Effect van Anti-c-fms antilichaam op Osteoclast vorming en verspreiding van Osteoclast voorloper In Vitro

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol omvat dissectie van lymfkliertest lange botten en beenmerg isolatie, voor het genereren van beenmerg macrofagen en produceren van de osteoclasten met behulp van macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-Kappa-B ligand (RANKL) of Tumornecrosefactor alfa (TNF-α) en hun arrestatie door anti-c-fms antilichaam, M-CSF receptor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Marahleh, A., Kitaura, H., Ishida, M., Shima, K., Kishikawa, A., Ogawa, S., Shen, W. R., Qi, J., Ohori, F., Noguchi, T., Nara, Y., Mizoguchi, I. Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e59089, doi:10.3791/59089 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het remodelleren van het bot is een complex proces en het gaat om perioden van afzetting en resorptie. Bot resorptie is een proces waarbij bot door osteoclasten in reactie op verschillende stimuli afgebroken wordt. Osteoclast precursoren differentiëren in multinuclear osteoclasten in reactie op macrophage kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-Kappa-B ligand (RANKL). Onder pathologische omstandigheden, het profiel van cytokine is anders en gaat om een mengsel van inflammatoire cytokines. Tumornecrosefactor alfa (TNF-α) is één van de belangrijkste cytokines zoals het vlindertje gebieden betrokken bij inflammatoire osteolyse in grote hoeveelheden. Het doel van dit protocol is bedoeld als een methode waarmee lymfkliertest beenmerg is geïsoleerd voor het genereren van de osteoclasten door inductie met M-CSF en RANKL of TNF-α, die vervolgens zal worden geremd doordat doses anti-c-fms antilichaam, de receptor voor M-CB. Dit experiment wijst de therapeutische waarde van anti-c-fms antilichaam in ziekten van inflammatoire bot resorptie.

Introduction

Osteoclasten zijn gespecialiseerde cellen, en ze onderscheiden van hematopoietische stamcellen door de fusie van meerdere osteoclast precursoren. Ze zijn essentieel voor het remodelleren van gezond bot en bijdragen aan de pathologische bot resorptie osteolytic ontstekingsziekten zoals reumatoïde artritis en Parodontitis1is gekoppeld.

Osteoclastogenesis en osteoclast functie worden gemedieerd door twee belangrijke factoren; macrophage kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-kappa-B ligand (RANKL). Zowel M-CSF en RANKL zijn belangrijk voor osteoclast differentiatie2. Een andere factor die heeft aangetoond voor het opwekken van osteoclast vorming van beenmerg macrofagen in vitro is Tumornecrosefactor alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α gemedieerde osteoclast vorming is aangetoond dat het van doorslaggevend belang voor osteolyse in destructieve bot ziekten zoals reumatoïde artritis6, parodontitis7en postmenopauzale osteoporose8.

C-fms is de receptor membraan van M-CB en bemiddelt haar optreden. De rol van c-fms is goed gedocumenteerd in de literatuur, zoals het werd aangetoond dat de administratie van een antilichaam tegen c-fms (anti-c-fms antilichaam) volledig osteoclastogenesis in een artritis model gearresteerd, alsook in TNF-α geïnduceerde bot erosies terwijl osteoclastogenesis verre van het ontstoken gewricht was nog steeds robuust9. Toediening van anti-c-fms antilichaam geremd osteoclast vorming en bot resorptie geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS) in muis calvariae10 zo goed zoals in LPS-geïnduceerde parodontitis model11. Bovendien, anti-c-fms antilichaam geremd mechanische stress-geïnduceerde wortel resorptie tijdens orthodontische tand verkeer12, evenals orthodontische tand verkeer en bot resorptie orthodontische tand verkeer13zijn gekoppeld.

M-CSF heeft gemeld dat de andere functies die essentieel voor de immuunrespons van de gastheer zijn. Het ontbreken van M-CB in op/op muizen met bacteriële longontsteking leiden tot de toename van bacteriële belasting en bacteriële verspreiding aan de lever met hepatische necrose14. M-CSF is daarom belangrijk voor immunologische reactie op het gebied van de bescherming tegen infectie.

Deze studie toont het effect van anti-c-fms antilichaam op M-CSF en RANKL of TNF-α geïnduceerde osteoclast vorming in vitro en M-CSF geïnduceerde proliferatie van osteoclast precursoren. Dit protocol toont het isolement van lymfkliertest beenmergcellen van lange beenderen en de stappen voor het genereren van beenmerg macrofagen (BMM), die worden beschouwd als osteoclast precursoren en voor het opwekken van de differentiatie van de BMM in multinuclear osteoclasten door twee methoden; RANKL of TNF-α. Het protocol vergelijkt ook de arrestatie van osteoclastogenesis in beide methoden met behulp van anti-c-fms antilichaam.

Het proces waarbij het beenmerg is geëxtraheerd en vervolgens gebruikt voor het genereren van osteoclast precursoren is betrouwbaar in het produceren van grote hoeveelheden van pure osteoclast culturen die kunnen worden gebruikt in meerdere downstream toepassingen zoals drug testen. Het gebruik van RANKL of TNF-α ertoe osteoclastogenesis in dit protocol onderscheidt osteoclastogenesis als een fysiologische proces (RANKL) van osteoclastogenesis als een pathologische proces (TNF-α), dat op zijn beurt twee alternatieve procedures biedt te begeleiden de beslissing waarvan één is superieur in termen van de reagentia om in downstream toepassingen worden gebruikt. Dit protocol biedt ook een methode waarmee we een geschikte concentratie van anti-c-fms-antilichaam dat veilig kan worden gebruikt voor latere studies deelnemen aan bot resorptie en osteolytic ziekten kunnen bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierlijke procedures en verzorging van de dieren werden uitgevoerd volgens Universiteit Tohoku regels en voorschriften.

1. lymfkliertest stuk dissectie en behandeling

  1. Voordat de dissectie, vul een plaat met ongeveer 50 mL α-MEM afhankelijk van de grootte van de container en plaats deze op het ijs. Dit zal dienen als een collectie container totdat de dissectie van alle beenderen voltooid is. Voor deze en latere experimenten, α-MEM met 10% foetale runderserum (FBS), 100 IU/mL penicilline G en 100 μg/mL streptomycine gebruiken.
  2. C57Bl/6J muis bij inademing met een overdosis van 5% Isofluraan euthanaseren.
  3. Corrigeer de muis in een liggende positie met behulp van pennen doorboord door de palmen en de voeten en de spray grondig met 70% ethanol.
  4. Een insnijding van de huid met behulp van steriele chirurgische schaar en pincet op het niveau van de heup te maken en uit te breiden tot de voeten bloot van de spieren.
  5. Snij de pees van de quadriceps spier koppelen en de pees verbonden zijn de hamstring spier aan het bot. Schil weg de spieren bloot zowel heup-en knie. Lokaliseren van deze pezen zal verlichten vrijmaken van beide spieren van hun bijlagen zonder weke tags. Niet gesneden in het bot.
  6. Plaats de schaar tussen de kop van het dijbeen en de gewrichtsruimte en snijd in het vrijmaken van het dijbeen, maar het bot intact te houden. Hierdoor zal het detachement van de botten zonder het risico van blootstelling van het beenmerg.
  7. Ook knippen weg de spieren die verbonden zijn aan het scheenbeen. Gesneden het scheenbeen vrij van zijn gehechtheid aan het enkelgewricht houden van het bot intact om verontreiniging te voorkomen.
  8. Schraap eventuele resterende weke delen van het bovenbeen en onderbeen met behulp van de schaar messen en kimwipe en plaats deze in een bord met α-MEM geplaatst op ijs.

2. lymfkliertest stuk beenmerg isolatie

  1. Vul een 30 G naald-spuit met α-MEM.
  2. Het verbreken van het scheenbeen en het dijbeen uit de buurt van het kniegewricht.
  3. Snij de uiteinden van de lange beenderen van beide zijden met behulp van schaar.
  4. Houd het bot van de schacht met pincet, plaats de naald in de ruimte van het merg van het bot en langzaam het spoelen van de inhoud van het beenmerg in een 6 cm cultuur schotel. Het bot zal verschijnen witte, met vermelding van de winning van alle inhoud van het beenmerg. Herhaal voor alle botten.
  5. Stam het beenmerg uitpakken met behulp van een 40 μm nylon cel zeef in een tube van 50 mL conische centrifuge en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
  6. Verwijder het supernatant, wassen met 5 mL van α-MEM en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. Repeat wassen voor een totaal van 2 keer.
  7. Resuspendeer de pellet in 10 mL α-MEM en het uitvoeren van een telling van de cel met behulp van een hemocytometer als volgt:
    1. Een verdunning van 1:1 van de celsuspensie maken door toevoeging van 10 μL van celsuspensie aan 10 μL van 0,4% trypan blauw in een tube van 1,5 mL en Pipetteer eens.
    2. Bedek de hemocytometer kamer met een dia cover en breng de kleurstof de hemocytometer. Het is belangrijk niet te overvulling of underfill van de kamer en de schorsing te vullen van de kamer door capillaire werking.
    3. Plaats de hemocytometer in het werkgebied van een microscoop. Met 10 x doelstelling, focussen op het center-plein. Graaf alle cellen 3 regels gebonden. Om ervoor te zorgen dat cellen niet twee keer worden geteld, tellen de bovenste en juiste hoeken van elk vierkant. Dode cellen verschijnt donkerblauw, deze zijn uitgesloten van de graaf.
  8. Afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing, zaad de cellen in een vaartuig van de juiste cultuur. Volg voor deze bijzonder experiment, sectie 3.

3. productie van BMM

  1. Zaad 1 x 107 cellen/10 mL in een 10 cm schotel cultuur en voeg M-CSF 100 ng/mL. De uiteindelijke concentratie van M-CSF is 100 ng/mL gestolde voedingsbodem. Incubeer de cultuur bij 37 ° C, 5% CO2 voor 3 dagen.
  2. Na 3 dagen, het verwijderen van het kweekmedium, wassen van de cellen krachtig met 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal naar niet-aanhanger cellen verwijderen, voeg 5 mL van de kamertemperatuur 0,02% trypsine-EDTA in PBS en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 5 min.
  3. Loskoppelen van de cellen door grondige pipetteren. Zorg ervoor dat de cellen hebben zijn losgemaakt door het observeren van de cultuur onder een microscoop (de cellen moeten verschijnen afgeronde en zwevend in de media). Als de cellen aangesloten blijven, herhaal pipetteren grondig als u wilt loskoppelen van hen. Wanneer de cellen hebben zijn vrijstaand, voeg 5 mL van α-MEM naar de inactivering van de reactie.
  4. De cellen in een conische tube van 50 mL en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant verzamelen en wassen met 5 mL van α-MEM.
  5. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet in 10 mL α-MEM.
  6. Het uitvoeren van een aantal van de cellen zoals hiervoor is beschreven in stap 2.7.1.
  7. Zaad 1 x 106 cellen/10 mL in een 10 cm schotel cultuur en voeg M-CSF 100 ng/mL. De uiteindelijke concentratie van M-CSF is 100 ng/mL gestolde voedingsbodem. Incubeer de cultuur bij 37 ° C, 5% CO2 voor 3 dagen.

4. generatie van osteoclasten van BMM als Osteoclast precursoren

  1. Na 3 dagen, de gekoppelde cellen die BMM als osteoclast precursoren vertegenwoordigen, stappen 3.2-3.7 na de oogst.
  2. Zaad BMM op 5 x 104 cellen/200 μL van α-MEM in een 96 goed bord. Toevoegen RANKL voor een eindconcentratie van 50 ng/mL of TNF-α voor een eindconcentratie van 100 ng/mL. M-CSF voor een eindconcentratie van 100 ng/mL toevoegen aan elk putje.
  3. Toevoegen van anti-c-fms antilichaam (eindconcentraties van 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) aan elk putje.
  4. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 4 dagen. Wijzigen van media om de andere dag voor 4 dagen.

5. tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) vlek

  1. Na 4 dagen incubatie, gecombineerd zachtjes het kweekmedium van elk putje. Was nou eenmaal met 200 μL van kamertemperatuur 1 x PBS.
  2. Voeg 200 μl van 10% formaline aan elk putje voor fixatie en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De formaline gecombineerd en elk goed 3 keer wassen met gedeïoniseerd water.
  3. Voeg toe 200 μL van 0,2% Triton X-100 in PBS aan elk goed voor permeabilization en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De Triton X-100 gecombineerd en elk goed 3 keer wassen met gedeïoniseerd water.
  4. Voeg 200 l TRAP vlek oplossing aan elk putje. Visualiseer de vlek onder de Microscoop. Het duurt van 10-30 min voor de vlek goed ontwikkelen.
  5. Gecombineerd de vlek en wassen elk goed met gedeïoniseerd water 3 keer, en droge lucht. Bewaren bij kamertemperatuur te gebruiken in verdere observatie.

6. verspreiding Assay

  1. Zaad BMM als osteoclast precursoren op 5 x 103 cellen/200 μL van α-MEM in een 96 goed bord. M-CSF voor een eindconcentratie van 100 ng/mL toevoegen aan elk putje.
  2. Toevoegen van anti-c-fms antilichaam (eindconcentraties van 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 3 dagen middellange ongewijzigd.
  3. Na 3 dagen, wassen de cellen met 1 x PBS. Voeg 100 μl van α-MEM toe aan elk putje.
  4. 10 μL van cel tellen kit oplossing toevoegen en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 2 h en bepalen van de extinctie van elk putje bij 450 nm met behulp van een microplate-lezer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het doel van dit protocol is te evalueren van het effect van anti-c-fms antilichaam op osteoclast vorming in aanwezigheid van RANKL of TNF-α en voor het bepalen van het effect van M-CSF op osteoclast precursoren proliferatie. In dit protocol, die wij hebben verstrekt een betrouwbaar proces watergasproces waarbij grote hoeveelheden pure osteoclast culturen zijn gegenereerd. Wij hebben ook een manier om te testen de geschikte concentratie anti-c-fms antilichaam voor remming van osteoclast vorming onder andere cultuur voorwaarden verstrekt.

De vorming van de osteoclast in M-CSF + RANKL cultuur met anti-c-fms antilichaam is afgebeeld in Figuur 1. Op 1, 10 ng/mL anti-c-fms antilichaam, er werd geen significante afname in het aantal osteoclasten t.o.v. controle (0 ng/mL). Terwijl bij 100, 1000 ng anti-c-fms antilichaam, was er een significante afname in het aantal osteoclasten t.o.v. controle. De vorming van de osteoclast in M-CSF + TNF-α cultuur met anti-c-fms antilichaam is afgebeeld in Figuur 2. Op 1 ng/mL anti-c-fms antilichaam was er geen significante afname in het aantal osteoclasten t.o.v. controle (0 ng/mL). Terwijl op 10, 100, 1000 ng/mL anti-c-fms antilichaam, was er een significante afname in het aantal osteoclasten t.o.v. controle.

Osteoclast precursoren cultuur met M-CSF + anti-c-fms antilichaam is afgebeeld in Figuur 3. Op 1, 10, 100 ng/mL, er werd geen significante afname in het aantal osteoclast precursoren in vergelijking met controle (0 ng/mL), terwijl bij 1000 ng/mL, was er een significante afname in het aantal osteoclast precursoren in vergelijking met controle. Dit geeft aan dat een concentratie oplopen tot 1000 ng/mL nodig is voor de remming van de proliferatie van osteoclast precursoren aanzienlijk.

Deze resultaten bieden informatie over het robuuste karakter van de RANKL in het produceren van osteoclasten terwijl een concentratie van 50 ng/mL van RANKL werd gebruikt, en een concentratie van 100 ng/mL van TNF-α was nodig om hetzelfde aantal osteoclasten verkrijgen. Beide methoden zijn geschikt voor osteoclast generatie maar het besluit van die is superieur hangt af van de stroomafwaartse toepassing in het kader van de reagentia moeten later worden gebruikt. Zoals blijkt uit de resultaten, het gebruik van RANKL is niet het equivalent van het gebruik van TNF-α voor het genereren van osteoclasten.

In dit protocol, gebruikten we anti-c-fms antilichaam voor de remming van osteoclastogenesis, en door te kijken naar de resultaten, we vinden dat een concentratie van 100 ng/mL van anti-c-fms antilichaam nodig was voor de productie van aanzienlijke afname van de osteoclast nummer in RANKL wells. Een concentratie van 1000 ng/mL van anti-c-fms antilichaam nodig was voor de remming van osteoclast voorloper proliferatie in MCSF proliferatie assay, terwijl een concentratie van slechts 10 ng/mL van anti-c-fms antilichaam nodig was voor de productie van aanzienlijke afname van de osteoclast nummer in TNF-α wells.

Figure 1
Figuur 1: Effect van anti-c-fms antilichaam op vorming van RANKL-geïnduceerde osteoclast. Microscopische observatie van osteoclast precursoren die werden behandeld met M-CSF, RANKL en verschillende dosis anti-c-fms antilichaam (0, 1, 10, 100 en 1000 ng/mL) voor 4 dagen. Cellen werden vastgesteld en bevlekt met TRAP kleuring. Aantal TRAP-positieve cellen gekweekt met M-CSF, RANKL en verschillende concentraties van anti-c-fms antilichaam (0, 1, 10, 100 en 1000 ng/mL) voor 4 dagen. Cellen werden vastgesteld en bevlekt met TRAP kleuring. Het aantal cellen van de TRAP-positief werd beoordeeld. Resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± S.D. van vier culturen. Statistische verschillen zijn waargenomen met behulp van de Scheffe tests (n = 4; * p < 0,01). Schaal bars = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Effect van anti-c-fms antilichaam op TNF-α-geïnduceerde osteoclast vorming. Microscopische observatie van osteoclast precursoren die werden behandeld met M-CSF, TNF-α en verschillende dosis anti-c-fms antilichaam (0, 1, 10, 100 en 1000 ng/mL) voor 4 dagen. Cellen werden vastgesteld en bevlekt met TRAP kleuring. Aantal TRAP-positieve cellen gekweekt met M-CSF, TNF-α en verschillende concentraties van anti-c-fms antilichaam (0, 1, 10, 100 en 1000 ng/mL) voor 4 dagen. Cellen werden vastgesteld en bevlekt met TRAP kleuring. Het aantal cellen van de TRAP-positief werd beoordeeld. Resultaten werden uitgedrukt als meanv ± S.D. van vier culturen. Statistische verschillen zijn waargenomen met behulp van de Scheffe tests (n = 4; * p < 0,01). Schaal bars = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Effect van anti-c-fms antilichaam inzake verspreiding van osteoclast voorloper. Cel levensvatbaarheid van osteoclast precursoren die werden behandeld met M-CSF en verschillende dosis van anti-c-fms antilichaam (0, 1, 10, 100 en 1000 ng/mL) voor 3 dagen. Cel tellen kit-8 werd gebruikt voor het meten van de levensvatbaarheid. Gegevens worden gepresenteerd als een percentage te vergelijken van de relatieve activiteit van de putten met M-CSF + anti-c-fms versus de putjes met M-CSF alleen en uitgedrukt in betekenen ± S.D. van vier culturen. Statistische verschillen zijn waargenomen met behulp van de Scheffe tests (n = 4; * p < 0,01). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In deze studie onderzochten we het effect van anti-c-fms antilichaam RANKL-geïnduceerde osteoclast vorming, TNF-α-geïnduceerde osteoclast vorming en M-CSF-geïnduceerde osteoclast voorloper proliferatie. We vonden dat de effectieve hoeveelheid anti-c-fms antilichaam voor de remming van de osteoclastogenesis tussen RANKL geïnduceerde osteoclast vorming, TNF-α geïnduceerde osteoclast vorming en M-CSF-geïnduceerde proliferatie van osteoclast precursoren anders is.

RANKL bemiddelt osteoclastogenesis in aanwezigheid van M-CSF in vitro en rang-null muizen ervaring ernstige osteopetrosis als gevolg van het falen van osteoclasten te ontwikkelen15, RANKL is een verplichte cytokine voor osteoclastogenesis en heeft dus een belangrijke regulerende rol in de homeostase van het bot. Daarom, als RANKL-geïnduceerde osteoclast vorming kan worden gecontroleerd, de daling in bot massa kan worden gecontroleerd. Echter als er buitensporige onderdrukking optreedt, worden bot homeostase niet gehandhaafd. In dit experiment tonen we dat anti-c-fms-antilichaam moet worden bij hoge concentratie 100 ng/mL te kunnen verlagen osteoclast vorming geïnduceerd door RANKL.

TNF-α gemedieerde osteoclast vorming is aangetoond dat het van doorslaggevend belang voor osteolyse in destructieve bone ziekten zoals reumatoïde artritis6, parodontitis7en postmenopauzale osteoporose8 en hier laten we zien dat anti-c-fms antilichaam kan gemakkelijk osteoclast vorming gemedieerd door TNF-α met een lage concentratie van 10 ng/mL afremmen. Het resultaat stelt dat een lage concentratie van anti-c-fms antilichaam van therapeutische waarde zijn kan te verlagen van het proces van osteoclastogenesis in pathologische omstandigheden maar minimaal effect op osteoclastogenesis in normale omstandigheden zou hebben.

M-CSF is een sleutelfactor voor osteoclast vorming als de op/op muizen die geen Csf1 het gen dat codeert voor M-CSF Toon een osteopetrotic fenotype gebrek aan volledige osteoclasten16. M-CSF bevordert ook het voortbestaan van osteoclast precursoren2. M-CSF niveaus worden verhoogd in het serum van patiënten met reumatoïde artritis hebben ernstige spondylitis ankylopoetica17 en in het gewrichtsvocht rond losse gezamenlijke prothese18. TNF-α verhoogt het aantal osteoclast precursoren in vivo als gevolg van het inducerende M-CSF genexpressie in stromale cellen9. In het licht van deze gegevens kunnen we concluderen dat M-CSF is een belangrijke bemiddelaar van ontsteking als gevolg van de effecten van TNF-α op stromale cellen die veroorzaakt een toename van M-CSF productie van deze cellen.

Er werd gemeld dat de M-CSF een belangrijke rol in de immuunrespons van de gastheer zoals antimicrobiële functies van zowel de longen en de lever mononucleaire fagocyten tijdens longontsteking14 speelt. Daarom, als buitensporig onderdrukking van M-CSF optreedt, bestaat de mogelijkheid dat de immuunrespons zal dalen. In dit experiment toonden we dat een zeer hoge concentratie van anti-c-fms antilichaam (1000 ng/mL) was nodig om te remmen osteoclast precursoren overleving en proliferatie gemedieerd door M-CSF. Deze resultaten naast elkaar genomen suggereren dat anti-c-fms-antilichaam kan werken als een therapeutische tot arrestatie van de osteoclastogenesis in TNF-α osteolytic ziekten bij lage concentratie, op hetzelfde moment die deze concentratie sparen osteoclast vorming geïnduceerd geïnduceerde zal door RANKL en M-CSF waarmee voor bot remodelleren te voorkomen.

Kritische stappen in het protocol moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het experiment een succes. In het begin van het protocol terwijl het ontleden is het belangrijk om te voorkomen dat snijden in het bot te voorkomen van besmetting van het beenmerg. In het proces van winning van het beenmerg, om ervoor te zorgen dat alle beenmerg zijn uitgepakt, de afboekingsmethode procedure moet worden herhaald nodig totdat alle beenmerg zijn uitgepakt, waarmee een hoog rendement van cellen. Dit protocol kan worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals het reagens testen, en het biedt ook een manier waarmee de concentratie van anti-c-fms antilichaam kan worden getest voor het vermijden van valse interpretatie van de resultaten. Zoals wij toonde, de concentratie van anti-c-fms-antilichaam dat nodig was voor de remming van de vorming van osteoclast is niet gelijk onder de methoden welke osteoclasten werden verkregen (RANKL of TNF-α), hebben dus geen resultaten verkregen met betrekking tot de concentratie van anti-c-fms Als u wilt worden zorgvuldig onderzocht in de toekomst experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door een JSPS KAKENHI verlenen uit hoofde van de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (nr. 16K 11776 aan H. K., No. 17K 17306 aan K. S., No. 16K 20637 aan K. K., No. 16K 20636 naar M. S., No. 18K 09862 tot I. M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-c-Fms antibody AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)
TNF-α Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.
RANKL PEPROTECH 315-11 Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli
M-CSF Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish.
α-MEM Wako with L-Glutamine and phenol red
Fetal Bovine Serum Biowest s1820-500 Fetal Bovine Serum French Origin
Culture dish Corning 100 mm x 20 mm style dish
96-well plate Thermofischer Scientific Nun clon Delta surface
Cell counting kit-8 Dojindo, Kumamoto, Japan
Microplate reader Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan
Cell strainer Corning 40 μm Nylon
Centrifuge tube Corning 50 mL CentriStar cap
Triton X-100 Wako Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).
  2. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289, (5484), 1504-1508 (2000).
  3. Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275, (7), 4858-4864 (2000).
  4. Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191, (2), 275-286 (2000).
  5. Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202, (5), 589-595 (2005).
  6. Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110, (10), 1419-1427 (2002).
  7. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100, (6), 1557-1565 (1997).
  8. Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
  9. Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115, (12), 3418-3427 (2005).
  10. Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64, (2), 219-227 (2012).
  11. Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20, (3), 319-324 (2014).
  12. Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79, (5), 835-841 (2009).
  13. Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87, (4), 396-400 (2008).
  14. Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196, (12), 5047-5055 (2016).
  15. Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13, (18), 2412-2424 (1999).
  16. Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, (12), 4828-4832 (1990).
  17. Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65, (12), 1671-1672 (2006).
  18. Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27, (4), 894-899 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics