Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

Bioengineering

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Summary

Dieser Artikel beschreibt die Verkapselung von Falcarindiol in Lipid-beschichtete 74 nm Nanopartikel. Die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln durch menschliche Stammzellen in Lipid Tröpfchen wird durch fluoreszierende und confocal Imaging überwacht. Nanopartikel werden hergestellt durch die schnelle Injektion Methode des Lösungsmittels verschieben und ihre Größe wird mit der dynamischen Lichtstreuung Technik gemessen.

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Pipó-Ollé, E., Walke, P., Notabi, M. K., El-Houri, R. B., Østergaard Andersen, M., Needham, D., Arnspang, E. C. Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (144), e59094, doi:10.3791/59094 (2019).

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Abstract

Nanopartikel sind der Schwerpunkt der ein erhöhtes Interesse an Drug-Delivery-Systeme für die Krebstherapie. Lipid-beschichteten Nanopartikel sind in Struktur und Größe von Low-Density-Lipoproteine (LDLs) inspiriert, weil Krebszellen einen erhöhten Bedarf an Cholesterin haben zu vermehren, und dies wurde als ein Mechanismus für die Bereitstellung von Krebsmedikamenten zu Krebs ausgeschöpft Zellen. Darüber hinaus kann je nach Medikament Chemie, Verkapselung der Drogenkonsums vorteilhaft, Abbau des Medikaments während der Zirkulation in vivo zu vermeiden sein. Dieses Design dient daher in dieser Studie zu fabrizieren Lipid-beschichteten Nanopartikel aus dem Krebsmedikament Falcarindiol, bietet eine potenzielle neue Abgabesystem von Falcarindiol um seine chemische Struktur gegen Abbau zu stabilisieren und zu verbessern ihre Aufnahme von Tumoren. Falcarindiol Nanopartikel, wurden mit einem Phospholipid und Cholesterin Monolage Verkapselung den gereinigten Droge Kern des Teilchens, entworfen. Die Lipid-Monolayer-Beschichtung besteht aus 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), Cholesterin (Chol) und 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) zusammen mit der Leuchtstoffröhre Label DiI (molare Verhältnis von 43:50:5:2). Die Nanopartikel sind hergestellt mit der schnelle Injektion Methode, die eine schnelle und einfache Technik, Nanopartikel durch gutes Lösungsmittel für Anti-Lösemittel Austausch auszufällen. Es besteht aus einer schnellen Injektion einer Ethanol-Lösung, die Nanopartikel-Komponenten in eine wässrige Phase enthält. Die Größe der fluoreszierende Nanopartikel wird mit dynamischen Lichtstreuung (DLS) bei 74.1 ± 6,7 nm gemessen. Die Aufnahme der Nanopartikel ist in humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) getestet und abgebildet, mit Fluoreszenz und konfokalen Mikroskopie. Die Aufnahme der Nanopartikel ist in hMSCs, was darauf hindeutet das Potenzial für ein solches stabile Drug Delivery System für Falcarindiol beobachtet.

Introduction

Lipid-beschichteten Nanopartikel sind ein erhöhtes Interesse hinsichtlich ihrer Funktion als Drug Delivery Systeme für Krebs-Therapie1sehen. Krebserkrankungen haben eine veränderte Lipid-Stoffwechsel Neuprogrammierung2 und ein erhöhter Bedarf an Cholesterin3vermehren. Sie overexpress LDLs1 und nehmen an mehr LDLs als normale Zellen, in dem Maße, in dem ein Krebspatient LDL Graf4noch gehen kann. LDL-Aufnahme fördert aggressive Phänotypen5 was Proliferation und Invasion im Brust-Krebs-6. Eine Fülle von LDL-Rezeptoren (LDLRs) ist ein prognostischer Indikator von metastasierendem potenzielle7. Inspiriert von der LDL und seine Aufnahme durch Krebszellen, eine neue Strategie ist genannt worden: die Droge, die aussehen wie der Krebs Lebensmittel machen8. Damit diese Nanopartikel Medikament Lieferung Neukonstruktionen8,9,10 wurden inspiriert durch die Kern-Lipid-stabilisiert und Gestaltung der natürlichen LDLs11 als Mechanismus für die Bereitstellung von Krebsmedikamenten für Krebszellen. Diese passive Fähigkeit targeting-Delivery-System unterstützt die Verkapselung, vor allem, hydrophobe Drogen, die sind in der Regel in peroralen Darreichungsform gegeben sondern nur eine kleine Menge der Medikamente in den Blutkreislauf, so begrenzen ihre erwarteten Wirksamkeit12. Wie mit der Stealth-Liposomen13, eine Polyethylenglykol (PEG) Beschichtung hilft, um immunologische Reaktion zu reduzieren und erstreckt sich die Zirkulation in den Blutkreislauf für optimale Tumor Aufnahme durch die angebliche verbesserte Durchdringung und Retentionswirkung (EPR) 14 , 15. jedoch zusätzlich zu, in einigen Fällen, die Instabilität in der Zirkulation und unerwünschte Verteilung im System16, einige Hindernisse bleiben ungelöst, wie wie und in welchem Umfang solche Nanopartikel durch Zellen aufgenommen werden und was ist Ihre intrazellulären Schicksal. Es ist hier, dass dieses Papier befasst sich die Nanopartikel Aufnahme einer speziellen hydrophoben Anti-Krebs-Medikament Falcarindiol, konfokale und Epifluoreszenz bildgebende Verfahren.

Ziel der Studie ist, Lipid-beschichteten Nanopartikel von Falcarindiol zu fabrizieren und ihre intrazelluläre Aufnahme in hMSCs zu studieren. Bewältigung der Herausforderungen im Zusammenhang mit der Lieferung dabei, potenziell Stabilisierung seiner Verwaltung und Verbesserung der Bioverfügbarkeit. So bewerten eine neue Liefersystem für das Krebsmedikament. Zuvor hat Falcarindiol mündlich über eine hohe Konzentration gereinigt Falcarindiol als ein Lebensmittel Ergänzung17verwaltet wurde. Allerdings gibt es Bedarf für einen strukturierteren Ansatz dieser vielversprechende Medikament liefern. Deshalb wurden Falcarindiol Nanopartikel mit einem Phospholipid und Cholesterin Kapseln monomolekularen Film mit der gereinigten Droge bilden den Kern des Teilchens, entworfen. Die schnelle Injektion Methode des Lösungsmittels verlagert, wie kürzlich entwickelt von Needham Et al. 8, wird in dieser Studie verwendet, um die Polyacetylen Falcarindiol Kapseln.

Die Methode hat wurde früher für die Herstellung von Nanopartikeln Lipid Kapseln diagnostische Bildgebung Agenten18,19, sowie test Moleküle (Triolein)27 und Drogen (Orlistat, Niclosamide Stearat)8 ,27,28. Es ist eine relativ einfache Technik, wenn mit den richtigen Molekülen durchgeführt. Nanoskaligen Partikeln, an der Grenze ihrer kritischen Keimbildung (~ 20 nm Durchmesser), bildet es sehr unlöslichen hydrophoben gelöste Stoffe, die in einem polaren Lösungsmittel aufgelöst. Die Lösungsmittelaustausch wird erreicht, indem eine schnelle Injektion von organischen Lösung in ein Übermaß an Antisolvent (in der Regel eine wässrige Phase in einer 1:9 Bio: wässrige Volumenverhältnis)20,21.

Die kompositorische Gestaltung der Nanopartikel ergeben sich mehrere Vorteile. Die DSPC:Chol Komponenten bieten eine sehr enge, fast undurchlässig, biokompatibel und biologisch abbaubare monomolekularen Film. Die PEG bietet eine sterisch stabilisierende Oberfläche, die wie ein Schutzschild aus Opsonization durch das Immunsystem, wirkt verlangsamt jede Aufnahme durch den retikuloendothelialen System (Leber und Milz) und Schutz gegen das Mononukleäre Phagozyten System, verhindert ihre Aufbewahrung und Abbau durch das Immunsystem und somit ihre Durchblutung Halbzeit im Blut22. Dadurch können die Partikel zu zirkulieren, bis sie an erkrankten Stellen, Leber wie z. B. Tumoren, wo das Gefäßsystem undicht ist, so dass EPR-Effekt, passive Ansammlung der Partikel hervorzubringen. Darüber hinaus erlaubt es die Lipid-Mantel, haben eine bessere Kontrolle über die Nanopartikel Größe durch den Kern seiner kritischen Kern Dimension27,28kinetisch abfangen. Lipide induzieren verschiedenen Oberflächeneigenschaften (einschließlich Peptid Ausrichtung, die noch nicht für dieses Projekt war), einen reinen Droge-Kern und ein niedriger Polydispersität22,27,28. Die Methode zur Partikelgrößenanalyse ist DLS, eine Technik, Forscher, die Größe einer großen Anzahl von Partikeln zur gleichen Zeit messen können. Allerdings kann diese Methode der Messwerte größer, bias, wenn Nanopartikel nicht Prozess23sind. Dieses Problem wird mit dem Lipid-Mantel sowie bewertet. Weitere Details dieser grundlegenden Designs und die Quantifizierung aller Merkmale sind in anderen Publikationen27,28gegeben.

Das Medikament in die Nanopartikel verkapselt ist Falcarindiol, eine diätetische Polyacetylen in Pflanzen aus der Familie Apiaceae gefunden. Es ist eine sekundäre Metaboliten aus dem aliphatischen C17Polyacetylenes Typ, der anzuzeigenden gesundheitsfördernde Effekte, einschließlich Anti-inflammatorische Aktivität, antibakterielle Wirkung und Zytotoxizität gegen ein breites Spektrum von Krebszelllinien gefunden wurde. Seine hohe Reaktivität bezieht sich auf seine Fähigkeit zur Interaktion mit verschiedenen Biomolekülen, als eine sehr reaktive Alkylierungsmittel gegen Mercapto und Aminogruppen24. Falcarindiol hat bisher gezeigt, Reduzierung der neoplastischen Läsionen in der Doppelpunkt17,25, obwohl die biologischen Mechanismen noch unbekannt sind. Es ist jedoch Gedanken, dass es interagiert mit Biomolekülen wie NF-κB, COX1, COX-2 und Zytokine hemmen ihre Tumor Progression und Zelle Verbreitung Prozesse, führen zu verhaften den Zellzyklus, endoplasmatische Retikulum (ER) zu betonen und Apoptose 17,26 in Krebszellen. Falcarindiol wird in dieser Studie verwendet, wie ein Beispiel Krebsmedikament aufgrund seiner Anti-Krebs-Potenzial und Mechanismus werden derzeit untersucht, und weil es vielversprechende Anti-Krebs Wirkung zeigt. Die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln ist in hMSCs getestet und abgebildet mit Epifluoreszenz und konfokalen Mikroskopie. Dieser Zellentyp wählte man aufgrund ihrer Größe eignen sich ideal für die Mikroskopie.

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Protocol

1. Nanopartikel-Synthese durch schnelle Lösungsmittel Verschiebung Technik

  1. Richten Sie für die Nanopartikel Vorbereitung Folgendes: einen Block Heizung/Probe Konzentrator, Exsikkator, ein digitales Dosiersystem mit einer 1 mL Spritze mit Glas, ein 12 mL Glasflasche, Magnetrührer, einen magnetischen floh (15 mm x 4,5 mm, in zylindrischer Form mit Polytetrafluorethylen [PTFE] Beschichtung) im Inneren des Glases und eine rotatorische Verdampfer.
  2. 2,4 mL 250 µM Falcarindiol Lager aufgelöst in 70 % EtOH-Wasser-Gemisch in einer Durchstechflasche Funkeln zu verzichten.
  3. Verdampft die flüssige Fraktion, mit der Probe-Konzentrator für ca. 4 h, trockene Falcarindiol zu erhalten.
    1. Legen Sie das Funkeln-Fläschchen in den Block Heizung; der Probe-Konzentrator liefert Gas über der Probe mit Edelstahl-Nadeln, Konzentration der Probenmaterials. Bei Raumtemperatur verdunsten; Verwenden Sie keine Hitze.
  4. Sobald getrocknet, fügen Sie die folgenden Komponenten der Lipid-Beschichtung in den oben genannten funkeln-Fläschchen: 31,64 mM DSPC 16.3 µL chloroform Stammlösung, 3,4 µL der Stammlösung 17,82 mM DSPE PEG 2000 Chloroform, 24 µL 25 mM Cholesterin Chloroform Lager Lösung und 6 µL 4 mM DiI Chloroform Stammlösung. Reinigen Sie die Spritze mit Chloroform nach Hinzufügen von einzelnen Komponenten um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
    Achtung: Schließen Sie sofort die Ampullen mit der Lipide, so dass das Lösungsmittel nicht verdunsten und, dabei die Konzentration ändern. Arbeiten Sie in einer Dampfhaube.
    Hinweis: Die Konzentrationen von Chloroform Stammlösungen können variieren, abhängig von der chemischen Lieferanten oder Verdünnungen im Labor hergestellt.
  5. Wickeln Sie das Fläschchen mit Alufolie zu DiI vor Licht zu schützen. Lassen Sie die Probe über Nacht im Exsikkator das Chloroform verdunsten.
  6. Auflösen der ausgetrockneten Probe im absoluten Ethanol zu einem Endvolumen von 1,2 mL, die Endkonzentrationen der DSPC, DSPE PEG 2000, Cholesterin und DiI von 0,43 mM, 0,05 mM, 0,5 mM und 0,02 mM, bzw. gibt. Diese Lösung stellt die organische Phase.
  7. Nehmen Sie die 12 mL Glasflasche, 9 mL gereinigtes Wasser füllen Sie ein und fügen Sie den magnetischen floh in das Fläschchen mit 9 mL Wasser hinzu. Halten Sie das Fläschchen auf den Magnetrührer, Rühren bei 500 u/min (Abbildung 1).
  8. Die Dosieranlage beimessen Sie die Spritze 1 mL Glas und reinigen Sie ihn mit Chloroform um jegliche Kontamination zu vermeiden. Dies durch, langsam ziehen das Chloroform in das Glasspritze und Verzicht auf manuell in einen Abfallsammler mindestens 10 Tiems.
    Achtung: Dies muss unter einem Abzug erfolgen.
  9. Grundieren Sie die Spritze mit Ethanol. Priming ersetzt das alte Lösungsmittel, sowie eventuelle Luftblasen entfernt.
    Achtung: Dies muss unter einem Abzug erfolgen.
  10. Aspirieren Sie mit der Spritze, 1 mL der organischen Phase.
  11. Legen Sie die Spritze in die Glasflasche, bis zur Mitte des Wasserzeichens 9 mL und erhalten Sie stabil in der Mitte der Durchstechflasche zu (siehe Abbildung 1).
  12. Spritzen Sie die Lösung mit der ausgewählten Geschwindigkeit der Injektion (833 µL/s) der Dispense-Taste auf die Dosieranlage (Abbildung 2). Dies erzeugt 10 mL 50 µM Lipid-beschichteten Nanopartikel aus Falcarindiol in 10 % Ethanol-haltigen Wasser.
    Hinweis: Diese Einspritzgeschwindigkeit wurde festgestellt, um feinste Partikel, erhalten eine enge Teilchengrößenverteilung zu erreichen. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Spritze in der Mitte, stabil und gerade, beim Verzicht auf der Lösung ist.
  13. Unmittelbar nach der Injektion entfernen Sie das Fläschchen aus der Rührer und übertragen Sie die Probe in ein 50 mL Rundboden Kolben (RBF) zu.
  14. Die Drehverdampfer der RBF beimessen und 1 mL der organischen Lösungsmittel, mit dem Drehverdampfer bei Raumtemperatur verdunsten. Vermeiden Sie überflüssige Blasenbildung.
    Hinweis: Dieser Schritt wird ~ 5 min dauern.
  15. Übertragen Sie die Nanopartikel Suspension aus dem RBF auf ein anderes 12 mL Glasflasche. Stellen Sie sicher, dass das Volumen 9 mL. Teilen Sie die Probe in zwei 12 mL Glasfläschchen (Put 4,5 mL in jedem).
  16. Hinzufügen eines der Fläschchen und 0,5 mL 10 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die andere Flasche 0,5 mL Reinstwasser. Nehmen Sie 1 mL pro Probe für die Messung der Partikelgröße.

2. die Partikelgrößenanalyse, die mit Hilfe der DLS-Technik

Hinweis: Größenmessungen wurden durchgeführt mit einem DLS-Analysator die Partikelgrößenverteilungen bestimmt. Es ist ausgestattet mit einem 100 mW Laser, die arbeitet bei einer Wellenlänge von 662.2 nm und mit einer Lawine Fotodiode Detektor platziert in einem 90° Winkel zu der Einfallswinkel. Der Strahl ist verstreut durch die Nanopartikel und von den Photodetektor erkannt.

  1. Schalten Sie die DLS-Instrument und stellen Sie die gewünschte Temperatur bei 20 ° C bis es stabilisiert.
  2. Legen Sie die Geräteparameter wie folgt: Daten Erfassungszeit = 4 s, Anzahl der Akquisitionen = 30, Auto-Dämpfung Funktion = ein, und die Auto-Dämpfung Fristen = 0.
  3. Füllen Sie die Kunststoff Küvette mit 1 mL der Nanopartikel Suspension und starten Sie die Messung.
  4. Bericht der gemessenen Größe je nach verwendeten Lösungsmittels (Wasser oder PBS).
    Hinweis: Die Messung mit PBS-Puffer vorgenommen, eine ungefähre Vorstellung von der Größe der Zellen in das Medium zu haben, wenn die Zellen zu behandeln. Die Behandlung erfolgt über die Nanopartikel in Wasser aufgelöst.
  5. Wiederholen Sie die Messungen 24 h nach der Synthese für die Aggregation der Partikel zu überprüfen.

3. Behandlung

  1. Minimale wesentliche Medium (MEM) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin, in einer humifizierten Kammer bei 37° C mit 5 % CO2zulegen Sie hMSCs.
    Achtung: Arbeiten Sie in der sterilen Laminar-Flow-Haube für Schritte 3.1, 3.2 und 3.3.
  2. Etwa 50.000 Samenzellen zu einer Zelle Dichte von ca. 30 % auf zuvor Absolute-EtOH-sterilisiert #1.5 Deckgläsern in 6-Well Platten gelegt. Fügen Sie MEM, um einem Endvolumen von 3 mL in jede Vertiefung haben. 24 h unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 3.1 inkubieren. Samen der Zellen 24 h vor der Behandlung.
    Hinweis: Es ist wichtig, dass die Zellen ausgesät werden mindestens 24 h vor der Nanopartikel-Behandlung, um sicherzustellen, dass die Zellen in eine angemessene Zusammenfluss sind.
  3. Ohne das Medium zu entfernen, fügen Sie 3 µL der Nanopartikel-Lösung für eine endgültige Falcarindiol Konzentration von 5 µM. Inkubation für 24 h unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 3.1.
    Hinweis: Die Nanopartikel Vorbereitung erfolgte am Tag der Zelltherapie, Partikel-Aggregation zu vermeiden.
  4. Waschen Sie anschließend nach 24 Stunden nach der Behandlung, die Zellen 2 X mit PBS, in 4 % Formaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur zu beheben, und speichern sie mit PBS-Puffer bei 4° C für bis zu mehreren Monaten bis abgebildet.
    Achtung: Dies muss unter einem Abzug erfolgen.
    1. Alternativ kann nach der Fixierung, ein 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) nukleare Färbung durchgeführt werden. Hierzu nach der Fixierung der Zellen, permeabilize sie mit 0,1 % Triton x-100 für 30 min, waschen Sie sie 2 X mit PBS, und färben sie mit 250 µL von 300 nM DAPI für 5 Minuten, vor Licht geschützt werden.

(4) Mikroskopie

  1. Fluoreszenz-Mikroskopie
    1. Verwenden Sie ein Weitfeld Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einer CCD-Kamera Elektrons multipliziert, um Bilder zu erwerben. Verwenden Sie die 150 x NA 1,45 Öl Ziel und der GFP LP-Kanal.
  2. Konfokale Mikroskopie
    1. Abrufen von Bildern der konfokalen Mikroskopie, mit 63 x NA 1.4 Öl Ziel, einem Argonlaser (514 nm) für DiI und ein zwei-Photonen-Laser (780 nm) für DAPI, um die Aufnahme von Nanopartikeln in die Zellen zu überprüfen.

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Representative Results

Zwei verschiedene Arten von Nanopartikeln wurden hergestellt, nämlich reine Falcarindiol Nanopartikel und Lipid-beschichtete Falcarindiol Nanopartikel. Verschiedenen Konzentrationen von Lipiden und Cholesterin wurden getestet. Wie aus Tabelle 1hervorgeht, hatte unbeschichtete Nanopartikel in Wasser gebildet und in PBS gemessen einen Durchmesser von 71 ± 20,3 nm mit einem Polydispersität Index (PDI) von 0.571. Diese Parameter wurden auf einem DLS-Analysator gemessen. Die Lipid-beschichteten Nanopartikel von Falcarindiol in den Experimenten verwendet, und also auch der Fluoreszenzfarbstoff, DiI, waren von ähnlicher Größe, nämlich 74.1 ± 6,7 nm; Sie erwiesen sich als relativ Prozess sein und hatte eine geringere PDI 0.182, kennzeichnet eine kleinere Verteilung der Partikelgrößen, da PDI die Größenverteilung der Nanopartikel Bevölkerung beschreibt. Im Allgemeinen wird ein PDI unter 0,3 liegen gewünscht, bei der Herstellung von Nanopartikeln für pharmazeutische Zwecke.

Im Anschluss an die Herstellung wurde die Partikelgröße gemessen, nach 3 h und 24 h, Zeiten beziehen sich auf die Verzögerungszeit für den Zusatz von Nanopartikeln in der Zellkultur erforderlich. Keine Aggregation wurde nach 24 Stunden beobachtet, jedoch Daten in dieser Handschrift nicht angezeigt werden, wie es in einer anderen Studie gemeldet werden, und es empfohlen wird, für Partikel Stabilität nach 24 Stunden zu testen. Nach der Bestätigung der Größe Stabilität der Lipid-beschichteten Nanopartikel, waren DiI beschriftet, Lipid-beschichteten Nanopartikel von nach dem Protokoll hergestellt und schließlich für die Aufnahme Studie verwendet. Für jede Studie wurde eine frische Nanopartikel Probe vorbereitet. Eine schematische Darstellung der endgültigen Falcarindiol Nanopartikel Struktur wird in Abbildung 3, und die Partikel Größe Daten nach Fertigung in Tabelle 1als auch die Messung 3 h nach der Herstellung angezeigt wird angezeigt.

Als eine erste Beobachtung der Nanopartikel im Inneren der Zellen wurden Epifluoreszenz Mikroskopie Bilder nach 24 Stunden nach der Behandlung erworben. Die Nanopartikel wurden als weiße helle Punkte visualisiert, und es konnte die Hypothese aufgestellt, dass Nanopartikel in den Zellen lagen rund um den Zellkern (Abb. 4A).

Um sicherzustellen, dass Falcarindiol Nanopartikel die Zellen betreten hatte, konfokale Mikroskopie erfolgte am hMSCs für 24 Std. Confocal behandelt bestätigt Bilder, dass Nanopartikel die Zellen betreten hatte, und eine große Anzahl von Nanopartikeln im Zytoplasma in verstreut wurden Jede Zelle (Abbildung 4B-D). Diese Ergebnisse zeigen, dass Nanopartikel als eine stabile Drug-Delivery-System für Falcarindiol handeln.

Figure 1
Abbildung 1 : Nanopartikel Vorbereitung Setup zeigt die Montage für die Injektion unter Rühren27. Der Aufbau besteht aus der Autopipette mit einer 1 mL-Glas-Spritze gefüllt mit 1 mL der ethanolische Lösung, die Nanopartikel-Komponenten enthält. Die Glasphiole enthält 9 mL Wasser und des magnetischen Flohs auf den Magnetrührer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Schaltplan der Vermischung von Lösemitteln in die schnelle Injektion Methode des Lösungsmittels Verschiebung27. Tafeln zeigen die Injektion von 1 mL ethanolische Phase mit Nanopartikeln Komponenten mit einer Geschwindigkeit von 833 µL/s in 9 mL Wasser unter Rühren bei 500 u/min. Die schnelle Injektion mit dem chaotischen Mischen der ethanolische Lösung, die Nanopartikel Komponenten (Falcarindiol, DSPC, Cholesterin, DSPE PEG 2000, DiI) in Antisolvent (Wasser), Leadd zur Bildung der Nanopartikel enthalten. Die Farbe wird durch DiI gegeben. Es kann beobachtet werden, wie die ethanolische Lösung gemischt wird, zunehmend die Konzentration und die Nanopartikel gebildet werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Schematische der endgültigen Falcarindiol Nanopartikel Struktur. Nanopartikel-Struktur, einschließlich DSPC DSPE PEG 2000, Cholesterin, DiI und Falcarindiol. Die verschiedenen Komponenten werden entsprechend ihrer Konzentration skaliert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Bilder von Lipid-beschichtete Falcarindiol Nanopartikeln in humanen mesenchymalen Stammzellen. (A) Epifluoreszenz Mikroskopie Bild des hMSCs mit Falcarindiol Nanopartikel für 24 h behandelt. Die folgenden Tafeln zeigen konfokalen Mikroskopie-Bilder von der hMSCs mit Falcarindiol Nanopartikel für 24 h: (B) DAPI Fleck der Kerne behandelt, (C) DiI Nanopartikel und (D) eine Überlagerung der beiden Bilder, Kerne sind in blau dargestellt und die Nanopartikel in rot. Der Maßstabsbalken sind 10 µm. Nanopartikel sind als weiße helle Punkte in das Zytoplasma der Zelle sichtbar gemacht. Die Bilder zeigen, dass eine große Anzahl von Nanopartikeln nach 24 h Inkubation der Zellen eingegeben haben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Typ von Nanopartikeln Lösungsmittel Nanopartikelgröße (nm) Polydisperisty (nm) Polydispersität Index (PDI)
Unbeschichtete Falcarindiol Wasser 83,9 ± 23,9 0.571
PBS 71 ± 20,3 0.571
Lipid beschichtet Falcarindiol PBS 91,6 ± 6,4 0.141
PBS nach 3h 93,5 ± 5,7 0,122
Lipid beschichtet Falcarindiol + DiI PBS 74,1 ± 6,7 0.182

Tabelle 1: verschiedene Designs der hergestellte Nanopartikel. Größe und Polydispersität Index der synthetisierten Falcarindiol Nanopartikel, je nach Lösungsmittel und Nanopartikel. Falcarindiol Nanopartikel mit und ohne einen Lipid-Mantel wurden hergestellt. Verschiedene Konzentrationen der Mantel Komponenten wurden getestet. Die Partikel-Aggregation wurde nach 3 h getestet.

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Discussion

Ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Lipid-beschichteten Nanopartikel für Drug-Delivery mit der einfachen, schnell, reproduzierbare und skalierbare schnelle Injektion Methode der Lösungsmittel Verschiebung war gefolgt27,28 und wird in diesem Papier als präsentiert auf Falcarindiol angewendet. Durch die Kontrolle der Geschwindigkeit der Injektion von der organischen Phase in wässrigen Phase und durch Beschichtung Lipide in entsprechenden Konzentrationen zu den Falcarindiol Kern Mantel konnte Partikel im Bereich von unter 100 nm erfolgreich abgerufen werden. Die Möglichkeit der induzierten Polydispersität wegen des Engagements der turbulente Durchmischung zur Falcarindiol Fällung allein wurde durch die Anwesenheit von Beschichtung Lipide gesteuert. Die Struktur dieser Lipid-beschichteten Nanopartikel ähnelte der Low-Density-Lipoproteine mit Ausnahme von den Ausschluss von der systemeigenen 500.000 kDa ApoB100 und die zusätzliche Anwesenheit von PEG-Lipide für die sterische Stabilität). Diese passiv gezielte Drug-Delivery-System ermöglicht die Kapselung einer breiten Palette von besonders hydrophobe Medikamente und diagnostische Materialien18,19, reduzieren die immunologische Reaktion und erhöhen die Akkumulation in Krebsgewebe16,18. Darüber hinaus schützt der Drug-Delivery-System abhängig von der Droge Abbaureaktionen (z. B. Hydrolyse, Enzymolysis), das Medikament vor Abbau während seiner Zirkulation in-vivo.

Daher wurden Falcarindiol Nanopartikel mit einem Lipid-Verkapselung monomolekularen Film mit einem reinen Kern der gereinigten Droge, konstruiert und gefertigt. Die Lipid-Monolayer Beschichtung bestand aus DSPC, Cholesterin und DSPE-PEG 2000 mit dem fluoreszierenden Label DiI. Die Herstellung der Partikel erfolgte nach der Methode schnelle Injektion Lösungsmittel Verschiebung besteht aus einer schnellen Injektion eine ethanolische Lösung mit Nanopartikeln-Komponenten in ein Übermaß an wässrigen Phase (1:9). Die Größe der Nanopartikel wurde mittels DLS gemessen, und die Aufnahme der Nanopartikel wurde in hMSCs untersucht und abgebildet, mit Fluoreszenz und konfokalen Mikroskopie.

Unbeschichtete Nanopartikel können auch erhalten werden, mit den Größen der 71 ± 20,3 nm. Jedoch wurden nach dem oben beschriebenen Protokoll folgend Nanopartikel von 74.1 nm ± 6,7 nm, mit Polydispersität Werte der 0.182, hergestellt. So, nach dem Ändern der Nanopartikel durch Hinzufügen des Lipid-Mantels, Größe und PDI der Nanopartikel wurde reduziert, so dass sie besser geeignet für Drogen-Lieferung.

Es ist wichtig, hoch die entscheidenden Schritte in das Protokoll, beispielsweise die Bedeutung der Spritze Position beim Einspritzen von der organischen Phase, die Vorbereitung der Nanopartikel am gleichen Tag der Behandlung, Aggregation zu vermeiden und die Aussaat der Zellen beachten am Vortag zur Gewährleistung angemessener Zusammenfluss. In der Tat können alle Schritte im ersten Teil des Protokolls als entscheidend, da sie entweder die Größe der Nanopartikel oder die Endkonzentration der Wirkstoff und Beschichtung Lipide beeinflussen. In Anbetracht "Konzentration" als ein wichtiger Parameter, sind Schritte 1.2, 1.4, 1.6, 1.15 und 1.16 entscheidend. In Anbetracht der "Nanopartikelgröße" als ein wichtiger Parameter sind Schritte 1,7, 1.11 und 1.12 entscheidend.

Fluoreszenz und konfokalen Mikroskopie hat gezeigt, dass Nanopartikel die Zellen betreten hatte, und eine große Anzahl von Nanopartikeln im Zytoplasma der Zelle verstreut waren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Nanopartikel entwickelt, die in dieser Studie als eine neue und stabile Drug-Delivery-System für Falcarindiol genutzt werden können.

Diese Technik bietet einen einfachen, schnellen und reproduzierbaren Ansatz um verschiedene Krebs-Medikamente zu Kapseln und die Grenzen der Methode werden bewertet mit dem Lipid-Mantel.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Moustapha Kassem (Odense University Hospital, Dänemark) für die humanen mesenchymalen Stammzellen. Die Autoren danken den dänischen Bioimaging Zentrum für Zugriff auf ihre Mikroskope. Die Autoren danken die Carlsberg und Villum Grundlagen für die finanzielle Unterstützung (zu E.A.C.). Die Autoren erkennen die finanzielle Unterstützung von Niels Bohr Professur Award von der dänischen National Research Foundation zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) Microlab Aarhus A/S ML 33154LP
6 well plates Greiner Bio One International GmbH 657160
Absolute Ethanol EMD Millipore (VWR) EM8.18760.1000
Chloroform Rathburn Chemicals Ltd. RH1009
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P
Confocal Microscope Zeiss LSM510
Cover Slips thickness #1.5 Paul Marienfeld GmbH & Co 117650
Desiccator Self-build
DiI Invitrogen D282
DLS Beckman Coulter DelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 850365C 
DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 880120C
eVol XR SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. 2910200
Fetal Bovine serum Gibco 10270-106
Fluorescence Miccroscope Olymous IX81 With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
Incubator Panasonic  MCO-18AC
Magnetic flea VWR Chemicals 15 x 4.5 mm Cylindrical shape with PTFE coating
Magnetic stirrer IKA RT-10
Minimum Essential Media Gibco 32561-029
PBS tablets for cell culture VWR Chemicals 97062-732
Pen/strep VWR Chemicals 97063-708
Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) Thermo Fisher 10010031
Rotary Evaporator Rotavapor, Büchi Labortechnik AG R-210
Sample concentrator  Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC SBHCONC/1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Firestone, R. A. Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells. Bioconjugate Chemistry. 5, (2), 105-113 (1994).
  2. Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipid metabolic reprogramming in cancer cells. Oncogenesis. 5, (1), 189 (2016).
  3. Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy. Cancer Biology & Medicine. 14, (3), 228 (2017).
  4. Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients. Family Practice. 33, (5), 449-452 (2016).
  5. Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19, (3), 393-406 (2014).
  6. dos Santos, R., et al. LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion. Lipids in Health and Disease. 13, (16), (2014).
  7. Gallagher, E. J., et al. Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access. Oncogene. 36, (46), 6462-6471 (2017).
  8. Needham, D., et al. Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food". Journal of Drug Targeting. 24, (9), 836-856 (2016).
  9. Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles. United States Patent Application Publication. Pub. No.: US 2009/0110739 A1 (2009).
  10. Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme. Journal of Controlled Release. 124, (3), 163-171 (2007).
  11. Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape. Journal of Lipid Research. 45, (5), 954-966 (2004).
  12. Schweizer, M. T., et al. A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer. PLoS ONE. 13, (8), 0202709 (2018).
  13. Allen, T. M., Hansen, C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068, (2), 133-141 (1991).
  14. Maeda, H. The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting. Advances in Enzyme Regulation. 41, (1), 189-207 (2001).
  15. Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect. PLoS ONE. 10, (5), 0123461 (2015).
  16. Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy. Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9, (2), (2016).
  17. Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats. Food & Function. 8, 964-974 (2017).
  18. Hervella, P., Parra, E., Needham, D. Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).
  19. Hervella, P., et al. Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors. Journal of Controlled Release. (2018).
  20. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28, (7), 3633-3640 (2012).
  21. Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -P., Cabane, B. Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries. Langmuir. 25, (4), 1970-1979 (2009).
  22. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8, (9), 2906-2912 (2008).
  23. Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69, (1), 1-9 (2018).
  24. Christensen, L. P., Brandt, K. Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41, (3), 683-693 (2016).
  25. Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).
  26. Jin, H. R., et al. The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress. CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).
  27. Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. University of Southern Denmark (SDU). (2018).
  28. Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. 6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress. Stockholm, Sweden. (2017).

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