Absorción de nuevas nanopartículas recubiertas de lípidos que contienen Falcarindiol por células madre mesenquimales humanas

Bioengineering

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Summary

Este artículo describe la encapsulación de falcarindiol en revestimiento lípido 74 nm nanopartículas. La absorción celular de las nanopartículas por las células de vástago humanas en gotitas del lípido es supervisada por la proyección de imagen confocal y fluorescente. Nanopartículas se fabrican por el método de la inyección rápida de cambio de disolvente, y su tamaño se mide con la técnica de dispersión de luz dinámica.

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Pipó-Ollé, E., Walke, P., Notabi, M. K., El-Houri, R. B., Østergaard Andersen, M., Needham, D., Arnspang, E. C. Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (144), e59094, doi:10.3791/59094 (2019).

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Abstract

Las nanopartículas son el foco de un creciente interés en sistemas de entrega de medicamentos para la terapia del cáncer. Nanopartículas recubiertas de lípidos están inspiradas en la estructura y tamaño de lipoproteínas de baja densidad (LDLs) porque las células cancerosas tienen una mayor necesidad de colesterol proliferar, y esto ha sido explotado como un mecanismo para la entrega de medicamentos contra el cáncer para cáncer células. Por otra parte, dependiendo de la química de la droga, encapsulando la droga puede ser ventajoso para evitar la degradación de la droga durante la circulación en vivo. Por lo tanto, en este estudio, este diseño se utiliza para fabricar nanopartículas recubiertas de lípidos de la droga anticáncer falcarindiol, proporcionando un potencial nuevo sistema de falcarindiol para estabilizar su estructura química contra la degradación y mejorar su absorción por los tumores. Falcarindiol nanopartículas, con una monocapa de fosfolípidos y colesterol encapsulando la base droga purificada de la partícula, fueron diseñadas. El recubrimiento de la monocapa de lípidos consiste en 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), colesterol (col) y 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) junto con el fluorescente etiqueta de DiI (relaciones molares de 43:50:5:2). Las nanopartículas son fabricadas mediante el método de la inyección rápida, que es una técnica rápida y sencilla para precipitar las nanopartículas por buen solvente para intercambio anti-solvente. Consiste en una inyección rápida de una solución de etanol que contiene los componentes de nanopartículas en una fase acuosa. El tamaño de las nanopartículas fluorescentes se mide con dispersión ligera dinámica (DLS) en 74,1 ± 6.7 nm. La absorción de las nanopartículas se prueba en humanos las células madre mesenquimales (hMSCs) y reflejada usando fluorescencia y microscopía confocal. La absorción de las nanopartículas se observa en hMSCs, sugiriendo la posibilidad de que un fármaco estable entrega sistema de falcarindiol.

Introduction

Las nanopartículas recubiertas de lípidos están viendo un mayor interés en cuanto a su función como sistemas de entrega de fármacos para el cáncer la terapia1. Tipos de cáncer tienen una reprogramación metabólica de lípidos alterado2 y una necesidad creciente de colesterol proliferar3. Que sobreexpresan LDLs1 y toman en LDLs más que las células normales, en la medida en que cuenta de LDL de un paciente de cáncer incluso puede bajar4. Captación de LDL promueve fenotipos agresivos5 dando por resultado la proliferación e invasión en cáncer de mama6. Una abundancia de receptores de LDL (LDLRs) es un indicador pronóstico de potencial metastásico7. Inspirado por el LDL y su absorción por las células de cáncer, una nueva estrategia ha sido llamada: hacer la droga como alimento del cáncer8. Así, estos nuevas nanopartículas droga entrega diseños8,9,10 se han inspirado en el diseño base y estabilizado de lípido de las LDLs natural11 como un mecanismo para la entrega de medicamentos contra el cáncer a las células cancerosas. Este pasivo a sistema soporta encapsulamiento de, especialmente, fármacos hidrofóbicos, que generalmente se dan en forma de dosificación oral pero proporcionan sólo una pequeña cantidad de la droga a la circulación sanguínea, limitando así su eficacia esperada12. Que con los liposomas stealth13, una capa de polietilenglicol (PEG) ayuda a reducir cualquier respuesta inmunológica y extiende la circulación en el torrente sanguíneo para la absorción óptima del tumor por la supuesta mayor penetración y efecto de retención (EPR) 14 , 15. sin embargo, además de, en algunos casos, la inestabilidad en la circulación y distribución indeseable en el sistema16, algunos obstáculos siguen siendo sin resolver, como cómo y en qué medida dichas nanopartículas se toman en las células y lo que es su destino intracelular. Es aquí que este trabajo aborda la incorporación de nanopartículas de un medicamento contra el cáncer hidrofóbico falcarindiol, usando confocal y epifluorescencia técnicas de imagen.

El objetivo del estudio es fabricar nanopartículas recubiertas de lípidos de falcarindiol y estudiar su absorción intracelular de hMSCs. De tal modo, potencialmente estabilizar su administración, superar los retos asociados con la entrega y mejora la biodisponibilidad. Así la evaluación de un nuevo sistema de entrega de este medicamento contra el cáncer. Previamente, falcarindiol ha sido administrados oral a través de una alta concentración purificada falcarindiol como un suplemento de alimentos17. Sin embargo, hay necesidad de un enfoque más estructurado ofrecer esta droga prometedora. Por lo tanto, falcarindiol nanopartículas, fosfolípidos y colesterol encapsulando monocapa con la droga purificada que constituye el núcleo de la partícula, fueron diseñadas. El método de inyección rápida del solvente cambiando, recientemente desarrollado por Needham et al. 8, se utiliza en este estudio para encapsular el falcarindiol polyacetylene.

El método se ha utilizado anteriormente para la fabricación de nanopartículas lipídicas para encapsular diagnóstico proyección de imagen agentes18,19, así como probar drogas (orlistat, estearato de Niclosamida) y moléculas (triolein)27 8 ,27,28. Es una técnica relativamente sencilla cuando se lleva a cabo con las moléculas del derecho. Forma partículas de combinar, en el límite de su carga crítica (~ 20 nm de diámetro) de altamente insolubles hidrofóbicos solutos disueltos en un disolvente polar. El intercambio de solvente es logrado por una rápida inyección de la solución orgánica en exceso de antisolvent (generalmente, una fase acuosa en un 1:9 orgánica: cociente del volumen acuoso)20,21.

El diseño compositivo de las nanopartículas dan lugar a múltiples ventajas. Los componentes de DSPC:Chol proporcionan una monocapa muy apretada, casi impermeable, biocompatible y biodegradable. La clavija proporciona una interfaz sterically estabilizador que actúa como un escudo de opsonización por el sistema inmunológico, frenar cualquier absorción por el sistema reticuloendotelial (hígado y bazo) y protección contra el sistema de fagocitos mononucleares, evitando sus retención y degradación por el sistema inmune y por lo tanto, aumenta su circulación en sangre22medio tiempo. Esto permite que las partículas que circulan hasta que extravasate en sitios enfermos, tales como tumores, donde el sistema vascular está agujereado, permitiendo el efecto EPR dar lugar a acumulación pasiva de las partículas. Además, la capa de lípidos permite un mejor control sobre el tamaño de las nanopartículas cinéticamente atrapando el núcleo en su núcleo fundamental dimensión27,28. Los lípidos inducen varias propiedades de superficie (incluyendo el péptido a, que aún no estaba disponible para este proyecto), un núcleo de fármaco puro y una baja polidispersidad22,27,28. El método utilizado para el análisis granulométrico es DLS, una técnica que permite a los investigadores medir el tamaño de un gran número de partículas al mismo tiempo. Sin embargo, este método puede sesgar las mediciones a los tamaños más grandes, si las nanopartículas no son generación23. Este problema es evaluado con la capa de lípidos así. Más detalles de estos diseños fundamentales y la cuantificación de todas las características se dan en otras publicaciones27,28.

La droga encapsulada en las nanopartículas es falcarindiol, un polyacetylene dietético encontrado en las plantas de la familia Apiaceae. Es un metabolito secundario alifático C17poliacetilenos del tipo de que se ha encontrado para mostrar efectos de promoción de la salud, incluyendo actividad antiinflamatoria, efectos antibacterianos y citotoxicidad contra una amplia gama de líneas celulares de cáncer. Su alta reactividad se relaciona con su capacidad para interactuar con diferentes biomoléculas, actuando como un agente alquilante muy reactivo contra mercapto y grupos amino24. Falcarindiol previamente se ha demostrado para reducir el número de lesiones neoplásicas en la colon17,25, aunque los mecanismos biológicos son todavía desconocidos. Sin embargo, es pensamiento que interactúa con biomoléculas como el NF-κB, COX1, COX-2, y citocinas, inhibiendo sus progresión y la célula proliferación procesos tumorales, llevando a la detención del ciclo celular, retículo endoplásmico (ER) estrés y apoptosis 17,26 en células de cáncer. Falcarindiol es utilizado en este estudio como medicamento contra un ejemplo debido a su potencial contra el cáncer y el mecanismo se están estudiando actualmente, y porque muestra efectos prometedores contra el cáncer. La absorción celular de las nanopartículas es probada en hMSCs y reflejada usando epifluorescencia y microscopía confocal. Este tipo de célula fue elegido debido a su gran tamaño, lo que es ideal para microscopía.

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Protocol

1. síntesis por solvente rápido desplazamiento técnica

  1. Establecer lo siguiente para la preparación de las nanopartículas: un concentrador calentador/muestra de bloque, un desecador, un sistema de distribución digital con una jeringa de vidrio de 1 mL, un frasco de vidrio de 12 mL, un agitador magnético, una pulga magnético (15 mm x 4,5 mm, en una forma cilíndrica con capa de politetrafluoroetileno [PTFE]) dentro del frasco de cristal y un evaporador rotatorio.
  2. Distribuir 2,4 mL de 250 μm falcarindiol caldo disuelto en una mezcla agua 70% EtOH en un vial de centelleo.
  3. Evaporar la fracción líquida, con el concentrador de la muestra durante aproximadamente 4 horas, para obtener falcarindiol seco.
    1. Introducir el frasco centelleo en el calentador del bloque; el concentrador de la muestra entrega gas sobre la muestra utilizando una aguja de acero inoxidable, concentrar la muestra. Se evaporan a temperatura ambiente; No utilice calor.
  4. Una vez seco, agregar los siguientes componentes de la capa de lípidos en el vial de centelleo mencionado: 16,3 μl de 31,64 mM DSPC cloroformo solución 3.4 μL de solución stock de cloroformo 17,82 mM DSPE PEG 2000, 24 μl del stock de cloroformo colesterol 25 mM solución y 6 μl de 4 mM DiI solución cloroformo. Limpie la jeringa con cloroformo después de agregar cada componente para evitar la contaminación cruzada.
    Atención: Inmediatamente cerrar los frascos que contienen los lípidos para que el solvente no se evaporan y, por lo tanto, modificar la concentración. Trabajar en una campana de humos.
    Nota: Las concentraciones de las soluciones madre cloroformo pueden variar, dependiendo del proveedor de productos químicos o las diluciones hechas en el laboratorio.
  5. Envolver el frasco con papel de aluminio para proteger DiI de la luz. Dejar la muestra durante la noche en el desecador para evaporar el cloroformo.
  6. Disolver la muestra desecada en etanol absoluto hasta un volumen final de 1,2 mL, que da concentraciones finales de DSPC DSPE PEG 2000, colesterol y DiI de 0,43 mM, 0.05 mM, 0,5 mM y 0.02 mM, respectivamente. Esta solución representa la fase orgánica.
  7. Tomar el frasco de vidrio de 12 mL, llenar con 9 mL de agua purificada y agregue la pulga magnética en el vial que contiene 9 mL de agua. Mantener el frasco en el agitador magnético, agitación a 500 rpm (figura 1).
  8. Conecte la jeringa de vidrio de 1 mL para el sistema de aplicación y limpieza con cloroformo para evitar cualquier contaminación. Esto, poco a poco tirando el cloroformo en la jeringa de vidrio y distribución manualmente en un recolector por lo menos 10 tiems.
    PRECAUCIÓN: Esto debe hacerse bajo una campana de humos.
  9. Preparar la jeringa con etanol. Cebado reemplaza el viejo solvente, así como elimina burbujas de aire.
    PRECAUCIÓN: Esto debe hacerse bajo una campana de humos.
  10. Usando la jeringa, aspirar 1 mL de la fase orgánica.
  11. Inserte la jeringa en el frasco de cristal, hasta el centro de la marca de 9 mL de agua y mantener estable en el frasco (como se muestra en la figura 1).
  12. Inyectar la solución a la velocidad seleccionada de la inyección (μL/s 833) pulsando el botón de descarga en el sistema de dispensación (figura 2). Esto genera 10 mL de 50 μm recubiertos de lípidos nanopartículas de falcarindiol en agua que contienen el etanol al 10%.
    Nota: Esta velocidad de inyección se ha encontrado para lograr las partículas más finas, obteniendo una distribución de tamaño de partícula estrecha. Es fundamental para que la jeringa esté en el centro, la constante y la recta al dispensar la solución.
  13. Inmediatamente después de la inyección, sacar la cubeta de agitador y transferir la muestra a un matraz de fondo redondo de 50 mL (FBR).
  14. Coloque el RBF en el rotavapor y evaporar a 1 mL de solvente orgánico, mediante el evaporador rotatorio a temperatura ambiente. Evitar la formación de burbujas.
    Nota: Este paso llevará ~ 5 min.
  15. Transferir la suspensión de nanopartículas de la RBF a otro frasco de vidrio de 12 mL. Asegúrese de que el volumen es de 9 mL. Dividir la muestra en dos frascos de vidrio de 12 mL (puesto 4,5 mL en cada uno).
  16. Agregar 0,5 mL de agua ultrapura y uno de los viales de 0,5 mL de 10 x tampón fosfato salino (PBS) al otro frasco. Tomar 1 ml de cada muestra para la medición de tamaño de partícula.

2. análisis granulométrico utilizando la técnica DLS

Nota: Medidas del tamaño se llevaron a cabo utilizando un analizador DLS que determina la distribución de tamaño de partícula. Está equipado con laser 100 mW que opera en una longitud de onda de 662.2 nm y con un detector de fotodiodo de avalancha en un ángulo de 90° para el ángulo de incidencia. El haz es dispersado por las nanopartículas y detectado por el fotodetector.

  1. Encienda el instrumento DLS y fijar la temperatura deseada a 20 ° C, hasta que se estabilice.
  2. Configurar los parámetros del instrumento como sigue: tiempo de la adquisición de datos = 4 s, el número de adquisiciones = 30, función de atenuación automática = y los límites de tiempo auto-atenuación = 0.
  3. Llene la cubeta de plástico con 1 mL de la suspensión de nanopartículas y comenzar la medición.
  4. Informe el tamaño medido según el solvente utilizado (agua o PBS).
    Nota: La medición en PBS se realiza para tener una idea aproximada del tamaño de las células en el medio en el tratamiento de las células. El tratamiento celular se hará con las nanopartículas disueltas en agua.
  5. Repita las mediciones 24 h después de la síntesis, para verificar la agregación de las partículas.

3. tratamiento

  1. Crece hMSCs medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina, en una cámara humified a 37° C con 5% CO2.
    PRECAUCIÓN: El trabajo en la campana de Flujo Laminar estéril para los pasos 3.1, 3.2 y 3.3.
  2. Las células de la semilla aproximadamente 50.000 para obtener una densidad celular de aproximadamente 30% previamente esterilizado como absoluto EtOH #1.5 cubreobjetos colocan en placas de 6 pocillos. Añadir MEM para tener un volumen final de 3 mL en cada pozo. Incubar durante 24 h en las mismas condiciones que en el paso 3.1. Las células 24 h antes del tratamiento de la semilla.
    Nota: Es crítico de que las células se siembran por lo menos 24 h antes del tratamiento de nanopartículas, para asegurarse de que las células están en una confluencia adecuada.
  3. Sin quitar el medio, agregar 3 μl de la solución de nanopartículas, para una concentración final falcarindiol de 5 μm. Incubar durante 24 h en las mismas condiciones que en el paso 3.1.
    Nota: Preparación de las nanopartículas se llevó a cabo en el día del tratamiento celular, para evitar la agregación de las partículas.
  4. Posteriormente, después de 24 h de tratamiento, lave las células 2 x con PBS, fijar en formaldehído al 4% por 10 min a temperatura ambiente y almacenarlas en PBS a 4° C por hasta varios meses hasta que la imagen.
    PRECAUCIÓN: Esto debe hacerse bajo una campana de humos.
    1. Como alternativa, después de la fijación, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción nuclear se puede realizar. Para ello, después de fijar las células, permeabilizarlos con 0,1% Tritón X-100 durante 30 minutos, lavar x 2 con PBS y mancha con 250 μl de 300 nM DAPI durante 5 minutos protegido de la luz.

4. microscopía

  1. Microscopía de fluorescencia
    1. Usar un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con una cámara CCD multiplicada electrón para adquirir imágenes. Utilice el 150 x objetivo de aceite NA 1.45 y el canal del GFP LP.
  2. Microscopía confocal
    1. Adquisición de imágenes de microscopía confocal, con 63 x NA 1.4 objetivo de aceite, un láser de argón (514 nm) DiI, y un láser de dos fotones (780 nm) para DAPI, para verificar la absorción de las nanopartículas en las células.

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Representative Results

Dos diferentes tipos de nanopartículas fueron fabricado, es decir, puro falcarindiol nanopartículas y nanopartículas recubiertas de lípidos falcarindiol. Se probaron diferentes concentraciones de lípidos y colesterol. Como se muestra en la tabla 1, las nanopartículas sin recubrimiento formado en el agua y mide en PBS tenían un diámetro de 71 ± 20.3 nm con un índice de polidispersidad (PDI) de 0.571. Estos parámetros fueron medidos en un analizador de DLS. Las nanopartículas recubiertas de lípidos de falcarindiol utilizadas en los experimentos y así como el tinte fluorescente, DiI, eran de un tamaño similar, es decir, de 74,1 ± 6.7 nm; sin embargo, ellos fueron encontrados para ser relativamente monodispersados y tuvieron un bajo PDI de 0.182, que indica una menor distribución de tamaños de partícula, ya que la PDI describe la distribución de tamaño de la población de nanopartículas. Generalmente, una PDI por debajo de 0,3 es deseada cuando fabricación de nanopartículas para propósitos farmacéuticos.

Después de la fabricación, el tamaño de partícula se midió después de 3 h y 24 h, tiempos basados en la demora necesaria para la adición de nanopartículas para el cultivo celular. No hay agregación se observó después de 24 h, sin embargo los datos no se visualizan en este manuscrito como se informará en otro estudio, y se recomienda para probar la estabilidad de la partícula después de 24 h. Después de confirmar la estabilidad del tamaño de las nanopartículas recubiertas de lípidos, nanopartículas DiI-labeled, recubiertos de lípidos fueron fabricadas siguiendo el protocolo y, eventualmente, utilizadas para el estudio de la absorción. Para cada estudio, se preparó una muestra fresca de nanopartículas. Un esquema de estructura de nanopartículas falcarindiol final se muestra en la figura 3y datos de tamaño de la partícula después de fabricación se muestra en la tabla 1, así como la medición tomada 3 h después de la fabricación.

Como una primera observación de las nanopartículas dentro de las células, se adquirieron imágenes de microscopía de epifluorescencia después de 24 h de tratamiento. Las nanopartículas fueron visualizadas como puntos blancos brillantes, y puede ser presumido que las nanopartículas se encontraban dentro de las células, que rodea el núcleo (figura 4A).

Para verificar que nanopartículas falcarindiol habían entrado en las células, la microscopia confocal fue realizada en hMSCs tratados durante 24 h. Confocal imágenes confirmaron que las nanopartículas habían entrado en las células, y un gran número de nanopartículas estaban dispersos en el citoplasma en cada célula (figura 4B-D). Estos resultados muestran que las nanopartículas actúan como un sistema estable de la droga para falcarindiol.

Figure 1
Figura 1 : Instalación de preparación de nanopartículas que muestra el montaje para la inyección bajo agitación27. La configuración consiste en la autopipette con una jeringa de vidrio de 1 mL con 1 mL de la solución de etanol que contiene componentes de las nanopartículas. El frasco de vidrio contiene 9 mL de agua y la pulga magnética se coloca sobre el agitador magnético. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Esquema de mezcla de solventes en el método de la inyección rápida del solvente cambio27. Los paneles muestran la inyección de 1 mL de etanol fase que contiene componentes de nanopartículas a una velocidad de 833 μl/s en 9 mL de agua y siempre bajo agitación a 500 rpm. La inyección rápida con la mezcla caótica de la solución de etanol que contiene componentes de las nanopartículas (falcarindiol, DSPC, colesterol, DSPE PEG 2000, DiI) en el antisolvent (agua), leadd a la formación de las nanopartículas. El color es dado por DiI. Puede observarse cómo se mezcla la solución de etanol, aumentan rápidamente su concentración y las nanopartículas se forman. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Esquema de la estructura de las nanopartículas falcarindiol final. Estructura de nanopartículas, incluyendo DSPC, DSPE PEG 2000, colesterol, DiI y falcarindiol. Los diferentes componentes se escalan según sus concentraciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Imágenes de las nanopartículas falcarindiol recubiertos de lípidos en células madre mesenquimales humanas. (A) imagen de microscopía de epifluorescencia de hMSCs tratadas con nanopartículas falcarindiol durante 24 h. Los siguientes paneles muestran imágenes de microscopía confocal de hMSCs tratadas con nanopartículas falcarindiol para 24 h: (B) Mancha DAPI de núcleos, núcleos de nanopartículas y (D) una superposición de ambas imágenes, DiI (C) se muestran en azul y la nanopartículas en rojo. Las barras de escala son 10 μm. nanopartículas se visualizan como puntos blancos brillantes en el citoplasma celular. La imágenes muestran que un gran número de nanopartículas ha entrado en las células después de 24 h de incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tipo de nanopartículas Solvente Tamaño de nanopartículas (nm) Polydisperisty (nm) Índice de polidispersidad (PDI)
Falcarindiol sin recubrimiento Agua 83.9 ± 23.9 0.571
PBS 71 ± 20,3 0.571
Recubiertos de lípidos Falcarindiol PBS 91.6 ± 6,4 0.141
PBS después de 3 horas 93.5 ± 5,7 0.122
Recubiertos de lípidos Falcarindiol + DiI PBS 74.1 ± 6,7 0.182

Tabla 1: diferentes diseños de las nanopartículas fabricadas. Índice de tamaño y la polidispersidad de las nanopartículas falcarindiol sintetizada, dependiendo del tipo de solvente y nanopartículas. Falcarindiol nanopartículas con y sin una capa de lípidos fueron fabricadas. Se probaron diferentes concentraciones de los componentes de la capa. La agregación de las partículas fue probada después de 3 horas.

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Discussion

Un protocolo detallado para la fabricación de nanopartículas recubiertas de lípidos para el suministro de medicamentos con el simple, método rápido, reproducible y escalable de inyección rápida de cambio solvente seguido27,28 y se presenta en este trabajo, como aplica a falcarindiol. Controlando la velocidad de la inyección de la fase orgánica fase acuosa y mediante el uso de lípidos de la capa en las concentraciones adecuadas para cubrir el núcleo falcarindiol, partícula en la gama de sub-100 nanómetro podría obtenerse con éxito. La posibilidad de polidispersidad inducido debido a la participación de la mezcla turbulenta para la precipitación de falcarindiol solo fue controlada por la presencia de lípidos de la capa. La estructura de estas nanopartículas recubiertas de lípidos se asemejó a las lipoproteínas de baja densidad, con la excepción de la exclusión de la kDa 500.000 nativos ApoB100 y la presencia adicional de lípidos PEG para la estabilidad estérica). Este sistema de entrega de droga pasivamente dirigida permite la encapsulación de una amplia gama de medicamentos especialmente hidrofóbicos y materiales diagnósticos18,19, reduciendo la respuesta inmunológica y aumentando la acumulación en los tejidos cancerosos16,18. Además, dependiendo de las reacciones de degradación de la droga (p. ej., hidrólisis, enzymolysis), el sistema de entrega de drogas protege el fármaco de la degradación durante su circulación en vivo.

Por lo tanto, falcarindiol nanopartículas, con una monocapa de lípidos encapsulado que contiene un núcleo puro de la droga purificada, fueron diseñadas y fabricadas. El revestimiento de monocapa lipídica consistió en DSPC, colesterol y DSPE PEG 2000, con la etiqueta fluorescente DiI. La fabricación de las partículas se llevó a cabo utilizando el método de la inyección rápida de cambio de disolventes, que consiste en una inyección rápida de una solución de etanol que contiene los componentes de las nanopartículas en un exceso de fase acuosa (1:9). El tamaño de las nanopartículas se midió usando DLS, y la absorción de las nanopartículas se examinó en hMSCs y reflejada usando fluorescencia y microscopía confocal.

Sin recubrimiento de nanopartículas pueden obtenerse también, con las dimensiones de 71 ± 20.3 nanómetro. Sin embargo, después de seguir el protocolo descrito, nanopartículas de 74,1 nm ± 6.7 nm, con valores de polidispersidad de 0.182, fueron fabricadas. Así, después de modificar las nanopartículas mediante la adición de la capa de lípidos, el tamaño y la PDI de las nanopartículas era reducido, haciendo de ellos más conveniente para la droga entrega.

Es importante ser muy consciente de los pasos críticos en el protocolo, como la importancia de la posición de la jeringa cuando inyectar la fase orgánica, la preparación de las nanopartículas en el mismo día del tratamiento para evitar la agregación y la siembra de las células el día antes para asegurar nivel de confluencia adecuada. De hecho, todos los pasos en la primera parte del protocolo pueden considerarse críticos que tampoco afectan el tamaño de las nanopartículas o la concentración final del compuesto activo y lípidos de la capa. 'Concentración' como un parámetro importante, pasos 1.2, 1.4, 1.6, 1.15 y 1.16 son críticos. 'Tamaño de nanopartículas' como un parámetro importante, teniendo en cuenta los pasos 1.7, 1.11 y 1.12 son críticos.

Fluorescencia y microscopía confocal demostraron que las nanopartículas habían entrado en las células, y un gran número de nanopartículas estaban dispersos en el citoplasma de cada célula. Estos resultados sugieren que las nanopartículas diseñadas en este estudio pueden funcionar como un sistema de entrega de drogas nuevas y estables para falcarindiol.

Esta técnica proporciona un enfoque sencillo, rápido y reproducible para encapsular fármacos contra el cáncer diferentes, y las limitaciones del método se evaluaron con la capa de lípidos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Dr. Moustapha Kassem (Hospital de la Universidad de Odense, Dinamarca) de las células madre mesenquimales humanas. Los autores agradecen el centro médico de Bioimagen danés para el acceso a sus microscopios. Los autores agradecen las Carlsberg y Villum fundaciones para apoyo financiero (E.A.C.). Los autores reconocen el apoyo financiero proporcionado por el Premio Cátedra de Niels Bohr de la Fundación de investigación nacional danés.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) Microlab Aarhus A/S ML 33154LP
6 well plates Greiner Bio One International GmbH 657160
Absolute Ethanol EMD Millipore (VWR) EM8.18760.1000
Chloroform Rathburn Chemicals Ltd. RH1009
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P
Confocal Microscope Zeiss LSM510
Cover Slips thickness #1.5 Paul Marienfeld GmbH & Co 117650
Desiccator Self-build
DiI Invitrogen D282
DLS Beckman Coulter DelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 850365C 
DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 880120C
eVol XR SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. 2910200
Fetal Bovine serum Gibco 10270-106
Fluorescence Miccroscope Olymous IX81 With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
Incubator Panasonic  MCO-18AC
Magnetic flea VWR Chemicals 15 x 4.5 mm Cylindrical shape with PTFE coating
Magnetic stirrer IKA RT-10
Minimum Essential Media Gibco 32561-029
PBS tablets for cell culture VWR Chemicals 97062-732
Pen/strep VWR Chemicals 97063-708
Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) Thermo Fisher 10010031
Rotary Evaporator Rotavapor, Büchi Labortechnik AG R-210
Sample concentrator  Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC SBHCONC/1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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