Método do impalement do microelétrodo para gravar o potencial da membrana de uma artéria cerebral média Cannulated

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Summary

O objetivo preliminar deste artigo é fornecer detalhes de como gravar o potencial da membrana (Vm) da artéria cerebral média usando o método do impalement do microelétrodo. A artéria cerebral média canulada é equilibrada para ganhar o Tom miogênico, e a parede do vaso é empalada usando microeletrodos de alta resistência.

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Reed, J. T., Sontakke, S. P., Pabbidi, M. R. Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery. J. Vis. Exp. (149), e59072, doi:10.3791/59072 (2019).

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Abstract

O potencial de membrana (Vm) das células musculares lisas vasculares determina o tom do vaso e, portanto, o fluxo sanguíneo para um órgão. Mudanças na expressão e função de canais iônicos e bombas eletrogênicas que regulam Vm em condições de doença poderiam potencialmente alterar vm, tônus vascular e fluxo sanguíneo. Assim, uma compreensão básica da eletrofisiologia e os métodos necessários para gravar com precisão Vm em Estados saudáveis e doentes são essenciais. Este método permitirá modulando Vm usando diferentes agentes farmacológicos para restaurar vm. Embora existam vários métodos, cada um com suas vantagens e desvantagens, este artigo fornece protocolos para registro de Vm de vasos de resistência canulados, como a artéria cerebral média, utilizando o método de empalamento do microeletrodo. As artérias cerebrais médias podem ganhar o Tom myogenic em uma câmara do miógrafo, e a parede da embarcação é empalada usando microeletrodos da resistência elevada. O sinal de Vm é coletado através de um electrometer, digitalizado, e analisado. Este método fornece uma leitura exata do Vm de uma parede da embarcação sem danificar as pilhas e sem mudar a resistência da membrana.

Introduction

O potencial de membrana (Vm) de uma célula refere-se à diferença relativa da carga iónica através da membrana plasmática e a permeabilidade relativa da membrana a estes íons. O Vm é gerado pela distribuição diferencial de íons e é mantido por canais de íons e bombas. Os canais iônicos como K+, na+e CL contribuem substancialmente para o repouso Vm. As pilhas de músculo liso vasculares (VSMCs) expressam mais de quatro tipos diferentes de K+ Channels1, dois tipos de CA2 + Channels tensão-fechados (vgcc)2, mais de dois tipos de CL canaletas3, 4. º , 5, loja-operado CA2 + canais6, estiramento-ativado catiões7,8, e electrogénico sódio-potássio ATPase bombas9 em suas membranas plasmáticas, todos os quais podem ser envolvidos na regulação da Vm.

O Vm de VSMCs depende da pressão do lúmen. Em vasos não pressurizados, Vm varia de-50 a-65 MV, porém, em segmentos arteriais pressurizados, vm varia de-37 a-47 MV10. A elevação da pressão intravascular faz com que os vsmcs despolarize11, diminua o limiar para a abertura de vgcc, e aumente o afluxo do cálcio que contribui ao desenvolvimento do Tom myogenic12. Pelo contrário, em vasos passivos ou não-pressurizados, a hiperpolarização da membrana, devido à alta atividade de K+ Channel, impedirá a abertura do vgcc, resultando em uma entrada de cálcio limitada e uma diminuição no cálcio intracelular, contribuindo para menos tônus vascular13. Assim, Vm devido às mudanças na pressão do lúmen parece desempenhar um papel essencial no desenvolvimento do Tom vascular, e ambos Vgcc e K+ canais desempenham um papel crucial na regulação da Vm.

Vm varia entre o tipo de embarcação e as espécies. Vm é-54 ± 1,3 MV em tiras arteriais mesentéricas superiores14,-45 ± 1 mV nas artérias cerebrais médias de ratos a 60 mmHg de pressão do lúmen12e-35 ± 1 mV em artérias parenquimatosas de ratos a 40 mmHg de pressão do lúmen15. O Vm de repouso gravado em músculo linfático de rato não esticado é de-48 ± 2 MV16. Vm de VSMCs cerebrais é mais negativo do que nas artérias periféricas. Na comparação, as artérias cerebrais médias Feline foram relatadas para ter um Vm de aproximadamente-70 MV, quando as artérias mesentérica e coronárias foram relatadas para ter-49 e-58 MV, respectivamente17,18. As diferenças na Vm em leitos vasculares podem refletir as diferenças na expressão e função dos canais iônicos e das bombas eletrogênicas de sódio e potássio.

Os aumentos e as diminuições em Vm são referidos como a despolarização da membrana e a hiperpolarização, respectivamente. Essas alterações na Vm desempenham um papel central em muitos processos fisiológicos, incluindo gating de canal iônico, sinalização celular, contração muscular e propagação do potencial de ação. A uma pressão fixa, muitos compostos vasodilatadores endógenos e sintéticos que ativam canais K+ causam hiperpolarização da membrana, resultando em vasodilatação1,13. Inversamente, a despolarização sustentada da membrana é vital na vasoconstrição agonista-induzida ou receptor-negociada19. Vm é uma variável crítica que não só regula CA2 + afluxo através do vgcc13 , mas também influencia a liberação de CA2 + de lojas internas20,21 e CA2 +-sensibilidade de o aparelho contrátil22.

Embora existam vários métodos para gravar Vm de diferentes tipos de células, os dados coletados a partir do método de empalamento de microeletrodos de vasos canulados parece ser mais fisiológico do que os dados obtidos a partir de VSMCs isolados. Quando gravado de VSMC isolado usando métodos atuais da braçadeira, Vm é visto como hyperpolarizations transientes espontâneos em VSMCs24. VSMCs isolados não estão no Syncytium, e as mudanças na resistência da série podem contribuir ao comportamento oscilatório de Vm. Por outro lado, o comportamento oscilatório não é observado quando o Vm é gravado a partir de vasos intactos, provavelmente devido ao contato celular entre os VSMCs que estão no Syncytium na artéria e são somados em todo o vaso levando a um vm estável 24. assim, a medida de Vm dos vasos pressurizados usando a técnica padrão do empalement do microelétrodo é relativamente próxima às circunstâncias physiological.

A gravação de Vm de vasos canulados poderia fornecer informações vitais, uma vez que vm de vsmcs que estão em Syncytium é um dos principais determinantes do tônus vascular e fluxo sanguíneo, e a modulação do vm poderia fornecer uma maneira de dilatar ou contraem os vasos sanguíneos. Assim, é essencial compreender a metodologia envolvida na gravação de Vm. Este artigo descreve a gravação intracelular de Vm das artérias cerebrais médias canulados (MCAS) usando um método do impalement do microelétrodo. Este protocolo descreverá como preparar MCAS, microeletrodos, configurar o eletrômetro e executar o método de empalamento para gravar Vm. Também, os dados representativos, os problemas comuns que foram encontrados ao usar este método e os problemas potenciais são discutidos.

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Protocol

Os ratos machos foram alojados na unidade de cuidados com animais da UMMC, que é aprovada pela Associação para avaliação e acreditação de cuidados com animais de laboratório (AAALAC). Os animais tiveram livre acesso à alimentação e à água durante todo o estudo. Os animais foram mantidos em ambiente controlado com temperatura a 24 ± 2 ° c, níveis de umidade de 60 – 80% e 12 h de luz/ciclos escuros. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais da UMMC.

1. preparação do equipamento

  1. Coloque um amplificador de eletrômetro diferencial de canal duplo (veja a tabela de materiais) perto da câmara do vaso e no local pretendido.
  2. Conecte a saída do canal a ou B do amplificador à entrada do canal do digitalizador com um cabo BNC-BNC.
  3. Monte a sonda no micromanipulador e coloque-a perto do microscópio e do miografo. A configuração de gravação deve ser instalada em uma tabela sem vibrações.
  4. Coloque os botões e interruptores na parte frontal do amplificador em posições que o configuram para este experimento, conforme descrito no manual.
  5. Conecte a terra do banho à terra do circuito do amplificador através com um elétrodo apropriado. Similarmente, assegure-se de que a gaiola esteja aterrada ao chassi do amplificador.

2. preparação de microeletrodos e montagem

  1. Use microeletrodos de vidro de borosilicato (veja a tabela de materiais) e puxe a ponta de vidro para ter um cone de 8 – 10 mm, diâmetro de < 1 μm e resistência de 80 – 120 MΩ quando preenchido com KCl de 3 M.
    1. Use um extrator padrão para conseguir um afilamento gradual curto usando as seguintes configurações: Heat = 650; velocidade = 20; puxar = 25; tempo = 250 e loop duas vezes para resistências mais elevadas e pontas menores. Consulte a tabela de materiais , pois as configurações são específicas do instrumento.
      Nota: Os diâmetros da ponta < 1 μm causarão dano mínimo à pilha quando empalados.
  2. Encha o microelétrodo com o KCl de 3 M usando uma seringa do microfiber (veja a tabela de materiais).
    1. Puxe lentamente o êmbolo da seringa de microfibra para cima enquanto injetando o KCl de 3 M no microeletrodo para permitir que o fluido encha e impeça a formação de bolhas de ar no interior do microeletrodo.
    2. Encha o microeletrodo até ficar cheio e assegure-se de que não haja bolhas de ar antes de colocá-la no suporte do microeletrodo. Se as bolhas estiverem presentes, Bata suavemente no microeletrodo com um dedo para remover as bolhas.
  3. Exercitando o cuidado, empurre firmemente o Shank do elétrodo no suporte através do furo furado. Se o excesso de fluido estiver presente, retire-o com um lenço.
  4. Conecte o conjunto do suporte do eletrodo à sonda do amplificador. Conduza um teste do elétrodo, ajuste o offset da entrada, verifique a configuração zero e verific o escapamento da entrada da ponta de prova como por o manual do amplificador.
  5. Meça a resistência do eletrodo usando um teste de eletrodo como mostrado na tabela 1.
  6. Note-se que um eletrodo de trabalho exibe uma mudança de tensão DC positiva de 1 mV/MΩ na saída do canal. Por outro lado, se uma grande tensão aparece na saída do canal e no medidor, isso indica um eletrodo bloqueado ou quebrado.
  7. Abra o software de gravação, atribua um nome ao arquivo e salve-o para análise futura em um software de armazenamento.

3. isolamento e canulação da artéria cerebral média

  1. Preparação dos reagentes.
    1. Prepare a solução de sal fisiológico de cálcio normal e baixo (PSS), conforme descrito na tabela 2.
  2. Prepare o miografo.
    1. Enxágüe a câmara miográfica (ver a tabela de materiais) com água destilada várias vezes para mantê-lo livre de detritos. Carregue a câmara com 5 mL de PSS normal.
    2. Encha ambas as cânulas de vidro com o PSS normal filtrado usando uma seringa de 5 – 10 mL. Encha com cuidado a cânula inteira e a tubulação unida sem introduzir nenhumas bolhas de ar.
    3. Prepare duas suturas de nylon do monofilamento (10-0, 0, 2 milímetros) com um Half-Knot cada um que usa o fórceps sem corte.
    4. Coloc os nós parcialmente fechados da sutura em ambas as cânulas ligeiramente longe da ponta usando o fórceps da dissecção um microscópio da dissecção. Mais tarde estes nós serão deslizados fora e amarrado com cuidado sobre as extremidades arteriais canulados para fixar a embarcação.
  3. Isole e canular a artéria cerebral média.
    1. Induzir anestesia profunda em um rato de Sprague Dawley usando 2 – 4% de isoflurano inalatório.
    2. Decapitar o rato usando guilhotina anestesia profunda.
    3. Retire cuidadosamente o crânio usando um cortador de osso e uma tesoura.
    4. Retire o cérebro do crânio e coloque-o em 5 mL de PSS de baixo cálcio no gelo.
    5. Identifique e dissecar um segmento não ramificado da artéria cerebral média do rato (MCA) com um diâmetro interno de 100 – 200 μm do cérebro usando tesouras e fórceps da mola.
    6. Monte o MCA nas cânulas de vidro usando o fórceps fino e fixe apertando as suturas no miógrafo que contem o PSS normal.
    7. Feche a cânula distal para que não haja fluxo dentro das MCAs.
    8. Conecte a pipeta do entrada a um reservatório que prende PSS para permitir o controle da pressão intraluminal que será monitorada com um transdutor de pressão in-line.
    9. Visualize as MCAs canuladas usando uma câmera de dispositivo acoplada por carga (consulte a tabela de materiais) montada em um microscópio invertido e um software de imagem.
    10. Ajuste o comprimento axial do MCA a um comprimento aproximado onde deva aparecer nem rígido nem flaccid.
    11. Equilibrar a solução de banho com O2 (95%) e CO2 (5%) a 37 ° c para fornecer oxigenação adequada, temperatura e manter o pH em 7,4.
  4. Empalar (penetrar na membrana plasmática celular) as células musculares lisas vasculares.
    1. Conecte o eletrodo de aterramento e mantenha-o imerso no PSS do miografo.
    2. Ilumine a câmara do vaso e olhe através do microscópio para visualizar a ponta do microelétrodo na solução do banho.
      Nota: Alternativamente, pode-se Visualizar o MCA e microeletrodo em um computador com um software de imagem.
    3. Use os controles do micromanipulador para mover a ponta do microeletrodo perto da parede externa do vaso sanguíneo. O micromanipulador e a ponta do microeletrodo devem estar em uma posição estável em relação ao tecido.
      Nota: Antes de iniciar experimentos, confirme que a tensão da membrana estabilizou. Se a tensão medida for instável, a ligação entre o eléctrodo e a célula não é selada, indicando um vazamento.
    4. Comece a gravação.
    5. Mova lentamente a ponta do microelétrodo para a embarcação, apontando para o centro da embarcação usando o curso ou o controle fino do micromanipulator.
      Nota: Ocasionalmente, uma pequena deflexão na gravação pode ser observada quando a ponta do microeletrodo contata uma membrana de fibra muscular.
    6. Quando a ponta vem na proximidade próxima à embarcação, avance o elétrodo para a frente em um movimento rápido usando o micromanipulador para empalbar a membrana do músculo.
    7. Neste ponto, pode-se começar a observar as alterações em Vm sendo gravado. Não toque no micromanipulador quando o microeletrodo empalaliza a membrana da célula.
      Nota: A diferença de tensão entre o eletrodo de registro e de referência diminui de 0 mV para entre-40 mV e-75 mV dependendo do nível de pressão intravascular ou outros estímulos excitatórios ou inibidores. Estas leituras caracterizam a diferença potencial do transmembrana da pilha atual.
    8. Realize vários empalamentos em uma única embarcação em diferentes áreas da embarcação sem danificar VSMCs para obter medições precisas.
    9. Após a gravação, use o manipulador para remover o microeletrodo em um movimento rápido.
    10. Interrompa a gravação e salve os arquivos de dados para análise posterior.

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Representative Results

O método apresentado pode ser usado confiantemente para gravar Vm em embarcações canulados. Um breve procedimento descrevendo como isolar MCA do cérebro é apresentado na Figura 1a. Após separar o cérebro do crânio, o MCA foi dissecado para fora e coloc em um prato de Petri que contem o baixo cálcio PSS. Parte do tecido conjuntivo que foi anexado também foi dissecado juntamente com MCA usando tesouras de mola e fórceps para evitar danos ao MCA durante o isolamento. Com cuidado, o tecido conjuntivo também foi removido, e o MCA dissecado estava pronto para ser transferido para o miografo. O MCA foi montado nas cânulas e amarrado usando nós da sutura em ambas as extremidades das cânulas no myograph. Uma representação esquemática de uma configuração típica do método de empalamento de microeletrodos é mostrada na Figura 1b. Um microelétrodo enchido com o KCl de 3 M foi conectado ao eletrômetro através de um suporte na ponta de prova. Canal de saída do eletrômetro foi ligado a um canal de entrada analógica de um digitalizador usando um cabo BNC-BNC. A saída do digitalizador foi conectada mais a um osciloscópio para visualizar o sinal no software de gravação. A terra é estabelecida usando um fio da pelota de AgCl que seja estendido do chassi do eletrômetro à solução do banho no myograph. Finalmente, os traços digitais foram visualizados no software de gravação no monitor do computador.

A MCA foi então incubada em PSS quente preparado na hora e foi pressurizada para 60 mmHg. Somente as embarcações que ganham o Tom foram usadas para a gravação de Vm . Depois que a embarcação ganhou o Tom significativo, o microelétrodo foi avançado na parede da embarcação. O diâmetro arterial e o empalamento da artéria foram visualizados por microscopia de vídeo. O impalement é considerado bem sucedido quando há uma deflexão rápida aos valores negativos, Vm é estável para ≥ 30 s, e a tensão retorna abruptamente a 0 milivolt em cima da remoção do elétrodo como mostrado na Figura 212,15. Nossos resultados sugerem que, em um MCA que é pressurizado a 60 mmHg, o Vm é ~-43,2 ± 2,9 MV.

Após um empalamento bem sucedido e estabilização de vm , as drogas que alteram o vm foram perfundidos no banho e as mudanças no vm foram gravadas. Nós usamos o KCl de 20 milímetros para despolarizar e 20 μm NS1619, um grande abridor de canaleta do potássio da condutibilidade sintética, para célula a membrana. Nossos resultados sugerem que a perfusão da câmara com KCl depolarizada a membrana por ~ 5,8 ± 0,18 mV. Por outro lado, a perfusão com NS1619 hiperpolarizada a membrana por ~ 3,8 ± 0,4 mV.

Figure 1
Figura 1: uma ilustração da isolação de artérias cerebrais médias e da gravação do potencial da membrana usando o método do empalement do microelétrodo. (A) usando tesouras da mola, corte o cérebro ou o tecido conexivo ao longo das linhas pontilhadas. Transfira e monte o MCA entre as duas cânulas de vidro e fixe-a usando suturas na câmara do miógrafo enchida com o PSS. (B) um microelétrodo enchido com o KCl de 3 M é introduzido no suporte e é conectado à ponta de prova. As mudanças no potencial transmembrana viajam da ponta de prova a um eletrômetro e ao digitalizador através de um cabo de BNC (o cabo de BNC é conectado da saída do canal do eletrômetro e a uma entrada análoga de um digitalizador). O potencial digitalizado é visto no software de gravação no monitor. A terra é estabelecida usando um fio da pelota de AgCl conectado do eletrômetro à solução do banho no myograph. MCA = artéria cerebral média; PSS = solução salina fisiológica; AgCl = cloreto de prata. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: registro do potencial de membrana utilizando o método de empalamento de microeletrodos de artérias cerebrais médias canuladas. Traço representativo de Vm. O empalamento é considerado bem sucedido se há uma deflexão abrupta aos valores negativos em cima da entrada do elétrodo, Vm é estável para ≥ 30 s, e a tensão retorna abruptamente a 0 milivolt em cima da remoção do elétrodo. O eixo X representa o tempo, e o eixo Y é o potencial da membrana. A linha pontilhada representa o valor basal ajustado antes do empalamento da embarcação. Seg = segundos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: registro de alterações no potencial de membrana utilizando o método de empalamento de microeletrodos quando os vasos são expostos a agentes vasoativos. O Vm foi gravado usando o método do impalement do microelétrodo das artérias cerebrais médias canulados antes e depois da exposição aos agentes vasoativas. O traço amostral representa (a) despolarização em resposta a 20 mm de KCl e (B) hiperpolarização em resposta a 20 μm NS1619 — um grande agonista do canal de potássio condutância. (C) gráfico de barras de síntese das alterações em Vm antes e após a aplicação de KCl e NS1619. A linha pontilhada representa o repouso Vm. O número no parêntese representa o número de embarcações utilizadas no estudo. Note que Vm atingiu a linha de base assim que a droga é lavada. Barra de erro representa o erro padrão da média. Seg = segundos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ajustes do eletrômetro para medir a resistência do elétrodo
Entrada do medidor Canal A ou B
Alternância de posição Em
Escala do medidor alternar para 200 mV
Eletrodo No banho
Modo Opere ao teste do elétrodo
Indicação do medidor 1 mV/MΩ

Tabela 1: ajustes do eletrômetro para medir a resistência do elétrodo.

Produtos químicos baixo cálcio PSS mM Normal PSS mM Empresa Catálogo
1 Nacl 119, 0 119, 0 Sigma S7653
2 Kcl 4,70 4,70 Sigma P4504
3 MgSO4 1,17 1,17 Sigma M7506
4 CaCl2 0, 5 1,60 Sigma C3881
5 HEPES 5, 0 5, 0 Sigma H7006
6 Glicose 10, 0 10, 0 Sigma G7021
7 NaH2po4 1,18 1,18 Sigma S0751
8 NaHCO3 18, 0 18, 0 Sigma S5761
pH: 7,4 pH: 7,4

Tabela 2: reagentes utilizados na preparação da solução salina de baixo cálcio e sal fisiológico normal.

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Discussion

Este artigo fornece as etapas necessárias em como usar um método afiado do impalement do microelétrodo para gravar Vm de uma preparação canulados da embarcação. Este método é amplamente utilizado, e oferece gravações consistentes de alta qualidade de Vm que respondem a uma vasta gama de perguntas experimentais.

Algumas considerações críticas e etapas de solução de problemas são descritas aqui para garantir o sucesso do método. A qualidade do microeletrodo (sua nitidez e resistência) e o processo celular que penetra influenciam a estabilidade e a acurácia do Vm. Se o sinal se drifts continuamente ou estiver acima ou abaixo da faixa de gravação do amplificador, é mais provável que o eletrodo esteja bloqueado ou a ponta esteja quebrada. Se o empalamento é apenas parcial, insuficiente, ou danifica a célula, o potencial gravado sobe de volta para 0 mV, resultando em um sinal instável ou nenhum sinal. Em alguns casos, o conteúdo da célula também pode bloquear o eletrodo de resistência muito alta. Todos esses problemas podem ser superados simplesmente substituindo o eletrodo por um novo.

Para o empalamento bem sucedido, um deve assegurar-se de que a resistência total da membrana de pilha esteja inalterada, e o potencial medido da membrana seja estável sem os escapes entre o elétrodo e a membrana. É crítico que o elétrodo esteja avançado para a pilha por um micromanipulator estável. Quando avançado para dentro de alguns micrômetros da célula, o potencial de ponta mudará resultando em uma ligeira deflexão na tensão detectada. Para evitar danificar a ponta do eletrodo ou alongamento da membrana celular, é necessário um avanço rápido do eletrodo. O empalamento bem sucedido é caracterizado por uma gota rápida no potencial da membrana seguida por uma estabilização em torno do potencial de descanso da membrana. Se a leitura potencial oscila, é possível que a ponta do eletrodo tenha interrompido a membrana causando o vazamento de sódio na célula e o potássio para vazar da célula, resultando em despolarização progressiva. Um outro problema neste método é que os potenciais da junção e os potenciais da ponta do elétrodo podem adicionar um artefato desnecessário à gravação de Vm . Potenciais de junção ocorrem quando condutores diferentes entram em contato. Há dois tipos diferentes de potenciais da junção, líquido-metal, e líquido-líquido. Junções de metal líquido são formadas quando a ponta da sonda contata o eletrólito na micropipeta. Junções líquido-líquidas, também chamadas de potencial de junção líquida, ocorrem quando duas soluções de concentrações variadas entram em contato. A difusão dos íons entre as soluções contribui para o desenvolvimento do potencial. Adicionalmente, as propriedades da ponta de vidro do elétrodo que interagem com o líquido podem gerar potenciais da ponta. Para minimizar a junção assim como potenciais da ponta, zerando o potencial medido no banho poderia reduzir o viés indesejado. Durante o empalamento, não se pode descartar a possibilidade de que o músculo endotelial, ao invés de liso, Vm poderia inadvertidamente ser amostrado em alguns experimentos. No entanto, estudos indicam que as camadas endotélio e VSMC são eletricamente acopladas em pequenas arteríolas e exibem respostas semelhantes de Vm 23.

Em última análise, três etapas neste processo são críticas para alcançar gravações bem-sucedidas. Em primeiro lugar, as embarcações devem ser adequadamente preparadas, assegurando que não sejam danificadas no processo. Em segundo lugar, os microeletrodos devem ser puxados para as propriedades elétricas direitas. Finalmente, o empalamento rápido da membrana sem quebrar a ponta é crucial para resultados exatos. O investigador deve compreender a electrofisiologia, como criar microeletrodos viáveis, e como configurar e usar um electrometer.

Apesar de sua importância, este método tem várias limitações. Primeiro, o custo agregado para adquirir todo o equipamento é alto (~ $30-40000). Em segundo lugar, os vasos frescos são necessários para todos esses experimentos; Portanto, um animal é eutanasiado para cada experimento, acrescentando ao custo global. Em terceiro lugar, a dissecção das artérias cerebrais, canulação dos vasos é tedioso, caro e tem uma curva de aprendizado. Em quarto lugar, a preparação de microeletrodos, empalamento e gravação de Vm requer uma compreensão completa da eletrofisiologia. Finalmente, para estabelecer esta criação no laboratório requer pessoal dedicado, tempo e esforço.

Vm é uma propriedade eletrofisiológica essencial que determina o tônus vascular e, portanto, o fluxo sanguíneo para um órgão. Vm pode ser alterado por vários produtos químicos vasoativos que são liberados a partir de neurônios, endotélio e componentes sanguíneos. Enquanto os vasoconstritores despolarizam a membrana, os dilatadores hiperpolarizam a membrana. Várias proteínas, incluindo K+ canais, Vgcc, ATPase de potássio de sódio, CA2 + ATPase, canais CL, operados por loja e canais de estiramento regulam o Vm. Alterações em qualquer uma dessas proteínas em condições de doença poderiam potencialmente alterar Vm e assim o tônus vascular e fluxo sanguíneo. O método de empalamento de microeletrodos é útil para registrar repouso, bem como alterações em Vm em resposta a vasoconstritores e dilatadores. Assim, este método poderia ser usado confiantemente para compreender o Vm normal e alterado associado com a doença, e pode ser útil no desenvolvimento de agentes farmacológicos projetados modular o vm, o Tom vascular e o fluxo sanguíneo.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte por subsídios do programa de pesquisa de apoio intramural (IRSP) de UMMC, AHA cientista Development Grant (13SDG14000006) concedido a Mallikarjuna R. Pabbidi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser Parkland scientific V3000PK
Dissection microscope Nikon Instruments Inc., NY Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575 Harvard Apparatus, MA 73-198
Littauer Bone Cutter Fine science tools 16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps Fine science tools 11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt Fine science tools 14008-14
Suture Harvard Apparatus 72-3287
Vannas Spring Scissors Fine science tools 15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera Qimaging, , BC Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier WPI FD223A
In-line pressure transducer Harvard Apparatus, MA MA1 72-4496
Micromanipulator Thor labs PCS-5400
Microelectrodes Warner Instruments LLC, CT G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe) WPI MF28G67-5
Microelectrode holder WPI MEH1SF
Myograph Living Systems Instrumentation, VT CH-1-SH
Puller Sutter Instrument, San Rafael, CA P-97
Vibration-free table TMC 3435-14
Softwares
Clampex 10 Molecular devices
p Clamp 10 Molecular devices
Imaging software Nikon, NY NIS-elements
Chemicals
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P4504
MgSO4 Sigma M7506
CaCl2 Sigma C3881
HEPES Sigma H7006
Glucose Sigma G7021
NaH2PO4 Sigma S0751
NaHCO3 Sigma S5761

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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