Assorbimento di nuove nanoparticelle rivestite con lipidi contenenti Falcarindiol di cellule staminali mesenchimali umane

Bioengineering

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Summary

Questo articolo viene descritto l'incapsulamento di falcarindiol in nanoparticelle di nm 74 del lipido-rivestite. L'assorbimento cellulare delle nanoparticelle di cellule staminali umane in goccioline del lipido è monitorato da formazione immagine di fluorescenza e confocale. Le nanoparticelle sono fabbricate con il metodo di iniezione rapida di solvente spostando e loro dimensione viene misurata con la tecnica di dispersione della luce dinamica.

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Pipó-Ollé, E., Walke, P., Notabi, M. K., El-Houri, R. B., Østergaard Andersen, M., Needham, D., Arnspang, E. C. Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (144), e59094, doi:10.3791/59094 (2019).

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Abstract

Le nanoparticelle sono al centro di un crescente interesse in sistemi di drug delivery per la terapia del cancro. Nanoparticelle lipidiche rivestite sono ispirate nella struttura e dimensione lipoproteine a bassa densità (LDL) perché le cellule tumorali hanno una maggiore necessità di colesterolo a proliferare, e ciò è stata sfruttata come un meccanismo per la consegna di farmaci anticancro per cancro cellule. Inoltre, a seconda di chimica di droga, che incapsula il farmaco può essere vantaggioso per evitare il degrado della droga durante la circolazione in vivo. Pertanto, in questo studio, questo disegno è usato per fabbricare nanoparticelle rivestite con del lipido della falcarindiol farmaco anticancro, fornendo un potenziale nuovo delivery system di falcarindiol al fine di stabilizzare la sua struttura chimica contro il degrado e migliorare la assorbimento dai tumori. Nanoparticelle di Falcarindiol, con un monostrato di fosfolipidi e colesterolo che incapsula il nucleo di droga purificato della particella, sono state progettate. Il rivestimento monostrato lipidico è costituito da 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), colesterolo (Chol) e 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) insieme con il fluorescente etichetta DiI (rapporti molari di 43:50:5:2). Le nanoparticelle sono fabbricate utilizzando il metodo di iniezione rapida, che è una tecnica semplice e veloce per far precipitare le nanoparticelle di buono-solvente per lo scambio di anti-solvente. Si compone di un'iniezione rapida di una soluzione di etanolo contenente i componenti delle nanoparticelle in una fase acquosa. Le dimensioni delle nanoparticelle fluorescenti sono misurata mediante diffusione dinamica della luce (DLS) a 74,1 ± 6,7 nm. L'assorbimento delle nanoparticelle è testato in cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) e imaging utilizzando fluorescenza e microscopia confocale. L'assorbimento delle nanoparticelle è osservata in hMSCs, suggerente il potenziale per tale un sistema di consegna di droga stabile per falcarindiol.

Introduction

Nanoparticelle lipidiche rivestite stanno vedendo un crescente interesse per quanto riguarda la loro funzione come sistemi di drug delivery per cancro terapia1. Tumori hanno una riprogrammazione del lipido-metabolica alterata2 e una maggiore necessità di colesterolo a proliferare3. Essi dei overexpress LDLs1 e prendere in più LDLs rispetto alle cellule normali, nella misura in cui conte di LDL di un malato di cancro possono anche andare verso il basso4. L'assorbimento di LDL promuove fenotipi aggressivo5 conseguente proliferazione ed invasione nel seno cancro6. Un'abbondanza di recettori per le LDL (LDLRs) è un indicatore prognostico di potenziale metastatico7. Ispirato da LDL e relativo assorbimento dalle cellule tumorali, una nuova strategia è stata chiamata: rendere il farmaco simile cibo del cancro8. Così, questi nuove nanoparticelle droga consegna disegni8,9,10 sono stati ispirati dal design nucleo - e del lipido-stabilizzato del naturale LDLs11 come un meccanismo per la distribuzione di farmaci antitumorali alle cellule tumorali. Questo passivo consegna sistema di targeting supporta l'incapsulamento di, soprattutto, farmaci idrofobici, che di solito sono indicati nel modulo di dosaggio orale ma forniscono solo una piccola quantità di droghe nel flusso sanguigno, limitando così la loro efficacia attesa12. Come con i liposomi stealth13, un rivestimento di polietilene glicole (spina) aiuta a ridurre qualsiasi risposta immunologica ed estende la circolazione nel flusso sanguigno per assorbimento ottimale del tumore tramite la presunta maggiore permeazione ed effetto di ritegno (EPR) 14 , 15. Tuttavia, oltre a, in alcuni casi, l'instabilità nella circolazione e distribuzione indesiderabili nel sistema16, alcuni ostacoli rimangono irrisolti, come ad esempio come e in quale misura tali nanoparticelle sono prese dalle cellule e che cosa è loro destino intracellulare. È qui che questo libro affronta l'assorbimento delle nanoparticelle di un particolare farmaco anticancro idrofobo falcarindiol, utilizzando confocale ed epifluorescenza tecniche di imaging.

L'obiettivo dello studio è per fabbricare nanoparticelle lipidiche-rivestite di falcarindiol e di studiare il loro assorbimento intracellulare in hMSCs. Quindi, potenzialmente stabilizzando la sua amministrazione, superando le sfide connesse con la consegna e migliorando la biodisponibilità. Così valutare un nuovo sistema di consegna per questo farmaco anticancro. In precedenza, falcarindiol è stato amministrato oralmente tramite una falcarindiol alta concentrazione purificato come un cibo supplemento17. Tuttavia, c'è necessità di un approccio più strutturato fornire questo farmaco promettente. Di conseguenza, le nanoparticelle di falcarindiol, con fosfolipidi e colesterolo incapsulamento monostrato con la droga purificata che costituisce il nucleo della particella, sono state progettate. Il metodo di iniezione rapida di solvente spostando, come recentemente sviluppato da Needham et al. 8, viene utilizzato in questo studio per incapsulare il poliacetilene falcarindiol.

Il metodo è stato utilizzato in precedenza per la fabbricazione di nanoparticelle lipidiche per incapsulare diagnostica imaging agenti18,19, nonché di testare molecole (trioleina)27 e farmaci (orlistat, niclosamide stearato)8 ,27,28. È una tecnica relativamente semplice quando effettuate con le molecole di destra. Forma particelle di dimensioni nanometriche, al limite della loro critica nucleazione (~ 20 nm di diametro), di soluti idrofobi altamente insolubili disciolti in un solvente polare. Il cambio di solvente avviene mediante una rapida iniezione della soluzione organica in un eccesso di antisolvente (di solito, una fase acquosa in un organico di 1:9: rapporto volume acquoso)20,21.

Il disegno compositivo delle nanoparticelle danno luogo a molteplici vantaggi. I componenti di DSPC:Chol forniscono un monostrato molto stretto, quasi impermeabile, biocompatibile e biodegradabile. Il PEG fornisce un'interfaccia stericamente stabilizzante che agisce come uno scudo di opsonizzazione dal sistema immunitario, rallentando alcun assorbimento dal sistema reticoloendoteliale (fegato e milza) e protezione contro il sistema dei fagociti mononucleari, impedendo loro conservazione e degradazione dal sistema immunitario e quindi, aumentando la loro circolazione metà-tempo nel sangue22. Ciò permette che le particelle a circolare fino a quando essi MPEG al malato siti, quali i tumori, dove il sistema vascolare è che perde, permettendo EPR-effetto dare origine a accumulazione passiva delle particelle. Inoltre, il mantello lipidico permette di avere un migliore controllo sulle dimensioni dei nanoparticelle intrappolando cineticamente il nucleo al suo nucleo fondamentale dimensione27,28. Lipidi inducono varie proprietà della superficie (tra cui peptide di targeting, che non era ancora disponibile per questo progetto), un nucleo di droga pura e un basso polidispersità22,27,28. Il metodo utilizzato per analisi granulometrica è DLS, una tecnica che permette ai ricercatori di misurare le dimensioni di un gran numero di particelle allo stesso tempo. Tuttavia, questo metodo può polarizzare le misurazioni di dimensioni maggiori, se le nanoparticelle non sono monodispersed23. Questo problema è valutato con il mantello lipidico pure. Maggiori dettagli di questi disegni fondamentali e la quantificazione di tutte le caratteristiche sono date in altre pubblicazioni27,28.

Il farmaco incapsulato in nanoparticelle è falcarindiol, un dietetico poliacetilene trovati in piante della famiglia delle Apiaceae. È un metabolita secondario dal alifatici C17poliacetileni tipo che è stato trovato per visualizzare gli effetti di promozione della salute, compreso attività antinfiammatoria, effetti antibatterici e citotossicità contro una vasta gamma di linee cellulari del cancro. Sua alta reattività è relativo alla sua capacità di interagire con diverse biomolecole, che agisce come un agente alchilante molto reattivo contro mercapto e gruppi amminici24. Falcarindiol precedentemente è stato indicato per ridurre il numero di lesioni neoplastiche nei due punti17,25, anche se i meccanismi biologici sono ancora sconosciuti. Tuttavia, è pensiero che interagisce con biomolecole quali NF-κB, COX1, COX-2, e citochine, inibendo il loro tumore progressione e cellula proliferazione processi, che portano ad arrestare il ciclo cellulare, reticolo endoplasmico (ER) lo stress e l'apoptosi 17,26 in cellule tumorali. Falcarindiol viene utilizzato in questo studio come farmaco anticancro esempio grazie al suo potenziale anticancro e il meccanismo sono attualmente in fase di studio, e perché dimostra gli effetti anticancro di promessa. L'assorbimento cellulare delle nanoparticelle è testato in hMSCs e imaging utilizzando epifluorescenza e microscopia confocale. Questo tipo di cella è stato scelto per via delle sue dimensioni, che li rende ideali per microscopia.

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Protocol

1. nanoparticella sintesi di solvente rapida tecnica di spostamento

  1. Impostare quanto segue per preparazione di nanoparticelle: un concentratore di blocco riscaldatore/campione, un essiccatore, un sistema di erogazione digitale con una siringa di vetro da 1 mL, un flaconcino di vetro di 12 mL, un agitatore magnetico, una pulce magnetico (15 mm x 4,5 mm, in una forma cilindrica con rivestimento di politetrafluoroetilene [PTFE]) dentro il flaconcino di vetro e un evaporatore rotatorio.
  2. Erogare 2,4 mL 250 µM falcarindiol Stock disciolto in 70% EtOH miscela acqua in un flaconcino di scintillazione.
  3. Evaporare la frazione liquida, con il concentratore di campione per circa 4 h, per ottenere falcarindiol asciutto.
    1. Inserire il flaconcino di scintillazione in blocco riscaldatore; il concentratore di campione trasporta gas sopra l'esempio utilizzando aghi in acciaio inox, concentrando il campione. Evaporare a temperatura ambiente; non utilizzare il calore.
  4. Una volta asciugato, aggiungere i seguenti componenti del rivestimento lipidico nella fiala di scintillazione suddetti: 16,3 µ l di 31,64 mM DSPC cloroformio soluzione stock, 3,4 µ l di soluzione madre di cloroformio 17,82 mM DSPE PEG 2000, 24 µ l di brodo di cloroformio colesterolo 25 mM soluzione e 6 µ l di 4mm DiI soluzione stock di cloroformio. Dopo l'aggiunta di ogni componente in modo da evitare la contaminazione incrociata, pulire la siringa con il cloroformio.
    Attenzione: Chiudere immediatamente le fiale contenente i lipidi, in modo che il solvente non evaporare e, quindi, modificare la concentrazione. Lavorare in una cappa aspirante.
    Nota: Le concentrazioni delle soluzioni di riserva di cloroformio possono variare, dipendendo il fornitore chimico o diluizioni realizzati in laboratorio.
  5. Avvolgere il flaconcino con foglio di alluminio per proteggere DiI dalla luce. Lasciar riposare il campione in un essiccatore per far evaporare il cloroformio.
  6. Sciogliere il campione essiccato in etanolo assoluto ad un volume finale di 1,2 mL, che dà le concentrazioni finali di DSPC, DSPE PEG 2000, colesterolo e DiI di 0,43 mM 0,05 mM, 0,5 mM e 0,02 mM, rispettivamente. Questa soluzione rappresenta la fase organica.
  7. Prendere la fiala in vetro 12 mL, riempirlo con 9 mL di acqua purificata e, aggiungere la pulce magnetica nel flaconcino contenente 9 mL di acqua. Tenere il flaconcino sull'agitatore magnetico, mescolando 500 giri/min (Figura 1).
  8. Collegare la siringa di vetro da 1 mL per il sistema di erogazione e pulirlo con cloroformio per evitare qualsiasi contaminazione. Questo di, lentamente tirando il cloroformio nella siringa di vetro ed erogazione manualmente in un tiems almeno 10 di raccolta dei rifiuti.
    Attenzione: Questo deve essere fatto sotto una cappa aspirante.
  9. Adescare la siringa con etanolo. Adescamento sostituisce il vecchio solvente, come pure rimuove eventuali bolle d'aria.
    Attenzione: Questo deve essere fatto sotto una cappa aspirante.
  10. Usando la siringa, aspirare 1 mL di fase organica.
  11. Inserire la siringa nel flaconcino di vetro, fino alla metà della filigrana 9 mL e mantenerla costante in mezzo il flaconcino (come mostrato nella Figura 1).
  12. Iniettare la soluzione alla velocità selezionata di iniezione (833 µ l/s) premendo il pulsante di erogazione sul sistema di erogazione (Figura 2). Questo genera 10 mL di 50 µM nanoparticelle lipidiche-rivestite di falcarindiol in acqua contenente etanolo di 10%.
    Nota: La velocità di iniezione è stata trovata per raggiungere le particelle più fini, come ottenere una distribuzione granulometrica stretta. È fondamentale per assicurarsi che la siringa sia nel centro, stazionario e dritto quando la soluzione di erogazione.
  13. Immediatamente dopo l'iniezione, estrarre la cuvetta dall'agitatore e trasferire il campione di un pallone a sfondo sferico 50ml (RBF).
  14. Allegare il RBF per l'evaporatore rotante ed evaporare 1 mL di solvente organico, mediante evaporatore rotante a temperatura ambiente. Evitare la formazione di bolle in eccesso.
    Nota: Questo passaggio porterà ~ 5 min.
  15. Trasferire la sospensione di nanoparticelle da RBF per un'altra fiala di vetro di 12 mL. Assicurarsi che il volume sia 9 mL. Dividere il campione in due flaconcini di vetro 12ml (messo 4,5 mL ciascuna).
  16. Aggiungere 0,5 mL di acqua ultrapura per una delle fiale e 0,5 mL di tampone fosfato salino (PBS) nel flaconcino di altri: 10x. Prendere 1 ml di ogni campione per la misura di dimensione delle particelle.

2. granulometria utilizzando la tecnica DLS

Nota: Dimensione misurazioni sono state effettuate utilizzando un analizzatore di liste di distribuzione che determina distribuzioni di dimensione delle particelle. È dotato di un laser di 100 mW che opera ad una lunghezza d'onda di 662.2 nm e con un rilevatore di fotodiodo valanga posizionato ad angolo 90° per l'angolo di incidenza. Il fascio è sparsi di nanoparticelle e rilevato dalla cellula fotoelettrica.

  1. Accendere lo strumento DLS e impostare la temperatura a 20 ° C, finché non si stabilizza.
  2. Impostare i parametri dello strumento come segue: tempo di acquisizione di dati = 4 s, numero di acquisizioni = 30, funzione di auto-attenuazione = On e i limiti di tempo di auto-attenuazione = 0.
  3. Riempire la provetta di plastica con 1 mL di sospensione di nanoparticelle e avviare la misurazione.
  4. Segnala la dimensione misurata secondo il solvente usato (acqua o PBS).
    Nota: La misura in PBS è fatta per avere un'idea approssimativa della dimensione delle cellule nel mezzo quando si trattano le cellule. Il trattamento delle cellule avverrà con le nanoparticelle disciolta in acqua.
  5. Ripetere le misurazioni 24 h dopo la sintesi, per cercare di aggregazione delle particelle.

3. cell trattamento

  1. Crescere hMSCs in medium essenziale minimo (MEM) completate con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina, in una camera umificata a 37° C con 5% CO2.
    Attenzione: Lavorare in cappa a flusso laminare sterile per punti 3.1, 3.2 e 3.3.
  2. Seme circa 50.000 cellule per ottenere una densità di cella di circa il 30% sulle precedentemente sterilizzati di assoluto-EtOH #1.5 lamelle poste in piastre da 6 pozzetti. Aggiungere MEM per ottenere un volume finale di 3 mL in ciascun pozzetto. Incubare per 24 h alle stesse condizioni come descritto al punto 3.1. Seme le cellule 24 h prima del trattamento.
    Nota: È fondamentale che le cellule sono seminate almeno 24h prima del trattamento di nanoparticelle, per assicurarsi che le celle siano in una confluenza adeguata.
  3. Senza rimuovere il mezzo, aggiungere 3 µ l della soluzione di nanoparticelle, per una concentrazione finale falcarindiol di 5 µM. Incubare per 24 h nelle stesse condizioni come descritto al punto 3.1.
    Nota: Preparazione di nanoparticelle è stato effettuato il giorno del trattamento delle cellule, per evitare l'aggregazione delle particelle.
  4. Successivamente, dopo 24 h di trattamento, lavare le cellule 2 x con PBS, fissandole in formaldeide 4% per 10 min a temperatura ambiente e memorizzarli in PBS a 4° C per fino a parecchi mesi fino a quando imaged.
    Attenzione: Questo deve essere fatto sotto una cappa aspirante.
    1. In alternativa, dopo la fissazione, un 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) di macchiatura nucleare può essere eseguita. Per questo, dopo aver sistemato le cellule, li permeabilize con 0,1% Triton X-100 per 30 min, lavarli 2 volte con PBS e li macchia con 250 µ l di 300 nM DAPI per 5 minuti, al riparo dalla luce.

4. microscopia

  1. Microscopia a fluorescenza
    1. Utilizzare un microscopio a fluorescenza widefield equipaggiato con una telecamera CCD elettrone-moltiplicato per acquisire immagini. Utilizzare il 150 x obiettivo olio NA 1,45 e il canale di GFP LP.
  2. Microscopia confocale
    1. Acquisire immagini di microscopia confocale, utilizzando il 63 x NA 1.4 obiettivo di olio, un laser ad Argon (514 nm) per DiI e di un laser di due fotoni (780 nm) per DAPI, per verificare l'assorbimento delle nanoparticelle nelle cellule.

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Representative Results

Due diversi tipi di nanoparticelle sono stati fabbricati, vale a dire puro falcarindiol nanoparticelle e nanoparticelle rivestite con lipidi falcarindiol. Le varie concentrazioni di lipidi e di colesterolo sono state testate. Come illustrato nella tabella 1, le nanoparticelle non patinate formata in acqua e misurato in PBS avevano un diametro di 71 ± 20,3 nm con un indice di polidispersione (PDI) di 0,571. Tali parametri sono stati misurati su un analizzatore di liste di distribuzione. Le nanoparticelle rivestite con del lipido di falcarindiol utilizzati negli esperimenti e quindi tra cui il colorante fluorescente, DiI, erano di dimensioni simili, vale a dire 74,1 ± 6,7 nm; Tuttavia, essi sono stati trovati per essere relativamente monodispersed e aveva un PDI inferiore di 0.182, che indica una distribuzione più piccola delle dimensioni delle particelle, poiché PDI descrive la distribuzione delle dimensioni della popolazione di nanoparticelle. Generalmente, un PDI sotto 0,3 è desiderato quando fabbricazione di nanoparticelle per scopi farmaceutici.

Dopo la fabbricazione, la dimensione delle particelle è stata misurata dopo 3 h e 24 h, tempi basati sul ritardo necessario per l'aggiunta di nanoparticelle per la coltura delle cellule. Non è stato osservato dopo 24 h, tuttavia i dati non mostrati in questo manoscritto come verrà segnalato in un altro studio, e si raccomanda di testare per la stabilità della particella dopo 24 h. Dopo aver confermato la stabilità di dimensione delle nanoparticelle rivestite su lipidi, DiI-etichettato, rivestite con lipidi nanoparticelle erano fabbricate seguendo il protocollo e, alla fine, utilizzate per lo studio di assorbimento. Per ogni studio, è stato preparato un campione fresco di nanoparticelle. Un disegno schematico della struttura delle nanoparticelle falcarindiol finale è mostrato nella Figura 3e dati relativi alle dimensioni della particella dopo fabbricazione è mostrato in tabella 1, come pure la misura presa 3 h dopo la fabbricazione.

Come una prima osservazione delle nanoparticelle all'interno delle cellule, epifluorescenza microscopia immagini sono state acquisite dopo 24 h di trattamento. Le nanoparticelle sono state visualizzate come punti luminosi bianchi, e si potrebbe ipotizzare che le nanoparticelle sono state situate all'interno delle cellule, che circonda il nucleo (Figura 4A).

Per verificare che le nanoparticelle falcarindiol avevano inserito le cellule, la microscopia confocale è stata effettuata su hMSCs trattati per 24 h. confocale immagini ha confermato che le nanoparticelle avevano inserito le cellule, e un gran numero di nanoparticelle disperse nel citoplasma in ogni cellula (Figura 4B-D). Questi risultati indicano che le nanoparticelle agiscono come un sistema di consegna di droga stabile per falcarindiol.

Figure 1
Figura 1 : Installazione di preparazione di nanoparticelle risultati Assemblea per iniezione sotto agitazione27. La configurazione è costituito dal autopipette con una siringa di vetro da 1 mL riempita con 1 mL di soluzione etanolica contengono componenti di nanoparticelle. Il flaconcino di vetro contiene 9 mL di acqua e la pulce magnetica viene inserita sull'agitatore magnetico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Schematico della miscelazione di solventi nel metodo iniezione rapida di solvente spostando27. Pannelli mostrano l'iniezione di 1 mL di fase etanolica contenente componenti degli nanoparticelle ad una velocità di 833 µ l/s in 9 mL di acqua mescolando a 500 giri/min. L'iniezione rapida con la mescolanza caotica della soluzione etanolica contenente componenti delle nanoparticelle (falcarindiol, DSPC, colesterolo, DSPE PEG 2000, DiI) in antisolvente (acqua), leadd alla formazione delle nanoparticelle. Il colore è dato dai DiI. Si può osservare come la soluzione etanolica è mescolata, cresce rapidamente la sua concentrazione e le nanoparticelle sono formate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Schematica della struttura delle nanoparticelle finale falcarindiol. Struttura delle nanoparticelle, inclusi DSPC, DSPE PEG 2000, colesterolo, DiI e falcarindiol. I diversi componenti vengono ridimensionati secondo le loro concentrazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Immagini di nanoparticelle rivestite con lipidi falcarindiol in cellule staminali mesenchimali umane. (A) immagine di microscopia epifluorescenza delle hMSCs trattati con nanoparticelle di falcarindiol per 24 h. I pannelli seguenti mostrano immagini di microscopia confocal di hMSCs trattati con nanoparticelle di falcarindiol per 24 h.: (B) macchia DAPI dei nuclei, nuclei di nanoparticelle e (D) una sovrapposizione di due immagini, DiI (C) sono mostrati in blu e il nanoparticelle in rosso. Le barre di scala sono 10 µm. nanoparticelle vengono visualizzate come puntini bianchi luminosi nel citoplasma delle cellule. Le immagini mostrano che un gran numero di nanoparticelle hanno inserito le cellule dopo 24 h di incubazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tipo di nanoparticelle Solvente Dimensioni delle nanoparticelle (nm) Polydisperisty (nm) Indice di polidispersione (PDI)
Non patinata Falcarindiol Acqua 83,9 ± 23,9 0,571
PBS 71 ± 20,3 0,571
Lipidica rivestito Falcarindiol PBS 91,6 ± 6,4 0,141
PBS dopo 3h 93,5 ± 5,7 0,122
Lipidica rivestito Falcarindiol + DiI PBS 74,1 ± 6,7 0.182

Tabella 1: disegni differenti delle nanoparticelle fabbricate. Dimensioni e polidispersità indice delle nanoparticelle falcarindiol sintetizzati, a seconda del tipo di solvente e di nanoparticelle. Nanoparticelle di Falcarindiol con e senza un cappotto del lipido sono state fabbricate. Sono state testate varie concentrazioni dei componenti cappotto. L'aggregazione delle particelle è stato testato dopo 3 h.

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Discussion

Un protocollo dettagliato per la realizzazione di nanoparticelle lipidiche-rivestite per il drug delivery con il semplice, metodo di iniezione rapida veloce, riproducibile e scalabile di solvente spostando era seguita27,28 e viene presentato in questa carta, come applicato a falcarindiol. Controllando la velocità dell'iniezione della fase organica in fase acquosa e utilizzando i lipidi rivestimento a concentrazioni appropriate per rivestire il nucleo di falcarindiol, particella nel campo di sotto dei 100 nm potrebbe essere ottenuta con successo. La possibilità di polidispersione indotta a causa del coinvolgimento di miscelazione turbolenta per la precipitazione di falcarindiol da solo era controllata dalla presenza di lipidi di rivestimento. La struttura di queste nanoparticelle rivestite con del lipido ha assomigliato le lipoproteine a bassa densità con eccezione dell'esclusione del nativo kDa 500.000 ApoB100 e l'ulteriore presenza di PEG-lipidi per stabilità sterica). Questo sistema di consegna passivamente mirato di farmaci permette l'incapsulamento di una vasta gamma di farmaci soprattutto idrofobici e materiali diagnostici18,19, riducendo la risposta immunologica e aumentando l'accumulo in tessuti cancerogeni16,18. Inoltre, a seconda le reazioni di degradazione del farmaco (ad es., idrolisi, enzymolysis), il sistema di consegna della droga protegge il farmaco dalla degradazione durante la sua circolazione in vivo.

Pertanto, nanoparticelle di falcarindiol, con un monostrato lipidico-incapsulamento contenente un nucleo puro della droga purificata, progettate e fabbricate. Il rivestimento monostrato lipidico è costituito da DSPC, colesterolo e DSPE-PEG 2000, con l'etichetta fluorescente DiI. La fabbricazione delle particelle è stata effettuata utilizzando il metodo di iniezione rapida di spostamento solvente, che consiste in un'iniezione rapida di una soluzione etanolica contenente i componenti di nanoparticelle in un eccesso di fase acquosa (1:9). Le dimensioni delle nanoparticelle è stata misurata utilizzando le liste di distribuzione, e l'assorbimento delle nanoparticelle è stata esaminata in hMSCs e imaging utilizzando fluorescenza e microscopia confocale.

Possono essere ottenute anche nanoparticelle non patinate, con le dimensioni di 71 ± 20,3 nm. Tuttavia, dopo aver seguito il protocollo sopra descritto, nanoparticelle di 74,1 nm ± 6,7 nm, con valori di polidispersione di 0.182, furono fabbricate. Così, dopo aver modificato le nanoparticelle aggiungendo il mantello lipidico, le dimensioni e la PDI delle nanoparticelle è stata ridotta, rendendo loro più adatto della droga consegna.

È importante essere molto consapevoli delle fasi critiche nel protocollo, come ad esempio l'importanza della posizione siringa quando si inietta la fase organica, la preparazione delle nanoparticelle nello stesso giorno del trattamento per evitare l'aggregazione e la semina delle cellule il giorno prima per garantire adeguata confluenza livello. Infatti, tutti i passaggi nella prima parte del protocollo possono essere considerati critici come colpiscono sia le dimensioni delle nanoparticelle o la concentrazione finale del composto attivo e lipidi di rivestimento. Considerando «concentrazione» come un parametro importante, passaggi 1.2, 1.4, 1.6, 1.15 e 1.16 sono critici. Considerando 'nanoparticella size' come un parametro importante, passaggi 1.7, 1.11 e 1.12 sono critici.

Fluorescenza e microscopia confocale ha mostrato che le nanoparticelle avevano inserito le cellule, e un gran numero di nanoparticelle disperse nel citoplasma di ogni cellula. Questi risultati indicano che le nanoparticelle progettate in questo studio possono funzionare come un sistema di consegna della droga di nuovo e stabile per falcarindiol.

Questa tecnica fornisce un approccio semplice, veloce e riproducibile per incapsulare farmaci differenti del cancro, e le limitazioni del metodo sono valutate con il mantello lipidico.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Dr. Moustapha Kassem (Odense University Hospital, Danimarca) per le cellule staminali mesenchimali umane. Gli autori ringraziano il centro di Bioimmagini del medico danese per l'accesso ai loro microscopi. Gli autori ringraziano i fondamenti di Carlsberg e Villum sostegno finanziario (per E.A.C.). Gli autori riconoscono il sostegno finanziario fornito dal premio Niels Bohr cattedra dalla Danish National Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) Microlab Aarhus A/S ML 33154LP
6 well plates Greiner Bio One International GmbH 657160
Absolute Ethanol EMD Millipore (VWR) EM8.18760.1000
Chloroform Rathburn Chemicals Ltd. RH1009
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P
Confocal Microscope Zeiss LSM510
Cover Slips thickness #1.5 Paul Marienfeld GmbH & Co 117650
Desiccator Self-build
DiI Invitrogen D282
DLS Beckman Coulter DelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 850365C 
DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 880120C
eVol XR SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. 2910200
Fetal Bovine serum Gibco 10270-106
Fluorescence Miccroscope Olymous IX81 With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
Incubator Panasonic  MCO-18AC
Magnetic flea VWR Chemicals 15 x 4.5 mm Cylindrical shape with PTFE coating
Magnetic stirrer IKA RT-10
Minimum Essential Media Gibco 32561-029
PBS tablets for cell culture VWR Chemicals 97062-732
Pen/strep VWR Chemicals 97063-708
Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) Thermo Fisher 10010031
Rotary Evaporator Rotavapor, Büchi Labortechnik AG R-210
Sample concentrator  Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC SBHCONC/1

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References

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