一种用自动表型分析预测线虫化学毒性的高通量测定

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Summary

通过对线虫表型分析的自动分析, 提出了一种定量鉴别和预测化学品急性毒性的方法。该协议描述了如何在384孔板中使用化学物质处理蠕虫, 捕获视频, 并量化与毒理学相关的表型。

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Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. D., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

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Abstract

对小鼠或大鼠等高阶生物中的化学品进行毒性测试是耗时和昂贵的, 因为它们的寿命长, 维护问题。相反, 线虫具有其优势, 使其成为毒性试验的理想选择: 寿命短、易于栽培、繁殖效率高。在这里, 我们描述了一个协议的自动表型分析的线虫在384孔板。线虫在384孔板中进行液体介质和化学处理, 并对每口井进行视频处理, 以量化化学对33种蠕虫特征的影响。实验结果表明, 量化的表型特征可以对不同化合物的急性毒性进行分类和预测, 并为啮齿类动物模型中的进一步传统化学毒性评价试验确定优先清单。

Introduction

随着化合物在工业生产和人们日常生活中的迅速发展, 研究这些化学品的毒性检测模型具有重要意义。在许多情况下, 使用啮齿类动物模型来评估不同化学品对健康的潜在毒性。一般来说, 在体内的啮齿类动物模型中, 确定致死浓度 (即不同化学品的50% 致死剂量 [ld50]) 被用作传统参数, 这既耗时又非常昂贵。此外, 由于减少、提炼或取代 (3r) 原则, 这对动物福利和伦理至关重要, 允许替换更高动物的新方法对科学研究有价值 123.线虫是一种自由生活的线虫, 已从土壤中分离出来。由于其寿命短、栽培方便、繁殖效率高等优点, 在实验室中得到了广泛的应用。此外, 许多基本的生物途径, 包括基本的生理过程和在线虫的应激反应,高级哺乳动物4,5,6,7被保存,8. 在我们和其他人进行的几次比较中, 在啮齿类动物中观察到线虫毒性和毒性之间有很好的一致性9。所有这些都使线虫成为测试体内化学毒性影响的良好模型。

近年来, 一些研究对线虫的表型特征进行了量化。这些特性可用于分析化学品 2310 的毒性和蠕虫老化11。我们还开发了一种结合液体蠕虫养殖系统和图像分析系统的方法, 在不同的化学处理, 将蠕虫培养在384孔板中12。该定量技术已开发出来, 可在384孔板中进行12-24h 的化学处理后, 自动分析线虫的33个参数。采用自动显微镜级进行实验视频采集。这些视频由定制设计的程序处理, 与蠕虫移动行为相关的33个功能被量化。该方法用于对10种化合物的处理下的蠕虫表型进行量化。结果表明, 不同的毒性能改变线虫的表型。这些量化的表型可用于识别和预测不同化合物的急性毒性。该方法的总体目标是促进液体培养中线虫实验的观察和表型定量。该方法可用于化学毒性评价和表型定量, 有助于预测不同化合物的急性毒性, 并为进一步的传统化合物建立优先清单。啮齿类动物模型中的化学毒性评估试验。此外, 该方法还可作为食品添加剂污染、药理化合物、环境外源化合物等, 应用于新型化学品或化合物的毒性筛选和检测。

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Protocol

该协议遵循了中国北京疾病预防控制中心动物伦理委员会的动物护理指南。

1. 化学制剂

  1. 获取化学品 (表 1材料表)。
  2. 确定单个化学品的最高和最低剂量, 对蠕虫的最低浓度为100% 杀伤力 (lc100, 24小时), 最大浓度为100% 非杀伤力 (lc0, 24小时)。使用至少6次浓度最高的稀释剂 (表 1)。
    注: 进行初步蠕虫杀伤力测试9 , 以探索 lc100 和 lc0 的新化学品, 以确定剂量。
  3. 用 k-介质 (材料表) 稀释每种化学品, 使其达到所需浓度的2倍。使用 k-媒体作为对照, 比较由化学品引起的表型变化。
    1. 例如, 制备7梯度浓度的氯化镉 (cdcl2) (表 1)。为制备2倍最高浓度水溶液 (4.64 mg/ml), 在 k-介质的8毫升中溶解92.8 毫克的 cdcl2固体粉末, 并在粉末完全溶解后填充至多 10 ml。用 k-介质稀释制备其他浓度水平。
  4. 为化学梯度中的每个浓度准备8个平行井。每口井含有50μl 的2倍化学溶液。准备至少三组由八个平行井组成的 k-介质作为控制 (表 2)。
    注: 简而言之, 每种化学品的单次剂量所需的体积为500μl 的2倍工作溶液。

2. 蠕虫准备

  1. 从 caenorhabditis 遗传学中心 (cgc) 中获得野生型 n2 蠕虫和大肠杆菌op50 菌株。
  2. 获取同步的 l4 蠕虫。
    1. 从条纹板中选取单个大肠杆菌op50。在 lb 肉汤100毫升的环境中对菌落进行无菌接种, 并在37°c 下过夜生长。
      注:大肠杆菌op50 溶液现已准备好播种到线虫生长介质 (ngm,材料表) 板。
    2. 将 ngm 倒进一个90毫米的塑料 petri 板。浇注每个盘子的 300μl大肠杆菌op50 溶液后的第二天浇注。在20°c 下, 用 op50 在 ngm 板上培育 n2 蠕虫约 2-3天, 直到大多数蠕虫达到成虫阶段。
    3. 将妊娠蠕虫收获到15毫升无菌锥形离心管中, 并带有无菌 h2o.让蠕虫沉淀至少 2分钟, 吸气 h2o, 并添加5毫升的漂白剂 (材料表)。
    4. 旋转管 5分钟, 旋转管 30秒 (在 1, 300 x), 以颗粒的鸡蛋, 并丢弃上清液。
    5. 用5毫升的无菌 h2o 清洗鸡蛋, 并将试管旋涡 5次. 将试管离心 30秒 (1, 300 x), 取出上清液, 然后再次清洗。
    6. 将鸡蛋移到一个带有 op50 的新的 ngm 板上。在20°c 下孵化。第二天早上监视孵化的 l1 蠕虫;蠕虫将在大约40小时内到达 l4 阶段。
  3. 用 k-介质将90毫米 petri 板上的 l4 蠕虫洗成一个50毫升无菌锥形管。在立体显微镜下, 将蠕虫的浓度调整到每 100μl k-培养基中的 ~ 40只动物。在384井板的每口井中加入 50μl (~ 20 蠕虫)。这些同步蠕虫 (l4 阶段) 已准备好通过化学品进行以下处理。

3. 化学处理和视频采集

注: 在384孔板中, 蠕虫 (每口井 50μl) 被处理到6至7剂量的单个化学品中 (表 1)。准备8口平行井, 每口都含有50μl 的2倍化学溶液 (8 口井充满相同的化学物质和相同浓度,表 2)。所有视频都是使用连接在倒置显微镜 (材料表) 上的数码相机收集的。化学处理实验持续24小时。在24小时化学处理实验中, 不要在每口井中添加细菌食物。

  1. 在添加化学品之前, 在自动阶段将384孔板与同步蠕虫一起设置, 并在编程采集过程中拍摄每口井的视频 (每秒7帧2秒; 扫描每个板大约需要 25分钟)。
  2. 为每口井添加根据第1节制备的2倍化学库存 50μl (表 2)。将时间设置为0小时点。
  3. 在20°c 下孵育384孔板, 并在80点转速时在孵化器振动台中摇晃。
  4. 从孵化器中取出盘子, 转移到自动阶段。在12小时和24小时拍摄整个盘子中每口井的视频, 检查在 k-培养基中进行的每一种特定化学处理的蠕虫表型。一个板屏幕大约需要25分钟。

4. 实验视频处理

注: 编写并打包了实验视频和图像处理程序。它可以自由下载 (见材料表)。实验视频以图像帧序列的形式存储, 每个视频的帧序列存储在特定的目录中。该程序可以识别蠕虫和量化表型自动。

  1. 在图形用户界面 (gui,图 1) 中, 添加参数, 如帧序列目录、输出目录、蠕虫大小参数和移动阈值参数。单击 "分析"按钮处理实验图像。
    1. 单击 "选择"按钮以选择源图像目录。
    2. 在接口中添加中间结果目录。
      注: 中间结果包括分段的图像。这些中间结果对处理后的图像进行目视观察是有用的。
    3. 在接口中添加最终结果目录。
    4. 在界面的"蠕虫大小" 文本框中添加平均蠕虫大小参数。
      注: 实验中使用的大小参数为 2, 000。
    5. 在接口中添加移动比率的阈值
      注: 实验中使用的比率为0.93。
    6. 单击 "分析"按钮开始图像处理。单击"重置" 按钮以清除添加的参数。
      注: 为蠕虫定义和量化了33个功能。所有定义的表型都按类别排序 (如表 3所示)。这些特征可以从实验图像中量化。通过比较这些特征, 可以对具有不同毒性的不同化学品进行定量比较。

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Representative Results

我们已经测试了暴露在超过10种化学物质12的不同浓度下的蠕虫的表型。在测试中, 在三个时间点 (0小时、12小时和 24小时) 对每种化合物的33个不同特征进行了量化。此前, 对人工和寿命分析的自动分析进行了 111 2 项比较。在这个试验中, 我们发现化学物质和浓度会影响蠕虫的表型。此方法的概述如图 2所示。

结果 (图 3图 4c, d) 显示, 随着化学浓度的增加, 蠕虫很快死亡。在浓度较高的情况下, 蠕虫变得更直, 弯曲程度低于浓度较低或对照组 (图 3图 4b)。一开始 (0小时), 所有表型的对照 (k-介质) 和化学处理没有显著差异。经过12小时的治疗, 在一定的化学剂量, 蠕虫的表型表现出不同程度的差异, 在对照组和不同的浓度组。例如, 主轴长度随着时间的增加而增加。还有一个梯度趋势, 从较低的化学浓度到较高的化学浓度。不同化学浓度的梯度趋势在小轴长度上也很显著(图 4a、b).

在本试验中, 根据蠕虫进入的区域和运动比 (图 4c,d), 以两种方法计算了蠕虫的运动性。两种方法的动力结果都显示出类似的模式。不同浓度和对照组在开始时 (0小时时) 的蠕虫运动没有显著差异。随着时间的推移, 对照组的蠕虫的动力明显下降。在12小时时, 在不同浓度接受化学处理的蠕虫与对照组相比, 其动力特征有显著差异。此外, 与浓度较低处理条件下的蠕虫相比, 浓度较高处理的蠕虫运动能力较弱。这表明, 浓度较高的蠕虫在较高浓度的处理下变得更少的运动, 死亡速度更快 (图 4c,d)。这些结果表明, 所设计的方法对化学毒性评价是有用的,线虫的量化表型是化学毒性鉴定的有用标志物。

Figure 1
图 1: 软件的接口.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 通过对线虫进行自动表型分析的高通量测定, 用于预测化学毒性请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3* 在不同时间点的 4.64 mg/ml cdcl2 (上板)、0.464 mg/ml cdcl2 (中间面板) 和 k-中 (下面板) 下的蠕虫实验图像.这些图像显示了384井板的一个代表性井中经过化学处理或对照组的蠕虫状态变化。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 不同浓度 cdcl2下蠕虫的量化特征.(a) 量化的主轴长度。(b) 量化的小轴长度。(c) 移动区域的量化动力。(d) 移动的区域蠕虫大小的量化运动。条形图显示单个蠕虫上每个要素的平均量化。误差条表示±标准偏差 (sd)。浓度单位 = mg/ml。请点击这里查看此图的较大版本.

Table 1
表 1: 384 孔板10种化学品的接触浓度l. 线虫急性毒性试验.

Table 2
表 2: 384 孔板布局示意图。

Table 3
表 3: 蠕虫的定义表型。

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Discussion

线虫的优点导致其在毒理学9中的应用越来越多, 无论是在机械研究还是高通量筛选方法。近年来, 线虫在补充其他毒理学研究模型系统方面的作用显著增加, 特别是在新化学品的快速毒性评估方面。本文为384井板蠕虫表型的高通量定量筛选提供了一种新的方法, 用于化学毒性的自动鉴定和评价。该检测方法是24小时内化学品急性毒性检测的理想选择, 可应用于亚急性毒性检测, 以及在收集更多数据的时间点和为蠕虫提供食物来源 (op50) 时也可使用。

用于稀释化学物质的介质可能会有所不同;我们在检测中选择了 k-培养基, 参考了 sofie等人.13. 在对照组和化学处理组中, 均在 k-培养基中培养蠕虫。人工淡水溶液或低离子强度的土壤溶液可以替代 k-介质。

具有不同毒性的化学品可以改变不同模式中的线虫表型。本试验中使用的化学品从《全球化学品统一分类和标签制度》的第三类至第六类中选出。6个或更多剂量水平上接触到化学物质, 涵盖了 0%-100% 的死亡率剂量范围。对于水溶性低的化学品, 建议使用 dmso 来促进化学在水中的溶解。由于高浓度的 dmso 可能会影响蠕虫的发育和寿命14, 因此在水产试验中使用的 dmso 不应超过0.2%。

自动量化特征显示不同毒性之间存在显著差异, 这表明这些量化的蠕虫表型在识别化学品毒性方面非常有用。结果表明, 表型分析揭示了利用线虫作为体内模型生物对不同化学物质的毒性进行分类和预测的保守功能。

美国国家毒理学计划 (ntp) 通过与美国环境保护署 (epa) 和国家卫生研究院 (nih) 化学基因组学中心 (现为国家局的国家中心) 签订的谅解备忘录, 建立了毒/21世纪社区。推进转化科学 (ncats)。迷惑行动21利用高通量的体外筛选和体内替代动物模型测试, 以确定毒性机制, 确定化学品的优先次序, 用于更多的体内毒性测试, 并开发人类毒理学反应的预测模型。作为这项工作的一部分,线虫被用来筛选环保局的第一阶段和第二阶段的库存, 其中分别含有292种和676种化学品, 用于化学品, 导致幼虫发育和生长减少15。copas (复杂对象参数分析仪和分选仪) 平台也被用于蠕虫毒理学筛选研究2。但是, copas 平台只量化了几个特征, 如蠕虫宽度、蠕虫长度和荧光强度。这种方法是对目前利用蠕虫快速预置新化学品毒性的方法的一种改进。

该协议中有几个关键步骤: 384 孔板中的蠕虫培养、化学处理、实验图像捕获和表型定量。与传统的毒性评价方法相比, 该协议可以量化一些难以手动计算的蠕虫表型, 这些表型可用于反映每种化学品的毒性, 如蠕虫的运动力、蠕虫宽度、蠕虫大小和灰度。强度。显然, 这种预测化学毒性的高通量测定方法将是一种有价值的毒性模型方法, 可用于啮齿类动物实验前的化学品预创造。

总之, 该技术为多个领域的快速毒性评价铺平了道路。研究人员可将该方法应用于食源性毒性的紧急分析、药物化合物的安全性评价以及新化学品和环境外源化合物的急性毒性筛选和检测。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢 cgc 善意地发送了线虫。这项工作得到了中国国家重点研究与发展计划 (#2018YFC1603102、#2018YFC1602705) 的支持;国家自然科学基金授予 (#31401025, #81273108, #81641184), 北京首都健康研究与开发专项项目 (#2011-1013-03), 北京环境毒理学重点实验室开放基金 (#2015 hjdl03), 中国山东省自然科学基金 (zr2017bf041)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

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References

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