Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

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Summary

Eine quantitative Methode wurde entwickelt, um zu identifizieren und die akute Toxizität von Chemikalien durch die automatisch analysieren die phänotypische Profilierung von Caenorhabditis ElegansVorhersagen. Dieses Protokoll beschreibt die Würmer mit Chemikalien zu behandeln, in einem 384-Well-Platte, Videos aufzunehmen und toxikologischen Verwandte Phänotypen zu quantifizieren.

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Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. D., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

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Abstract

Toxizitätstests von Chemikalien in der höheren Ordnung Organismen, wie Mäusen oder Ratten, die Anwendung ist zeitaufwändig und teuer, wegen ihrer langen Lebensdauer und Wartungsprobleme. Im Gegenteil, der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) hat Vorteile machen es ideal für Toxizitätstests: eine kurze Lebensdauer, einfache Kultivierung und effiziente Reproduktion. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die automatische phänotypischen Profilierung von C. Elegans in einem 384-Well-Platte. Die Fadenwürmer sind kultiviert in einem 384-Well-Platte mit flüssigen Mittel und chemische Behandlung und Videos stammen von jedem Bohrloch zur Quantifizierung des chemischen Einfluss auf 33 Wurm-Funktionen. Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass die quantifizierten Phänotyp-Features können klassifizieren und, die akute Toxizität für verschiedene chemische Verbindungen Vorhersagen und eine Prioritätenliste für weitere traditionelle chemische Toxizität Assessment-Tests in einem Nagetier Modell zu etablieren.

Introduction

Zusammen mit der rasanten Entwicklung von chemischen Verbindungen, die auf industrielle Produktion und Menschen das tägliche Leben angewendet ist es wichtig, die Toxizitätstests Modelle für die Chemie zu studieren. In vielen Fällen ist das Nagetiere Tiermodell eingesetzt, um die mögliche Toxizität von Chemikalien auf die Gesundheit zu bewerten. Im Allgemeinen dient die Bestimmung der tödliche Konzentrationen (d. h., die vermutlich 50 % tödliche Dosis [LD50] verschiedener chemischer Stoffe) als traditionelle Parameter in einem in-vivo, Nager (Ratte/Maus) Modell ist aufwendig und sehr teuer. Darüber hinaus durch die Reduzierung zu verfeinern Sie, oder ersetzen Sie (3R) Prinzip, das den Tierschutz und Ethik im Mittelpunkt steht, neue Methoden, mit denen für der Ersatz von höheren Tieren sind wertvolle wissenschaftliche Forschung1,2,3 . C. Elegans ist eine freilebende Nematoden, die aus dem Boden isoliert wurde. Es wurde weithin als Organismus Forschung im Labor aufgrund seiner vorteilhaften Eigenschaften, wie eine kurze Lebensdauer, einfache Kultivierung und effiziente Reproduktion verwendet. Darüber hinaus sind viele grundlegende biologischer Signalwege, darunter grundlegende physiologische Prozesse und Stressreaktionen in C. Elegans in höheren Säugetiere4,5,6,7 konserviert. , 8. in ein paar Vergleiche wir und andere haben, gibt es eine gute Übereinstimmung zwischen C. Elegans Toxizität und Toxizität bei Nagetieren9beobachtet. All dies macht C. Elegans ein gutes Modell, die Auswirkungen der chemischen Toxizität in vivo zu testen.

Vor kurzem, einige Studien quantifiziert die phänotypische Merkmale von C. Elegans. Die Funktionen können verwendet werden, um die Toxizität von Chemikalien2,3,10 und die Alterung der Würmer11zu analysieren. Wir entwickelten auch eine Methode, die kombiniert einen flüssigen Wurm Kultivierung System und eine Bild-Analyse-System, in dem die Würmer in einem 384-Well-Platte unter verschiedenen chemischen Behandlungen12kultiviert sind. Dieses quantitative Verfahren wurde entwickelt, um die 33 Parameter von C. Elegans automatisch nach 12-24 h chemische Behandlung in einem 384-Well-Platte mit flüssigen Medium zu analysieren. Eine automatisierte Mikroskoptisch dient zur experimentellen Videoerfassung. Die Videos werden von einem maßgeschneiderten Programm verarbeitet, und 33 Funktionen im Zusammenhang mit den Würmern beweglichen Verhalten quantifiziert. Die Methode wird verwendet, um den Wurm Phänotypen unter der Behandlung von 10 Verbindungen zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen, dass unterschiedliche Toxizitäten der Phänotypen von C. Elegansverändern können. Diese quantifizierten Phänotypen können verwendet werden, zu identifizieren und vorherzusagen, die akute Toxizität von verschiedenen chemischen Verbindungen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Beobachtung und phänotypischen Quantifizierung von Experimenten mit C. Elegans in einer flüssigen Kultur zu erleichtern. Diese Methode eignet sich für den Einsatz von C. Elegans in chemische Toxizität Auswertungen und Phänotyp Quantifizierungen, die helfen, vorherzusagen, die akute Toxizität von verschiedenen chemischen Verbindungen und etablieren eine Prioritätenliste für weitere traditionelle chemische Toxizität Assessment-Tests in einem Nagetier-Modell. Darüber hinaus kann diese Methode auf die Toxizität screening und Erprobung von neuen Chemikalien oder die Verbindung als Lebensmittel Zusatzstoff Agent Verschmutzung, Pharmacautical Verbindungen, ökologische exogene Substanz und So weiter angewendet werden.

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Protocol

Das Protokoll folgt den Tierbetreuung Richtlinien der Tier-Ethik-Kommission des Peking-Zentrums für die Prävention und die Kontrolle in China.

1. chemische Aufbereitung

  1. Chemikalien (Tabelle 1 und Tabelle of Materials) erhalten.
  2. Bestimmen Sie die höchste und die niedrigste Dosierung der einzelnen Chemikalien für eine minimale Konzentration von 100 % Letalität (LC100, 24 h) und eine maximale Konzentration von 100 % Nonlethality (LC0, 24 h) nach Worms. Verwenden Sie mindestens sechs Verdünnungen der höchsten Konzentration (Tabelle 1).
    Hinweis: Führen Sie eine vorläufige Wurm Letalität Test9 to explore LC100 and LC0 für ein neues chemisches, um die Dosierung zu bestimmen.
  3. Jede chemische Substanz mit K-Medium (Table of Materials) 2 x die erforderliche Konzentration zu verdünnen. Verwenden Sie K-Medium als ein Steuerelement, um den Phänotyp Veränderungen durch die Chemikalien zu vergleichen.
    1. Bereiten Sie beispielsweise 7 gradient Konzentrationen von Cadmium Chlorid (CdCl2) (Tabelle 1). 2 X vorbereiten die höchsten konzentrierte wässrige Lösung (4,64 mg/mL) auflösen 92,8 mg CdCl2 solide Pulver in 8 mL K-Medium und bis zu 10 mL zu füllen, nachdem das Pulver vollständig aufgelöst hat. Bereiten Sie die anderen Ebenen der Konzentration durch Verdünnung mit K-Medium.
  4. Bereiten Sie acht parallele Brunnen für jede Konzentration in den chemischen Gradienten. Jedes enthält gut 50 µL 2 x chemische Lösung. Bereiten Sie mindestens drei Gruppen von acht parallele Vertiefungen der K-Medium als Steuerelemente (Tabelle 2).
    Hinweis: In Kürze ist ein Volumen von 500 µL 2 x funktionierende Lösung für eine einzelne Dosis von jeder Chemikalie erforderlich.

2. Wurm Vorbereitung

  1. Wildtyp N2 Würmer und Escherichia coli OP50-Stämme von Caenorhabditis Genetik Center (CGC) erhalten.
  2. Erhalten Sie synchronisierte L4 Würmer.
    1. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von E. Coli OP50 aus der Streifen-Platte. Aseptisch impfen Sie die Kolonie in 100 mL LB Brühe und wachsen sie über Nacht bei 37 ° C.
      Hinweis: Die E. Coli OP50 Lösung ist jetzt bereit für die Aussaat auf Nematoden Wachstumsfugen Medium (NGM, Table of Materials).
    2. Gießen Sie NGM in einem 90 mm Kunststoff Petri Teller. Säen Sie jede Platte mit 300 µL E. Coli OP50 Lösung am Tag nach dem Gießen. Ca. 2-3 Tage, bis die meisten der Würmer erwachsenen Stadium erreicht haben inkubieren Sie N2 Würmer auf der NGM-Platten mit OP50 bei 20 ° C.
    3. Ernte trächtigen Würmer in 15 mL sterile konische Zentrifugenröhrchen mit sterilen H2O. Lassen Sie die Würmer für mindestens 2 min niederzulassen, Aspirieren H2O, und 5 mL Bleichmittel Puffer (Table of Materials).
    4. Wirbel der Röhre für 5 min, drehen das Rohr für 30 s (bei 1.300 X g), pellet-die Eier, und entsorgen Sie den überstand.
    5. Waschen Sie die Eier mit 5 mL sterilem H2O und Wirbel der Röhre für 5 S. Zentrifuge das Rohr für 30 s (bei 1.300 X g), entfernen der Überstand und waschen wieder.
    6. Die Eier auf einen neuen NGM-Teller mit OP50 Pipette. Inkubieren sie bei 20 ° C. Am nächsten Morgen die geschlüpften L1 Würmer zu überwachen; die Würmer werden das L4-Stadium in ca. 40 h erreichen.
  3. Waschen Sie die L4-Würmer ab 90 mm Petri Platten mit K-Medium in ein 50 mL sterile konische Rohr. Passen Sie die Konzentration der Würmer zu ~ 40 Tieren pro 100 µL K-Medium unter einem Stereomikroskop. Fügen Sie 50 µL (~ 20 Würmer) in jede Vertiefung von 384-Well-Platte. Diese synchronisierte Würmer (L4-Stadium) sind bereit für den Anschluss an die Behandlung durch Chemikalien.

3. chemische Behandlung und Videoaufnahme

Hinweis: In einem 384-Well-Platte sind Würmer (in jede Vertiefung 50 µL) sechs bis sieben Dosierungen von einer einzelnen Chemikalie (Tabelle 1) behandelt. Bereiten Sie acht parallele Brunnen, jeweils 50 µL 2 x chemische Lösung für jede Dosierung (acht Brunnen sind gefüllt mit der gleichen chemischen und die gleiche Konzentration, Tabelle 2). Alle Videos werden mit einer digitalen Kamera angebracht zu einem inversen Mikroskop (Table of Materials) gesammelt. Die chemische Behandlung Experiment dauert 24 Stunden. Fügen Sie keine bakterielle Nahrung in jede Vertiefung während des 24 h-chemische Behandlung-Experiments.

  1. Vor dem Hinzufügen von Chemikalien, 384-Well-Platte mit den synchronisierten Würmern auf die automatische Bühne und nehmen Sie Videos von jeder gut mit dem programmierten Erwerb-Verfahren (7 Bilder pro Sekunde für 2 s; es dauert ~ 25 min zu jeder Platte Scannen).
  2. Fügen Sie 50 µL 2 x chemische Lager zubereitet nach Absatz 1 für jede Vertiefung (Tabelle 2). Stellen Sie die Zeit, als die 0 h-Punkt.
  3. 384-Well-Platte bei 20 ° C inkubieren und bei 80 u/min in einem Inkubator-Shaker schütteln.
  4. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und überträgt es auf einem automatischen Stadium. Nehmen Sie Videos von jeder gut die ganze Platte um 12 h und 24 h, die Phänotypen der Würmer für jede spezifische chemische Behandlung in K-Medium zu überprüfen. Ca. 25 min sind erforderlich für eine Platte Bildschirm.

4. Experiment Videoverarbeitung

Hinweis: Ein Programm für experimentelles Video und Bilder Verarbeitung entstand und verpackt. Es kann frei heruntergeladen werden (siehe Tabelle der Materialien). Das experimentelle Video in Form einer Bildsequenz Frame gespeichert, und die Bildfolge von jedem Video wird in einem bestimmten Verzeichnis gespeichert. Das Programm erkennt Würmer und Phänotypen automatisch zu quantifizieren.

  1. Fügen Sie in der grafischen Benutzeroberfläche (GUI, Abb. 1) die Parameter, wie die Frame-Sequenz-Verzeichnis, das Ausgabeverzeichnis und Wurm-Size-Parameter der Bewegung Schwelle Parameter. Klicken Sie auf die Schaltfläche analysieren um die experimentelle Bilder zu bearbeiten.
    1. Klicken Sie auf Wählen Sie wählen Sie das Quellverzeichnis Bilder.
    2. Die mittleren Ergebnis-Verzeichnis in der Schnittstelle hinzufügen.
      Hinweis: Die mittleren Ergebnisse enthalten die segmentierte Bilder. Diese mittleren Ergebnisse eignen sich für die visuelle Beobachtung der bearbeiteten Bilder.
    3. Das Endergebnis-Verzeichnis in der Schnittstelle hinzufügen.
    4. Fügen Sie die durchschnittliche Wurm-Size-Parameter in der Wurm Größe Textbox in der Schnittstelle.
      Hinweis: Der Size-Parameter, die in den Experimenten ist 2.000.
    5. Fügen Sie die Schwelle des verschobenen Verhältnis in der Schnittstelle.
      Hinweis: Das Verhältnis in den Experimenten verwendeten beträgt 0,93.
    6. Klicken Sie auf die Schaltfläche analysieren , um die Bildbearbeitung zu starten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zurücksetzen , um die zusätzlichen Parameter zu löschen.
      Hinweis: Es gibt 33 Funktionen definiert und quantifiziert für Würmer. Die definierten Phänotypen sind sortiert nach Kategorien (siehe Tabelle 3). Diese Funktionen können vom experimentellen Bilder quantifiziert werden. Ein quantitativer Vergleich unter verschiedenen Chemikalien, die unterschiedliche Toxizitäten, kann durch den Vergleich dieser Eigenschaften erfolgen.

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Representative Results

Wir haben die Phänotypen von Würmern ausgesetzt, unterschiedliche Konzentrationen von mehr als 10 Chemikalien12getestet. Im Test waren 33 besondere Merkmale für jede chemische Verbindung zu drei Zeitpunkten (0 h, 12 h und 24 h) quantifiziert. Zuvor erfolgte ein Vergleich zwischen einer manuellen und einer automatischen Analyse eines Lebensdauer Assays11,12. In diesem Test fanden wir, dass Chemikalien und Konzentrationen der Wurm Phänotypen beeinflussen können. Ein Überblick über diese Methode ist in Abbildung 2dargestellt.

(Abbildung 3 und Abbildung 4c, d), ergab, dass die Würmer schnell wie die chemische Konzentration erhöht gestorben. Bei höheren Konzentrationen die Würmer wurde gerader und weniger gekrümmt als bei niedrigeren Konzentrationen oder in Kontrollgruppen (Abbildung 3 und Abbildung 4b). Am Anfang (0 Uhr) gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kontrolle (K-Mittel) und chemische Behandlungen für alle Phänotypen. Nach einer Behandlung mit einer bestimmten chemischen Dosierung 12 h zeigte die Phänotypen der Würmer verschiedene Grade der Unterschiede zwischen Kontrolle und Konzentration der verschiedenen Gruppen. Zum Beispiel erhöht die Länge der Hauptachse als Zeit erhöht. Es gibt auch ein Farbverlauf Trend von niedrigeren zu höheren chemischen Konzentrationen. Der gradient Trend der verschiedenen chemischen Konzentrationen war auch signifikant in der Länge der Nebenachse (Abb. 4a, b).

In diesem Test wurde der Wurm Motilität auf zweierlei Weise, basierend auf den Bereich der Wurm zog und das Verhältnis der Motilität (Abbildung 4c, d) berechnet. Motilität beides ergab ähnliche Muster. Es gab keine signifikanten Unterschiede der Wurm Motilität unter verschiedenen Konzentrationen und Kontrollgruppen zu Beginn (Zeitpunkt 0 h). Im Laufe der Zeit Rückgang die Würmer in den Kontrollgruppen zeigte einen stabilen der Motilität. Um 12 Uhr zeigte die Würmer, die chemische Behandlungen bei verschiedenen Konzentrationen unterzog sich signifikante Unterschiede in der Motilität im Vergleich zu Kontrollgruppen. Darüber hinaus zeigte die Würmer unter höheren Konzentration Behandlungen schwache Beweglichkeit im Vergleich zu den Würmern unter niedriger Konzentration Behandlungen. Dies bedeutet, dass Würmer unter höheren Konzentration Behandlungen weniger bewegliche wurde und starb schneller (Abbildung 4C, d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die entwickelte Methode nützlich für chemische Toxizität Bewertungen ist und die quantifizierten Phänotypen von C. Elegans nützliche Marker für chemische Toxizität Identifikation sind.

Figure 1
Abbildung 1 : Die Oberfläche der Software. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Die Pipeline eines Hochdurchsatz-Assays für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis Elegans. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Experimentelle Bilder von Worms unter 4,64 mg/mL CdCl2 (obere Abdeckung), 0,464 mg/mL CdCl2 (mittlere Panel) und K-Medium (Bodenplatte), zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Bilder zeigen die Statusänderungen von Würmern unter chemische Behandlung oder in einer Kontrollgruppe in einem repräsentativen gut von 384-Well-Platte im Laufe der Zeit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Die quantifizierten Merkmale der Würmer unter verschiedenen Konzentrationen von CdCl2. (ein) die quantifizierten Hauptachse Länge. (b) die quantifizierten Nebenachse Länge. (c) die quantifizierten Motilität durch den verschobenen Bereich. (d) die quantifizierten Motilität durch den verschobenen Bereich/Wurm Größe. Die Bar Diagramme zeigen die durchschnittliche Quantifizierung für jedes Feature auf einzelne Würmer. Die Fehlerbalken kennzeichnen ± Standardabweichung (SD). Die Konzentration Einheit = mg/mL. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Table 1
Tabelle 1: Expositionskonzentration 10 Chemikalien für die 384-Well-Platte C. Elegans akute Toxizität Test

Table 2
Tabelle 2: Eine schematische Darstellung des 384-Well-Platte-Layout.

Table 3
Tabelle 3: Definierten Phänotypen von Würmern.

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Discussion

Die Vorteile von C. Elegans führten zu seiner zunehmenden Verwendung in Toxikologie9, sowohl für mechanistische Studien und Hochdurchsatz-Screening Ansätze. Eine stärkere Rolle für C. Elegans in Ergänzung zu anderen Modellsysteme in der toxikologischen Forschung hat in den letzten Jahren, vor allem für die schnelle Toxizität Bewertung neuer Chemikalien beachtlich. Dieser Artikel enthält eine neue quantitative Hochdurchsatz-Screening von Wurm-Assay Phänotypen in einem 384-Well-Platte für die automatische Identifizierung und Bewertung der chemischen Toxizität. Dieser Assay ist ideal für die akute Toxizität von Chemikalien innerhalb von 24 h Prüfung und subakuten Toxizität sowie Tests, wenn mehr Zeit Datenpunkte gesammelt und Nahrungsquelle (OP50) wird für die Würmer angewandt werden.

Das Medium für das Verdünnen der Chemikalien kann variieren; Wir entschieden uns für K-Medium in der Probe mit dem Hinweis auf SofieEt al. 13. Würmer wurden kultiviert in K-Medium in die Kontrolle und chemischen Behandlungsgruppen. Eine künstliche Süßwasser-Lösung oder eine Bodenlösung mit geringer Ionenstärke kann Alternativen zu den K-Medium sein.

Chemikalien mit verschiedenen Toxizitäten verändern die Phänotypen von C. Elegans in verschiedenen Mustern. In diesem Test verwendete Chemikalien wurden von der dritten bis sechsten Kategorien von Global harmonisierten System der Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS) gewählt. C. Elegans waren Chemicals bei sechs oder mehr Dosierungen, die der Dosierungsbereich von 0-100 % Mortalität bedeckt ausgesetzt. Für diese Chemikalien mit geringer Wasserlöslichkeit wird DMSO empfohlen, zur chemischen Auflösung im Wasser zu fördern. Da eine hohe Konzentration von DMSO Wurm Entwicklung und Lebensdauer14beeinflussen kann, sollte nicht mehr als 0,2 % DMSO für aquatische Tests verwendet werden.

Die automatisch quantifizierten Funktionen zeigen signifikanten Unterschied zwischen verschiedenen Toxizitäten, was beweist, dass diese quantifizierten Phänotypen von Worms sehr nützlich bei der Ermittlung der Toxizität von Chemikalien sind. Es darauf hingewiesen, dass die phänotypische Profilerstellung offenbart konservierte Funktionen zu klassifizieren und die Toxizität von verschiedenen Chemikalien mit Nematoden C. Elegans als Modellorganismus in-vivo vorherzusagen.

Die US National Toxicology Program (NTP) gründeten die Tox21 Gemeinde durch ein Memorandum of Understanding mit der US Environmental Protection Agency (EPA) und die National Institutes of Health (NIH) Chemical Genomics Center, jetzt das National Center for Translationale Wissenschaften (NCATS) auf dem Vormarsch. Tox21 verwendet in-vitro-High Throughput Screening und in-vivo alternative Tiermodell testen um Mechanismen der Toxizität, Chemikalien für zusätzliche in-vivo Toxizitätstests priorisieren und Prognosemodellen menschliche toxikologische Reaktionen zu entwickeln. Als Teil dieser Bemühungen wurde C. Elegans verwendet, um Bildschirm der EPA ToxCast Phase I und Phase II-Bibliotheken, die 292 und 676, bzw. für Chemikalien zu Chemikalien larvale Entwicklung und Wachstum15verringert. Die COPAS (komplexe Objekt parametrische Analyzer und Sorter) Plattform ist auch verwendet worden für das Wurm toxikologischen Screening2Studien. Allerdings wird die COPAS-Plattform nur einige Features, z. B. Breite Wurm und Wurm Länge der Fluoreszenzintensität quantifiziert. Diese Methode ist eine Verbesserung der aktuellen Methoden mit Würmern zu schnell die Toxizität von neuen Chemikalien Vorauswahl.

Es gibt mehrere wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls: der Wurm-Kultur in ein 384-Well-Platte, die chemische Behandlung der experimentellen Bilderfassung und Phänotyp Quantifizierung. Im Vergleich zu traditionellen Toxizität Evaluationsmethoden, kann dieses Protokoll einige Phänotypen von Würmern zu quantifizieren, die schwierig, manuell zu berechnen und entsprechend die Toxizitäten der jede Chemikalie, wie Wurm Motilität, breite Wurm, Wurm Größe und grau nützlich sind Intensität. Klar, wird dieser Hochdurchsatz-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität eines wertvollen Toxizität Modellansatzes und könnte für die prescreening von Chemikalien vor Nagetier Tierversuche verwendet werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen weichen diese Technik auf schnelle Toxizität Beurteilung in mehreren Bereichen. Forscher könnte die Methode für den Notfall Analyse der Toxizität bei lebensmittelbedingten Toxikose, die Sicherheitsbewertung von Arzneimittel zur Behandlung, sowie die akute Toxizität Screening und Erkennung von neuen Chemikalien und Umwelt exogenen Verbindungen gelten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken CGC für Bitte senden den C. Elegans. Diese Arbeit wurde von National Key Research und Development Program of China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705) unterstützt. National Natural Science Foundation of China Grant (#31401025, #81273108, #81641184), die Kapital Gesundheitsforschung und Entwicklung von speziellen Projekt in Peking (#2011-1013-03), die Öffnung-Fonds von der Beijing Key Laboratory der Umwelttoxikologie (# 2015HJDL03), und die naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Shandong, China (ZR2017BF041).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23, (5), 1235-1240 (2004).
  2. Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245, (2), 153-159 (2010).
  3. Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22, (11), 2768-2774 (2003).
  4. Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50, (3), 209-214 (2004).
  5. Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28, (4), 791-799 (2009).
  6. Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47, (4), 722-728 (2009).
  7. Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20, (9), 1132-1137 (2008).
  8. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106, (1), 5-28 (2008).
  9. Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2, (6), 403-412 (2013).
  10. Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2, (12), 1259 (2007).
  11. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12, (3), 398-409 (2013).
  12. Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19, (1), 18 (2018).
  13. Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, (1), 145-159 (2018).
  14. Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400, (4), 613-618 (2010).
  15. Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124, (5), 586-593 (2016).

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