необходимы свежие сосуды; следовательно, животное усыплено для каждого эксперимента, добавляя к общей стоимости. В-третьих, вскрытие мозговых артерий, кануляция сосудов утомительно, дорого и имеет кривую обучения. В-четвертых, подготовка микроэлектродов, прокол и запись Vm требует глубокого понимания электрофизиологии. Наконец, для создания этой установки в лаборатории требуется преданный персонал, время и усилия.

Vm является важным электрофизиологическим свойством, определяющим тонус сосудов и, таким образом, приток крови к органу. Vm может быть изменен несколькими вазоактивными химическими веществами, которые высвобождаются из нейронов, эндотелия и компонентов крови. В то время как сосудосуживающие деполяризуют мембрану, расширители гиперполяризуют мембрану. Несколько белков, в том числе K каналы, VGCC, натрия калия ATPase, Ca2 "ATPase, Cl- каналы, магазин-управляемых и растяжек каналов регулировать Vм. Изменения в любом из этих белков в условиях заболевания потенциально могут изменить Vм и, таким образом, сосудистый тон и кровоток. Метод микроэлектрода impalement полезен для записи отдыха, а также изменения в Vм в ответ на сосудосуживающие и расширители. Таким образом, этот метод может быть надежно использован для понимания нормального и измененного V м, связанного с болезнью, и может быть полезен в разработке фармакологических препаратов, предназначенных для модулирования Vм,сосудистого тона и кровотока.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана грантами от программы интрамуральной поддержки (IRSP) от УГМК, Грантом развития ученых AHA (13SDG14000006), присужденными Малликарджуне Р. Паббиди.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser Parkland scientific V3000PK
Dissection microscope Nikon Instruments Inc., NY Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575 Harvard Apparatus, MA 73-198
Littauer Bone Cutter Fine science tools 16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps Fine science tools 11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt Fine science tools 14008-14
Suture Harvard Apparatus 72-3287
Vannas Spring Scissors Fine science tools 15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera Qimaging, , BC Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier WPI FD223A
In-line pressure transducer Harvard Apparatus, MA MA1 72-4496
Micromanipulator Thor labs PCS-5400
Microelectrodes Warner Instruments LLC, CT G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe) WPI MF28G67-5
Microelectrode holder WPI MEH1SF
Myograph Living Systems Instrumentation, VT CH-1-SH
Puller Sutter Instrument, San Rafael, CA P-97
Vibration-free table TMC 3435-14
Softwares
Clampex 10 Molecular devices
p Clamp 10 Molecular devices
Imaging software Nikon, NY NIS-elements
Chemicals
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P4504
MgSO4 Sigma M7506
CaCl2 Sigma C3881
HEPES Sigma H7006
Glucose Sigma G7021
NaH2PO4 Sigma S0751
NaHCO3 Sigma S5761

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
  2. Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32, (6), 353-370 (1995).
  3. Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271, (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
  4. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502, (Pt 2), 259-264 (1997).
  5. Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507, (Pt 3), 729-736 (1998).
  6. Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19, (7), 266-269 (1998).
  7. Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262, (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
  8. Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501, (Pt 2), 343-353 (1997).
  9. Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286, (4), C813-C820 (2004).
  10. Coca, A., Garay, R. Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. Taylor & Francis. (1993).
  11. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55, (2), 197-202 (1984).
  12. Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508, (Pt 1), 199-209 (1998).
  13. Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
  14. Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237, (1), C75-C80 (1979).
  15. Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300, (3), H803-H812 (2011).
  16. Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12, (2), 66-75 (2014).
  17. Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239, (1), C23-C26 (1980).
  18. Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42, (2), 253-256 (1983).
  19. Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98, (7), 931-938 (2006).
  20. Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
  21. Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346, (6), 691-700 (1992).
  22. Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347, (4), 438-444 (1993).
  23. Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269, (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
  24. Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278, (2), C235-C256 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics