Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung und Verbreitung von Osteoklasten-Vorläufer In-vitro-

Immunology and Infection

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Summary

Dieses Protokoll enthält Dissektion der murinen langen Knochen und Knochenmark isoliert, Knochenmark Makrophagen zu generieren und produzieren Osteoklasten mit Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL) oder Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) und ihre Verhaftung durch Anti-c-Fms Antikörper, M-CSF Rezeptor.

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Marahleh, A., Kitaura, H., Ishida, M., Shima, K., Kishikawa, A., Ogawa, S., Shen, W. R., Qi, J., Ohori, F., Noguchi, T., Nara, Y., Mizoguchi, I. Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e59089, doi:10.3791/59089 (2019).

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Abstract

Knochenaufbau ist ein komplexer Prozess, und es handelt sich um Zeiträume von Ablagerung und Resorption. Knochenabbau ist ein Prozess, durch den Knochen durch Osteoklasten in Reaktion auf verschiedene Reize abgebaut wird. Osteoklasten-Vorläufer differenzieren Multikern Osteoklasten in Reaktion auf Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL). Unter pathologischen Bedingungen das Zytokin-Profil ist anders und beinhaltet eine Mischung von inflammatorischen Zytokinen. Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) ist eines der wichtigsten Zytokine wie es in großen Mengen in den Bereichen mit entzündlichen Osteolyse gefunden wird. Der Zweck dieses Protokolls ist, ein Verfahren bereitzustellen, mit denen murinen Knochenmark isoliert ist, um Osteoklasten durch Induktion mit M-CSF und RANKL oder TNF-α, anschließend gehemmt wird, durch steigende Dosen des Antikörpers Anti-c-Fms, den Rezeptor, zu generieren für M-CSF. Dieses Experiment zeigt den therapeutischen Wert des Antikörpers Anti-c-Fms bei Erkrankungen des entzündliche Knochenabbau.

Introduction

Osteoklasten sind hoch spezialisierte Zellen, und sie unterscheiden von hämatopoetischen Stammzellen durch die Verschmelzung von mehreren Osteoklasten-Vorläufer. Sie sind unerlässlich für gesunden Knochenaufbau und tragen zur pathologischen Knochenabbau osteolytischen Entzündungskrankheiten wie rheumatoide Arthritis und Parodontitis1zugeordnet.

Osteoclastogenesis und Osteoklasten Funktion sind durch zwei Schlüsselfaktoren vermittelt; Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL). M-CSF und RANKL sind wichtig für die Osteoklasten Differenzierung2. Ein weiterer Faktor, das gezeigt worden ist, induzieren Osteoklasten-Formation von in-vitro-Knochenmark Makrophagen ist Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α)3,4,5. TNF-α vermittelten Osteoklasten Bildung kritisch für Osteolyse in destruktiver Knochenerkrankungen wie rheumatoider Arthritis6, Parodontitis7und postmenopausalen Osteoporose8gezeigt wurde.

C-Fms ist die Membran-Rezeptor von M-CSF und vermittelt seine Wirkung. Die Rolle des c-Fms ist in der Literatur gut dokumentiert, wie nachgewiesen wurde, dass die Verwaltung eines Antikörpers gegen c-Fms (Antikörper Anti-c-Fms) komplett verhaftet Osteoclastogenesis in einem Modell Arthritis sowie in TNF-α induzierte Knochen Erosionen während Osteoclastogenesis entfernte aus dem entzündeten Gelenk war noch robuste9. Verwaltung von Anti-c-Fms Antikörper gehemmt Osteoklasten Bildung und Knochen Resorption induziert durch Lipopolysaccharid (LPS) in Maus Calvariae10 ebenso wie LPS-induzierte Parodontitis Modell11. Darüber hinaus gehemmt Antikörper Anti-c-Fms mechanische stressinduzierte Wurzelresorption während der kieferorthopädischen Zahn Bewegung12sowie kieferorthopädische Zahnbewegungen und Knochenabbau kieferorthopädischen Zahn Bewegung13zugeordnet.

M-CSF wurde berichtet, um andere Funktionen haben, die für die Host-Immunantwort unabdingbar sind. Das Fehlen von M-CSF bei Op/Op-Mäusen mit bakterieller Lungenentzündung führen zur Steigerung der bakteriellen Belastung und bakterielle Verbreitung in der Leber mit hepatischen Nekrose14. M-CSF ist daher wichtig für immunologische Reaktion beim Schutz vor Infektionen.

Diese Studie zeigt die Wirkung der Antikörper Anti-c-Fms auf M-CSF und RANKL oder TNF-α induzierte Osteoklasten Bildung in-vitro- und M-CSF induzierte Proliferation von Osteoklasten-Vorläufer. Dieses Protokoll zeigt die Isolation der murinen Knochenmarkzellen von Röhrenknochen, und die Schritte des Knochenmarks Makrophagen (BMM) generiert, die als Osteoklasten-Vorläufer gelten und induzieren die Differenzierung der BMM in Multikern Osteoklasten durch zwei Methoden; RANKL oder TNF-α. Das Protokoll wird auch die Verhaftung von Osteoclastogenesis bei beiden Methoden mit Anti-c-Fms Antikörper verglichen.

Der Prozess mit dem Knochenmark extrahiert und anschließend zur Erzeugung von Osteoklasten-Vorläufer ist zuverlässig in der Herstellung von großen Mengen des reinen Osteoklasten-Kulturen, die in mehrere downstream-Anwendungen wie Drogentests verwendet werden können. Die Verwendung von RANKL oder TNF-α induzieren Osteoclastogenesis in diesem Protokoll unterscheidet Osteoclastogenesis als physiologische Prozess (RANKL) von Osteoclastogenesis als pathologische Prozess (TNF-α), was wiederum zwei alternative Verfahren führen die Entscheidung ist eine überlegene in Bezug auf die Reagenzien in downstream-Anwendungen verwendet werden. Dieses Protokoll bietet auch eine Methode, mit der wir eine geeignete Konzentration des Antikörpers Anti-c-Fms feststellen können, die für das spätere Studium Knochenabbau und osteolytischen Krankheiten beteiligt sicher verwendet werden kann.

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Protocol

Alle tierischen Verfahren und Pflege der Tiere wurden nach Tohoku Universität Regeln und Vorschriften durchgeführt.

(1) murinen Megalosauridae Dissektion und Handling

  1. Füllen Sie vor Dissektion eine Platte mit etwa 50 mL der α-MEM abhängig von der Größe des Behälters und legen Sie ihn auf Eis. Dies wird als ein Auffangbehälter dienen, bis das Sezieren von allen Knochen abgeschlossen ist. Für diese und die folgenden verwenden Experimente, Sie α-MEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 IU/mL Penicillin G und 100 μg/mL Streptomycin.
  2. C57Bl/6J Maus durch Inhalation einer Überdosierung von 5 % Isofluran einschläfern.
  3. Befestigen Sie die Maus in Rückenlage mit Nadeln durchbohrt die Handflächen und Füße und Spray gründlich mit 70 % Ethanol.
  4. Einen Hautschnitt über sterile Chirurgische Scheren und Pinzetten auf der Ebene der Hüfte zu machen und bis zu den Füßen aussetzen der Muskeln zu verlängern.
  5. Schneiden Sie die Sehne anbringen des Quadrizeps-Muskels und die Sehne anbringen die Kniesehne Muskeln bis auf die Knochen. Ziehen Sie die Muskeln, die Freilegung der Hüft-und Kniegelenke. Diese sehnen Ortung erleichtert beide Muskeln aus ihren Anlagen ohne Weichgewebe Tags zu befreien. Schneiden Sie nicht in den Knochen.
  6. Positionieren Sie die Schere zwischen dem Kopf des Oberschenkelknochens und der Gelenkspalt und schneiden in den Oberschenkelknochen zu befreien, sondern halten die Knochen intakt. Damit wird die Ablösung der Knochen ohne das Risiko der Freilegung des Knochenmarks.
  7. Ähnlich schneiden Sie die Muskeln an der Tibia anbringen. Schneiden der Tibia frei von seiner Anhaftung an das Sprunggelenk Knochen zur Vermeidung von Kontaminationen intakt zu halten.
  8. Kratzen Sie alle verbleibenden Weichgewebe aus dem Femur und Tibia mit der Schere Messer und Windex und legen Sie sie in einen Teller mit α-MEM auf Eis gelegt.

(2) murinen Megalosauridae Knochenmark isoliert

  1. Füllen Sie eine 30 G Nadel Spritze mit α-MEM.
  2. Trennen Sie die Tibia und Femur entfernt das Kniegelenk.
  3. Schneiden Sie die Enden der langen Knochen von beiden Seiten mit einer Schere.
  4. Halten Sie die Knochen von der Welle mit einer Pinzette, stechen Sie die Nadel in den Knochenmark-Raum des Knochens und spülen Sie langsam den Inhalt des Knochenmarks in der Kulturschale 6 cm. Der Knochen erscheint weiß, die Gewinnung von Knochenmark Inhalte anzeigt. Wiederholen Sie für alle Knochen.
  5. Belastung der Knochenmark-Extrakt mit einem 40 µm Nylon Zelle Sieb in eine konische Zentrifugenröhrchen 50 mL und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min.
  6. Den Überstand verwerfen, waschen mit 5 mL der α-MEM und Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min. wiederholen Wash für insgesamt 2 Mal.
  7. Aufschwemmen Sie das Pellet in 10 mL von α-MEM und führen Sie eine Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer wie folgt:
    1. Machen Sie eine 1:1 Verdünnung der Zellsuspension durch Zugabe von 10 μl Zellsuspension auf 10 μL von 0,4 % Trypan blau in einem 1,5 mL Röhrchen und pipette einmal.
    2. Die Hemocytometer Kammer mit einer Schiebeabdeckung abdecken und die Farbstoff-Suspension auf die Hemocytometer übertragen. Es ist wichtig, nicht zu überfüllen oder underfill Kammer und erlauben die Aussetzung, die Kammer durch Kapillarwirkung zu füllen.
    3. Legen Sie die Hemocytometer auf einen Mikroskoptisch. Mit 10 X-Objektiv, konzentrieren Sie sich auf das mittlere Quadrat. Zählen Sie alle Zellen von 3 Zeilen gebunden. Um sicherzustellen, dass Zellen nicht zweimal gezählt werden, zählen Sie die oberen und rechten Ecken jedes Quadrats. Abgestorbenen Zellen erscheint dunkelblau, diese sind von der Zählung ausgeschlossen.
  8. Abhängig von der nachgeschalteten Anwendung Samen der Zellen in einem entsprechenden Kulturgefäß. Folgen Sie für dieses besondere Experiment Abschnitt 3.

3. Generation der BMM

  1. Samen 1 x 107 Zellen/10 mL in ein 10 cm Kultur Schüssel und fügen Sie M-CSF 100 ng/mL. Die Endkonzentration von M-CSF ist 100 ng/mL Kulturmedium. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C, 5 % CO2 für 3 Tage.
  2. Nach 3 Tagen das Kulturmedium zu entfernen, die Zellen kräftig mit 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zweimal, nicht anhaftende Zellen zu entfernen, fügen Sie 5 mL Raumtemperatur 0,02 % Trypsin-EDTA in PBS waschen und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 5 min.
  3. Lösen Sie die Zellen, indem gründliche pipettieren. Stellen Sie sicher, dass die Zellen getrennt wurde, durch die Beobachtung der Kultur unter dem Mikroskop (die Zellen sollte abgerundete und schwebend in den Medien erscheinen). Wenn die Zellen nicht wegziehen lassen, wiederholen Sie pipettieren gründlich um sie zu lösen. Wenn die Zellen getrennt haben, fügen Sie 5 mL α-MEM, die Reaktion zu inaktivieren.
  4. Sammeln Sie die Zellen in ein 50 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. überstand verwerfen, und waschen Sie mit 5 mL der α-MEM.
  5. 300 X g für 5 min Zentrifugieren und das Pellet in 10 mL von α-MEM aufzuwirbeln.
  6. Führen Sie eine Zellzahl im Schritt 2.7.1 wie zuvor beschrieben.
  7. Samen 1 x 106 Zellen/10 mL in ein 10 cm Kultur Schüssel und fügen Sie M-CSF 100 ng/mL. Die Endkonzentration von M-CSF ist 100 ng/mL Kulturmedium. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C, 5 % CO2 für 3 Tage.

4. Generation von Osteoklasten von BMM als Osteoklasten-Vorläufer

  1. Ernten Sie nach 3 Tagen die angeschlossenen Zellen, die Osteoklasten-Vorläufer, folgende Schritte 3.2-3.7 BMM darstellen.
  2. Samen BMM auf 5 x 104 Zellen/200 μL der α-MEM in eine 96-well-Platte. Fügen Sie RANKL für eine Endkonzentration von 50 ng/mL oder TNF-α für eine Endkonzentration von 100 ng/mL. Geben Sie in jede M-CSF für eine Endkonzentration von 100 ng/mL.
  3. Fügen Sie Anti-c-Fms-Antikörper (Endkonzentrationen von 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) in jede Vertiefung.
  4. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 4 Tage. Medien täglich für 4 Tage zu wechseln.

5. Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) Fleck

  1. Aspirieren Sie nach 4 Tagen Inkubation sanft das Kulturmedium von jedem Bohrloch. Waschen Sie nun einmal mit 200 μL der Raumtemperatur 1 X PBS.
  2. Fügen Sie 200 μl 10 % Formalin in jede Vertiefung zur Fixierung und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie der Formalin und waschen Sie jeweils gut 3 Mal mit entionisiertem Wasser.
  3. Fügen Sie 200 μL von 0,2 % Triton x-100 mit PBS-Puffer zu jedem gut für Permeabilisierung und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie der Triton x-100 und waschen Sie jeweils gut 3 Mal mit entionisiertem Wasser.
  4. Fügen Sie 200 μL der TRAP-Fleck-Lösung in jede Vertiefung. Visualisieren Sie den Fleck unter dem Mikroskop. Es dauert 10-30 min für den Fleck richtig entwickeln.
  5. Aspirieren Sie den Fleck und waschen jeweils gut mit entionisiertem Wasser 3mal, und an der Luft trocknen. Halten Sie bei Raumtemperatur, in weitere Beobachtungen zu verwenden.

6. Verbreitung Assay

  1. Samen BMM als Osteoklasten-Vorläufer auf 5 x 103 Zellen/200 μL der α-MEM in eine 96-well-Platte. Geben Sie in jede M-CSF für eine Endkonzentration von 100 ng/mL.
  2. Fügen Sie Anti-c-Fms-Antikörper (Endkonzentrationen von 0, 1, 10, 100, 1.000 ng/mL) und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 3 Tage ohne mittlere Änderung.
  3. Nach 3 Tagen Waschen der Zellen mit 1 X PBS. Geben Sie in jedes 100 μL der α-MEM.
  4. Hinzufügen von 10 μL der Zelle zählen Kit Lösung und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 2 h und bestimmen die Extinktion von jedem Bohrloch bei 450 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.

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Representative Results

Dieses Protokoll dient zur Bewertung der Wirkung der Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung in Gegenwart von RANKL oder TNF-α und die Wirkung von M-CSF auf Osteoklasten-Vorläufer-Verbreitung zu bestimmen. In diesem Protokoll haben wir einen zuverlässigen Prozess bereitgestellt, mit dem große Mengen von reinem Osteoklasten Kulturen entstehen. Wir haben auch eine Möglichkeit, Anti-c-Fms Antikörperkonzentration geeignet für Hemmung der Osteoklasten Formation unter verschiedenen Kulturbedingungen zu testen zur Verfügung gestellt.

Die Osteoklasten Bildung in M-CSF + RANKL Kultur mit Anti-c-Fms-Antikörper ist in Abbildung 1dargestellt. Bei 1 10 ng/mL Anti-c-Fms Antikörper, gab es keine signifikante Abnahme der Zahl der Osteoklasten im Vergleich zur Kontrolle (0 ng/mL). Während bei 100, 1.000 ng Anti-c-Fms Antikörper, gab es ein deutlichen Rückgang der Zahl der Osteoklasten im Vergleich zur Kontrolle. Die Osteoklasten Bildung in M-CSF + TNF-α-Kultur mit Anti-c-Fms-Antikörper ist in Abbildung 2dargestellt. Zu 1 ng/mL Anti-c-Fms Antikörper gab es keine signifikante Abnahme der Zahl der Osteoklasten im Vergleich zur Kontrolle (0 ng/mL). Bei 10, 100, 1.000 ng/mL Anti-c-Fms Antikörper, gab es ein deutlichen Rückgang der Zahl der Osteoklasten im Vergleich zur Kontrolle.

Osteoklasten-Vorläufer-Kultur mit M-CSF + Anti-c-Fms Antikörper ist in Abbildung 3dargestellt. Bei 1, 10, 100 ng/mL, gab es keine signifikante Abnahme der Zahl der Osteoklasten-Vorläufer im Vergleich zur Kontrolle (0 ng/mL), während bei 1.000 ng/mL, gab es ein deutlichen Rückgang der Zahl der Osteoklasten-Vorläufer im Vergleich zur Kontrolle. Dies bedeutet, dass eine Konzentration so hoch wie 1.000 ng/mL benötigt wird, um die Verbreitung von Osteoklasten-Vorläufer deutlich hemmen.

Diese Ergebnisse liefern Informationen über die Robustheit von RANKL in der Herstellung von Osteoklasten, während eine Konzentration von 50 ng/mL RANKL verwendet wurde, und eine Konzentration von 100 ng/mL TNF-α nötig war, um die gleiche Anzahl von Osteoklasten zu erhalten. Beide Methoden eignen sich für Osteoklasten Generation aber die Entscheidung ist überlegen hängt von der nachgeschalteten Anwendung im Rahmen der Reagenzien für die spätere Verwendung. Die Ergebnisse zeigen, entspricht mit RANKL nicht mit TNF-α um Osteoklasten zu erzeugen.

In diesem Protokoll wir Anti-c-Fms Antikörper Osteoclastogenesis hemmen, und mit Blick auf die Ergebnisse, finden wir, dass eine Konzentration von 100 ng/mL Anti-c-Fms Antikörper nötig war, um signifikante Abnahme in Osteoklasten Zahl in RANKL Brunnen zu produzieren. Eine Konzentration von 1.000 ng/mL Anti-c-Fms Antikörper war nötig, um die Osteoklasten Vorläufer Verbreitung in MCSF Verbreitung Assay zu hemmen, während eine Konzentration von nur 10 ng/mL Anti-c-Fms Antikörper nötig war, um signifikante Abnahme der Osteoklasten produzieren Nummer im TNF-α-Brunnen.

Figure 1
Abbildung 1: Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten RANKL-induzierte Bildung. Mikroskopische Beobachtung der Osteoklasten-Vorläufer, die mit M-CSF, RANKL und verschiedenen Dosis des Anti-c-Fms Antikörper behandelt wurden (0, 1, 10, 100 und 1000 ng/mL) für 4 Tage. Zellen wurden fixiert und gefärbt mit TRAP Färbung. Anzahl der TRAP-positiven Zellen kultiviert mit M-CSF, RANKL und verschiedenen Konzentrationen der Antikörper Anti-c-Fms (0, 1, 10, 100 und 1000 ng/mL) für 4 Tage. Zellen wurden fixiert und gefärbt mit TRAP Färbung. Die Anzahl der TRAP-positiven Zellen wurde bewertet. Ergebnisse wurden als Mittelwert ± S.D. der vier Kulturen. Statistische Unterschiede mithilfe Scheffes Tests erkannt wurden (n = 4; * p < 0,01). Skalieren von Balken = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf TNF-α-induzierte Osteoklasten Bildung. Mikroskopische Beobachtung der Osteoklasten-Vorläufer, die mit M-CSF, TNF-α und verschiedenen Dosis des Anti-c-Fms Antikörper behandelt wurden (0, 1, 10, 100 und 1000 ng/mL) für 4 Tage. Zellen wurden fixiert und gefärbt mit TRAP Färbung. Anzahl der TRAP-positiven Zellen kultiviert mit M-CSF, TNF-α und verschiedenen Konzentrationen der Antikörper Anti-c-Fms (0, 1, 10, 100 und 1000 ng/mL) für 4 Tage. Zellen wurden fixiert und gefärbt mit TRAP Färbung. Die Anzahl der TRAP-positiven Zellen wurde bewertet. Ergebnisse wurden als Meanv ± S.D. der vier Kulturen. Statistische Unterschiede mithilfe Scheffes Tests erkannt wurden (n = 4; * p < 0,01). Skalieren von Balken = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf Verbreitung von Osteoklasten-Vorläufer. Handy-Lebensfähigkeit der Osteoklasten-Vorläufer, die mit M-CSF behandelt wurden und verschiedene Dosis des Antikörpers Anti-c-Fms (0, 1, 10, 100 und 1000 ng/mL) für 3 Tage. Zelle zählen Kit-8 wurde verwendet, um Rentabilität zu messen. Daten werden als Prozentsatz auf die relative Aktivität der Brunnen mit M-CSF vergleichen vorgestellt + Anti-c-Fms im Vergleich zu den Brunnen mit M-CSF allein und als ausgedrückt bedeuten ± S.D. der vier Kulturen. Statistische Unterschiede mithilfe Scheffes Tests erkannt wurden (n = 4; * p < 0,01). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung des Antikörpers Anti-c-Fms auf Osteoklasten RANKL-induzierte Bildung, Bildung von TNF-α-induzierte Osteoklasten und M-CSF-induzierte Osteoklasten Vorläufer Verbreitung. Wir fanden, dass die wirksame Menge des Antikörpers Anti-c-Fms für die Hemmung des Osteoclastogenesis zwischen Osteoklasten RANKL-induzierte Bildung, TNF-α induzierte Osteoklasten Bildung und M-CSF-induzierte Proliferation von Osteoklasten-Vorläufer unterscheidet.

RANKL vermittelt Osteoclastogenesis in Anwesenheit von in-vitro-M-CSF und Rang Null Mäuse erleben schwere Osteopetrose aufgrund des Ausfalls von Osteoklasten zu15, so RANKL ist eine obligatorische Zytokin für Osteoclastogenesis und hat eine wichtige regulatorische Rolle im Knochen Homöostase. Daher, wenn RANKL-induzierte Osteoklasten Bildung gesteuert werden kann, die Abnahme in den Knochen Masse gesteuert werden. Wenn übermäßige Unterdrückung auftritt, wird Knochen Homöostase jedoch nicht aufrechterhalten. In diesem Experiment zeigen wir, dass diese Antikörper Anti-c-Fms muss auf hohe Konzentration 100 ng/mL zu Osteoklasten Bildung von RANKL induziert verringern können.

TNF-α vermittelten Osteoklasten Bildung nachgewiesen wurde, kritisch für Osteolyse in destruktiven Knochenerkrankungen wie rheumatoider Arthritis6, Parodontitis7und postmenopausalen Osteoporose8 und hier zeigen wir, dass Anti-c-fms Antikörper kann leicht Osteoklasten Bildung vermittelt durch TNF-α in einer niedrigen Konzentration von 10 ng/mL hemmen. Das Ergebnis legt nahe, dass eine niedrige Konzentration von Anti-c-Fms Antikörper des therapeutischen Nutzens, den Prozess der Osteoclastogenesis unter pathologischen Bedingungen zu verringern aber nur minimale Auswirkungen auf Osteoclastogenesis unter normalen Bedingungen hätte.

M-CSF ist ein Schlüsselfaktor für die Osteoklasten Bildung als die Op/Op-Mäuse, die Csf1 fehlt das Gen Kodierung für M-CSF zeigen einen Osteopetrotic Phänotypus durch völlige Fehlen von Osteoklasten16. M-CSF fördert auch das Überleben der Osteoklasten-Vorläufer-2. M-CSF sind erhöht im Serum von Patienten mit rheumatoider Arthritis, die schweren Morbus Bechterew17 und in der Gelenkflüssigkeit um lose Gelenkprothese18. TNF-α erhöht die Anzahl der Osteoklasten Vorstufen in Vivo durch Induktion M-CSF Genexpression in Stromazellen Zellen9. Anhand dieser Daten können wir feststellen, dass M-CSF ist ein wichtiger Vermittler der Entzündung aufgrund der Auswirkungen der TNF-α auf Stromazellen Zellen verursacht eine Zunahme in der M-CSF Produktion aus diesen Zellen.

Es wurde berichtet, dass M-CSF eine wichtige Rolle im Host Immunantwort z. B. antimikrobiellen Funktionen der Lunge und der Leber mononukleären Phagozyten bei Lungenentzündung14 spielt. Daher, wenn übermäßige Unterdrückung von M-CSF auftritt, besteht die Möglichkeit, die die Immunantwort verringern wird. In diesem Experiment haben wir gezeigt, dass eine sehr hohe Konzentration des Antikörpers Anti-c-Fms (1.000 ng/mL) nötig war, um die Osteoklasten Vorstufen überleben und Verbreitung von M-CSF vermittelt hemmen. Diese Ergebnisse nebeneinander deuten darauf hin, dass diese Antikörper Anti-c-Fms arbeiten kann, wie eine therapeutische, Osteoclastogenesis in TNF-α zu verhaften osteolytischen Krankheiten bei niedrigen Konzentration bei gleichzeitiger induziert, die diese Konzentration Osteoklasten Bildung durch induzierte scheuen wird RANKL und M-CSF, die Knochen Umbau auftreten ermöglichen.

Wichtige Schritte im Protokoll müssen sorgfältig durchgeführt werden, um den Erfolg des Experiments zu gewährleisten. Am Anfang des Protokolls beim sezieren ist es wichtig, schneiden in den Knochen zur Vermeidung von Kontaminationen des Knochenmarks zu vermeiden. In den Prozess der Gewinnung von Knochenmark, um sicherzustellen, dass alle Knochenmark extrahiert wurden, den Spülvorgang wiederholt sich pro benötigt, bis alle Knochenmark extrahiert wurden, wird eine hohe Ausbeute an Zellen bieten. Dieses Protokoll kann genutzt werden, in mehreren downstream-Anwendungen, wie z. B. Reagenz zu testen, und es bietet auch eine Möglichkeit, die Konzentration der Antikörper Anti-c-Fms getestet werden kann, falsche Interpretation der Ergebnisse zu vermeiden. Wie wir gezeigt haben, ist die Konzentration von Anti-c-Fms-Antikörper, welcher nötig war, um die Bildung von Osteoklasten hemmen ungleich unter den Methoden durch die Osteoklasten (RANKL oder TNF-α) gewonnen wurden, haben somit Ergebnisse in Bezug auf die Konzentration des Anti-c-Fms um genau zu sein untersucht in Zukunft Experimenten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise durch eine JSPS KAKENHI unterstützt von der Japan Society for Promotion of Science (Nr. 16K 11776, H. K., Nr. 17K 17306, K. S., Nr. 16K 20637 K. K., Nr. 16K 20636, M. S., Nr. 18K 09862 I. m.) zu gewähren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-c-Fms antibody AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)
TNF-α Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.
RANKL PEPROTECH 315-11 Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli
M-CSF Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish.
α-MEM Wako with L-Glutamine and phenol red
Fetal Bovine Serum Biowest s1820-500 Fetal Bovine Serum French Origin
Culture dish Corning 100 mm x 20 mm style dish
96-well plate Thermofischer Scientific Nun clon Delta surface
Cell counting kit-8 Dojindo, Kumamoto, Japan
Microplate reader Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan
Cell strainer Corning 40 μm Nylon
Centrifuge tube Corning 50 mL CentriStar cap
Triton X-100 Wako Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether

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References

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