Effekten af Anti-c-fms antistof på osteoklast dannelse og spredning af osteoklast forløber In Vitro

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol omfatter dissektion af murine lange knogler og knoglemarv isolation, at generere knoglemarv makrofager og producere osteoklaster ved hjælp af makrofag koloni stimulerende faktor (M-CSF) og receptor aktivator af nuclear factor Kappa B ligand (RANKL) eller tumor nekrose faktor alfa (TNF-α) og deres anholdelse af anti-c-fms antistof, M-CSF receptor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Marahleh, A., Kitaura, H., Ishida, M., Shima, K., Kishikawa, A., Ogawa, S., Shen, W. R., Qi, J., Ohori, F., Noguchi, T., Nara, Y., Mizoguchi, I. Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e59089, doi:10.3791/59089 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Knogle remodellering er en kompleks proces, og det indebærer perioder med deposition og resorption. Knogleresorption er en proces, hvormed knogle er opdelt efter osteoklaster i respons på forskellige stimuli. Osteoklast prækursorer differentiere i multinuclear osteoklaster svar på makrofag koloni stimulerende faktor (M-CSF) og receptor aktivator af nuclear factor Kappa B ligand (RANKL). Patologiske betingelser, cytokin-profil er forskellige og omfatter en blanding af inflammatoriske cytokiner. Tumor nekrose faktor alfa (TNF-α) er en af de vigtigste cytokiner som det findes i store mængder i områder, der indgår med inflammatoriske osteolyse. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en metode, hvorved murine knoglemarven er isoleret for at generere osteoklaster gennem induktion med M-CSF og enten RANKL eller TNF-α, som efterfølgende blive hæmmet af stigende doser af anti-c-fms antistof, receptoren for M-CSF. Dette eksperiment fremhæver den terapeutiske værdi af anti-c-fms antistof i sygdomme i inflammatoriske knogleresorption.

Introduction

Osteoklaster er højt specialiserede celler, og de differentiere fra hæmatopoietisk stamceller via fusion af flere osteoklast prækursorer. De er afgørende for sund knogle remodellering og bidrage til patologiske knogleresorption associeret med inflammatorisk osteolytiske sygdomme som leddegigt og paradentose1.

Osteoclastogenesis og osteoklast funktion er medieret af to centrale faktorer; makrofag koloni stimulerende faktor (M-CSF) og receptor aktivator af nuclear factor kappa B ligand (RANKL). Både M-CSF og RANKL er vigtigt, at osteoklast differentiering2. En anden faktor, som har vist sig at fremkalde osteoklast dannelse fra knoglemarven makrofager in vitro-er tumor nekrose faktor alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α medieret osteoklast dannelse har vist sig at være afgørende for osteolyse i destruktive bone sygdomme som leddegigt6, paradentose7og postmenopausale osteoporose8.

C-fms er membran receptor af M-CSF og medierer sin indsats. Rollen som c-fms er veldokumenteret i litteraturen som det blev påvist, at administrationen af et antistof mod c-fms (anti-c-fms antistof) helt anholdt osteoclastogenesis i en arthritis model samt i TNF-α induceret knogle erosioner mens osteoclastogenesis fjernt fra det betændte fælles var stadig robust9. Administration af anti-c-fms antistof hæmmede osteoklast dannelse og knogle resorption induceret af LPS (LPS) i mus calvariae10 såvel som i LPS-induceret parodontitis model11. Derudover hæmmede anti-c-fms antistof mekanisk stress-induceret root resorption under Ortodontisk tand bevægelse12, som Ortodontisk tand bevægelse og knogleresorption forbundet med tandregulering tand bevægelse13.

M-CSF er blevet rapporteret at have andre funktioner, som er afgørende for at vært immunrespons. Fravær af M-CSF i op/op mus med bakteriel lungebetændelse føre til øget bakteriel byrde og bakteriel spredning til leveren med levernekrose14. Derfor, M-CSF er vigtigt for immunologisk respons i beskyttelse mod infektion.

Denne undersøgelse viser effekten af anti-c-fms antistof på M-CSF og RANKL eller TNF-α induceret osteoklast formation in vitro- og M-CSF induceret spredning af osteoklast prækursorer. Denne protokol viser isolering af murine knoglemarv celler fra lange knogler, og de skridt til at generere knoglemarv makrofager (BMM), der betragtes som osteoklast prækursorer og at inducere differentiering af BMM i multinuclear osteoklaster af to metoder; enten RANKL eller TNF-α. Protokollen sammenligner også anholdelsen af osteoclastogenesis i begge metoder, anti-c-fms antistof.

Den proces som knoglemarven er udvundet og efterfølgende bruges til at generere osteoklast prækursorer er pålidelige i producerer store mængder af ren osteoklast kulturer, som kan bruges i flere downstream applikationer som dopingkontrol. Brug af enten RANKL eller TNF-α til at fremkalde osteoclastogenesis i denne protokol adskiller osteoclastogenesis som en fysiologisk proces (RANKL) fra osteoclastogenesis som patologiske proces (TNF-α), som igen indeholder to alternative procedurer til at guide den beslutning, hvoraf én er overlegen med hensyn til reagenser skal bruges i efterfølgende ansøgninger. Denne protokol indeholder også en metode, hvorved vi kan bestemme en passende koncentration af anti-c-fms-antistof, der kan anvendes sikkert for senere studier involverede i knogleresorption og osteolytiske sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr procedurer og pasning af dyr blev udført ifølge Tohoku Universitet regler og forordninger.

1. murine Hindlimb dissektion og håndtering

  1. Før dissektion, fylde en tallerken med ca. 50 mL af α-MEM afhængigt af størrelsen af containeren og placere den på is. Dette vil tjene som en samling beholder indtil dissektion af alle knogler er fuldført. For dette og efterfølgende bruge eksperimenter, α-MEM indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS), 100 IE/mL penicillin G, og 100 μg/mL streptomycin.
  2. Aflive C57Bl/6J mus ved indånding af en overdosis af 5% isofluran.
  3. Fix musen i en liggende stilling ved hjælp af stifter gennemboret gennem håndflader og fødder og spray grundigt med 70% ethanol.
  4. Gøre en hud indsnit ved hjælp af steril kirurgiske saks og pincet på niveauet af hoften og udvide det ned til fødderne udsætter musklerne.
  5. Skære senen vedhæfter quadriceps muskler og sener knyttet forstrækning muskler til knoglen. Skræl væk musklerne udsætter både hofte-og knæled. At lokalisere disse sener vil lette frigør begge muskler fra deres vedhæftede filer uden at forlade bløddele tags. Ikke skære ind i knoglen.
  6. Placer saks mellem lederen i femur og ledspalten og skåret i det frigøre lårbenet, men at holde knoglen intakt. Dette vil gøre det muligt udstationering af knogler uden risikoen for at afsløre knoglemarven.
  7. Ligeledes skåret væk musklerne vedhæfte til skinnebenet. Skære tibia fri for fastgøring på fodleddet at holde knoglen intakt til at undgå forurening.
  8. Skrab alle resterende bløde væv fra lårben og skinneben ved hjælp af saks vinger og kimwipe og placere den i en plade med α-MEM placeret på is.

2. murine Hindlimb knoglemarv Isolation

  1. Fylde en 30 G kanyle sprøjte med α-MEM.
  2. Afbryde skinnebenet og lårbenet fra knæleddet.
  3. Skær enderne af lange knogler fra begge sider ved hjælp af saks.
  4. Hold knogle fra akslen ved hjælp af pincet, indsætte nålen ind i marv rummet af knoglen og langsomt flush indholdet af marv i en 6 cm kultur skål. Knoglen vises hvid, med angivelse af udvinding af alle knoglemarv indhold. Gentag for alle knogler.
  5. Stamme knoglemarven uddrag ved hjælp af en 40 μm nylon celle si i en 50 mL konisk centrifugeglas, og der centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
  6. Supernatanten, skylles med 5 mL af α-MEM og centrifugeres ved 300 x g i 5 min. Gentag vask for i alt 2 gange.
  7. Resuspenderes i 10 mL af α-MEM og udføre en celletal, ved hjælp af en hemocytometer som følger:
    1. Gøre en 1:1 fortynding af cellesuspension ved at føje 10 μL cellesuspension til 10 μL af 0,4% trypan blå i en 1,5 mL tube og afpipetteres en gang.
    2. Dække hemocytometer kammer med et dias dække og overføre farvestof suspension til hemocytometer. Det er vigtigt ikke at for meget eller underfill kammeret og tillade suspension til at fylde salen af kapillaritet.
    3. Placer hemocytometer på et mikroskop scenen. Bruger 10 x mål, fokusere på den midterste firkant. Tælle alle celler af 3 linier. For at sikre, at celler ikke tælles dobbelt, Tæl de øverste og højre hjørner af hver firkant. Døde celler vises mørkeblå, disse er undtaget fra optællingen.
  8. Afhængigt af programmet downstream seed cellerne i en passende kultur fartøj. For denne særlige eksperiment, Følg punkt 3.

3. generation af BMM

  1. Frø 1 x 107 celler/10 mL i en 10 cm kultur parabol og tilføje M-CSF 100 ng/mL. Den endelige koncentration af M-CSF er 100 ng/mL af næringssubstratet. Inkuber kultur ved 37 ° C, 5% CO2 til 3 dage.
  2. Efter 3 dage, fjerne næringssubstratet, vaske cellerne energisk med 10 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) to gange for at fjerne ikke-tilhænger celler, tilsættes 5 mL af stuetemperatur 0,02% trypsin-EDTA i PBS og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 5 min.
  3. Frigør cellerne ved grundig pipettering. Kontroller, at cellerne er blevet skilt ved at observere kultur under mikroskop (cellerne skal vises afrundet og flydende i media). Hvis cellerne blive siddende, Gentag pipettering grundigt for at løsne dem. Når cellerne er blevet skilt, tilsættes 5 mL af α-MEM at inaktivere reaktion.
  4. Indsamle cellerne i en 50 mL konisk rør og centrifugeres ved 300 x g i 5 min. Fjern supernatanten, og skylles med 5 mL af α-MEM.
  5. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min og resuspenderes i 10 mL af α-MEM.
  6. Udføre en celletal, som tidligere beskrevet taktfast 2.7.1.
  7. Frø 1 x 106 celler/10 mL i en 10 cm kultur parabol og tilføje M-CSF 100 ng/mL. Den endelige koncentration af M-CSF er 100 ng/mL af næringssubstratet. Inkuber kultur ved 37 ° C, 5% CO2 til 3 dage.

4. generation af osteoklasterne fra BMM som osteoklast prækursorer

  1. Efter 3 dage, høste de tilknyttede celler, som repræsenterer BMM som osteoklast prækursorer, efter trin 3.2-3.7.
  2. Frø BMM på 5 x 104 celler/200 μl af α-MEM i en 96 godt plade. Tilføje RANKL til en slutkoncentration på 50 ng/mL eller TNF-α for en endelig koncentration på 100 ng/mL. Tilføje M-CSF for en endelig koncentration på 100 ng/mL til hver brønd.
  3. Tilføje anti-c-fms antistof (endelige koncentrationer af 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) til hver brønd.
  4. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 til 4 dage. Ændre medierne hver anden dag i 4 dage.

5. tartrat-resistente sur fosfatase (FÆLDE) plet

  1. Efter 4 dages inkubation, forsigtigt Aspirér næringssubstratet i hver brønd. Vask hver godt en gang med 200 μl stuetemperatur 1 x PBS.
  2. Tilføje 200 μl af 10% formalin til hver brønd for fiksering og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Opsug formalin og vask hver godt 3 gange med deioniseret vand.
  3. Tilføje 200 μl af 0,2% Triton X-100 i PBS til hver godt for permeabilization og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Opsug Triton X-100 og vask hver godt 3 gange med deioniseret vand.
  4. Tilføje 200 μl af TRAP pletten løsning til hver brønd. Visualisere plet under mikroskopet. Det vil tage fra 10-30 min for pletten udvikle sig korrekt.
  5. Opsug pletten og vask hver godt med deioniseret vand 3 gange, og lufttørre. Holde ved stuetemperatur til at bruge i yderligere observation.

6. spredning analyse

  1. Frø BMM som osteoklast prækursorer på 5 x 103 celler/200 μl af α-MEM i en 96 godt plade. Tilføje M-CSF for en endelig koncentration på 100 ng/mL til hver brønd.
  2. Tilføje anti-c-fms antistof (endelige koncentrationer af 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 til 3 dage uden medium forandring.
  3. Efter 3 dage, cellerne vaskes med 1 x PBS. Tilsæt 100 μL af α-MEM til hver brønd.
  4. Tilsæt 10 μl af celle tælle kit løsning og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 for 2 h og bestemme absorbansen af hver brønd ved 450 nm med en mikrotiterplade læser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med denne protokol er at vurdere effekten af anti-c-fms antistof på osteoklast dannelse RANKL eller TNF-α, og at fastlægge effekten af M-CSF på osteoklast prækursorer spredning. I denne protokol, har vi leveret en pålidelig proces, hvor store mængder af ren osteoklast kulturer er genereret. Vi leverer også en måde at teste anti-c-fms antistof passende koncentration for hæmme osteoklast dannelse under forskellige kultur betingelser.

Osteoklast dannelsen i M-CSF + RANKL kultur med anti-c-fms antistof er vist i figur 1. På 1, 10 ng/mL anti-c-fms antistof, der var ingen signifikant fald i antallet af osteoklasterne i forhold til kontrol (0 ng/mL). Samtidig med 100, 1.000 ng anti-c-fms antistof, der var en betydelig nedgang i antallet af osteoklasterne sammenlignet med kontrol. Osteoklast dannelsen i M-CSF + TNF-α kultur med anti-c-fms antistof er vist i figur 2. På 1 ng/mL anti-c-fms antistof var der ingen signifikant fald i antallet af osteoklasterne i forhold til kontrol (0 ng/mL). På 10, 100, 1.000 ng/mL anti-c-fms antistof, der var en betydelig nedgang i antallet af osteoklasterne sammenlignet med kontrol.

Osteoklast prækursorer kultur med M-CSF + anti-c-fms antistof er vist i figur 3. På 1, 10, 100 ng/mL, der ikke var nogen betydelig nedgang i antallet af osteoklast prækursorer i forhold til kontrol (0 ng/mL), mens på 1.000 ng/mL, der var en betydelig nedgang i antallet af osteoklast prækursorer i forhold til kontrol. Dette angiver, at en så højt som 1000 ng/mL koncentration er nødvendig for at hæmme spredningen af prækursorer til osteoklast betydeligt.

Disse resultater giver oplysninger om den robust natur af RANKL i producerer osteoklaster, mens en koncentration på 50 ng/mL af RANKL blev brugt, og en koncentration af 100 ng/mL TNF-α var nødvendig for at opnå det samme antal osteoklaster. Begge disse metoder er velegnede til osteoklast generation, men beslutningen er overlegen afhænger af downstream programmet inden for rammerne af reagenser skal bruges senere. Som resultaterne viser, er ved hjælp af RANKL ikke svarer til ved hjælp af TNF-α for at generere osteoklaster.

I denne protokol, vi brugte anti-c-fms antistof til at hæmme osteoclastogenesis, og ved at kigge på resultaterne, vi finder, at en koncentration på 100 ng/mL af anti-c-fms antistof var nødvendig for at producere betydelige fald i osteoklast antallet i RANKL brønde. En koncentration af 1.000 ng/mL af anti-c-fms antistof var nødvendig for at hæmme osteoklast forløber spredning i MCSF spredning analyse, mens en koncentration på kun 10 ng/mL af anti-c-fms antistof var nødvendig for at producere betydelige fald i osteoklast antallet i TNF-α brønde.

Figure 1
Figur 1: effekt af anti-c-fms antistof på RANKL-induceret osteoklast dannelse. Mikroskopiske observation af osteoklast prækursorer, der blev behandlet med M-CSF, RANKL og forskellige dosis anti-c-fms antistof (0, 1, 10, 100 og 1000 ng/mL) i 4 dage. Celler var fast og farves med FÆLDE farvning. Antallet af TRAP-positive celler dyrkes med M-CSF, RANKL og forskellige koncentrationer af anti-c-fms antistof (0, 1, 10, 100 og 1000 ng/mL) i 4 dage. Celler var fast og farves med FÆLDE farvning. Antallet af TRAP-positive celler blev vurderet. Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± S.D. i fire kulturer. Statistiske forskelle blev fundet ved hjælp af Scheffes test (n = 4; * p < 0,01). Skalere barer = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: effekten af anti-c-fms antistof på TNF-α-induceret osteoklast dannelse. Mikroskopiske observation af osteoklast prækursorer, der blev behandlet med M-CSF, TNF-α og forskellige dosis anti-c-fms antistof (0, 1, 10, 100 og 1000 ng/mL) i 4 dage. Celler var fast og farves med FÆLDE farvning. Antallet af TRAP-positive celler dyrkes med M-CSF, TNF-α og forskellige koncentrationer af anti-c-fms antistof (0, 1, 10, 100 og 1000 ng/mL) i 4 dage. Celler var fast og farves med FÆLDE farvning. Antallet af TRAP-positive celler blev vurderet. Resultaterne blev udtrykt som meanv ± S.D. i fire kulturer. Statistiske forskelle blev fundet ved hjælp af Scheffes test (n = 4; * p < 0,01). Skalere barer = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: effekten af anti-c-fms antistof på spredning af osteoklast forløber. Celle levedygtighed osteoklast prækursorer, der blev behandlet med M-CSF og forskellige dosis anti-c-fms antistof (0, 1, 10, 100 og 1000 ng/mL) i 3 dage. Celle tælle kit-8 blev brugt til at måle levedygtighed. Data er præsenteret som en procentdel til at sammenligne den relative aktivitet af brøndene indeholdende M-CSF + anti-c-fms versus brøndene indeholdende M-CSF alene og udtrykt som betyder ± S.D. i fire kulturer. Statistiske forskelle blev fundet ved hjælp af Scheffes test (n = 4; * p < 0,01). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse undersøgte vi effekten af anti-c-fms antistof på RANKL-induceret osteoklast dannelse, TNF-α-induceret osteoklast dannelse og M-CSF-induceret osteoklast forløber spredning. Vi fandt, at den effektive anti-c-fms antistof til hæmning af osteoclastogenesis blandt RANKL-induceret osteoklast dannelse, TNF-α induceret osteoklast dannelse og M-CSF-induceret spredning af osteoklast prækursorer er forskellige.

RANKL medierer osteoclastogenesis i nærværelse af M-CSF in vitro, og rang-null mus opleve alvorlige osteopetrosis på grund af svigt af osteoklasterne at udvikle15, dermed RANKL er en obligatorisk cytokin for osteoclastogenesis og har en regulerende rolle i knoglen homøostase. Derfor, hvis RANKL-induceret osteoklast dannelse kan kontrolleres, at faldet i bone mass kan kontrolleres. Men hvis overdreven undertrykkelse opstår, knogle homøostase vedligeholdes ikke. I dette eksperiment viser vi, at anti-c-fms antistof skal være på høj koncentration 100 ng/mL at formindske osteoklast dannelse induceret af RANKL.

TNF-α medieret osteoklast dannelse har vist sig at være afgørende for osteolyse i destruktive bone sygdomme som leddegigt6, paradentose7og postmenopausale osteoporose8 og her viser vi at anti-c-fms antistof kan nemt hæmmer osteoklast dannelse medieret af TNF-α på en lav koncentration af 10 ng/mL. Resultatet tyder på, at en lav koncentration af anti-c-fms antistof kunne af terapeutiske værdi at mindske processen med osteoclastogenesis i patologiske betingelser men ville have minimal effekt på osteoclastogenesis under normale forhold.

M-CSF er en nøglefaktor for osteoklast dannelse som op/op mus, som mangler Csf1 genet, der koder for M-CSF Vis en osteopetrotic fænotype på grund af fuldstændig mangel på osteoklaster16. M-CSF også fremmer overlevelse af osteoklast prækursorer2. M-CSF niveauer er øget i serum hos patienter med reumatoid artrit, der har alvorlige ankyloserende spondylitis17 og i synovialvæske omkring løs fælles protesen18. TNF-α øger antallet af osteoklast prækursorer i vivo som følge af inducerende M-CSF genekspression i stromale celler9. På baggrund af disse data kan vi konkludere, at M-CSF er en vigtig mediator af betændelse på grund af virkningen af TNF-α på stromale celler, der forårsager en stigning i M-CSF produktion fra disse celler.

Det er blevet rapporteret, at M-CSF spiller en vigtig rolle i vært immunrespons såsom antimikrobielle funktioner af både lunge og lever mononukleære fagocytter under lungebetændelse14. Derfor, hvis overdreven undertrykkelse af M-CSF opstår, er der mulighed for, at immunresponset vil falde. I dette eksperiment viste vi, at en meget høj koncentration af anti-c-fms antistof (1.000 ng/mL) var nødvendig for at hæmme osteoklast prækursorer overlevelse og spredning medieret af M-CSF. Disse resultater taget side om side tyder på, at anti-c-fms antistof kan arbejde som en terapeutisk at arrestere osteoclastogenesis i TNF-α inducerede osteolytiske sygdomme ved lav koncentration, på samme tid denne koncentration vil skåne osteoklast dannelse induceret af RANKL og M-CSF, hvilket vil give mulighed for knogle remodellering for at forekomme.

Kritiske trin i protokollen skal udføres omhyggeligt for at sikre succes i forsøget. I begyndelsen af protokollen mens dissekere er det vigtigt at undgå at skære ind i knoglen til at undgå forurening af knoglemarven. Ved at udtrække knoglemarven, for at sikre, at alle knoglemarven er blevet udvundet, rødmen proceduren skal gentages pr. behov indtil alle knoglemarven er blevet udvundet, som giver et højt udbytte af celler. Denne protokol kan udnyttes i flere downstream programmer, såsom reagens test, og det giver også en måde, hvorved koncentrationen af anti-c-fms antistof kan testes undgå falske fortolkning af resultaterne. Som vi viste, at koncentrationen af anti-c-fms antistof, som var nødvendig for at hæmme osteoklast dannelse er ikke lig blandt metoderne af hvilke osteoklaster blev indhentet (RANKL eller TNF-α), har således nogen resultater, der opnås med hensyn til koncentrationen af anti-c-fms for at blive grundigt undersøgt i fremtidige eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet i en del af en JSPS KAKENHI tilskud fra Japan-samfund til fremme af videnskab (nr. 16K 11776 for at H. K., No. 17K 17306 til K. S., nr. 16K 20637 til K. K., No. 16K 20636 til M. S., nr. 18K 09862 til I. M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-c-Fms antibody AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)
TNF-α Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.
RANKL PEPROTECH 315-11 Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli
M-CSF Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish.
α-MEM Wako with L-Glutamine and phenol red
Fetal Bovine Serum Biowest s1820-500 Fetal Bovine Serum French Origin
Culture dish Corning 100 mm x 20 mm style dish
96-well plate Thermofischer Scientific Nun clon Delta surface
Cell counting kit-8 Dojindo, Kumamoto, Japan
Microplate reader Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan
Cell strainer Corning 40 μm Nylon
Centrifuge tube Corning 50 mL CentriStar cap
Triton X-100 Wako Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).
  2. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289, (5484), 1504-1508 (2000).
  3. Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275, (7), 4858-4864 (2000).
  4. Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191, (2), 275-286 (2000).
  5. Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202, (5), 589-595 (2005).
  6. Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110, (10), 1419-1427 (2002).
  7. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100, (6), 1557-1565 (1997).
  8. Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
  9. Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115, (12), 3418-3427 (2005).
  10. Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64, (2), 219-227 (2012).
  11. Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20, (3), 319-324 (2014).
  12. Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79, (5), 835-841 (2009).
  13. Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87, (4), 396-400 (2008).
  14. Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196, (12), 5047-5055 (2016).
  15. Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13, (18), 2412-2424 (1999).
  16. Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, (12), 4828-4832 (1990).
  17. Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65, (12), 1671-1672 (2006).
  18. Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27, (4), 894-899 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics