मानव Mesenchymal स्टेम सेल द्वारा Falcarindiol युक्त नए लिपिड लेपित नैनोकणों के ऊपर ले

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

यह लेख लिपिड लेपित ७४ एनएम नैनोकणों में falcarindiol के encapsulation का वर्णन है । मानव स्टेम सेल द्वारा लिपिड बूंदों में सेलुलर नैनोकणों की निगरानी फ्लोरोसेंट और फोकल इमेजिंग द्वारा नजर रखी है । नैनोकणों विलायक स्थानांतरण की तेजी से इंजेक्शन विधि द्वारा गढ़े हैं, और उनके आकार गतिशील प्रकाश बिखरने तकनीक के साथ मापा जाता है ।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pipó-Ollé, E., Walke, P., Notabi, M. K., El-Houri, R. B., Østergaard Andersen, M., Needham, D., Arnspang, E. C. Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (144), e59094, doi:10.3791/59094 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

नैनोकणों कैंसर थेरेपी के लिए दवा वितरण प्रणालियों में वृद्धि हुई ब्याज का ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । लिपिड लेपित नैनोकणों कम घनत्व लिपो (LDLs) द्वारा संरचना और आकार में प्रेरित कर रहे हैं, क्योंकि कैंसर कोशिकाओं पैदा करना करने के लिए कोलेस्ट्रॉल के लिए एक वृद्धि की जरूरत है, और यह कैंसर के लिए विरोधी दवाओं को वितरित करने के लिए एक तंत्र के रूप में शोषण किया गया है कक्षों. इसके अलावा, ड्रग रसायन पर निर्भर करता है, दवा encapsulating vivo में संचलन के दौरान दवा की गिरावट से बचने के लिए लाभप्रद हो सकता है । इसलिए, इस अध्ययन में, इस डिजाइन विरोधी दवा falcarindiol के लिपिड लेपित नैनोकणों बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है, falcarindiol के एक संभावित नए वितरण प्रणाली प्रदान करने के लिए क्षरण के खिलाफ अपनी रासायनिक संरचना को स्थिर करने और अपने सुधार ट्यूमर द्वारा ऊपर उठाना । Falcarindiol नैनोकणों, एक फॉस्फोलिपिड और कोलेस्ट्रॉल monolayer कण के शुद्ध दवा कोर encapsulating के साथ, डिजाइन किए गए थे । लिपिड monolayer कोटिंग के होते हैं 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), कोलेस्ट्रॉल (चौल), और 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy (पॉलीथीन ग्लाइकोल)-२०००] (DSPE खूंटी २०००) फ्लोरोसेंट के साथ साथ लैबल दिी (43:50:5:2 के अनुपात दाढ़) । नैनोकणों तेजी से इंजेक्शन विधि का उपयोग कर गढ़े हैं, जो विरोधी विलायक एक्सचेंज के लिए अच्छे विलायक द्वारा नैनोकणों हाला करने के लिए एक तेज और सरल तकनीक है । यह एक जलीय चरण में एक इथेनॉल nanoparticle घटक युक्त समाधान के तेजी से इंजेक्शन के होते हैं । फ्लोरोसेंट नैनोकणों के आकार ७४.१ ± ६.७ एनएम में गतिशील प्रकाश छितराना (DLS) का उपयोग कर मापा जाता है । नैनोकणों के ऊपर मानव mesenchymal स्टेम सेल (hMSCs) में परीक्षण किया और प्रतिदीप्ति और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर imaged है । नैनोकणों के hMSCs में मनाया जाता है, falcarindiol के लिए इस तरह के एक स्थिर दवा वितरण प्रणाली के लिए क्षमता का सुझाव ।

Introduction

लिपिड लेपित नैनोकणों एक वृद्धि कैंसर थेरेपी1के लिए दवा वितरण प्रणाली के रूप में अपने समारोह के बारे में रुचि देख रहे हैं । कैंसर एक बदल लिपिड चयापचय reprogramminging2 और कोलेस्ट्रॉल के लिए एक वृद्धि की जरूरत है3पैदा करना है । वे LDLs1 एक्सप्रेस और सामांय कोशिकाओं से अधिक LDLs में ले, हद है कि एक कैंसर रोगी के एलडीएल गिनती भी नीचे जा सकते है4। एलडीएल उठाना आक्रामक phenotypes5 को बढ़ावा देता है जिसके परिणामस्वरूप स्तन कैंसर6में प्रसार और आक्रमण होता है । एलडीएल रिसेप्टर्स (LDLRs) के एक बहुतायत मेटास्टेटिक संभावित7के एक शकुन संकेतक है । एलडीएल से प्रेरित होकर और इसके कैंसर की कोशिकाओं द्वारा एक नई रणनीति बुलाया गया है: दवा कैंसर के भोजन की तरह लगरही8। इस प्रकार, इन नए nanoparticle दवा वितरण डिजाइन8,9,10 कोर से प्रेरित किया गया है-और विरोधी दवाओं देने के लिए एक तंत्र के रूप में प्राकृतिक LDLs11 के लिपिड स्थिर डिजाइन कैंसर कोशिकाओं के लिए । इस निष्क्रिय लक्ष्यीकरण वितरण प्रणाली के encapsulating का समर्थन करता है, विशेष रूप से, hydrophobic दवाओं, जो आम तौर पर मौखिक खुराक के रूप में दिए गए हैं, लेकिन केवल खून के लिए दवाओं की एक छोटी राशि प्रदान करते हैं, तो उनकी उंमीद प्रभावकारिता12सीमित । चुपके liposomes13के साथ के रूप में, एक पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) कोटिंग किसी भी immunologic प्रतिक्रिया को कम करने में मदद करता है और इष्टतम ट्यूमर के लिए खून में परिसंचरण फैली कथित बढ़ाया permeation और प्रतिधारण (EPR) प्रभाव द्वारा 14 , 15. हालांकि, इसके अलावा, कुछ उदाहरणों में, सिस्टम16में संचलन और अवांछनीय वितरण में अस्थिरता, कुछ बाधाएं अनसुलझी रह जाती हैं, जैसे कैसे और किस हद तक इस तरह के नैनोकणों कोशिकाओं द्वारा में लिया जाता है और क्या है उनकी intracellular किस्मत. यह यहां है कि इस कागज एक विशेष hydrophobic विरोधी दवा falcarindiol के nanoparticle को संबोधित करते हैं, फोकल और epifluorescence इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर ।

अध्ययन का उद्देश्य falcarindiol के लिपिड लेपित नैनोकणों बनाना और hMSCs में उनके intracellular का अध्ययन करने के लिए है । जिससे, संभावित अपने प्रशासन स्थिर, प्रसव के साथ जुड़े चुनौतियों पर काबू पाने, और जैव उपलब्धता में सुधार । इस प्रकार इस विरोधी दवा के लिए एक नई वितरण प्रणाली का आकलन । पहले, falcarindiol एक उच्च एकाग्रता के माध्यम से मौखिक रूप से administrated किया गया है एक आहार17पूरक के रूप में falcarindiol शुद्ध । हालांकि, इस होनहार दवा देने के लिए एक अधिक संरचित दृष्टिकोण के लिए की जरूरत है । इसलिए, falcarindiol नैनोकणों, एक फॉस्फोलिपिड और कोलेस्ट्रॉल monolayer कण के कोर का गठन शुद्ध दवा के साथ encapsulating के साथ, डिजाइन किए गए थे । विलायक स्थानांतरण के रैपिड इंजेक्शन विधि, के रूप में हाल ही में Needham एट अल द्वारा विकसित की है । 8, इस अध्ययन में प्रयोग किया जाता है polyacetylene falcarindiol encapsulate ।

विधि पहले लिपिड नैनोकणों के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया है नैदानिक इमेजिंग एजेंटों encapsulate18,19, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परीक्षण अणुओं (triolein)27 और ड्रग्स (orlistat, niclosamide स्टीयरेट)8 ,27,28. यह एक अपेक्षाकृत सरल तकनीक है जब सही अणुओं के साथ किया जाता है । यह nanosized कणों रूपों, उनके महत्वपूर्ण nucleation की सीमा पर (~ 20 एनएम व्यास), अत्यधिक अघुलनशील hydrophobic solutes एक ध्रुवीय विलायक में भंग की । विलायक विनिमय antisolvent के एक अतिरिक्त (आमतौर पर, एक 1:9 कार्बनिक में एक जलीय चरण: जलीय मात्रा अनुपात)20,21में कार्बनिक समाधान की एक तेजी से इंजेक्शन द्वारा पूरा किया है ।

नैनोकणों के संयोजन डिजाइन कई फायदे के लिए वृद्धि दे । DSPC: चौल घटक एक बहुत तंग, लगभग अभेद्य, संगत, और biodegradable monolayer प्रदान करते हैं । खूंटी एक sterically स्थिर इंटरफेस है जो प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा opsonization से एक ढाल के रूप में कार्य करता है, reticuloendothelial प्रणाली (जिगर और तिल्ली) और mononuclear phagocyte प्रणाली के खिलाफ की रक्षा के द्वारा किसी भी आगे को धीमा, उनके प्रतिधारण और प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा क्षरण, और इसलिए, उनके संचलन में वृद्धि छमाही22रक्त में समय । इस कणों को प्रसारित जब तक वे ऐसे ट्यूमर के रूप में रोगग्रस्त साइटों, पर extravasate, जहां संवहनी प्रणाली टपका हुआ है, EPR-प्रभाव कणों के निष्क्रिय संचय को जंम देने के लिए अनुमति देता है । इसके अतिरिक्त, लिपिड कोट एक की अनुमति देता है नैनोकणों ' आकार पर बेहतर नियंत्रण के लिए काइनेटिक अपनी महत्वपूर्ण नाभिक आयाम27,28पर कोर फँसाने के द्वारा । लिपिड विभिन्न सतह गुण (पेप्टाइड लक्ष्यीकरण, जो इस परियोजना के लिए अभी तक उपलब्ध नहीं था सहित) प्रेरित, एक शुद्ध दवा कोर, और एक कम polydispersity22,27,28. कण आकार विश्लेषण के लिए इस्तेमाल विधि DLS, एक तकनीक है कि शोधकर्ताओं ने एक ही समय में कणों की एक बड़ी संख्या के आकार को मापने के लिए अनुमति देता है । नैनोकणों23monodispersed नहीं हैं, तो हालांकि, इस विधि माप बड़ा आकार करने के लिए बायस कर सकते हैं । यह समस्या लिपिड कोट के साथ के रूप में अच्छी तरह से मूल्यांकन किया है । इन मौलिक डिजाइनों के अधिक विवरण और सभी विशेषताओं के ठहराव27,28अन्य प्रकाशनों में दिए गए हैं ।

दवा नैनोकणों में समझाया falcarindiol है, एक आहार polyacetylene Apiaceae परिवार से पौधों में पाया । यह aliphatic सी17polyacetylenes प्रकार है कि स्वास्थ्य को बढ़ावा देने के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए पाया गया है से एक माध्यमिक metabolite है, विरोधी भड़काऊ गतिविधि सहित, जीवाणुरोधी प्रभाव, और कैंसर सेल लाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ cytotoxicity. अपनी उच्च प्रतिक्रियाशीलता के लिए विभिंन प्रकार के अणुओं के साथ बातचीत करने की क्षमता से संबंधित है, mercapto और एमिनो24समूहों के खिलाफ एक बहुत ही सक्रिय alkylating एजेंट के रूप में अभिनय । Falcarindiol पहले बृहदांत्र17,25में नवोत्पादित घावों की संख्या को कम करने के लिए दिखाया गया है, हालांकि जैविक तंत्र अभी भी अज्ञात हैं । हालांकि, यह सोचा है कि यह ऐसे NF-κB, COX1, कॉक्स-2 के रूप में, और साइटोकिंस, उनके ट्यूमर प्रगति और कोशिका प्रसार प्रक्रियाओं बाधा, सेल चक्र, endoplasmic जालिका (एर) तनाव को गिरफ्तार करने के लिए अग्रणी के रूप में इस तरह के अणुओं के साथ बातचीत, और apoptosis 17,कैंसर कोशिकाओं में26 । Falcarindiol इस अध्ययन में एक उदाहरण विरोधी अपनी विरोधी क्षमता और तंत्र के कारण दवा के रूप में प्रयोग किया जाता है वर्तमान में अध्ययन किया जा रहा है, और क्योंकि यह होनहार विरोधी प्रभाव से पता चलता है । नैनोकणों के सेलुलर अधिक hMSCs में परीक्षण किया और epifluorescence और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर imaged है । इस सेल प्रकार अपने बड़े आकार के कारण चुना गया था, उंहें माइक्रोस्कोपी के लिए आदर्श बना ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

तेजी से विलायक स्थानांतरण तकनीक द्वारा 1. Nanoparticle संश्लेषण

  1. नैनोकणों की तैयारी के लिए निंनलिखित सेट करें: एक ब्लॉक हीटर/नमूना संकेंद्रक, एक desiccator, एक 1 मिलीलीटर ग्लास सिरिंज के साथ एक डिजिटल वितरण प्रणाली, एक 12 मिलीलीटर कांच की शीशी, एक चुंबकीय सरगर्मी, एक चुंबकीय पिस्सू (15 मिमी x ४.५ मिमी के साथ एक बेलनाकार आकार में, कांच की शीशी के अंदर polytetrafluoroethylene [PTFE] कोटिंग), और एक rotatory वाष्पीकरण ।
  2. २.४ मिलीलीटर की २५० µ मीटर falcarindiol स्टॉक में भंग ७०% ेतोः पानी के मिश्रण में एक जुटाई शीशी ।
  3. तरल अंश लुप्त हो जाना, लगभग 4 घंटे के लिए नमूना संकेंद्रण का उपयोग कर, सूखी falcarindiol प्राप्त करने के लिए ।
    1. ब्लॉक हीटर में जुटाना शीशी डालें; नमूना संकेंद्रक नमूने पर ध्यान केंद्रित स्टेनलेस स्टील सुई का उपयोग कर, नमूना गैस बचाता है । कमरे के तापमान पर लुप्त हो जाना; गर्मी का उपयोग न करें ।
  4. एक बार सूख, ऊपर उल्लेख किया में लिपिड कोटिंग के निंनलिखित घटकों को जोड़ने की शीशी: १६.३ µ एल के ३१.६४ मिमी DSPC क्लोरोफॉर्म स्टॉक समाधान, ३.४ µ एल के १७.८२ मिमी DSPE खूंटी २००० क्लोरोफॉर्म स्टॉक समाधान, 24 µ एल के 25 मिमी कोलेस्ट्रॉल क्लोरोफॉर्म स्टॉक हल, और 6 µ एल के 4 मिमी दिी क्लोरोफॉर्म स्टॉक समाधान । प्रत्येक घटक को जोड़ने के लिए पार संक्रमण से बचने के बाद क्लोरोफॉर्म के साथ सिरिंज साफ.
    सावधानी: तुरंत लिपिड से युक्त शीशियों को बंद करें ताकि विलायक लुप्त नहीं होता है और, इस प्रकार, एकाग्रता को संशोधित । एक धुएं डाकू में काम करते हैं ।
    नोट: क्लोरोफॉर्म स्टॉक समाधान की सांद्रता, रासायनिक आपूर्तिकर्ता या लैब में किए गए कमजोर पड़ने के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
  5. प्रकाश से दिी की रक्षा करने के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ शीशी लपेटें । क्लोरोफॉर्म को वाष्पित करने के लिए desiccator में रातोंरात नमूना छोड़ दें ।
  6. पूर्ण इथेनॉल में शुष्क नमूना १.२ मिलीलीटर है, जो DSPC, DSPE खूंटी २०००, कोलेस्ट्रॉल, और ०.४३ मिमी, ०.०५ मिमी, ०.५ मिमी, और ०.०२ मिमी, क्रमशः के दिी के अंतिम सांद्रता देता है की अंतिम मात्रा को भंग । यह समाधान ऑर्गेनिक चरण का प्रतिनिधित्व करता है ।
  7. 12 मिलीलीटर कांच की शीशी ले लो, यह शुद्ध पानी की 9 मिलीलीटर के साथ भरें और, पानी की 9 मिलीलीटर युक्त शीशी में चुंबकीय पिस्सू जोड़ें । शीशी को चुंबकीय सरगर्मी पर रखें, ५०० आरपीएम पर क्रियाशीलता (चित्रा 1).
  8. 1 मिलीलीटर ग्लास सिरिंज वितरण प्रणाली के लिए अनुलग्न करें और किसी भी संक्रमण से बचने के लिए क्लोरोफॉर्म के साथ इसे साफ । द्वारा यह, धीरे गिलास सिरिंज में क्लोरोफॉर्म खींच और एक अपशिष्ट कलेक्टर में मैंयुअल रूप से वितरण कम से कम 10 tiems ।
    चेतावनी: यह एक धुएं डाकू के तहत किया जाना चाहिए ।
  9. प्रधानमंत्री इथेनॉल के साथ सिरिंज । भड़काना पुराने विलायक की जगह है, साथ ही किसी भी हवा के बुलबुले को हटा ।
    चेतावनी: यह एक धुएं डाकू के तहत किया जाना चाहिए ।
  10. सिरिंज का प्रयोग, कार्बनिक चरण के महाप्राण 1 मिलीलीटर ।
  11. ग्लास शीशी में सिरिंज डालें, 9 मिलीलीटर वॉटरमार्क के बीच करने के लिए, और यह शीशी के बीच में स्थिर बनाए रखने (के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है) ।
  12. इंजेक्शन की चयनित गति पर समाधान इंजेक्षन (८३३ µ एल/वितरण प्रणाली (चित्रा 2) पर वितरण बटन दबाकर... यह 10% इथेनॉल युक्त पानी में falcarindiol के ५० µ एम लिपिड लेपित नैनोकणों के 10 मिलीलीटर उत्पंन करता है ।
    नोट: इस इंजेक्शन की गति एक संकीर्ण कण आकार वितरण प्राप्त करने, बेहतरीन कणों को प्राप्त करने के लिए पाया गया है । यह सुनिश्चित करें कि सिरिंज केंद्र में है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है, स्थिर, और सीधे जब समाधान वितरण.
  13. इंजेक्शन लगाने के तुरंत बाद शीशी को चमचे से निकाल लें और नमूने को ५० मिलीलीटर गोल-नीचे कुप्पी (RBF) में ट्रांसफर करें ।
  14. रोटरी वाष्पीकरण करने के लिए RBF संलग्न और कमरे के तापमान पर रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग कर, कार्बनिक विलायक के 1 मिलीलीटर लुप्त हो जाना । अतिरिक्त बुलबुला गठन से बचें ।
    नोट: यह कदम ~ 5 मिनट लग जाएगा ।
  15. nanoparticle सस्पेंशन को RBF से दूसरी 12 एमएल ग्लास शीशी में ट्रांसफर करें । सुनिश्चित करें कि वॉल्यूम 9 mL है । २ १२ मिलीलीटर ग्लास शीशियों में नमूना भाजित (प्रत्येक में ४.५ मिलीलीटर डाल) ।
  16. शीशियों में से एक करने के लिए ultrapure पानी की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और अन्य शीशी के लिए 10x फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के ०.५ मिलीलीटर. कण आकार माप के लिए प्रत्येक नमूने की 1 मिलीलीटर बाहर ले लो ।

2. कण आकार DLS तकनीक का उपयोग कर विश्लेषण

नोट: आकार माप कण आकार वितरण निर्धारित करता है जो एक DLS विश्लेषक का उपयोग करके किए गए थे । यह एक १०० मेगावाट लेजर कि ६६२.२ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर चल रही है और एक हिमस्खलन photodiode घटना कोण को ९० डिग्री कोण पर रखा डिटेक्टर के साथ सुसज्जित है । बीम नैनोकणों द्वारा बिखरा हुआ है और photodetector द्वारा पता लगाया ।

  1. DLS साधन पर बारी और 20 डिग्री सेल्सियस पर वांछित तापमान सेट, जब तक यह स्थिर ।
  2. साधन पैरामीटर सेट निम्नानुसार: डेटा अधिग्रहण समय = 4 एस, अधिग्रहण की संख्या = 30, ऑटो क्षीणन समारोह = पर, और ऑटो क्षीणन समय सीमा = 0.
  3. nanoparticle के 1 मिलीलीटर के साथ प्लास्टिक cuvette भरें और माप शुरू करते हैं ।
  4. (पानी या पंजाब) विलायक इस्तेमाल के आधार पर मापा आकार की रिपोर्ट ।
    नोट: पंजाब में माप के माध्यम में कोशिकाओं के आकार के एक अनुमानित विचार है जब कोशिकाओं के इलाज के लिए किया जाता है । पानी में घुल नैनोकणों के साथ सेल ट्रीटमेंट किया जाएगा ।
  5. संश्लेषण के बाद माप 24 h दोहराएँ, कण एकत्रीकरण के लिए जाँच करने के लिए.

3. सेल उपचार

  1. 5% CO2के साथ 37 ° c में एक humified कक्ष में, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक न्यूनतम आवश्यक माध्यम (मेम) में hMSCs बढ़ाएँ ।
    चेतावनी: कदम ३.१, ३.२ और ३.३ के लिए बाँझ लामिना फ्लो हुड में काम करते हैं ।
  2. बीज लगभग ५०,००० कोशिकाओं के लगभग 30% के एक सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए पहले निरपेक्ष-ेतोः-निष्फल #1 .5 coverslips में रखा 6-अच्छी तरह से प्लेटें । मेम जोड़ें आदेश में एक अच्छी तरह से 3 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा है । ३.१ चरण में के रूप में एक ही स्थिति के तहत 24 घंटे के लिए मशीन । उपचार से पहले कोशिकाओं को 24 ज सीड ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कोशिकाओं को nanoparticle उपचार से पहले कम से कम 24 ज वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को एक पर्याप्त संगम में हैं ।
  3. माध्यम को हटाने के बिना, nanoparticle समाधान के 3 µ एल जोड़ने के लिए, एक अंतिम falcarindiol एकाग्रता के लिए 5 µ मी. के लिए कदम ३.१ में एक ही स्थिति में 24 घंटे के लिए ।
    नोट: नैनोकणों ' तैयारी सेल उपचार के दिन पर किया गया था, कण एकत्रीकरण से बचने के लिए ।
  4. बाद में, उपचार के 24 ज के बाद, पंजाबियों के साथ 2x कोशिकाओं को धो, 4% formaldehyde में उंहें कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ठीक है, और उंहें पंजाब में 4 डिग्री सेल्सियस से अधिक के लिए कई महीनों के लिए की दुकान में छवि ।
    चेतावनी: यह एक धुएं डाकू के तहत किया जाना चाहिए ।
    1. वैकल्पिक रूप से, निर्धारण के बाद, एक 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) परमाणु दाग प्रदर्शन किया जा सकता है । इस के लिए, कोशिकाओं फिक्सिंग के बाद, उंहें ०.१% ट्राइटन X-१०० के साथ permeabilize 30 मिनट के लिए, उंहें पंजाबियों के साथ 2x धो लो, और उंहें २५० µ एल ३०० एनएम DAPI के 5 मिनट के लिए, प्रकाश से संरक्षित के साथ दाग ।

4. माइक्रोस्कोपी

  1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
    1. छवियों को प्राप्त करने के लिए एक इलेक्ट्रॉन गुणा सीसीडी कैमरे से सुसज्जित एक widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें । 150x ना १.४५ तेल उद्देश्य और GFP LP चैनल का उपयोग करें ।
  2. फोकल माइक्रोस्कोपी
    1. 63x NA १.४ तेल उद्देश्य, दिी के लिए एक आर्गन लेजर (५१४ एनएम), और DAPI के लिए एक दो फोटॉन लेजर (७८० एनएम), कोशिकाओं में नैनोकणों के ऊपर की पुष्टि करने के लिए का उपयोग करते हुए फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों का अधिग्रहण ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

नैनोकणों के दो अलग प्रकार गढ़े गए थे, अर्थात् शुद्ध falcarindiol नैनोकणों और लिपिड लेपित falcarindiol नैनोकणों । लिपिड और कोलेस्ट्रॉल की विभिन्न सांद्रता का परीक्षण किया गया । के रूप में 1 तालिकामें दिखाया गया है, uncoatd पानी में बनाया और पंजाब में मापा ०.५७१ के एक polydispersity सूचकांक (PDI) के साथ ७१ ± २०.३ एनएम का व्यास था । उन पैरामीटर्स पर एक DLS विश्लेषक मापा गया था । falcarindiol के लिपिड लेपित नैनोकणों प्रयोगों में इस्तेमाल किया, और इतना फ्लोरोसेंट डाई सहित, दिी, एक समान आकार के थे, अर्थात् ७४.१ ± ६.७ एनएम; हालांकि, वे अपेक्षाकृत monodispersed पाया और ०.१८२ के एक कम PDI था, जो कण आकार के एक छोटे वितरण इंगित करता है, क्योंकि PDI nanoparticle जनसंख्या के आकार के वितरण का वर्णन किया गया । आम तौर पर, ०.३ के नीचे एक PDI जब दवा प्रयोजनों के लिए गढ़े नैनोकणों वांछित है ।

निर्माण के बाद, कण आकार 3 एच और 24 घंटे, सेल संस्कृति को नैनोकणों के अलावा के लिए आवश्यक देरी के आधार पर बार के बाद मापा गया था । कोई एकत्रीकरण 24 घंटे के बाद मनाया गया, लेकिन डेटा इस पांडुलिपि में नहीं दिखाया गया है के रूप में यह एक और अध्ययन में सूचित किया जाएगा, और यह 24 घंटे के बाद कण स्थिरता के लिए परीक्षण करने के लिए सिफारिश की है । लिपिड लेपित नैनोकणों के आकार स्थिरता की पुष्टि करने के बाद, दिी-लेबल, लिपिड लेपित नैनोकणों प्रोटोकॉल का पालन करके गढ़े गए थे और, अंततः, के लिए इस्तेमाल किया अध्ययन । हर स्टडी के लिए एक फ्रेश nanoparticle सैंपल तैयार किया गया था । अंतिम falcarindiol ' नैनोकणों संरचना का एक योजनाबद्ध चित्र 3में दिखाया गया है, और कण के आकार के आंकड़ों के निर्माण के बाद 1 तालिकामें दिखाया गया है, साथ ही साथ माप निर्माण के बाद 3 ज लिया ।

कोशिकाओं के अंदर नैनोकणों के पहले अवलोकन के रूप में, epifluorescence माइक्रोस्कोपी छवियों के उपचार के 24 ज के बाद अधिग्रहीत किया गया था । नैनोकणों सफेद चमकदार डॉट्स के रूप में visualized थे, और यह कल्पना की जा सकती है कि नैनोकणों कोशिकाओं के अंदर स्थित थे, नाभिक के आसपास (4 चित्राएक) ।

falcarindiol नैनोकणों कोशिकाओं में प्रवेश किया था कि पुष्टि करने के लिए, फोकल माइक्रोस्कोपी hMSCs पर 24 घंटे के लिए इलाज किया गया था कि नैनोकणों कोशिकाओं में प्रवेश किया था की पुष्टि की, और नैनोकणों की एक बड़ी संख्या में कोशिका द्रव्य में बिखरे हुए थे हर कोशिका (चित्रा 4बी डी) । ये परिणाम बताते है कि नैनोकणों falcarindiol के लिए एक स्थिर दवा वितरण प्रणाली के रूप में कार्य करते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : नैनोकणों तैयारी सेटअप दिखा रहा है इंजेक्शन के लिए विधानसभा सरगर्मी के तहत27 सेटअप एक 1 मिलीलीटर ग्लास नैनोकणों ' घटकों वाले इथेनॉल समाधान के 1 मिलीलीटर से भरा सिरिंज के साथ autopipette के होते हैं । कांच की शीशी में 9 मिलीलीटर पानी होता है और चुम्बकीय चमचे पर चुंबकीय पिस्सू रखा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : विलायक27स्थानांतरण के रैपिड इंजेक्शन विधि में सॉल्वैंट्स के मिश्रण की योजनाबद्ध । पैनलों ८३३ µ एल की गति से नैनोकणों ' घटक युक्त इथेनॉल चरण के 1 मिलीलीटर के इंजेक्शन दिखाने के पानी की 9 मिलीलीटर में/जबकि ५०० rpm पर सरगर्मी । नैनोकणों ' अवयव (falcarindiol, DSPC, कोलेस्ट्रॉल, DSPE खूंटी २०००, दिी) में antisolvent (पानी) युक्त इथेनॉल समाधान की अराजक मिश्रण के साथ तेजी से इंजेक्शन, नैनोकणों के गठन के लिए सीसा । रंग दिी द्वारा दिया जाता है । यह देखा जा सकता है कि कैसे इथेनॉल समाधान मिश्रित है, तेजी से अपनी एकाग्रता में वृद्धि और नैनोकणों का गठन कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : अंतिम falcarindiol ' नैनोकणों संरचना की योजनाबद्ध । DSPC, DSPE खूंटी २०००, कोलेस्ट्रॉल, दिी, और falcarindiol सहित Nanoparticle संरचना । विभिन्न घटकों को उनकी सांद्रता के अनुसार स्केल कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : मानव mesenchymal स्टेम सेल में लिपिड लेपित falcarindiol नैनोकणों की छवियां । () 24 ज के लिए falcarindiol नैनोकणों के साथ इलाज hMSCs की Epifluorescence माइक्रोस्कोपी इमेज । निंनलिखित पैनलों 24 ज के लिए falcarindiol नैनोकणों के साथ इलाज hMSCs के फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों को दिखाने के लिए: () नाभिक के DAPI दाग, () दिी नैनोकणों, और () दोनों छवियों का एक ओवरले, नाभिक नीले रंग में दिखाए जाते है और लाल रंग में नैनोकणों । स्केल सलाखों के 10 µm. नैनोकणों कक्ष कोशिका द्रव्य में सफेद चमकदार डॉट्स के रूप में visualized हैं । चित्र बताते है कि नैनोकणों की एक बड़ी संख्या के बाद कोशिकाओं में प्रवेश किया है 24 गर्मी की ज । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नैनोकणों का प्रकार विलायक Nanoparticle आकार (एनएम) Polydisperisty (एनएम) Polydispersity इंडेक्स (PDI)
अनकोट Falcarindiol पानी ८३.९ ± 23, 9 ०.५७१
Pbs ७१ ± 20, 3 ०.५७१
लिपिड लेपित Falcarindiol Pbs ९१.६ ± 6, 4 ०.१४१
3h के बाद पंजाब ९३.५ ± 5, 7 ०.१२२
लिपिड लेपित Falcarindiol + दिी Pbs ७४.१ ± 6, 7 ०.१८२

तालिका 1: गढ़े नैनोकणों के विभिंन डिजाइनों । आकार और संश्लेषित falcarindiol नैनोकणों के polydispersity सूचकांक, विलायक और nanoparticle प्रकार पर निर्भर करता है । Falcarindiol नैनोकणों के साथ और एक लिपिड कोट के बिना गढ़े थे । कोट घटकों के विभिंन सांद्रता का परीक्षण किया गया । 3 ज के बाद कण एकत्रीकरण का परीक्षण किया गया ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सरल, तेज, reproducible, और विलायक स्थानांतरण के स्केलेबल रैपिड इंजेक्शन विधि के साथ दवा वितरण के लिए लिपिड लेपित नैनोकणों के निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल27,28 के बाद किया गया था और इस पत्र में प्रस्तुत किया है, के रूप में falcarindiol के लिए आवेदन किया । जलीय चरण में कार्बनिक चरण के इंजेक्शन की गति को नियंत्रित करने और falcarindiol कोर, उप में कण-१०० एनएम रेंज सफलतापूर्वक प्राप्त किया जा सकता है कोट करने के लिए उपयुक्त सांद्रता पर कोटिंग लिपिड का उपयोग करके । अकेले falcarindiol वर्षा के लिए मिश्रण अशांत की भागीदारी के कारण प्रेरित polydispersity की संभावना कोटिंग लिपिड की उपस्थिति द्वारा नियंत्रित किया गया था । इन लिपिड लेपित नैनोकणों की संरचना देशी ५००,००० केडीए ApoB100 और steric स्थिरता के लिए खूंटी-लिपिड की अतिरिक्त उपस्थिति के बहिष्कार के अपवाद के साथ कम घनत्व लिपो मची). इस निष्क्रिय लक्षित दवा वितरण प्रणाली विशेष रूप से hydrophobic दवाओं और नैदानिक सामग्री18,19की एक व्यापक रेंज के encapsulation की अनुमति देता है, immunologic प्रतिक्रिया को कम करने और संचय में वृद्धि कैंसर के ऊतकों16,18. इसके अलावा, दवा क्षरण प्रतिक्रियाओं पर निर्भर करता है (जैसे, hydrolysis, enzymolysis), दवा वितरण प्रणाली vivo में अपने संचलन के दौरान क्षरण से दवा की रक्षा ।

इसलिए, falcarindiol नैनोकणों, एक लिपिड encapsulating monolayer के साथ शुद्ध दवा की एक प्योर कोर युक्त, डिजाइन और गढ़े थे । लिपिड monolayer कोटिंग DSPC के शामिल, कोलेस्ट्रॉल, और DSPE-खूंटी २०००, फ्लोरोसेंट लेबल दिी के साथ. कणों का निर्माण बाहर किया गया था विलायक स्थानांतरण, जो जलीय चरण (1:9) के एक अतिरिक्त में नैनोकणों घटकों युक्त एक तेजी से इंजेक्शन के होते है की रैपिड इंजेक्शन विधि का उपयोग कर । नैनोकणों के आकार DLS का उपयोग कर मापा गया था, और नैनोकणों के ऊपर hMSCs में जांच की और प्रतिदीप्ति और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged था ।

अनकोट नैनोकणों भी प्राप्त किया जा सकता है, ७१ ± २०.३ एनएम के आकार के साथ । हालांकि, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करने के बाद, ७४.१ एनएम ± ६.७ एनएम के नैनोकणों, ०.१८२ के polydispersity मूल्यों के साथ, गढ़े थे । इस प्रकार, लिपिड कोट जोड़कर नैनोकणों को संशोधित करने के बाद, नैनोकणों का आकार और PDI कम हो गया था,, उन्हें दवा वितरण के लिए और अधिक उपयुक्त बनाने.

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों के बारे में बेहद सजग होना जरूरी है, जैसे जैविक चरण में इंजेक्शन लगाते समय सिरिंज की स्थिति का महत्व, एकत्रीकरण से बचने के लिए उपचार के उसी दिन नैनोकणों की तैयारी, और कोशिकाओं के सीडिंग का पर्याप्त संगम स्तर को सुनिश्चित करने के लिए पहले दिन । वास्तव में, प्रोटोकॉल के पहले भाग में सभी कदम महत्वपूर्ण माना जा सकता है क्योंकि वे या तो नैनोकणों या सक्रिय यौगिक और कोटिंग लिपिड के अंतिम एकाग्रता के आकार को प्रभावित करते हैं । एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के रूप में ' एकाग्रता ' पर विचार, कदम १.२, १.४, १.६, १.१५, और १.१६ महत्वपूर्ण हैं. एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के रूप में ' nanoparticle आकार ' पर विचार, कदम १.७, १.११, और १.१२ महत्वपूर्ण हैं.

प्रतिदीप्ति और फोकल माइक्रोस्कोपी से पता चला कि नैनोकणों ने कोशिकाओं में प्रवेश किया था, और हर कोशिका के कोशिका द्रव्य में बड़ी संख्या में नैनोकणों बिखरे हुए थे । इन परिणामों का सुझाव है कि नैनोकणों इस अध्ययन में डिजाइन falcarindiol के लिए एक नया, और स्थिर दवा वितरण प्रणाली के रूप में कार्य कर सकते हैं ।

इस तकनीक को एक सरल, तेज, और reproducible दृष्टिकोण प्रदान करता है विभिंन कैंसर दवाओं encapsulate, और विधि की सीमाओं लिपिड कोट के साथ मूल्यांकन कर रहे हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक डॉ Moustapha Kassem (ओडेंसे विश्वविद्यालय अस्पताल, डेनमार्क) मानव mesenchymal स्टेम सेल के लिए धंयवाद । लेखक अपने सूक्ष्मदर्शी के लिए उपयोग के लिए डेनिश चिकित्सा जैव इमेजिंग केंद्र धंयवाद । लेखक वित्तीय सहायता के लिए कार्ल्सबर्ग और Villum फाउंडेशन धंयवाद (E.A.C. के लिए) । लेखक वित्तीय डेनमार्क नेशनल रिसर्च फाउंडेशन से नील्स बोह्र प्रोफेसरी पुरस्कार द्वारा प्रदान की सहायता स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) Microlab Aarhus A/S ML 33154LP
6 well plates Greiner Bio One International GmbH 657160
Absolute Ethanol EMD Millipore (VWR) EM8.18760.1000
Chloroform Rathburn Chemicals Ltd. RH1009
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P
Confocal Microscope Zeiss LSM510
Cover Slips thickness #1.5 Paul Marienfeld GmbH & Co 117650
Desiccator Self-build
DiI Invitrogen D282
DLS Beckman Coulter DelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 850365C 
DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 880120C
eVol XR SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. 2910200
Fetal Bovine serum Gibco 10270-106
Fluorescence Miccroscope Olymous IX81 With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
Incubator Panasonic  MCO-18AC
Magnetic flea VWR Chemicals 15 x 4.5 mm Cylindrical shape with PTFE coating
Magnetic stirrer IKA RT-10
Minimum Essential Media Gibco 32561-029
PBS tablets for cell culture VWR Chemicals 97062-732
Pen/strep VWR Chemicals 97063-708
Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) Thermo Fisher 10010031
Rotary Evaporator Rotavapor, Büchi Labortechnik AG R-210
Sample concentrator  Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC SBHCONC/1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Firestone, R. A. Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells. Bioconjugate Chemistry. 5, (2), 105-113 (1994).
  2. Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipid metabolic reprogramming in cancer cells. Oncogenesis. 5, (1), 189 (2016).
  3. Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy. Cancer Biology & Medicine. 14, (3), 228 (2017).
  4. Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients. Family Practice. 33, (5), 449-452 (2016).
  5. Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19, (3), 393-406 (2014).
  6. dos Santos, R., et al. LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion. Lipids in Health and Disease. 13, (16), (2014).
  7. Gallagher, E. J., et al. Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access. Oncogene. 36, (46), 6462-6471 (2017).
  8. Needham, D., et al. Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food". Journal of Drug Targeting. 24, (9), 836-856 (2016).
  9. Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles. United States Patent Application Publication. Pub. No.: US 2009/0110739 A1 (2009).
  10. Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme. Journal of Controlled Release. 124, (3), 163-171 (2007).
  11. Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape. Journal of Lipid Research. 45, (5), 954-966 (2004).
  12. Schweizer, M. T., et al. A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer. PLoS ONE. 13, (8), 0202709 (2018).
  13. Allen, T. M., Hansen, C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068, (2), 133-141 (1991).
  14. Maeda, H. The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting. Advances in Enzyme Regulation. 41, (1), 189-207 (2001).
  15. Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect. PLoS ONE. 10, (5), 0123461 (2015).
  16. Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy. Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9, (2), (2016).
  17. Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats. Food & Function. 8, 964-974 (2017).
  18. Hervella, P., Parra, E., Needham, D. Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).
  19. Hervella, P., et al. Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors. Journal of Controlled Release. (2018).
  20. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28, (7), 3633-3640 (2012).
  21. Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -P., Cabane, B. Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries. Langmuir. 25, (4), 1970-1979 (2009).
  22. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8, (9), 2906-2912 (2008).
  23. Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69, (1), 1-9 (2018).
  24. Christensen, L. P., Brandt, K. Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41, (3), 683-693 (2016).
  25. Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).
  26. Jin, H. R., et al. The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress. CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).
  27. Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. University of Southern Denmark (SDU). (2018).
  28. Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. 6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress. Stockholm, Sweden. (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics