線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

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Summary

定量法は識別し、線虫の表現型プロファイリングを自動的に分析することによって化学物質の急性毒性を予測しました。このプロトコルでは、384 ウェル プレートでの化学物質とワームを治療、ビデオをキャプチャおよび毒性関連表現型を定量化する方法について説明します。

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Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. D., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

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Abstract

時間がかかり、高価で、その長い寿命とメンテナンスの問題のためは、マウスやラットなどの注文の高等生物で化学物質の毒性試験を適用します。それどころか、線虫線虫(C. elegans) 毒性試験のための理想的な選択にする利点があります: 短い寿命、簡単栽培、および効率的な複製。ここでは、自動表現型プロファイリング線虫 c. エレガンスの 384 ウェル プレートでのプロトコルについて述べる。線虫みみずが液体中で化学治療、384 ウェル プレートで培養し動画、各ウェルの 33 ワーム機能に関する化学物質の影響を定量化します。実験結果は、定量化された表現型特徴できます分類し異なる化学物質の急性毒性を予測し、齧歯動物モデルでさらに伝統的な化学的毒性評価テストの優先順位を確立することを示しています。

Introduction

工業生産や人々 の日常生活に適用される化合物の急激な発展、毒性化学物質のためのモデルのテストを検討することが重要です。多くの場合、げっ歯類の動物モデルを採用して、健康に異なる化学物質の潜在的な毒性を評価します。一般に、致死濃度 (すなわち、assayed 50% 致死量 [LD50] 異なる化学物質) の微量は、時間がかかり、非常に高価である齧歯動物 (ラット/マウス) モデルでは生体内で、従来のパラメーターとして使用されます。さらに、リデュースのため調整、または、動物の福祉と倫理の中心 (3 r) 原則、科学研究1,2,3に貴重な高等動物の交換のための新しいメソッドを置き換える.線虫は土壌から分離された線虫です。それは短い寿命、簡単栽培、および効率的な複製などの有益な特性のため、研究室で研究生物として広く使用でされています。また、線虫基本的な生理学的なプロセスおよびストレス反応を含む多くの基本的な生物学的経路はより高い哺乳類4,5,6,7内に保存されます。,8します。 私たちと他の人が行った比較のカップルは、線虫の毒性と齧歯動物9において毒性との良い一致があります。これはすべて線虫体内化学物質毒性の効果をテストする良いモデル。

最近では、いくつかの研究では、線虫 c. エレガンスの表現型の特徴を定量化しました。化学物質2,3,10の毒性やワーム11の高齢化を分析する機能を使用できます。我々 はまたシステム、画像解析システム、ワームはさまざまな化学治療法12下 384 ウェル プレートで培養した培養液のワームを組み合わせた方法を開発しました。自動的に液体培地と 384 ウェル プレートの化学治療の 12-24 時間後、C. elegans の 33 のパラメーターを分析するこの量的な技術を開発しました。自動顕微鏡ステージは実験のビデオ獲得のため使用されます。ビデオは、カスタム設計のプログラムによって処理され、ワームの移動動作に関連 33 機能を定量化します。10 化合物の治療の下でワームの表現型を定量化するための方法です。異なる毒性が線虫 c. エレガンスの表現型を変えることができることを示した。識別し、異なる化学物質の急性毒性を予測するこれらの定量化された表現型を使用できます。このメソッドの全体的な目標は、観察と液体培養における線虫の実験の表現型の定量化を容易にするためにです。この方法は化学的毒性評価と異なる化合物の急性毒性を予測し、優先順位のリストに役立つ表現型数量にc. の elegansのアプリケーションの役に立つさらに伝統的なげっ歯類モデルにおける化学的毒性評価試験。さらに、このメソッドは、毒性スクリーニングと食品添加剤汚染、pharmacautical 化合物、環境の外因性化合物と新しい化学物質や化合物のテストに適用できます。

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Protocol

プロトコル中国の病気予防および管理の北京センターの動物倫理委員会の動物のケアのガイドラインに従います。

1. 化学合成

  1. 化学物質 (表 1表の材料) を取得します。
  2. 最小濃度 100% 致死 (LC100、24 h) とワームに 100 %nonlethality (LC0、24 h) の最大許容濃度の個々 の化学物質の最高と最低の量を決定します。最高濃度 (表 1) の少なくとも六つの希釈液を使用します。
    注: LC100 と新しい化学 LC0 投与量を決定するための予備的なワームの致死試験9を実施します。
  3. 必要な濃度 x 2 K 中 (材料表) の個々 の化学物質を希釈します。コントロールとして K 培地を使用すると、化学物質によって引き起こされる表現型変化を比較します。
    1. たとえば、塩化カドミウム (CdCl2) 濃度の 7 グラデーションを準備 (表 1)。2 x を準備するには、最高の濃縮水溶液 (4.64 mg/mL) は CdCl2固体粉末 K 中の 8 mL の 92.8 mg を溶解し、粉末が完全に溶解した後、10 mL を埋めます。K 培地で希釈して他の濃度レベルを準備します。
  4. 化学勾配のすべての濃度を 8 つ並列井戸を準備します。まあ、化学溶液 x 2 の 50 μ L が含まれています。コントロール (テーブル 2) として 8 並列井戸 K 中の少なくとも 3 つのグループを準備します。
    注: 簡単に言えば、作業ソリューション × 2 の 500 μ L のボリュームは個々 の化学物質の単回投与に必要です。

2. ワームの準備

  1. 野生型 N2 ワームおよびエシェリヒア属大腸菌OP50 系統線虫の遺伝学センター (CGC) から取得します。
  2. 同期の L4 ワームを取得します。
    1. ストリーク プレートからエシェリヒア属大腸菌OP50 のシングル コロニーをピックアップします。無菌流体培養基 LB の 100 mL のコロニーを接種して、37 ° C で一晩成長
      注:エシェリヒア属大腸菌OP50 ソリューションは線虫の成長媒体 (NGM、材料表) プレートに播種の準備ができました。
    2. 90 mm プラスチック ペトリ プレートに NGM を注ぐ。シードのエシェリヒア属大腸菌OP50 ソリューション 300 μ L、各プレートを注入後一日。20 ° C で OP50 で NGM プレートに N2 ワーム ワームのほとんどが大人の段階に達するまで約 2 〜 3 日間インキュベートします。
    3. 収穫妊娠ワームを 15 mL 滅菌円錐形遠心分離機管滅菌 H2o.ワームを少なくとも 2 分間落ち着く、H2O を吸引、漂白剤バッファー (材料表) の 5 mL を追加しなさい
    4. 渦 5 分チューブ スピン 30 用チューブ (1,300 x g) で卵をペレットし、上澄みを廃棄します。
    5. 5 ml の滅菌の H2O および渦の卵チューブ 5 s. 遠心チューブ 30 (1,300 x g) で s があり、削除、上清および洗浄のためのもう一度洗浄します。
    6. OP50 で新しい NGM プレート上に卵をピペットします。20 ° C でそれらを孵化させなさい次の朝孵化 L1 ワームを監視します。ワーム約 40 h で L4 段階に到達します。
  3. 50 mL の生殖不能の円錐管に K 培地で 90 mm ペトリ皿の L4 ワームを洗います。顕微鏡の下の K 中の 100 μ L あたり 40 ~ 動物にワームの濃度を調整します。384 ウェル プレートの各ウェルに 50 μ L (~ 20 ワーム) を追加します。これらの同期のワーム (L4 期) は化学薬品によって次の治療のため準備ができています。

3. 化学処理とビデオ キャプチャ

注: 384 ウェル プレート ワーム (各ウェルに 50 μ L)、個々 の化学物質 (表 1) の 7 つの用量を 6 に扱われます。(8 つの井戸は同じ化学と同じ濃度、表 2に満ちている) すべての用量の化学溶液 x 2 の 50 μ L を含む各 8 つ並列井戸を準備します。すべてのビデオは、倒立顕微鏡 (材料表) に接続されたデジタル カメラを使用して収集されます。化学治療実験は 24 時間続きます。24 h 化学治療実験中に、各ウェルに細菌食品を追加しないでください。

  1. 化学物質を追加する前に自動ステージ上同期ワームと 384 ウェル プレートを設定し、プログラムの取得手続きの各ウェルのビデオ (2 の 1 秒あたり 7 フレーム s; 各プレートをスキャンする 〜 25 分)。
  2. 各ウェル (表 2) のセクション 1 に従って調製化学株式 × 2 の 50 μ L を追加します。0 h ポイントとして設定します。
  3. 20 ° C で 384 ウェル プレートをインキュベートし、インキュベーター シェーカー 80 rpm で振る。
  4. インキュベーターからプレートを削除し、それを自動ステージに転送します。全体のプレートの各ウェルの動画 12 h、24 h を取る K 培地でそれぞれの固有の化学治療のためのワームの表現型を確認します。約 25 分が 1 つのプレート画面必要です。

4. 実験ビデオ処理

注: 実験的なビデオおよび画像処理のためのプログラムが書き込まれ、パッケージ化します。(材料の表を参照してください) 自由にダウンロードすることができます。実験的なビデオはイメージ フレーム シーケンスのフォームに格納され、各ビデオのフレーム シーケンスは特定のディレクトリに格納されます。プログラムは、ワームを認識し、自動的に表現型を定量化できます。

  1. グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI、図 1)、フレーム シーケンスのディレクトリ、出力ディレクトリ、ワームのサイズ パラメーター移動しきい値パラメーターなどのパラメーターを追加します。実験画像を処理するには、分析をクリックします。
    1. ソース画像のディレクトリを選択して [選択] ボタンをクリックします。
    2. インターフェイスで中間結果ディレクトリを追加します。
      注: 中間結果には、分割された画像が含まれます。これらの中間結果は、処理した画像の目視観察に適しています。
    3. インターフェイスでは、最終的な結果ディレクトリを追加します。
    4. ワームのサイズ] ボックスに、インターフェイス平均ワームのサイズ パラメーターを追加します。
      注: 実験で使用するサイズ パラメーターは 2,000 です。
    5. インターフェイス内の移動率のしきい値を追加します。
      注: 実験で使用率は 0.93 です。
    6. イメージの処理を開始するには、分析をクリックします。追加のパラメーターをクリアするリセットボタンをクリックします。
      注: 33 機能定義し、ワームの定量化があります。すべての定義された表現型は、(表 3で示されている) カテゴリでソートされます。これらの機能は、実験的な映像から定量化することができます。これらの機能を比較することによって、異なる毒性を持つ別の化学物質の定量的な比較を行うことができます。

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Representative Results

我々 は 10 以上の化学物質12の異なる濃度にさらされた線虫の表現型をテストしています。テストは、33 の特徴は各化合物 (0 h、12 h、24 h) の 3 つの時点での定量化されました。以前は、マニュアルと寿命アッセイの自動解析の比較は11,12に行われました。この分析では、化学物質と濃度がワームの表現型に影響を与えることがわかった。この方法の概要は図 2に示します。

(図 3および図 4c, d) 結果、ワームが増加化学物質濃度としてすぐに死亡しました。高濃度で, ワームとまっすぐなり低濃度または制御グループ (図 3および図 4b) のよりより少なく曲がり。(0 h) で始まり、コントロール (K 中) とすべての表現型のための化学的処理間に有意差はありませんでした。特定化学物質用量による治療の 12 h は後、は、ワームの表現型は、コントロールおよび濃度の異なるグループ間のばらつきの程度が異なるを示した。たとえば、主要な軸の長さ増加時間は増加しました。高い化学的濃度を下からグラデーション傾向もあります。異なる化学濃度の勾配の傾向の短軸長さも有意(図 4a、b).

このアッセイでは、ワームの運動は、エリア移動ワームと運動率 (図 4c, d) に基づく、2 つの方法で計算しました。両方の方法の運動結果は同様のパターンを示した。ワーム運動性別濃度 (0 h 時点) 時の冒頭にコントロール グループ間の有意差はありませんでした。時間が経つにつれ安定を示した群でワームは運動の減少します。12 h で異なる濃度で化学療法を施行したワームは運動の制御グループと比較して有意差を示した。さらに、高濃度トリートメントでワームは低い集中治療下でワームと比較して弱い運動を示した。これは、高濃度トリートメントでワームが少ない運動になったし、速く (図 4c、d) が死んだことを示します。これらの結果は、設計法は化学毒性評価に役立つと線虫の定量化された表現型は、化学的毒性識別のための有用なマーカーをお勧めします。

Figure 1
図 1: ソフトウェアのインターフェイスこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2:線虫の自動化された表現型プロファイリングによる化学毒性の予測のための高スループット試金のパイプラインしますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: [4.64 mg/mL CdCl2 (上部パネル)、0.464 mg/mL CdCl2 (中央のパネル)、および K-培地 (底板)、異なる時点でのワームの実験画像です。画像は、時間を通して 384 ウェル プレートの 1 つの代表的な井戸でワーム化学治療中またはコントロール グループ内の状態の変化を見る。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: CdCl2の異なる濃度の下でワームの定量化機能します。() 定量化された主要な軸の長さ。(b) 限定短軸の長さ。(c) 移動によって定量化された運動領域。(d) 移動によって定量化された運動エリア/ワームのサイズ。バー プロットが単一のワームの各機能の平均数量を表示。誤差範囲は ± 標準偏差 (SD) を示します。濃度単位 mg/mL を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Table 1
表 1: 384 ウェル プレートの 10 の化学物質の曝露濃度線虫 c. エレガンス急性毒性試験

Table 2
表 2:384 ウェル プレート レイアウトの模式図。

Table 3
表 3: 定義された表現型のワーム。

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Discussion

線虫 c. エレガンスの利点は、毒物学9解明と高スループット スクリーニングのアプローチの両方の使用が増えたにつながっています。毒性研究の他のモデル システムを補完するのにc. の elegansの高められた役割は、近年、特に新規化学物質の急速な毒性評価で注目されています。この記事は、自動認識と化学的毒性の評価のためワームの高スループット、定量的スクリーニングの新しいアッセイ 384 ウェル プレートで表現型を提供します。この試金は 24 h 内の化学物質の急性毒性試験に最適な亜急性毒性データのより多くの時間ポイントを収集し、ワームの食料源 (OP50) を供給だけでなくテストに適用できます。

化学物質を希釈して使用される媒体は異なります。我々 はソフィーを参照してアッセイの K-培地を選んだ13。 ワームがコントロールと化学の両方の試験治療グループで K 培地で培養しました。人工淡水ソリューションまたは低イオン強度と土壌溶液は、K 中の代替可能性があります。

異なる毒性を持つ化学物質は、さまざまなパターンで線虫 c. エレガンスの表現型を変更できます。このテストで使用される化学物質は、世界調和システムの分類とラベリング (GHS) の 3 〜 6 カテゴリーから選ばれました。線虫は、0-100% 死亡率の用量範囲をカバーした六つ以上の用量レベルでの化学物質にさらされました。低水容解性のこれらの化学物質は、水の化学分解を促進し、DMSO を使用することをお勧めします。DMSO の高濃度、ワームの開発と寿命14の影響を与えます、水生のテストはよりも 0.2 %dmso を使用しません。

自動的に数量化された機能は、ワームのこれらの定量化された表現型が化学物質の毒性を特定するに非常に役に立つことを示す別の毒性の間で有意差を示します。それは、表現型プロファイリングを分類および体内のモデル生物としての線虫C. elegansを使用して異なる化学物質の毒性を予測する保存機能を明らかに示されます。

米国国家毒性プログラム (NTP) は、米国環境保護庁 (EPA) と国立衛生研究所 (NIH) 化学ゲノミクス センター、今国立センターとの覚書を Tox21 コミュニティを設立しました。トランスレーショナル科学 (NCATS) を進めます。Tox21 は、高速の in vitro スクリーニングと毒性のメカニズムを識別するためにテスト生体内で代替動物モデル追加体内毒性テストは、化学物質を優先して人体毒性反応の予測モデルを開発するを使用します。その努力の一環として、私は、フェーズ II のライブラリは、化学物質につながる, 292 と 676 の化学物質が含まれて減少開発成長の幼虫15EPA の ToxCast 相を画面にc. の elegansを使いました。COPAS (複雑な目的パラメトリック分析・選別機) プラットフォームがまた使用されてワーム毒性スクリーニング研究2。ただし、COPAS プラットフォームのみワーム幅、ワームの長さ、および蛍光強度など、いくつかの機能を定量化します。このメソッドは、新しい化学物質の毒性を急速に選別するワームを使用して現在の方法への改善です。

プロトコルの中でいくつかの重要なステップがあります: 384 ウェル プレート、化学治療、実験イメージ キャプチャと表現型定量化ワーム文化。伝統的な毒性評価手法と比較して、このプロトコルは手動で計算することは困難かつワーム運動、ワームの幅、ワームのサイズ、グレーなど、すべての化学物質の毒性を反映する有用なワームのいくつかの表現型を定量化できます。強度。明らかに、化学的毒性の予測のためのこの高スループット試金は貴重な毒性モデル アプローチになります、げっ歯類の動物実験の前に化学物質の細胞診のためにされる可能性があります。

要約すると、この手法は、複数の分野で急速な毒性評価に道を開きます。研究者は、食品中毒、医薬品化合物の安全性評価と同様に、急性毒性スクリーニング毒性の緊急の分析と新規化学物質と環境の外因性化合物の検出にメソッドを適用できます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、CGC が親切に c. の elegans を送信することをありがちましょう。この仕事に支えられたキー研究と開発中国プログラムの (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705);中国の助成金 (#31401025、#81273108 #81641184)、資本健康研究北京 (#2011-1013-03)、北京の環境毒物学 (# の主実験室の開口部基金の特別なプロジェクトの開発の国家自然科学基金2015HJDL03) と自然科学基金、中国山東省 (ZR2017BF041)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

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References

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