Falcarindiol 인간 중간 엽 줄기 세포에 의해 포함 된 새로운 지질 코팅 나노 입자의

Bioengineering

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Summary

이 문서에서는 falcarindiol 지질 코팅 74 nm 나노 입자에 캡슐화를 설명합니다. 인간 줄기 세포 지질 작은 물방울에 의해 나노 입자의 세포질 통풍 관 그리고 confocal 형광 이미징에 의해 모니터링 됩니다. 나노 입자 용 매 변화, 급속 한 주입 방법으로 조작 하 고 그들의 크기는 동적 산란 기법으로 측정 된다.

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Pipó-Ollé, E., Walke, P., Notabi, M. K., El-Houri, R. B., Østergaard Andersen, M., Needham, D., Arnspang, E. C. Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (144), e59094, doi:10.3791/59094 (2019).

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Abstract

나노 암 치료를 위한 약물 전달 시스템에 대 한 관심 증가의 초점입니다. 지질 코팅 나노 구조와 크기에 의해 영감을 저밀도 지 단백질 (LDLs) 암 세포에, 콜레스테롤을 위한 증가 필요 때문에이 암에 항 암 제 약물을 전달 하기 위한 메커니즘으로 이용 되 셀입니다. 또한, 약물 화학에 따라 약물을 캡슐화 수 순환 vivo에서 동안 약물의 저하를 방지에 유리. 따라서,이 연구에서이 디자인은 사용 falcarindiol 저하에 대 한 그것의 화학 구조를 안정화 하 고 개선의 잠재적인 새로운 배달 시스템을 제공 하는 항 암 약 falcarindiol의 지질 코팅 된 나노 입자를 조작 하는 종양에 의해 통풍 관입니다. Falcarindiol 나노 입자의 정제 약 코어 캡슐화 인지질 및 콜레스테롤 단층으로 설계 되었다. 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 콜레스테롤 (철), 및 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000 지질 단층 코팅에 의하여 이루어져 있다] (DSPE 못 2000)는 형광 함께 레이블 DiI (43:50:5:2의 어 금 니 비율). 나노 입자는 반대로 용 매 교환에 대 한 좋은 용 매에 의해 나노 입자를 침전 하는 빠르고 간단한 기법 급속 한 주입 방법을 사용 하 여 조작. 그것은 수성 단계로 나노 부품을 포함 하는 에탄올 솔루션의 급속 한 주사를 이루어져 있다. 형광 나노 입자의 크기는 74.1 ± 6.7 nm에서 동적 산란 (DL)을 사용 하 여 측정 됩니다. 나노 입자의 이해 인간 중간 엽 줄기 세포 (hMSCs)에서 테스트 하 고 형광 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 나노 입자의 통풍 관은 안정적인 약물 전달 시스템 falcarindiol에 대 한 잠재력을 제안 하는 hMSCs에서 관찰 됩니다.

Introduction

지질 코팅 나노 암 치료1약물 전달 시스템으로 그들의 기능에 관한 관심 증가 보고 있다. 암은 바꾸 인된 지질 대사 재활23에 콜레스테롤 증가 필요 있다. 그들은 LDLs1 overexpress 고 정상 세포 보다 더 많은 LDLs에서 암 환자의 LDL 수 내려4도 갈 수 있는 범위. LDL 이해 확산 및 유 방 암6내 습 결과로 공격적 고기5 촉진 합니다. LDL 수용 체 (LDLRs)의 전이성 잠재적인7의 예 후 지시자 이다. Ldl 콜레스테롤과 암 세포에 의해 그것의 이해에 의해 영감, 새로운 전략 이라고: 암의 음식 처럼 마약을 확인8. 따라서, 이러한 새로운 나노 약물 전달 설계8,,910 항 암 약물을 전달 하기 위한 메커니즘으로 자연 LDLs11 의 코어 및 지질 안정 된 디자인에 의해 고무 되 에 암 세포. 이 수동 배달 시스템을 대상으로 지원 특히, 캡슐화, 소수 성 약물, 구두 복용량 양식에서 일반적으로 제공 하지만 그래서 그들의 예상된 효능12제한 혈 류 약물의 작은 금액을 제공 합니다. 스텔스 리13, 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 코팅 면역학 응답을 줄이는 데 도움이 됩니다 하 고 최적의 종양 통풍 관에 대 한 혈 류에서 순환은 의미에 의해 확장 향상 된 침투 및 보존 (EPR) 효과 14 , 그러나 15., 이외에, 일부 인스턴스, 순환에 있는 불안정과 시스템16에 바람직하지 않는 배급에 어떤 장애물 유지 이러한 나노 입자는 세포에 의해에서 촬영 방법과 어느 정도 이며 어떤 같은 미해결 그들의 세포내 운명입니다. 그것은 여기이 종이의 특정 소수 성 항 암 제 약물 falcarindiol, 공초점 레이저를 사용 하 여 epifluorescence 이미징 기술을 나노 통풍 관을 해결.

연구의 목표는 falcarindiol의 지질 코팅 된 나노 입자를 조작 하 고 hMSCs에 그들의 세포내 이해 연구. 따라서, 잠재적으로 안정화의 관리, 배달와 관련 된 도전을 극복 하 고 bioavailability 향상. 따라서이 항 암 약에 대 한 새로운 전달 시스템 평가. 이전에, falcarindiol는 되었습니다 관리 구두로 정화 높은 농도 falcarindiol 통해17음식 보충. 그러나,이 유망한 약을 제공 하는 더 체계적인된 접근 방법 위한 필요가 있다. 따라서, falcarindiol 나노 입자, 인지질 및 콜레스테롤 입자의 핵심 구성 정화 약으로 단층을 캡슐화 디자인 되었다. 용 매 변화, 급속 한 주입 방법으로 최근 개발한 Needham 외. 8이 연구에서 polyacetylene falcarindiol를 캡슐화 하는 데 사용 됩니다.

메서드를 사용 하면 이전 지질 나노 입자의 제조에 대 한 진단 이미징 에이전트18,19, 캡슐화 하 고 분자 (triolein)27 및 약물 (orlistat, niclosamide stearate) 테스트 사용 되었습니다8 ,,2728. 그것은 상대적으로 간단한 기술을 바로 분자와 함께 실시입니다. 그것은 극 지 용 매에 용 해 하는 매우 불용 성 소수 용액의 nanosized 입자, 그들의 중요 한 nucleation (~ 20 nm 직경)의 한계에 형성. 솔벤트 exchange antisolvent의 과잉으로 유기 솔루션의 빠른 주입에 의해 수행 됩니다 (일반적으로, 1:9 유기에서 수성 단계: 수성 볼륨 비율)20,21.

나노 입자의 구성 디자인 여러 장점을 일으키 다. DSPC:Chol 구성 요소는 매우 빡 빡, 거의 불 침투성, 생체, 그리고 생 분해성 단층을 제공합니다. Reticuloendothelial 시스템 (간, 비장)과 단 식 시스템에 대 한 보호, 예방 하 여 어떤 글귀 둔화 못이 면역 체계에 의해 opsonization에서 방패 역할 sterically 안정화 인터페이스를 제공 한다. 그들의 유지와 면역 시스템 저하 고 그러므로, 그들의 순환 혈액22에 하프 타임 증가. 그러면 그들은 병에 걸리는 사이트에 extravasate 때까지 순환 하는 입자 같은 종양, 혈관 시스템이 새, EPR 효과 입자의 수동 축적을 허용. 또한, 지질 코트 네의 중요 한 핵 차원27,28에서 코어를 트래핑에 의해 나노 입자의 크기에 더 나은 통제를가지고 있습니다. 지질 (은 아직이 프로젝트에 사용할 수 있는 대상, 펩타이드를 포함 하 여) 다양 한 표면 특성, 순수한 마약 코어 및 낮은 증가할수록22,,2728유도. 입자 크기 분석을 위해 사용 되는 방법은 DL, 동시에 많은 수의 입자의 크기를 측정 하는 연구를 허용 하는 기술입니다. 그러나,이 메서드는 나노 입자 monodispersed23없는 경우 더 큰 크기를 측정 편견 수 있습니다. 이 문제는 또한 지질 코트와 함께 평가 됩니다. 이러한 기본적인 디자인의 자세한 내용과 모든 특성의 정량화는 다른 간행물27,28에 부여 됩니다.

나노 입자에 약물은 falcarindiol, 식이 polyacetylene 미나리과 가족에서 식물에서 발견. 그것은 건강 증진 효과, 항균 효과, 항 염증 성 활동과 암 세포 라인의 다양 한 범위에 대 한 세포 독성을 포함 하 여 표시를 발견 되었습니다 지방 족 C17polyacetylenes 형식에서 2 차 대사 산물. 그것의 높은 반응성 mercapto 및 아미노 그룹24매우 반응 alkylating 에이전트 역할 다른 생체와 상호 작용 하는 기능에 관련 되어 있습니다. Falcarindiol 생물 학적 메커니즘은 여전히 알려진 콜론17,25, 종양 약 병의 수를 줄이기 위해 표시 되었습니다 이전. 그러나, 그것은 생체 COX1, NF-κB-2, 같은 상호 작용 및 그들의 종양 진행과 셀 확산 프로세스, 세포 주기, 바인딩과 그물 (응급실)을 체포로 이어지는 억제 cytokines, 스트레스, 생각 및 apoptosis 17,26 암 세포에서. Falcarindiol 제 잠재력 및 메커니즘 예 항 암 제 약물 현재 공부 되 고 있다 그리고 그것은 유망한 항 암 효과 보여주기 때문에이 연구에 사용 됩니다. 나노 입자의 세포질 통풍 관 hMSCs에서 테스트 하 고 epifluorescence 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 이 세포 유형은 현미경에 이상적 그것의 큰 크기 때문에 선택 되었다.

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Protocol

1. 나노 입자 합성 기술 변화는 급속 한 용 매에 의해

  1. 나노 입자 준비에 대 한 다음과 같은 설정: 블록 히터/샘플 집중, desiccator, 1 mL 유리 주사기, 12 mL 유리 유리병, 자력, 자석 벼룩 (15 m m x 4.5 m m, 원통 모양에서 디지털 분배 시스템 소계 [PTFE] 코팅) 유리 병, 및 회전 증발 기 내부.
  2. 2.4 mL 섬광 유리병에 70 %EtOH 물 혼합물에 녹아 250 µ M falcarindiol 재고의 분배.
  3. 증발 건조 falcarindiol를 대략 4 h에 대 한 샘플 집중 장치를 사용 하 여 액체 분수.
    1. 삽입 섬광 유리병 블록 히터; 샘플 집중 집중 샘플 스테인리스 바늘을 사용 하 여 샘플을 통해 가스를 제공 합니다. 실내 온도;에서 증발 열을 사용 하지 마십시오.
  4. 건조 되 면, 위에서 언급 한 섬광 유리병으로 지질 코팅의 다음 구성 요소를 추가: 31.64 mm DSPC 16.3 µ L 클로 프롬 재고 솔루션, 17.82 mM DSPE 못 2000 클로 프롬 재고 솔루션의 3.4 µ L, 25mm 콜레스테롤 클로 프롬 주식의 24 µ L 솔루션, 그리고 4 mM DiI 클로 프롬 재고 솔루션의 6 µ L. 교차 오염을 방지 하는 각 구성 요소를 추가한 후 클로 프롬과 주사기를 청소.
    주의: 즉시 용 매 증발 하 고 않는, 따라서, 농도 수정 있도록 지질을 포함 하는 튜브를 닫습니다. 증기 두건에서 작동 합니다.
    참고: 클로 프롬 재고 솔루션의 농도가 달라질 수 있습니다, 화학 업체 또는 실험실에서 만든 희석에 따라.
  5. 알루미늄 호 일 로부터 보호 하기 위해 DiI 빛 유리병을 감싸 줍니다. 밤새 껏 증발 하는 클로 프롬을 desiccator 샘플을 둡니다.
  6. Desiccated 샘플 DSPC, DSPE 나무 못 2000, 콜레스테롤, 및 0.43 m m, 0.05 m m, 0.5 m m, 0.02 m m의 DiI의 최종 농도 각각 주는 1.2 mL의 최종 볼륨을 절대 에탄올에 용 해. 이 솔루션은 유기 단계를 나타냅니다.
  7. 12 mL 유리 약 병을가지고, 순화 된 물 9 mL와 함께 그것을 채울 그리고, 포함 하는 물 9 mL 유리병에 자석 벼룩을 추가. 500 rpm (그림 1)에서 교 반 자력에 유리병을 유지.
  8. 분배 시스템을 1 mL 유리 주사기를 연결 하 고 어떤 오염 든 지 피하기 위하여 클로 프롬으로 그것을 청소. 이것으로, 천천히 유리 주사기에 클로 프롬 고 폐기물 수집 적어도 10 tiems에 수동으로 분배.
    주의:이 증기 두건에서 수행 되어야 합니다.
  9. 에탄올과 주사기 프라임. 못쓰게 된 용 매를 대체 뿐 아니라 모든 기포를 제거 합니다.
    주의:이 증기 두건에서 수행 되어야 합니다.
  10. 주사기를 사용 하 여, 유기 단계의 1 mL 발음.
  11. 9 mL 워터 마크의 중간까지 유리 약 병에 주사기를 삽입 하 고 ( 그림 1에서 같이) 유리병 중간 꾸준한 유지.
  12. 분배 시스템 (그림 2)에 디스 펜스 버튼을 누르면 사출 (833 µ L/s)의 선택 된 속도에 솔루션을 주입. 이 10% 에탄올이 포함 된 물에서 falcarindiol의 50 µ M 지질 코팅 나노의 10 mL를 생성합니다.
    참고:이 사출 속도 좁은 입자 크기 분포를 얻는 최고의 입자를 달성 하기 위해 발견 되었습니다. 그것은 솔루션을 분배 하는 경우 주사기 센터, 꾸준히, 그리고 직선에서 인지 확인 중요 합니다.
  13. 주입 직후는 교 반기에서 유리병을 제거 하 고 50 mL 둥근 바닥 플라스 크 (RBF)에 샘플을 전송 합니다.
  14. RBF 회전 증발 기를 부착 하 고 유기 용 매, 실내 온도에서 회전 증발 기를 사용 하 여 1 mL를 증발. 초과 거품 형성을 하지 마십시오.
    참고:이 단계는 ~ 5 분을 걸릴 것 이다.
  15. 나노 서 스 펜 션은 RBF에서 다른 12 mL 유리 유리병 전송. 볼륨 9 mL 인지 확인 합니다. 2 개의 12 mL 유리 튜브 (넣어 각 4.5 mL)에서 샘플을 분할.
  16. 초순의 0.5 mL 튜브 중 하나 및 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 다른 유리병에 x 10의 0.5 mL를 추가 합니다. 입자 크기 측정에 대 한 각 샘플의 1 mL를 꺼내.

2. 입자 크기 분석 DL 기술을 사용 하 여

참고: 크기 측정 입자 크기 분포를 결정 하는 DL 분석기를 사용 하 여 실행 되었다. 그것은 662.2의 파장에서 작동 하는 100 mW 레이저 장비 nm와 입사 각도를 90 ° 각도로 배치는 눈사태 포토 다이오드 발견자. 광선은 나노 입자에 의해 흩어져 고는 매칭에서 검색.

  1. DLS 악기를 켜고 안정화 될 때까지 20 ° C에서 원하는 온도 설정.
  2. 악기 매개 변수를 다음과 같이 설정: 데이터 수집 시간 = 4 s, 취득의 수 = 30, 자동 감쇠 기능에, = 및 자동 감쇠 시간 제한 = 0.
  3. 나노 서 스 펜 션의 1 mL와 함께 플라스틱 베트를 측정 시작.
  4. 용 매 사용 (물 또는 PBS)에 따라 측정 된 크기를 보고 합니다.
    참고: PBS에서 측정 한 아이디어가 대략적인 매체에서 셀의 크기의 셀을 대우 할 때 이루어집니다. 세포 치료는 물에 용 해 하는 나노 입자와 함께 할 것입니다.
  5. 합성 입자 집계에 대 한 확인 후 24 시간 측정을 반복 합니다.

3. 세포 치료

  1. 최소 필수 매체 (MEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스, 5% CO2와 37 ° C에서 humified 챔버에 보충에서 hMSCs를 성장 한다.
    주의: 3.1, 3.2, 3.3 단계에 대 한 살 균 층 류 두건에서 작동 합니다.
  2. #1.5 coverslips 이전 절대 EtOH 소독에 약 30%의 셀 밀도 얻기 위해 씨앗 약 50, 000 셀 6 잘 플레이트에 배치. 각 잘에서 3 mL의 최종 볼륨을 가지기 위해 메모리를 추가 합니다. 3.1 단계 에서처럼 동일한 조건 하에서 24 h에 대 한 품 어. 세포 치료 전에 24 h 씨입니다.
    참고: 셀 나노 치료는 세포는 적절 한 합류에 있는지 확인 하기 전에 적어도 24 시간 시드는 긴요 하다.
  3. 매체를 제거 하지 않고 추가 5 µ M.의 마지막 falcarindiol 농도 대 한 나노 솔루션의 3 µ L 3.1 단계 에서처럼 동일한 조건에서 24 시간에 대 한 품.
    참고: 나노 입자 준비 입자 집계를 피하기 위해 세포 치료의 날에 실시 되었다.
  4. 그 후, 치료의 24 시간 후 씻어 셀 2 x PBS, 실 온에서 10 분 동안 4% 포름알데히드에 그들을 수정 하 고 몇 개월 몇 군데 때까지 4 ° C에서 PBS에 보관.
    주의:이 증기 두건에서 수행 되어야 합니다.
    1. 또는, 고정, 4 ', 후 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 얼룩 수행할 수 있습니다. 이 위해, 세포, 고정 후 permeabilize 그들 0.1% 트라이 톤 X-100 30 분 동안 그들을 씻어 PBS, 2 x 300 250 µ L로 얼룩 그리고 빛 으로부터 보호 5 분간 nM DAPI.

4입니다. 현미경

  1. 형광 현미경 검사 법
    1. Widefield 형광 현미경 전자 곱한 CCD 카메라와 장비를 사용 하 여 이미지. NA 1.45 오일 목표 x 150 GFP lp로 채널을 사용 합니다.
  2. Confocal 현미경 검사 법
    1. Confocal 현미경 검사 법의 이미지, 나 1.4 석유 목표, 아르곤 레이저 x 63을 사용 하 여 (514 nm) DiI, 및 2 광자 레이저 (780 nm) DAPI, 세포에는 나노 입자의 이해를 확인에 대 한.

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Representative Results

두 가지 유형의 나노 조작, 즉 순수한 falcarindiol 나노 입자와 지질 코팅 falcarindiol 나노 입자 했다. 지질과 콜레스테롤의 농도 다양 한 테스트 되었습니다. 표 1에서 보듯이 코팅된 나노 입자 물에서 형성 하 고 PBS에 측정 0.571의 증가할수록 인덱스 (PDI)와 71 ± 20.3 nm의 직경을 했다. 이러한 매개 변수는 DL 분석기에 측정 되었다. Falcarindiol는 실험에 사용 되 고 그래서 형광 염료, DiI, 등의 지질 코팅 나노가 했다 비슷한 크기, 즉 74.1 ± 6.7 nm; 그러나, 그들은 상대적으로 monodispersed 것을 발견 했다 고 0.182, PDI는 나노 입자의 크기 분포를 설명 하는 때문에, 작은 입자 크기 분포를 나타내는의 낮은 PDI를 했다. 일반적으로, 0.3 아래 PDI 제약으로 나노 입자를 제조 하는 경우 원하는.

제조, 다음 입자 크기는 3 h 24 h, 세포 배양에 나노 입자의 추가에 필요한 지연에 따라 시간 후 측정 했다. 그러나 없음 집계 데이터는이 원고에 표시 되지 않습니다 또 다른 연구에서 보고 될 것 이다 하 고 24 시간 후 입자 안정성에 대 한 테스트 하는 것이 좋습니다 24 시간 후 관찰 되었다. 확인 후 지질 코팅 된 나노 입자의 크기 안정성, DiI 분류, 지질 코팅 나노 입자는 프로토콜에 따라 조작 되었고, 결국, 통풍 관 연구에 대 한 사용. 모든 연구에 대 한 신선한 나노 샘플 준비 되었다. 마지막 falcarindiol 나노 입자의 구조의 회로도 제작 측정 제조 후 3 h를 찍은 표 1에 표시 한 후 그림 3, 그리고 입자의 크기 데이터에 표시 됩니다.

세포 안에서 나노 입자의 첫번째 관측으로 epifluorescence 현미경 이미지 처리의 24 h 후 인수 했다. 나노 입자 흰색 밝은 점으로 시각화 했다 하 고 나노 입자 (그림 4A) 핵을 둘러싼 셀, 안쪽에 있는 것은 가상 수 있습니다.

Falcarindiol 나노 셀을 입력 했다, confocal 현미경 검사 법 hMSCs 24 h. Confocal 치료에 수행한 확인 하려면 이미지 확인 나노 셀, 입력 했다 및 나노 입자의 많은 수에서 세포질에 흩어져 모든 셀 (그림 4B D)입니다. 이 결과 나노 입자 falcarindiol에 대 한 안정적인 약물 전달 시스템으로 행동을 보여준다.

Figure 1
그림 1 :27저 어 아래 주입에 대 한 어셈블리를 보여주는 나노 준비 설치. 나노 입자의 구성 요소를 포함 하는 ethanolic 솔루션의 1 mL로 가득 1 mL 유리 주사기는 autopipette 설치 프로그램에 의하여 이루어져 있었다. 유리 약 병 물 9 mL를 포함 하 고 자기 벼룩은 자력에 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 용 매27이동의 급격 한 주입 방법에 용 제를 혼합 하 여의 도식. 패널 표시 500 rpm에서 교 반 하면서 물 9 mL에 833 µ L/s의 속도로 나노 입자의 구성 요소를 포함 하는 ethanolic 단계의 1 mL의 주입. 나노 입자의 구성 요소 (falcarindiol, DSPC, 콜레스테롤, DSPE 나무 못 2000, DiI) antisolvent (물)는 나노 입자의 형성에는 leadd에 포함 된 ethanolic 솔루션의 혼돈 된 혼합과 급속 한 주입. 색상은 DiI에 의해 주어진 다. Ethanolic 솔루션을 혼합 하는 방법을 관찰 될 수 있다, 급속 하 게 증가 농도는 나노 입자 형성 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 최종 falcarindiol 나노 입자의 구조의 도식. 나노 구조, DSPC, DSPE 나무 못 2000, 콜레스테롤, DiI, falcarindiol 등. 다른 구성 요소는 그들의 농도 따라 축척 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 인간 중간 엽 줄기 세포에서 지질 코팅 falcarindiol 나노 입자의 이미지. (A) hMSCs의 Epifluorescence 현미경 이미지 falcarindiol 나노 입자 24 h에 대 한 치료. 다음 패널 표시 hMSCs falcarindiol 나노 입자 핵의 24 h (B): DAPI 얼룩에 대 한 치료의 confocal 현미경 이미지, (C) DiI 나노 입자, 및 (D) 둘 다의 오버레이 이미지 핵 파란색으로 표시 됩니다 및 빨간색으로 나노 입자입니다. 눈금 막대는 10 µ m. 나노 입자는 세포 세포질에서 흰색 밝은 점으로 시각화 됩니다. 이미지 보기 나노 입자의 많은 외피의 24 h 후 셀을 입력 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

나노 입자의 유형 용 매 나노 크기 (nm) Polydisperisty (nm) 증가할수록 인덱스 (PDI)
비 코팅된 Falcarindiol 83.9 ± 23,9 0.571
PBS 71 ± 20,3 0.571
지질 코팅 Falcarindiol PBS 91.6 ± 6, 4 0.141
3 h 후 PBS 93.5 ± 5,7 0.122
지질 코팅 Falcarindiol + DiI PBS 74.1 ± 6, 7 0.182

표 1: 조작된 나노 입자의 다른 디자인. 용 매 및 나노 유형에 따라 합성된 falcarindiol 나노 입자의 크기와 증가할수록 인덱스입니다. Falcarindiol 나노 입자와 지질 코트 없이 조작 했다. 코트 구성의 다양 한 농도 테스트 되었습니다. 입자 집계 3 h 후 테스트를 했다.

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Discussion

간단한 약물 전달에 대 한 지질 코팅 나노 날조를 위한 상세한 프로토콜, 용 매 이동의 재현, 빠르고 확장 가능한 급속 한 주입 방법 뒤27,28 되었고로이 문서에 제공 됩니다. falcarindiol에 적용. 수성 단계로 유기 단계의 주입 속도 조절 하 여, 코트 falcarindiol 코어를 적절 한 농도에서 코팅 지질을 사용 하 여 하위-100 nm 범위에 있는 입자를 성공적으로 얻을 수 있습니다. 혼자 falcarindiol 강 수에 대 한 난 류 혼합의 개입으로 인해 유발된 증가할수록 가능성 코팅 지질의 존재에 의해 통제 되었다. 이러한 지질 코팅 된 나노 입자의 구조 닮은 네이티브 500000 kDa ApoB100의 배제 및 입체 안정성에 대 한 추가 말뚝-지질 존재의 예외 저밀도 지 단백질). 이 수 동적 대상된 약물 전달 시스템 수 특히 소수 성 약물과 진단 자료18,19, 면역학 응답을 줄이고에 축적을 증가의 광범위의 캡슐화 암 조직16,18. 또한, 약물 저하 반응 (예를 들어, 가수분해, enzymolysis)에 따라 약물 전달 시스템은 vivo에서 그것 순환 동안 저하에서 약물을 보호합니다.

따라서, falcarindiol 나노 입자, 순화 된 약물의 순수한 핵심을 포함 하는 지질 캡슐 단층으로 설계 되었고 조작. 지질 단층 코팅 형광 라벨 DiI와 DSPC, 콜레스테롤, 및 DSPE 못 2000의 구성 되어 있습니다. 입자의 제조 수성 단계 (1:9)의 과잉으로 나노 입자 구성 요소를 포함 하는 ethanolic 솔루션의 급속 한 주입으로 구성 된의 용 매 변화, 급속 한 주입 방법을 사용 하 여 실행 되었다. 나노 입자의 크기, DL을 사용 하 여 측정 되었다는 나노 입자의 통풍 관 hMSCs에 시험 되었다 하 고 형광 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데.

비 코팅된 나노 입자 또한 얻을 수 있습니다, 71 ± 20.3 nm의 크기. 그러나, 위에서 설명한 프로토콜에 따라, 후 0.182의 값이 증가할수록 74.1 nm ± 6.7 nm의 나노 조작 했다. 따라서, 나노 입자는 지질 코트를 추가 하 여 수정 후 크기와은 나노 입자의 PDI는 감소, 그들을 위해 더 적당 한 마약 배달.

높은 인식 주사기 위치의 중요성 같은 프로토콜의 중요 한 단계 때 유기 단계, 집계을 피하기 위해 치료의 같은 날에는 나노 입자의 준비 및 셀의 시드를 주입 하는 것이 중요 하다 하루 전에 적절 한 합류 수준 되도록. 사실, 모든 단계는 프로토콜의 첫 번째 부분에 중요 한 중 하나는 나노 입자의 크기 또는 활성 화합물 및 코팅 지질의 최종 농도 영향으로 간주 수 있습니다. '농도'를 고려 하 고 중요 한 매개 변수로, 1.2, 1.4, 1.6, 1.15, 1.16 단계는 중요 합니다. '나노 크기'는 중요 한 매개 변수를 감안 하면 1.7, 1.11, 1.12 단계는 중요 합니다.

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 나노 셀, 입력 했다 및 나노 입자의 많은 모든 세포의 세포질에 흩어져 나타났다. 이러한 결과 본이 연구에서 설계 된 나노 입자 falcarindiol에 대 한 새로운, 그리고 안정적인 약물 전달 시스템으로 작동할 수 것이 좋습니다.

이 기술은 다른 암 약물, 캡슐화, 빠르고, 간단 하 고 재현성 접근 하며 메서드의 제한 지질 코트와 함께 평가 됩니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 인간 중간 엽 줄기 세포에 대 한 박사 Moustapha Kassem (덴마크, 오 덴 세 대학 병원) 감사합니다. 저자는 덴마크 의료 Bioimaging 센터 그들의 현미경에 대 한 액세스를 감사합니다. 저자는 칼 스 버그와 Villum 기초를 (E.A.C.)을 재정 지원에 대 한 감사합니다. 저자는 덴마크 국립 연구 재단에서 닐스 보어 교수 수상에 의해 제공 하는 금융 지원을 인정 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) Microlab Aarhus A/S ML 33154LP
6 well plates Greiner Bio One International GmbH 657160
Absolute Ethanol EMD Millipore (VWR) EM8.18760.1000
Chloroform Rathburn Chemicals Ltd. RH1009
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P
Confocal Microscope Zeiss LSM510
Cover Slips thickness #1.5 Paul Marienfeld GmbH & Co 117650
Desiccator Self-build
DiI Invitrogen D282
DLS Beckman Coulter DelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 850365C 
DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) Avanti Polar Lipids, Inc. 880120C
eVol XR SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. 2910200
Fetal Bovine serum Gibco 10270-106
Fluorescence Miccroscope Olymous IX81 With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
Incubator Panasonic  MCO-18AC
Magnetic flea VWR Chemicals 15 x 4.5 mm Cylindrical shape with PTFE coating
Magnetic stirrer IKA RT-10
Minimum Essential Media Gibco 32561-029
PBS tablets for cell culture VWR Chemicals 97062-732
Pen/strep VWR Chemicals 97063-708
Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) Thermo Fisher 10010031
Rotary Evaporator Rotavapor, Büchi Labortechnik AG R-210
Sample concentrator  Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC SBHCONC/1

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