الامتصاص من جديد جسيمات نانوية المغلفة بالدهون التي تحتوي على فالكارينديول بالخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

توضح هذه المقالة تغليف فالكارينديول في المغلفة بالدهن 74 نانومتر جسيمات نانوية. ويرصد على الإقبال جسيمات نانوية من الخلايا الجذعية البشرية إلى قطيرات الدهن الخلوية التصوير الفلورسنت و [كنفوكل]. جسيمات نانوية ملفقة بطريقة الحقن السريع للمذيبات التحول، ويقاس حجمها مع تقنية تشتت الضوء الحيوي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pipó-Ollé, E., Walke, P., Notabi, M. K., El-Houri, R. B., Østergaard Andersen, M., Needham, D., Arnspang, E. C. Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (144), e59094, doi:10.3791/59094 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

جسيمات نانوية هي محط اهتمام متزايد في أنظمة توصيل العقاقير لعلاج السرطان. جسيمات نانوية المغلفة بالدهن هي مستوحاة في هيكل وحجم من البروتينات الدهنية low-density (LDLs) لأن الخلايا السرطانية بحاجة متزايدة الكولسترول آخذة في الانتشار، وهذا تم استغلاله كآلية لإيصال الأدوية السرطان بالسرطان الخلايا. وعلاوة على ذلك، تبعاً لكيمياء العقاقير، تغليف المخدرات يمكن أن تكون مفيدة لتجنب تدهور للمخدرات خلال الدورة الدموية المجراة. ولذلك، في هذه الدراسة، يستخدم هذا التصميم اختﻻق جسيمات نانوية المغلفة بالدهن من فالكارينديول المخدرات السرطان، توفير نظام التسليم جديدة محتملة فالكارينديول من أجل استقرار هيكلها الكيميائية ضد التدهور وتحسين به الامتصاص بالأورام. جسيمات نانوية فالكارينديول، مع أحادي الطبقة فسفوليبيد والكولسترول، تغليف المخدرات المنقي جوهر الجسيمات، وقد صممت. يتكون الطلاء أحادي الطبقة الدهنية 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (دسبك)، ونسبة الكولسترول في الدم (شول) و 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (دسب شماعة 2000) جنبا إلى جنب مع فلوري التسمية دي (نسب المولى من 43:50:5:2). ملفقة جسيمات نانوية استخدام أسلوب الحقن السريع، وتقنية سريعة وبسيطة يعجل جسيمات نانوية بواسطة مذيب جيد للمذيبات المضادة تبادل. وهو يتألف من حقنه السريع محلول الإيثانول التي تحتوي على مكونات نانوحبيبات إلى مرحلة مائي. ويقاس حجم جسيمات نانوية الفلورية استخدام تشتت الضوء الحيوي (DLS) في شمال البحر الأبيض المتوسط ± 6.7 74.1. يتم اختبار الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة (همسكس) على الإقبال جسيمات نانوية وتصويرها باستخدام الأسفار والفحص المجهري [كنفوكل]. ويلاحظ على الإقبال جسيمات نانوية في همسكس، مما يوحي باحتمال هذه المخدرات مستقر نظام توصيل فالكارينديول.

Introduction

جسيمات نانوية المغلفة بدهن نشهد اهتماما متزايداً فيما يتعلق بوظيفتها كنظم إيصال العقاقير ل علاج السرطان1. السرطان قد غيرت إعادة برمجة دهن الأيض2 وازدياد حاجة الكولسترول تنتشر3. أوفيريكسبريس LDLs1 ، وتأخذ في LDLs أكثر من الخلايا الطبيعية، بقدر ما عد LDL مريض السرطان يمكن أن تنخفض حتى4. ويعزز امتصاص LDL تعمل العدوانية5 مما أدى إلى انتشار وغزو في سرطان الثدي6. وفرة مستقبلات LDL (لدلرس) مؤشر تنبؤاتها المحتملة النقيلي7. مستوحاة من LDL وفي امتصاص الخلايا السرطانية، تم وضع استراتيجية جديدة تسمى: جعل المخدرات تبدو مثل الأغذية السرطان8. وهكذا، هذه نانوحبيبات المخدرات تسليم التصاميم الجديدة8،،من910 ولقد استلهمت التصميم الأساسية والدهن استقرت LDLs الطبيعية11 كآلية لإيصال الأدوية السرطان للخلايا السرطانية. وتؤيد هذا السلبي استهداف نظام التسليم تغليف، لا سيما، المخدرات مسعور، والتي ترد عادة في شكل الجرعة الفموية ولكن توفر فقط كمية صغيرة من المخدرات إلى مجرى الدم، حتى تحد من فعالية المتوقعة على12. كما مع الشبح الدهنية13، طلاء البولي إثيلين غليكول (شماعة) يساعد على تقليل أي استجابة مناعية ويمتد التداول في مجرى الدم لامتصاص الورم الأمثل بالمفترض تعزيز تخلل وأثر الاحتفاظ (EPR) 14 , 15-ومع ذلك، بالإضافة إلى في بعض الحالات، وعدم الاستقرار في التداول والتوزيع غير المرغوب فيها في نظام16، بعض العقبات التي تظل دون حل، مثل كيف وإلى أي مدى هذه الجسيمات النانوية هي اتخذتها الخلايا، وما هو مصيرهم داخل الخلايا. ومن هنا أن تتناول هذه الورقة استيعاب نانوحبيبات خاصة المخدرات السرطان مسعور فالكارينديول واستخدام [كنفوكل] وتقنيات التصوير ابيفلوريسسينسي.

الهدف من هذه الدراسة هو اختﻻق جسيمات نانوية المغلفة بالدهن من فالكارينديول ودراسة عن امتصاص داخل الخلايا في همسكس. وبالتالي، يحتمل أن استقرار إدارته، والتغلب على التحديات المرتبطة بإيصال وتحسين التوافر الأحيائي. ومن ثم تقييم نظام توصيل جديد لهذه المخدرات السرطان. سابقا، فالكارينديول قد تم تدار شفويا عن طريق فالكارينديول تركيز عال تنقيته ك تكملة أغذية17. ومع ذلك، هناك الحاجة إلى اتباع نهج أكثر تنظيماً لتقديم هذا الدواء تبشر بالخير. لذلك، صممت جسيمات نانوية فالكارينديول، مع فسفوليبيد وتغليف أحادي الطبقة مع تنقية المخدرات التي تشكل جوهر الجسيمات، نسبة الكولسترول في الدم. أسلوب الحقن السريع للمذيبات التحول، وضعتها مؤخرا نيدام et al. 8، يستخدم في هذه الدراسة لتغليف فالكارينديول بولياسيتيليني.

الأسلوب قد استخدمت سابقا لتصنيع جسيمات نانوية الدهن لتغليف18،وكلاء التصوير التشخيصي19، فضلا عن اختبار جزيئات (تريولين)27 والمخدرات (orlistat، ستيرات niclosamide)8 ،،من2728. وأسلوب بسيط نسبيا عندما تنفذ بالجزيئات الصحيحة. أشكال الجسيمات نانوسيزيد، في حدود على التنو الحرجة (~ 20 نانومتر القطر)، غير قابلة للذوبان العالية الذوائب مسعور المذابة في المذيبات قطبية. يتم إنجاز تبادل المذيبات بحقنه سريع للحل الأساسي في وجود فائض أنتيسولفينت (عادة، مرحلة مائي في عضوية 1:9: نسبة حجم مائي)20،21.

تصميم التركيبية جسيمات نانوية تؤدي إلى مزايا متعددة. توفر مكونات DSPC:Chol أحادي الطبقة جداً ضيق وتقريبا كتيمة ومتوافق حيويا والقابلة للتحلل. شماعة يوفر واجهة ستيريكالي استقرار الذي يعمل كدرع من أوبسونيزاتيون بالنظام المناعي، وإبطاء امتصاص أي نظام شبكي (الكبد والطحال) وحماية ضد النظام بلعمية وحيدات النوى، ومنع ما استبقاء وتدهور بنظام المناعة، ومن ثم زيادة تداولها نصف الوقت في الدم22. وهذا يسمح للجزيئات أن يعمم حتى أنهم اكسترافاساتي في مواقع المريضة، مثل الأورام، وحيث أن نظام الأوعية الدموية راشح، السماح للجيش الثوري الشعبي-تأثير أن تؤدي إلى تراكم سلبي للجسيمات. بالإضافة إلى ذلك، يسمح معطف الدهن واحد لتحسين السيطرة على حجم جسيمات نانوية بمحاصرة كينيتيكالي الأساسية في27،البعد نواة الحرجة في28. حمل الدهون الخصائص السطحية المختلفة (بما في ذلك الببتيد الاستهداف، التي لم تكن متاحة لهذا المشروع) ونواة المخدرات نقية و27،22،بوليديسبيرسيتي انخفاض28. الطريقة المستخدمة لتحليل حجم الجسيمات من دائرة الأراضي والمساحة، أسلوب الذي يسمح للباحثين لقياس حجم عدد كبير من الجسيمات في نفس الوقت. ومع ذلك، هذا الأسلوب يمكن التحيز القياسات لأحجام أكبر، إذا لم تكن جسيمات نانوية مونوديسبيرسيد23. ويتم تقييم هذه المسألة مع معطف الدهن كذلك. تعطي مزيدا من التفاصيل عن هذه التصاميم الأساسية والتحديد الكمي لكل الخصائص في سائر المنشورات27،28.

المخدرات مغلفة بجسيمات نانوية فالكارينديول، polyacetylene غذائية الموجودة في النباتات من عائلة خيمية. وهو المستقلب ثانوية من نوع بولياسيتيلينيس17ج الاليفاتيه التي تم العثور عليها لعرض آثار تعزيز الصحة، بما في ذلك الأنشطة المضادة للالتهابات والآثار المضادة للبكتيريا سيتوتوكسيسيتي ضد طائفة واسعة من خطوط خلايا السرطان. تفاعلية عالية تتصل بقدرتها على التفاعل مع الجزيئات الحيوية المختلفة، بوصفها عامل الكيلاتينج جداً من رد الفعل ضد ميركاتو والمجموعات الأمينية24. فالكارينديول سابقا قد ثبت للحد من عدد الآفات الورمية في القولون17،25، على الرغم من أن الآليات البيولوجية التي لا تزال غير معروفة. بيد أن من يعتقد أن يتفاعل مع الجزيئات الحيوية مثل NF-κB، COX1، كوكس-2، ونشدد على السيتوكينات، التي تحول دون ورم الخلية وتطور انتشار عملياتها، مما أدى إلى اعتقال خلية دورة، هيولى (ER)، والمبرمج 17،26 في الخلايا السرطانية. ويستخدم فالكارينديول في هذه الدراسة كما مثال المخدرات السرطان بسبب إمكاناتها السرطان وآلية هي قيد الدراسة حاليا، ونظرا لأنه يظهر آثار السرطان واعدة. يتم اختبار في همسكس على الإقبال جسيمات نانوية الهاتف الخلوي وتصويرها باستخدام ابيفلوريسسينسي والفحص المجهري [كنفوكل]. واختير هذا النوع الخلية بسبب كبر حجمها، يجعلها مثالية للفحص المجهري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-نانوحبيبات التوليف بالمذيبات السريعة التحول تقنية

  1. قم بإعداد الإجراءات التالية لإعداد جسيمات نانوية: مركز سخان/عينة كتلة، مجفف، الاستغناء عن نظام رقمي مع حقنه زجاجية 1 مل، قنينة زجاج 12 مل، محرض مغناطيسي، برغوث مغناطيسي (15 ملم × 4.5 ملم، في شكل أسطواني مع طلاء تترافلوروايثيلين [PTFE]) داخل القنينة الزجاجية، ومبخر الدنمارك.
  2. الاستغناء عن 2.4 مل من 250 ميكرون فالكارينديول الأسهم حله في 70% EtOH المياه الخليط في قنينة التﻷلؤ.
  3. تتبخر الكسر السائل، استخدام مركزات عينة لما يقرب من 4 ح، للحصول على فالكارينديول الجافة.
    1. إدراج القنينة التﻷلؤ في سخان كتلة؛ يسلم مركزات عينة الغاز على العينة باستخدام الإبر الفولاذ المقاوم للصدأ، والتركيز العينة. تتبخر في درجة حرارة الغرفة؛ يجب عدم استخدام الحرارة.
  4. مرة واحدة المجففة، أضف المكونات التالية للطلاء الدهني في القنينة التﻷلؤ المذكورة أعلاه: ميليلتر 16.3 مم 31.64 دسبك كلوروفورم حل الأسهم، ميليلتر 3.4 ملم 17.82 دسب شماعة 2000 كلوروفورم حل الأسهم، 24 ميليلتر من الأسهم كلوروفورم الكوليسترول 25 مم الحل، وميليلتر 6 من 4 مم دي كلوروفورم حل الأسهم. تنظيف المحاقن مع كلوروفورم بعد إضافة كل مكون لتجنب التلوث المتبادل.
    تنبيه: إغلاق فورا قارورة تحتوي على الدهون حيث أن المذيب لا تتبخر و، وبالتالي تعديل التركيز. ويعمل في غطاء دخان.
    ملاحظة: تركيزات كلوروفورم حلول الأسهم يمكن أن تختلف، تبعاً للمورد الكيميائية أو تخفيف في المختبر.
  5. لف القنينة مع رقائق الألومنيوم لحماية دي من الضوء. اترك العينة بين عشية وضحاها في مجففة تتبخر في كلوروفورم.
  6. إذابة العينة يهتمان في الإيثانول المطلق لوحدة تخزين نهائي 1.2 مل، الذي يعطي تركيزات النهائي دسبك دسب شماعة 2000، نسبة الكولسترول في الدم ودي من 0.43، 0.05 مم، 0.5 مم، و 0.02 ملم، على التوالي. ويمثل هذا الحل في المرحلة العضوية.
  7. تأخذ قنينة زجاج 12 مل وملء مع 9 مل مياه النقية، وإضافة البرغوث المغناطيسي إلى القنينة التي تحتوي على 9 مل من الماء. تبقى القنينة على محرض المغناطيسي، إثارة 500 لفة في الدقيقة (الشكل 1).
  8. إرفاق المحاقن الزجاجية 1 مل إلى الاستغناء عن النظام وتنظيفه مع كلوروفورم لتجنب أي تلوث. وهذا، بسحب كلوروفورم في محقن الزجاج ببطء والاستغناء عن يدوياً إلى تيمز جامع نفايات على الأقل 10.
    تنبيه: يجب أن يكون ذلك تحت غطاء دخان.
  9. رئيس الوزراء المحاقن مع الإيثانول. فتيلة يستبدل المذيب القديمة، فضلا عن إزالة أي فقاعات الهواء.
    تنبيه: يجب أن يكون ذلك تحت غطاء دخان.
  10. استخدام المحاقن، نضح 1 مل المرحلة العضوية.
  11. إدراج المحاقن في القنينة الزجاج، حتى منتصف مائية مل 9، والحفاظ على ثابت في منتصف القنينة (كما هو موضح في الشكل 1).
  12. حقن الحل بسرعة المحدد لحقن (833 ميليلتر/s) بالضغط على زر dispense على الاستغناء عن النظام (الشكل 2). يقوم هذا بإنشاء 10 مل من 50 ميكرومتر المغلفة بدهن جسيمات نانوية من فالكارينديول في المياه التي تحتوي على الإيثانول 10%.
    ملاحظة: تم العثور على هذه السرعة حقن تحقيقا للجسيمات أرقى، الحصول على توزيع حجم جسيمات ضيقة. من المهم التأكد من المحاقن في مركز وثابت، ومباشرة عند الاستغناء عن الحل.
  13. فورا بعد الحقن، إزالة القنينة من محرض ونقل العينة قارورة مستديرة قاع 50 مل (المصرف).
  14. إرفاق المصرف مبخر دوراني وتتبخر 1 مل المذيبات العضوية، باستخدام مبخر دوراني في درجة حرارة الغرفة. تجنب تشكيل فقاعة الزائدة.
    ملاحظة: سيتم اتخاذ هذه الخطوة ~ 5 دقيقة.
  15. نقل تعليق نانوحبيبات من المصرف إلى آخر قنينة زجاج 12 مل. تأكد من أن وحدة التخزين مل 9. تقسيم العينة في قارورة زجاج 12 مل اثنين (وضع 4.5 مل في كل منهما).
  16. إضافة 0.5 مل من الماء عالي النقاوة إلى واحدة من القنينات و 0.5 مل من 10 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) إلى القنينة الأخرى. إخراج 1 مل لكل عينة لقياس حجم الجسيمات.

2-تحليل حجم الجسيمات باستخدام تقنية DLS

ملاحظة: أجريت قياسات الحجم باستخدام محلل DLS الذي يحدد توزيع حجم الجسيمات. وهي مجهزة بليزر 100 ميغاواط التي تعمل في موجه 662.2 شمال البحر الأبيض المتوسط ومع كاشف الضوئي الانهيار جليدي وضعها بزاوية 90 درجة لزاوية الحادث. الشعاع متناثرة جسيمات نانوية والكشف عنها بواسطة فوتوديتيكتور.

  1. قم بتشغيل الأداة DLS وضبط درجة الحرارة المطلوبة عند 20 درجة مئوية، إلى حين أن يستقر.
  2. تعيين معلمات الصك كما يلي: وقت اقتناء البيانات = 4 s، وعدد من المقتنيات = 30، الدالة التلقائي-التوهين =، والحدود الزمنية السيارات-التوهين = 0.
  3. ملء ومبومو البلاستيك مع 1 مل تعليق نانوحبيبات وبدء القياس.
  4. تقرير حجم يقاس تبعاً للمذيبات المستخدمة (الماء أو برنامج تلفزيوني).
    ملاحظة: اعتماد القياس في برنامج تلفزيوني أن فكرة تقريبية عن حجم الخلايا في المتوسط عند علاج الخلايا. وسوف يتم معالجة الخلية مع جسيمات نانوية المذابة في الماء.
  5. تكرار القياسات 24 ساعة بعد التوليف، للتحقق من تجميع الجسيمات.

3-خلية العلاج

  1. ينمو همسكس في المتوسط الأساسية الدنيا (MEM) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين، 1% في دائرة هوميفيد في 37 درجة مئوية مع 5% CO2.
    تنبيه: العمل في "هود الاندفاق الصفحي" العقيمة للخطوات 3.1 و 3.2 و 3.3.
  2. وضع البذور حوالي 50,000 الخلايا للحصول على كثافة خلية حوالي 30 في المائة في السابق المطلق-EtOH-تعقيم كوفيرسليبس #1.5 في لوحات 6-جيدا. إضافة ذاكرة كي يكون وحدة تخزين نهائي 3 مل في كل بئر. احتضانها ح 24 بالشروط نفسها كما في الخطوة 3، 1. بذور الخلايا 24 ساعة قبل العلاج.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان الخلايا هي المصنفة على الأقل 24 ساعة قبل العلاج نانوحبيبات، التأكد من أن الخلايا في التقاء كافية.
  3. دون إزالة المتوسطة، إضافة 3 ميليلتر من الحل نانوحبيبات، لتركيز فالكارينديول نهائي من 5 ميكرومتر. إينكوباتي على 24 ساعة في الظروف نفسها كما في الخطوة 3، 1.
    ملاحظة: أجريت إعداد جسيمات نانوية اليوم لعلاج الخلية، لتجنب تراكم الجسيمات.
  4. وفي وقت لاحق، بعد 24 ساعة علاج، تغسل الخلايا 2 x مع برنامج تلفزيوني، إصلاحها في 4% فورمالدهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لتصل إلى عدة أشهر حتى تصويرها.
    تنبيه: يجب أن يكون ذلك تحت غطاء دخان.
    1. وبدلاً من ذلك، بعد التثبيت، 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) تلطيخ النووية يمكن أن يؤديها. لذلك، بعد تحديد الخلايا، بيرميبيليزي لهم مع 0.1% X-100 تريتون لمدة 30 دقيقة، غسلها x 2 مع برنامج تلفزيوني، ووصمة عار لهم مع 250 ميليلتر من 300 نانومتر DAPI لمدة 5 دقائق، محمية من الضوء.

4-الفحص المجهري

  1. مجهر الأسفار
    1. استخدام مجهر الأسفار ويديفيلد مجهزة بكاميرا CCD ضرب إلكترون للحصول على الصور. استخدام 150 × 1.45 غ النفط الهدف والقناة LP التجارة والنقل.
  2. مجهر [كنفوكل]
    1. الحصول على صور مجهرية [كنفوكل]، باستخدام 63 × 1.4 غ النفط الهدف، ليزر أرجون (514 nm) دي، وليزر اثنين-فوتون (780 نانومتر) ل DAPI، للتأكد من الأخذ جسيمات نانوية داخل الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكانت نوعين مختلفين من جسيمات نانوية جسيمات نانوية فالكارينديول ملفقة، إلا وهي نقية وجسيمات نانوية فالكارينديول المغلفة بالدهن. تم اختبار تركيزات مختلفة من الدهون والكوليسترول في الدم. كما هو مبين في الجدول 1، جسيمات نانوية غير المصقول تشكلت في المياه، ويقاس في برنامج تلفزيوني كان يبلغ قطرها 71 ± 20.3 شمال البحر الأبيض المتوسط مع مؤشر بوليديسبيرسيتي (PDI) 0.571. وقيست تلك المعلمات على محلل دائرة الأراضي والمساحة. جسيمات نانوية المغلفة بالدهن من فالكارينديول المستخدمة في التجارب، وذلك بما في ذلك صبغة الفلورسنت، دي، كانت ذات حجم مماثل، هما 74.1 ± 6.7 نانومتر؛ بيد أنه تبين أن مونوديسبيرسيد نسبيا وقد PDI أقل من 0.182، الذي يشير إلى توزيع أصغر من أحجام الجسيمات، حيث يصف توزيع حجم السكان نانوحبيبات من حزب النضال الديمقراطي الإندونيسي. وبوجه عام، هو المطلوب PDI أدناه 0.3 عند افتعال جسيمات نانوية للأغراض الصيدلانية.

وعقب التلفيق، وتم قياس حجم الجسيمات بعد ح 3 وح 24، مرات استناداً إلى التأخير المطلوبة لإضافة جسيمات نانوية لثقافة الخلية. ولوحظ لا التجميع بعد 24 ساعة، ولكن لا يتم عرض البيانات في هذه المخطوطة كما أنها سترد في دراسة أخرى، ومن المستحسن لاختبار استقرار الجسيمات بعد 24 ساعة. بعد التأكد من استقرار حجم جسيمات نانوية المغلفة بالدهن، جسيمات نانوية المسمى دي، المغلفة بدهن ملفقة باتباع البروتوكول، وفي نهاية المطاف، تستخدم لدراسة الامتصاص. لكل دراسة، تم إعداد عينة نانوحبيبات طازجة. ويرد تخطيطي هيكل جسيمات نانوية فالكارينديول النهائية في الشكل 3، وحجم البيانات الجسيمات بعد تلفيق هو مبين في الجدول 1، فضلا عن قياس أخذ ح 3 بعد تلفيق.

الملاحظة أولى لجسيمات نانوية داخل الخلايا، اقتنى ابيفلوريسسينسي المجهري الصور بعد 24 ساعة علاج. كانت تصور جسيمات نانوية كنقط بيضاء مشرقة، وأنه يمكن أن يكون الافتراض بأن جسيمات نانوية كانت موجودة داخل الخلايا، والمحيطة بالنواة (الشكل 4أ).

للتحقق من أن دخلت جسيمات نانوية فالكارينديول الخلايا، وتم إجراء الفحص المجهري [كنفوكل] على همسكس علاج 24 h. كونفوكال أكدت الصور أن جسيمات نانوية دخلت الخلايا، وعدد كبير من جسيمات نانوية كانت منتشرة في السيتوبلازم في كل خلية (الشكل 4ب-د). تظهر هذه النتائج أن جسيمات نانوية بمثابة نظام إيصال المخدرات مستقرة فالكارينديول.

Figure 1
الشكل 1 : إعداد إعداد جسيمات نانوية عرض الجمعية لحقن تحت إثارة27- الإعداد يتكون من أوتوبيبيتي حقنه زجاجية 1 مل مليئة 1 مل الحل اثانوليك التي تحتوي على مكونات جسيمات نانوية. قنينة زجاجية تحتوي على 9 مل من الماء ويوضع البرغوث المغناطيسية على محرض المغناطيسية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : التخطيطي لخلط المواد المذيبة في أسلوب الحقن السريع للمذيبات تحويل27- لوحات إظهار حقن 1 مل اثانوليك المرحلة التي تحتوي على مكونات جسيمات نانوية بسرعة 833 ميليلتر/s إلى 9 مل من الماء مع التحريك 500 لفة في الدقيقة. الحقن السريع مع خلط الفوضوي لحل اثانوليك التي تحتوي على مكونات جسيمات نانوية (فالكارينديول، دسبك، الكولسترول، شماعة دسب 2000، دي) إلى أنتيسولفينت (المياه)، ليد لتشكيل جسيمات نانوية. وتعطي اللون دي. يمكن أن يلاحظ كيف يتم خلط الحل ethanolic، تتزايد بسرعة تركيزه وجسيمات نانوية تتشكل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : التخطيطي هيكل جسيمات نانوية فالكارينديول النهائية- نانوحبيبات البنية، بما في ذلك دسبك دسبي شماعة 2000 ونسبة الكولسترول في الدم، دي، وفالكارينديول. يتم تحجيم العناصر المختلفة وفقا لتركيزات بهم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : صور من جسيمات نانوية فالكارينديول المغلفة بالدهن في الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية. (أ) صورة مجهرية ابيفلوريسسينسي همسكس تعامل مع جسيمات نانوية فالكارينديول على 24 ساعة. اللوحات التالية تظهر الصور مجهرية [كنفوكل] من همسكس تعامل مع جسيمات نانوية فالكارينديول ل 24 h: (ب) DAPI وصمة النوى، ونوى دي (ج) الجسيمات النانوية، والصور (د) تراكب على حد سواء، وتظهر باللون الأزرق، جسيمات نانوية باللون الأحمر. هي أشرطة مقياس 10 ميكرون. جسيمات نانوية تصور كنقط بيضاء مشرقة في السيتوبلازم الخلية. وتظهر الصور أن عدد كبير من جسيمات نانوية دخلت الخلايا بعد 24 ساعة حضانة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

نوع من جسيمات نانوية المذيبات حجم نانوحبيبات (نيو مكسيكو) بوليديسبيريستي (نيو مكسيكو) فهرس بوليديسبيرسيتي (حزب النضال الديمقراطي الإندونيسي)
فالكارينديول غير مصقول المياه 83.9 ± 23,9 0.571
برنامج تلفزيوني 71 ± 20,3 0.571
المادة الدهنية المغلفة فالكارينديول برنامج تلفزيوني 91.6 ± 6.4 0، 141
برنامج تلفزيوني بعد ح 3 93.5 ± 5.7 0.122
المادة الدهنية المغلفة فالكارينديول + دي برنامج تلفزيوني 74.1 ± 6 و 7 0.182

الجدول 1: تصاميم مختلفة من جسيمات نانوية ملفقة. مؤشر حجم وبوليديسبيرسيتي من جسيمات نانوية فالكارينديول المركبة، تبعاً لنوع المذيب ونانوحبيبات. جسيمات نانوية فالكارينديول مع أو بدون طبقة دهن كانت ملفقة. تم اختبار تركيزات مختلفة من مكونات معطف. تم اختبار تجميع الجسيمات بعد ح 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول مفصل لاختلاق جسيمات نانوية المغلفة بالدهن لإيصال الأدوية مع البسيطة، أسلوب الحقن السريع سريع واستنساخه، وقابلة التحول المذيبات كان يتبع27،في الفترة من28 ويرد في هذه الورقة، كما تطبيق فالكارينديول. التحكم في سرعة حقن المرحلة العضوية في المرحلة المائية واستخدام الطلاء الدهون بتركيزات مناسبة لمعطف الأساسية فالكارينديول، الجسيمات في النطاق الفرعي-100 نانومتر يمكن الحصول عليها بنجاح. ويسيطر إمكانية polydispersity المستحث بسبب مشاركة خلط المضطرب لهطول الأمطار فالكارينديول وحدها من وجود الدهون طلاء. هيكل هذه الجسيمات النانوية المغلفة بالدهن تشبه البروتينات الدهنية low-density باستثناء استبعاد كاتشين 500,000 الأصلية ApoB100 ووجود شماعة-شحوم إضافية للاستقرار الفراغية). ويسمح هذا النظام إيصال المخدرات تستهدف سلبية تغليف مجموعة واسعة النطاق من المخدرات لا سيما مسعور ومواد التشخيص18،19، الحد من الاستجابة المناعية وزيادة التراكم في الأنسجة السرطانية16،18. وعلاوة على ذلك، تبعاً للمخدرات تدهور ردود الفعل (مثل التحلل المائي، انزيموليسيس)، يحمي نظام إيصال المخدرات المخدرات من التدهور خلال تعميمه المجراة.

لذلك، صممت جسيمات نانوية فالكارينديول، مع أحادي الطبقة تغليف المادة الدهنية التي تحتوي على نواة نقية من الدواء المنقي، وملفقة. طلاء أحادي الطبقة الدهنية تألفت دسبك ونسبة الكولسترول في الدم، وشماعة دسب 2000، مع التسمية فلوري دي. وتم تصنيع الجسيمات استخدام أسلوب الحقن السريع لتحويل المذيبات، التي تتألف من حقنه السريع لحل اثانوليك التي تحتوي على مكونات جسيمات نانوية إلى وجود فائض مرحلة المائية (1:9). تم قياس حجم الجسيمات النانوية استخدام دائرة الأراضي والمساحة، وبحثت في همسكس على الإقبال جسيمات نانوية وتصويرها باستخدام الأسفار والفحص المجهري [كنفوكل].

يمكن أيضا الحصول جسيمات نانوية غير المصقول، مع أحجام 71 ± 20.3 نانومتر. ومع ذلك، بعد اتباع البروتوكول، المذكورة أعلاه، جسيمات نانوية 74.1 شمال البحر الأبيض المتوسط ± 6.7 نيوتن متر، مع قيم polydispersity 0.182، كانت ملفقة. وهكذا، بعد تعديله جسيمات نانوية بإضافة طبقة الدهن، حجم وحزب النضال الديمقراطي الإندونيسي من جسيمات نانوية كان انخفاض،، مما يجعل منها أكثر ملاءمة للمخدرات التسليم.

من المهم أن تكون على علم عاليا الخطوات الحاسمة في البروتوكول، مثل أهمية موقف المحاقن عند الحقن في المرحلة العضوية، إعداد جسيمات نانوية في اليوم نفسه للعلاج لتجنب التراكم، والبذر للخلايا اليوم السابق لضمان مستوى التقاء كافية. وفي الواقع، يمكن اعتبار جميع الخطوات المذكورة في الجزء الأول من البروتوكول حاسمة لأنها أما تؤثر على حجم الجسيمات النانوية أو تركيز النهائي المجمع النشط والدهون طلاء. النظر في 'تركيز' كمعلمة هامة، خطوات 1.2 و 1.4، 1.6، 1.15 و 1.16 الحاسمة. في ضوء 'حجم نانوحبيبات' كمعلمة هامة، خطوات 1.7 و 1.11 1.12 الحاسمة.

الأسفار والفحص المجهري [كنفوكل] أظهرت أن جسيمات نانوية دخلت الخلايا، وعدد كبير من جسيمات نانوية كانت منتشرة في السيتوبلازم لكل خلية. وتوحي هذه النتائج أن جسيمات نانوية المصممة في هذه الدراسة يمكن أن تعمل كنظام توصيل العقاقير الجديدة، ومستقرة فالكارينديول.

هذا الأسلوب يوفر نهج بسيط وسريع، واستنساخه لتغليف أدوية السرطان المختلفة، ويتم تقييم أوجه قصور الأسلوب مع معطف الدهن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور مصطفى قاسم (مستشفى جامعة اودنسي، الدانمرك) للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية. يشكر المؤلفون مركز بيويماجينج الطبي الدانمركي للوصول إلى تلك المجاهر. يشكر المؤلفون الأسس Carlsberg وبلوم للدعم المالي (ل E.A.C.). الكتاب الإقرار الدعم المالي المقدم من جائزة "الأستاذية نيلز بور" من "مؤسسة البحوث الوطنية الدانمركية".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) Microlab Aarhus A/S ML 33154LP
6 well plates Greiner Bio One International GmbH 657160
Absolute Ethanol EMD Millipore (VWR) EM8.18760.1000
Chloroform Rathburn Chemicals Ltd. RH1009
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P
Confocal Microscope Zeiss LSM510
Cover Slips thickness #1.5 Paul Marienfeld GmbH & Co 117650
Desiccator Self-build
DiI Invitrogen D282
DLS Beckman Coulter DelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 850365C 
DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 880120C
eVol XR SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. 2910200
Fetal Bovine serum Gibco 10270-106
Fluorescence Miccroscope Olymous IX81 With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
Incubator Panasonic  MCO-18AC
Magnetic flea VWR Chemicals 15 x 4.5 mm Cylindrical shape with PTFE coating
Magnetic stirrer IKA RT-10
Minimum Essential Media Gibco 32561-029
PBS tablets for cell culture VWR Chemicals 97062-732
Pen/strep VWR Chemicals 97063-708
Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) Thermo Fisher 10010031
Rotary Evaporator Rotavapor, Büchi Labortechnik AG R-210
Sample concentrator  Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC SBHCONC/1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Firestone, R. A. Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells. Bioconjugate Chemistry. 5, (2), 105-113 (1994).
  2. Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipid metabolic reprogramming in cancer cells. Oncogenesis. 5, (1), 189 (2016).
  3. Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy. Cancer Biology & Medicine. 14, (3), 228 (2017).
  4. Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients. Family Practice. 33, (5), 449-452 (2016).
  5. Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19, (3), 393-406 (2014).
  6. dos Santos, R., et al. LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion. Lipids in Health and Disease. 13, (16), (2014).
  7. Gallagher, E. J., et al. Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access. Oncogene. 36, (46), 6462-6471 (2017).
  8. Needham, D., et al. Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food". Journal of Drug Targeting. 24, (9), 836-856 (2016).
  9. Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles. United States Patent Application Publication. Pub. No.: US 2009/0110739 A1 (2009).
  10. Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme. Journal of Controlled Release. 124, (3), 163-171 (2007).
  11. Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape. Journal of Lipid Research. 45, (5), 954-966 (2004).
  12. Schweizer, M. T., et al. A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer. PLoS ONE. 13, (8), 0202709 (2018).
  13. Allen, T. M., Hansen, C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068, (2), 133-141 (1991).
  14. Maeda, H. The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting. Advances in Enzyme Regulation. 41, (1), 189-207 (2001).
  15. Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect. PLoS ONE. 10, (5), 0123461 (2015).
  16. Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy. Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9, (2), (2016).
  17. Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats. Food & Function. 8, 964-974 (2017).
  18. Hervella, P., Parra, E., Needham, D. Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).
  19. Hervella, P., et al. Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors. Journal of Controlled Release. (2018).
  20. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28, (7), 3633-3640 (2012).
  21. Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -P., Cabane, B. Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries. Langmuir. 25, (4), 1970-1979 (2009).
  22. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8, (9), 2906-2912 (2008).
  23. Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69, (1), 1-9 (2018).
  24. Christensen, L. P., Brandt, K. Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41, (3), 683-693 (2016).
  25. Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).
  26. Jin, H. R., et al. The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress. CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).
  27. Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. University of Southern Denmark (SDU). (2018).
  28. Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. 6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress. Stockholm, Sweden. (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics