Microelectrode Impalement metode for å Record membran potensial fra en Kanylert Middle cerebral arterie

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hovedmålet med denne artikkelen er å gi detaljer om hvordan å registrere membran potensial (Vm) fra midten cerebral arterien ved hjelp av microelectrode impalement metoden. Den kanylert midten cerebral arterien er equilibrated å få myogenic tone, og fartøyet veggen er Impaled ved hjelp av høy motstand microelectrodes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Reed, J. T., Sontakke, S. P., Pabbidi, M. R. Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery. J. Vis. Exp. (149), e59072, doi:10.3791/59072 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Membran potensial (Vm) av vaskulære glatte muskelceller bestemmer fartøyets tone og dermed blodstrømmen til et organ. Endringer i uttrykket og funksjon av ion kanaler og electrogenic pumper som regulerer Vm i sykdomstilstander potensielt kan endre vm, vaskulær tone, og blodstrøm. Således, en grunnleggende forståelse av elektrofysiologi og de metoder som er nødvendige for å nøyaktig registrere Vm i sunne og syke stater er avgjørende. Denne metoden vil tillate modulerende Vm bruke ulike farmakologiske midler for å gjenopprette Vm. Selv om det er flere metoder, hver med sine fordeler og ulemper, gir denne artikkelen protokoller for å spille inn Vm fra kanylert motstand fartøy som midten cerebral arterien ved hjelp av microelectrode impalement metoden. Middle cerebral arterier får lov til å få myogenic tone i en myograph kammer, og fartøyet veggen er Impaled ved hjelp av høy motstand microelectrodes. Vm signalet samles inn gjennom en electrometer, digitalisert og analysert. Denne metoden gir en nøyaktig lesning av Vm av en fartøy vegg uten å skade cellene og uten å endre membran motstanden.

Introduction

Membranen potensialet (Vm) av en celle refererer til den relative forskjellen av ioniske lade over plasma membranen og den relative permeabilitet av membranen til disse ioner. Vm er generert av differensial fordeling av ioner og vedlikeholdes av ion kanaler og pumper. Ion-kanaler som K+, na+og CL bidrar vesentlig til hvile Vm. Vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) uttrykke mer enn fire forskjellige typer av K+ kanaler1, to typer spenning-gated ca2 + kanaler (VGCC)2, mer enn to typer CL-kanaler 3, 4 andre priser , 5, butikk-opererte ca2 + kanaler6, strekk-aktivert spesifiserer kanaler7,8, og electrogenic natrium-kalium ATPase pumper9 i sine plasma membraner, som alle kan være involvert i regulering av Vm.

Vm av VSMCs avhenger av lumen trykk. I beholdere uten trykk, varierer Vm fra-50 til-65 mv, men i trykk arterie segmenter, Vm spenner fra-37 til-47 mv10. Heving av intravaskulær trykk forårsaker VSMCs til depolarize11, reduserer TERSKELEN for VGCC åpning, og øker kalsium tilstrømningen bidra til utvikling av myogenic tone12. Tvert imot, i passive eller ikke-trykkbeholdere, membran hyperpolarization, på grunn av høy K+ kanal aktivitet, vil hindre VGCC fra å åpne, noe som resulterer i begrenset kalsium oppføring og en nedgang i intracellulære kalsium, bidrar til mindre vaskulær tone13. Dermed, Vm på grunn av endringer i lumen trykk ser ut til å spille en viktig rolle i vaskulær tone utvikling, og både VGCC og K+ kanaler spille en avgjørende rolle i regulering av Vm.

Vm varierer mellom fartøy type og art. Vm er-54 ± 1,3 mv i marsvin overlegen chrezbryzheechno arteriell strips14,-45 ± 1 mv i rotte middle cerebral arterier ved 60 mmHg lumen trykk12, og-35 ± 1 mV i rotte parenkymatøs arterier på 40 mmHg lumen trykk15. Den hviler Vm registrert i unstretched rotte lymfatisk muskel er-48 ± 2 mv16. Vm av cerebral VSMCs er mer negativ enn i perifere arterier. Til sammenligning, feline midt cerebral arterier ble rapportert å ha en Vm av ca-70 mv, mens chrezbryzheechno og koronar arterier ble rapportert å ha-49 og-58 mv, henholdsvis17,18. Forskjeller i Vm på tvers av vaskulær senger kan gjenspeile forskjellene i uttrykket og funksjon av ion kanaler og electrogenic natrium-kalium pumper.

Økninger og reduksjoner i Vm er referert til som membran depolarization og hyperpolarization, henholdsvis. Disse endringene i Vm spiller en sentral rolle i mange fysiologiske prosesser, inkludert ion-Channel gating, celle signalering, muskel sammentrekning, og handling potensiell forplantning. På et fast trykk, mange endogene og syntetiske vasodilator forbindelser som aktiverer K+ kanaler forårsake membran hyperpolarization, noe som resulterer i vasodilatasjon1,13. Omvendt, vedvarende membran depolarization er viktig i Agonistiske-indusert eller reseptor-mediert vasokonstriksjon19. Vm er en kritisk variabel som ikke bare regulerer ca2 + tilstrømningen gjennom VGCC13 , men også påvirker utgivelsen av ca2 + fra interne butikker20,21 og ca2 +-følsomhet for kontraktile apparatet22.

Mens det er flere metoder for å spille inn Vm fra ulike celletyper, synes data innsamlet fra microelectrode impalement metode for kanylert fartøy å være mer fysiologiske enn data innhentet fra isolerte VSMCs. Når innspilt fra isolerte VSMC ved hjelp av gjeldende klemme metoder, Vm er sett på som spontan transient Hyperpolarizations i VSMCs24. Isolerte VSMCs er ikke i syncytium, og endringene i serie motstanden kan bidra til den oscillasjon atferden til Vm. På den annen side, oscillasjon atferd er ikke observert når Vm er registrert fra intakt fartøy, sannsynligvis på grunn av celle-celle kontakt mellom VSMCs som er i syncytium i arterien og er summert hele fartøyet fører til en stabil Vm 24. således er måling av Vm fra trykkbeholdere som bruker standard microelectrode impalement teknikk relativt nær de fysiologiske forholdene.

Innspilling Vm fra kanylert fartøy kunne gi viktig informasjon, siden Vm av VSMCs som er i syncytium er en av de viktigste faktorer som er avgjørende for vaskulær tone og blodstrøm, og modulering av Vm kan gi en måte å dilate eller constrict blodkar. Derfor er det viktig å forstå metodikken involvert i innspillingen Vm. Denne artikkelen beskriver intracellulære innspilling av Vm fra kanylert middels cerebral arterier (MCAs) ved hjelp av en microelectrode impalement metode. Denne protokollen beskriver hvordan du klargjør MCAs, microelectrodes, konfigurerer electrometer og utfører impalement-metoden for å registrere Vm. Også representative data, vanlige problemer som oppstod ved bruk av denne metoden og potensielle problemer, diskuteres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Det mannlig rotter var huset inne det dyr bekymre letter for UMMC, hvilke er anerkjent av foreningen for vurderingen og akkreditering av laboratorium dyr bekymre (AAALAC). Dyr hadde fri tilgang til mat og vann gjennom hele studien. Dyr ble opprettholdt i et kontrollert miljø med temperatur ved 24 ± 2 ° c, luftfuktighet på 60-80% og 12 h lys/mørke sykluser. Alle protokoller ble godkjent av Animal Care og use Committee of UMMC.

1. utarbeidelse av utstyr

  1. Plasser en dual Channel differensial electrometer forsterker (se tabell over materialer) i nærheten av fartøy kammeret og på ønsket sted.
  2. Koble utgangen på forsterker kanal A eller B til kanal inngangen for digitalisering med en BNC-BNC-kabel.
  3. Monter sonden i micromanipulator og plasser den i nærheten av mikroskopet og myograph. Opptaks oppsettet må være installert på et vibrasjonsfritt bord.
  4. Plasser knottene og bryterne på fremsiden av forsterkeren i posisjoner som konfigurerer den for dette eksperimentet, som beskrevet i håndboken.
  5. Koble badet bakken til kretsen bakken av forsterkeren via med en passende elektrode. På samme måte, sørg for at buret er jordet til kabinettet til forsterkeren.

2. utarbeidelse av Microelectrodes og montering

  1. Bruk Borosilikatglass glass microelectrodes (se tabell over materialer) og trekk glass spissen for å få en 8 – 10 mm taper, diameter på < 1 μm og motstanden på 80 – 120 MΩ når den er fylt med 3 M KCl.
    1. Bruk en standard avtrekker for å oppnå en kort gradvis taper ved å bruke følgende innstillinger: Heat = 650; hastighet = 20; pull = 25; tid = 250 og sløyfe to ganger for høyere motstander og mindre tips. Se tabellen med materialer ettersom innstillingene er instrument spesifikke.
      Merk: Tips diameter < 1 μm vil forårsake minimal skade på cellen når den Impaled.
  2. Fyll microelectrode med 3 M KCl ved hjelp av en mikrofiber sprøyte (se tabell over materialer).
    1. Trekk stempelet langsomt inn i microelectrode, mens du injiserer 3 M KCl på plass slik at væsken kan fylles og hindre dannelse av luftbobler inne i microelectrode.
    2. Fyll microelectrode til det er fullt og sørg for at det ikke er luftbobler før du plasserer det i microelectrode holderen. Hvis det finnes bobler, trykker du forsiktig på microelectrode med en finger for å fjerne boblene.
  3. Trening omsorg, fast Skyv elektrode skaftet inn i holderen gjennom boret hullet. Hvis overflødig væske er til stede, Fjern den med et vev.
  4. Koble elektrode holde renheten til forsterker proben. Utfør en elektrode test, Juster inngangs forskyvningen, kontroller null innstillingen og kontroller inn data lekkasje i sonden i henhold til forsterker manualen.
  5. Mål elektrode motstanden ved hjelp av en elektrode test som vist i tabell 1.
  6. Vær oppmerksom på at en fungerende elektrode viser en positiv forskyvning av DC-spenningen på 1 mV/MΩ ved kanal utgangen. På den annen side, hvis en stor spenning vises på kanalen utgang og på måleren, indikerer dette en blokkert eller brukket elektrode.
  7. Åpne innspillingen programvare, tilordne et navn til filen og lagre den for fremtidig analyse i en lagring programvare.

3. isolering og Kanyleringen av midt cerebral arterien

  1. Klargjør reagensene.
    1. Forbered normal og lav kalsium fysiologisk saltløsning (PSS) som beskrevet i tabell 2.
  2. Forbered myograph.
    1. Skyll myograph kammeret (se tabell over materialer) med destillert vann flere ganger for å holde den fri for rusk. Legg i kammeret med 5 mL normal PSS.
    2. Fyll begge glass kanyler med filtrert normal PSS ved hjelp av en 5 – 10 mL sprøyte. Fyll nøye hele kanyle og den vedlagte slangen uten å innføre noen luftbobler.
    3. Forbered to monofilament nylon sting (10-0, 0,02 mm) med en halv knute hver ved hjelp av stump tang.
    4. Plasser delvis lukkede Sutur knuter på begge kanyler litt vekk fra tuppen ved hjelp av disseksjon tang under et disseksjon mikroskop. Senere vil disse knop bli gled av og bundet forsiktig på kanylert arteriell endene til å sikre fartøyet.
  3. Isoler og kannelerer den midterste cerebral arterien.
    1. Indusere dyp anestesi i en Sprague Dawley rotte ved hjelp av 2-4% inhalert isoflurane.
    2. Halshugge rotta benytter giljotinen under dyp anestesi.
    3. Forsiktig fjerne skallen ved hjelp av en bein kutter og en saks.
    4. Fjern hjernen fra skallen og plasser den i 5 mL lav kalsium PSS på is.
    5. Identifisere og analysere ut en rette segment av rotte midt cerebral arterie (MCA) med en indre diameter på 100-200 μm fra hjernen ved hjelp av våren saks og tang.
    6. Monter MCA på glass kanyler ved hjelp av fin tang og sikre ved å stramme sting i myograph som inneholder normal PSS.
    7. Steng av den kanyle, slik at det ikke blir noen strømning i MCAs.
    8. Koble tilsig til et reservoar som holder PSS, for å muliggjøre kontroll av intraluminal trykk som vil overvåkes med en in-line trykkgiver.
    9. Visualiser kanylert MCAs ved hjelp av et enhets kamera (se tabell over materialer) som er montert på et invertert mikroskop og en bildebehandlingsprogramvare.
    10. Sett aksial lengden på MCA til en omtrentlig lengde der det skal vises verken stiv eller slapp tilstand.
    11. Likevekt bad løsning med O2 (95%) og CO2 (5%) ved 37 ° c for å gi tilstrekkelig oksygenering, temperatur og for å opprettholde pH ved 7,4.
  4. Spidde (trenge inn i cellen plasma membranen) den vaskulære glatte muskelceller.
    1. Koble jordelektroden og hold den nedsenket i myograph PSS.
    2. Belyse fartøy kammeret og se gjennom mikroskopet for å visualisere tuppen av microelectrode i badekaret.
      Merk: Alternativt kan man visualisere MCA og microelectrode på en datamaskin som har en tenkelig programvare.
    3. Bruk kontrollene på micromanipulator til å flytte tuppen av microelectrode nær den ytre veggen av blodkaret. Micromanipulator og tuppen av microelectrode må være i en stabil posisjon i forhold til vevet.
      Merk: Før du begynner med eksperimenter, må du kontrollere at membran spenningen har stabilisert. Hvis den målte spenningen er ustabil, er ikke forbindelsen mellom elektroden og cellen forseglet, noe som indikerer en lekkasje.
    4. Start opptaket.
    5. Beveg langsomt spissen av microelectrode mot fartøyet, med sikte på midten av fartøyet ved hjelp av kurs eller fin kontroll av micromanipulator.
      Merk: Noen ganger kan en liten utslag i opptaket observeres når microelectrode spissen kontakter en muskel fiber membran.
    6. Når spissen kommer i umiddelbar nærhet til fartøyet, før elektroden fremover i en rask bevegelse ved hjelp av micromanipulator å spidde membranen av muskelen.
    7. På dette punktet, kan man begynne å observere endringene i Vm blir registrert. Ikke berør micromanipulator når microelectrode Impales membranen i cellen.
      Merk: Forskjellen i spenning mellom opptaket og referanse elektroden reduseres fra 0 mV til mellom-40 mV og-75 mV avhengig av nivået av intravaskulær trykk eller andre eksitatoriske eller hemmende stimuli. Disse målingene karakteriserer den transmembrane potensielle forskjellen i gjeldende celle.
    8. Utfør flere impalements på et enkelt fartøy i forskjellige områder av fartøyet uten å skade VSMCs for å få nøyaktige målinger.
    9. Etter innspillingen, bruk det manipulator å fjerne det microelectrode inne ettall rask bevegelse.
    10. Stopp innspillingen og lagre datafiler for videre analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den presenterte metoden kan være pålitelig brukes til å spille inn Vm i kanylert fartøy. En kort prosedyre som beskriver hvordan du isolerer MCA fra hjernen er presentert i figur 1a. Etter å skille hjernen fra skallen, var MCA dissekert ut og plassert i en Petri parabolen inneholder lav kalsium PSS. En del av bindevev som var festet var også dissekert sammen med MCA bruke våren saks og tang for å hindre skade på MCA under isolasjon. Forsiktig, bindevev ble også fjernet, og dissekert MCA var klar til å overføre til myograph. MCA ble montert på kanyler og bundet ved hjelp Sutur knop på begge ender av kanyler i myograph. En skjematisk fremstilling av et typisk microelectrode impalement metode oppsett er vist i figur 1B. En microelectrode fylt med 3 M KCl var koblet til electrometer via en holder i sonden. Kanal utgangen til electrometer var koblet til en analog inngangskanal med en digitaliseringsenhet ved hjelp av en BNC-BNC-kabel. Digitaliserings utgang ble viderekoblet til et oscilloskop for å visualisere signalet i innspillingen programvare. Bakken er etablert ved hjelp av en AgCl pellet wire som ble forlenget fra kabinettet av electrometer til bad løsning i myograph. Til slutt ble digitale spor tatt i mot i opptaksprogramvaren på dataskjermen.

The MCA ble deretter inkubert i nylaget varme PSS og ble trykksatt til 60 mmHg. Bare fartøy som får tone ble brukt til Vm -opptak. Etter at fartøyet fikk betydelig tone, ble microelectrode rykket inn i fartøy veggen. Arteriell diameter og impalement av arterien ble visualisere ved hjelp av video mikroskopi. Impalement anses som vellykket når det er en rask avvisning av negative verdier, Vm er stabil for ≥ 30 s, og spenningen returnerer brått til 0 mv ved fjerning av elektroden som vist i figur 212,15. Våre resultater tyder på at i en MCA som er trykksatt til 60 mmHg, Vm er ~-43,2 ± 2,9 mv.

Etter en vellykket impalement og Vm stabilisering, stoffene som endrer vm var perfusert i badekaret og endringer i vm ble registrert. Vi brukte 20 mM KCl til depolarize og 20 μM NS1619, en syntetisk stor konduktans kalium kanal åpner, for å hyperpolarize membranen. Våre resultater tyder på at mengden av kammeret med KCl depolarisert membranen av ~ 5,8 ± 0,18 mV. På den annen side, med NS1619 hyperpolarized membranen med ~ 3,8 ± 0,4 mV.

Figure 1
Figur 1: en illustrasjon av isolering av middels cerebral arterier og opptak av membran potensial ved hjelp av microelectrode impalement metode. (A) ved hjelp av fjær saks, kutt hjernen eller bindevev langs de stiplede linjene. Overfør og Monter MCA mellom de to glass kanyler og fest den ved hjelp av sting i myograph kammeret fylt med PSS. (B) en microelectrode fylt med 3 M KCl er satt inn i holderen og er koblet til sonden. Endringer i transmembrane potensielle reiser fra sonden til en electrometer og til digitalisering via en BNC-kabel (BNC-kabel er koblet fra kanal utgang på electrometer og til en analog inngang av en digitaliseringsenhet). Det digitaliserte potensialet ses i opptaksprogramvaren på monitoren. Bakken er etablert ved hjelp av en AgCl pellet wire koblet fra electrometer til bad løsning i myograph. MCA = middels cerebral arterien; PSS = fysiologisk saltoppløsning; AgCl = sølv klorid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: opptak av membran potensial ved hjelp av microelectrode impalement metode fra kanylert midten cerebral arterier. Representative spor av Vm. Impalement anses som vellykket hvis det er en brå avvisning av negative verdier ved elektrode registrering, Vm er stabilt for ≥ 30 s, og spenningen returnerer brått til 0 mv ved fjerning av elektroden. X-aksen representerer tiden, og Y-aksen representerer membran potensialet. Den stiplede linjen representerer den justerte Baseline før impalement av fartøyet. Sek = sekunder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: opptak av endringer i membran potensialet ved hjelp av microelectrode impalement metode når fartøy utsettes for vasoactive midler. Vm ble spilt inn ved hjelp av microelectrode impalement metode fra kanylert midten cerebral arterier før og etter eksponering for vasoactive midler. Eksempel på sporing representerer (A) depolarization som svar på 20 mm KCl og (B) hyperpolarization som svar på 20 μM NS1619-en stor konduktans kalium kanal Agonistiske. (C) oppsummering søylediagram av endringene i Vm før og etter påføring av KCl og NS1619. Den stiplede linjen representerer hviler Vm. Tallet i parentesen representerer antall fartøy som brukes i studien. Merk at Vm nådde Baseline så snart stoffet er vasket ut. Feil linjen representerer standard feil av gjennomsnittet. Sek = sekunder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Innstillinger av electrometer for å måle elektrode motstanden
Måler inngang Kanal A eller B
Veksle mellom posisjoner I
Meter rekkevidde veksle til 200 mV
Elektroden I badekaret
Modus Betjen med elektrode test
Måler indikasjon 1 mV/MΩ

Tabell 1: innstillinger for electrometer for å måle elektrode motstanden.

Kjemikalier lav kalsium PSS mM Normal PSS mM Selskapet Katalogen
1 Nacl 119,00 for alle 119,00 for alle Sigma S7653
2 KCl 4,70 for alle 4,70 for alle Sigma P4504
3 MgSO4 1,17 for alle 1,17 for alle Sigma M7506
4 CaCl2 0,05 for alle 1,60 for alle Sigma C3881
5 HEPES 5,00 for alle 5,00 for alle Sigma H7006
6 Glukose 10,00 for alle 10,00 for alle Sigma G7021
7 NaH2PO4 1,18 for alle 1,18 for alle Sigma S0751
8 NaHCO3 18,00 for alle 18,00 for alle Sigma S5761
pH: 7,4 pH: 7,4

Tabell 2: reagenser som brukes ved tilberedning av lav kalsium og normal fysiologisk saltoppløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkelen gir de nødvendige trinnene for hvordan du bruker en skarp microelectrode impalement metode for å spille inn Vm fra en kanylert fartøy forberedelse. Denne metoden er mye brukt, og tilbyr høy kvalitet, konsekvent opptak av Vm som svarer på et bredt spekter av eksperimentelle spørsmål.

Noen kritiske hensyn og feilsøkingstrinn er beskrevet her for å sikre suksess av metoden. Kvaliteten på microelectrode (dens skarphet og motstand) og mobilnettet prosessen den penetrerer påvirke stabiliteten og nøyaktigheten av Vm. Hvis signalet kontinuerlig driver eller er over eller under opptaks området til forsterkeren, er det mest sannsynlig at elektroden er blokkert, eller at spissen er ødelagt. Hvis impalement bare er delvis, utilstrekkelig eller skader cellen, klatrer det registrerte potensialet tilbake til 0 mV, noe som resulterer i et ustabilt signal eller ikke noe signal. I noen tilfeller kan innholdet i cellen også blokkere den svært høy motstands elektroden. Alle disse problemene kan overvinnes ved bare å erstatte elektroden med en ny.

For vellykket impalement, må man sørge for at den totale motstanden i cellemembranen er uendret, og den målte membran potensialet er stabilt uten lekkasjer mellom elektroden og membranen. Det er viktig at elektroden er avansert mot cellen med en stabil micromanipulator. Når avansert til innen noen få mikrometer av cellen, spissen potensialet vil endre resulterer i en liten utslag i oppdaget spenning. For å unngå skade på spissen av elektroden eller strekking av cellemembranen er det nødvendig med rask utvikling av elektroden. Vellykket impalement er karakterisert ved en rask fall i membran potensialet etterfulgt av en stabilisering rundt hvile potensialet av membranen. Hvis den potensielle lesing svinger, er det mulig at spissen av elektroden har forstyrret membranen forårsaker natrium lekke inn i cellen og kalium å lekke ut av cellen, noe som resulterer i progressiv depolarization. Et annet problem i denne metoden er at veikryss potensialer og elektrodespissen potensialer kan legge til en unødvendig gjenstand til Vm innspillingen. Junction potensialer oppstår når ulike ledere kommer i kontakt. Det er to forskjellige typer veikryss potensialer, flytende-metall, og væske-væske. Væske-metall kryss dannes når spissen av sonden kontakter elektrolytt i micropipette. Væske-flytende veikryss, også kalt væske knutepunkt potensial, oppstår når to løsninger av varierende konsentrasjoner kommer i kontakt. Spredningen av ioner mellom løsningene bidrar til utvikling av potensialet. Dessuten kan egenskapene til glass elektrodespissen i samspill med væske generere spiss potensialer. For å minimere krysset samt spissen potensialer, nullstilling den målte potensialet i badekaret kunne redusere uønskede bias. Under impalement, kan man ikke utelukke muligheten for at endothelial, snarere enn glatt muskel, Vm kan utilsiktet bli samplet i noen eksperimenter. Men studier tyder på at endotelet og VSMC lag er elektrisk koblet i små arterioler og viser lignende Vm svar23.

Til syvende og sist er tre trinn i denne prosessen avgjørende for å oppnå vellykkede innspillinger. Først må fartøy være hensiktsmessig forberedt, slik at de ikke blir skadet i prosessen. For det andre må microelectrodes trekkes til de riktige elektriske egenskapene. Til slutt, rask impalement av membranen uten å bryte spissen er avgjørende for nøyaktige resultater. Undersøkeren må forstå elektrofysiologi, hvordan man lager levedyktig microelectrodes, og hvordan man setter opp og bruker en electrometer.

Til tross for sin betydning, har denne metoden ulike begrensninger. Først den samlede kostnaden for å anskaffe alt utstyret er høy (~ $30-40000). For det andre er det behov for ferske fartøy for alle disse eksperimentene; derav et dyr er euthanized for hvert eksperiment, og legger til den totale kostnaden. For det tredje, Disseksjon av cerebral arterier, kanyleringen av fartøyene er kjedelige, dyre og har en læringskurve. For det fjerde, forbereder microelectrodes, impalement og innspilling Vm krever en grundig forståelse av elektrofysiologi. Til slutt, for å etablere dette satt opp i laboratoriet krever dedikerte ansatte, tid og krefter.

Vm er en essensiell elektrofysiologisk egenskap som bestemmer vaskulær tone og dermed blodstrømmen til et organ. Vm kan endres av flere vasoactive kjemikalier som frigjøres fra neurons, endotelet og blodkomponenter. Mens vasoconstrictors depolarize membranen, Dilators hyperpolarize membranen. Flere proteiner, inkludert K+ Channels, VGCC, natrium kalium ATPase, ca2 + ATPase, CL- kanaler, butikk drevne og strekk kanaler regulerer Vm. Endringer i noen av disse proteinene i sykdomstilstander kan potensielt endre Vm og dermed vaskulær tone og blodstrøm. Den microelectrode impalement metoden er nyttig for å registrere hvile, samt endringer i Vm som svar på vasoconstrictors og Dilators. Så, denne metoden kan brukes pålitelig til å forstå normal og endret Vm assosiert med sykdom, og kan være nyttig i utviklingen av farmakologiske midler designet for å modulere Vm, vaskulær tone og blodstrøm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd fra intramural støtte forskningsprogram (IRSP) fra UMMC, AHA forsker Development Grant (13SDG14000006) tildelt Mallikarjuna R. Pabbidi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser Parkland scientific V3000PK
Dissection microscope Nikon Instruments Inc., NY Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575 Harvard Apparatus, MA 73-198
Littauer Bone Cutter Fine science tools 16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps Fine science tools 11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt Fine science tools 14008-14
Suture Harvard Apparatus 72-3287
Vannas Spring Scissors Fine science tools 15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera Qimaging, , BC Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier WPI FD223A
In-line pressure transducer Harvard Apparatus, MA MA1 72-4496
Micromanipulator Thor labs PCS-5400
Microelectrodes Warner Instruments LLC, CT G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe) WPI MF28G67-5
Microelectrode holder WPI MEH1SF
Myograph Living Systems Instrumentation, VT CH-1-SH
Puller Sutter Instrument, San Rafael, CA P-97
Vibration-free table TMC 3435-14
Softwares
Clampex 10 Molecular devices
p Clamp 10 Molecular devices
Imaging software Nikon, NY NIS-elements
Chemicals
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P4504
MgSO4 Sigma M7506
CaCl2 Sigma C3881
HEPES Sigma H7006
Glucose Sigma G7021
NaH2PO4 Sigma S0751
NaHCO3 Sigma S5761

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
  2. Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32, (6), 353-370 (1995).
  3. Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271, (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
  4. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502, (Pt 2), 259-264 (1997).
  5. Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507, (Pt 3), 729-736 (1998).
  6. Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19, (7), 266-269 (1998).
  7. Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262, (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
  8. Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501, (Pt 2), 343-353 (1997).
  9. Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286, (4), C813-C820 (2004).
  10. Coca, A., Garay, R. Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. Taylor & Francis. (1993).
  11. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55, (2), 197-202 (1984).
  12. Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508, (Pt 1), 199-209 (1998).
  13. Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
  14. Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237, (1), C75-C80 (1979).
  15. Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300, (3), H803-H812 (2011).
  16. Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12, (2), 66-75 (2014).
  17. Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239, (1), C23-C26 (1980).
  18. Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42, (2), 253-256 (1983).
  19. Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98, (7), 931-938 (2006).
  20. Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
  21. Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346, (6), 691-700 (1992).
  22. Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347, (4), 438-444 (1993).
  23. Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269, (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
  24. Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278, (2), C235-C256 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics