Подражая и манипулирования поджелудочной железы ацинарной протоковой метаплазии в 3-мерной клеточной культуре

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Изоляция первичного железистый клетки, белок выражение или деятельности модуляции, культура и вниз поток приложения обильно полезны в ex vivo исследования ацинарной протоковой метаплазия (ADM), раннее событие в развитии рака поджелудочной железы.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fleming Martinez, A. K., Storz, P. Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture. J. Vis. Exp. (144), e59096, doi:10.3791/59096 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Дифференциация железистый клетки протоковой клетки в течение панкреатита и в начале развития рака поджелудочной железы является ключевым процессом, который требует дальнейшего изучения. Чтобы понять механизмы регулирования ацинарной протоковой метаплазия (ADM), ex vivo 3D культуры и дифференциации клеток первичного ацинарной протоковой клетки предлагает много преимуществ по сравнению с другими системами. С техникой здесь модуляции экспрессии белков является простой и быстрый, требующих только один день, чтобы изолировать, стимулировать или вирусно заражать и начать культивирования первичной железистый клетки для изучения процесса адм. В отличие от использования матрицы базальной мембраны, посев железистый клетки кластеров в коллагена я внеклеточного матрикса, позволяет железистый клетки сохраняют самобытность ацинарной до манипуляции. Это очень важно при тестировании вклад различных компонентов для индукции адм Не только последствия цитокинов или других ectopically управляемых факторов для тестирования через эту технику, но вклад общих мутаций, увеличение белков или нокдаун экспрессии белков для тестирования через вирусные инфекции Основная железистый клетки, используя аденовирусных или лентивирусные векторы. Кроме того клетки могут быть повторно изолированы от коллагена или матрица базальной мембраны в конечной точке и проанализированы для выражения протеина.

Introduction

Железистый протоковой метаплазия (ADM) — это защитный механизм течение панкреатита и ключевой процесс вождения развития рака поджелудочной железы1 требует дальнейшего механистического понимания. В то время как воспаление индуцированной ADM реверсивные2, онкогенных мутаций в крас , которые присутствуют в 90% случаев рак поджелудочной железы3, предотвратить дифференциация обратно в железистый фенотип4,5, 6. Culturing и дифференциации первичных железистый клетки в протоковой клетки в культуре 3D позволяет для изучения молекулярных механизмов, регулирующих процесс ADM, который трудно изучать в естественных условиях. Такие ex vivo исследований позволяют в реальном времени визуализации ADM, его водителя и его регуляторы. Было выявлено несколько драйверов ADM процесса, а также механистического понимания по их течению сигнальных путей, или проверить с помощью здесь описал метод. К ним относятся ADM индукции, TGF-α (альфа фактор роста трансформации)-опосредованной выражение MMP-7 (матрицы металлопротеиназы-7) и активации Notch7, а также RANTES (регулируется по активации, нормальной клетки T выразил и выделяется; также известна как лиганд хемокиновых 5 или CCL5) и TNFα (фактора некроза опухоли альфа)-индуцированной ADM через активацию NF-κB (ядерный фактор κB)8. Дополнительные посредника ADM является онкогенный крас9,10, который вызывает увеличение окислительного стресса, что улучшает процесс ADM путем увеличения выражение EGFR (рецептор к эпидермальному фактору роста) и его лигандов, EGF ( эпидермальный фактор роста) и TGF-α11.

Хотя использование линий клеток рака поджелудочной железы является общим для исследования in vitro, культуры главной ячейки предлагают много преимуществ. Например, основной железистый клетки от не трансгенных мышей или мышей, укрывательство инициирующей мутации, например красG12D, являются наиболее подходящей моделью для изучения раннее событие ADM, потому что клетки имеют несколько и управляемой мутации, которые как известно, чтобы присутствовать в начале развития рака поджелудочной железы. Это в отличие от многих линий клеток рака поджелудочной железы, которые имеют несколько мутаций и разнообразные выражения, основанные на проход номер12. Кроме того исследования на животных были проверены сигнальные пути, определены такими средствами. Одно предостережение использования первичных железистый клетки является, что они не могут transfected как типичные рак клеточных линий.

Метод здесь подробно методы железистый клетки изоляции, 3D культуры, которая имитирует ADM, добавляя стимуляторов или модулирующая белков через лентивирусные или аденовирусных инфекций, а также переизоляция клеток в конечной точке для дальнейшего анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все животные работы был одобрен IACUC клиники Майо.

1. Подготовка материалов, 3-мерной матрицы базы и решения

  1. Cut 500 мкм и 105 мкм полипропиленовых сеток в 76 мм 76 мм квадратов. Сложите каждый квадрат пополам дважды, чтобы создать меньше сложить квадрат. Место один 500 мкм и один 105 мкм сетка квадрат в автоклавируемый мешочек.
  2. Автоклав полипропиленовая сетка квадраты, а также две пары ножниц и щипцы.
  3. Сделайте 100 мл 10 x Waymouth в раствор. Перемешать 1 флакон (14 g) Waymouth в порошок в 50 мл деонизированной воды (DI) и, когда распался, добавить 30 мл бикарбоната натрия 7,5% (75 г/Л). Положить окончательный объем 100 мл с помощью ди воды и фильтрации стерилизации.
    1. СМИ хранилище 10 x Waymouth на 4 ° C и используется для подготовки коллагеновые гели и 1 x Waymouth СМИ. Если преципитаты формы, отменить.
  4. Сделайте 50 мл 1 x Waymouth в полный СМИ в поджелудочной железы, добавив 125 мкл ингибитора трипсина 40 мг/мл соевого, 12,5 мкл дексаметазона 4 мг/мл и 500 мкл плода бычьим сывороточным (ФБС). Стерилизуют фильтрацией и использовать в течение 48 ч.
  5. Подготовка 3-мерной матрицы баз с помощью коллагена или базальной мембраны матрицы (см. таблицу материалы для информации). Когда закупорить база, установите пластину на льду, избежать пузырей и поверните пластину сразу же после дозирование объема каждой скважины для обеспечения полного охвата.
    1. Создание базы коллагена, смешивая следующие компоненты на льду в культуре ткани капюшоном: 5,5 мл типа я крысы хвост коллаген, 550 мкл 10 x Waymouth в СМИ и 366.6 мкл 0,34 M NaOH (отфильтрованные).
      Примечание: Это достаточно решение сделать коллагена баз для одной 24-а, 12-ну или 6-ну плиты. Одна пластина является достаточным для ацинарной изоляции от одного поджелудочной железы.
    2. Используйте следующие тома для пластины коллагена база: 80 мкл (8-Ну стеклянное скольжение), 200 мкл (24-ну плита), 400 мкл (12-ну Латы) или 800 мкл (6-ну плита).
    3. Для базальной мембраны матрица базы, накапайте матрица без каких-либо дополнительных компонентов. Используйте следующие тома для каждой скважины: 50 мкл (8-Ну стеклянное скольжение), 120 мкл (24-ну плита), 240 мкл (12-ну Латы) или 600 мкл (6-ну плита).
    4. Пусть баз затвердеть в течение по крайней мере 30 минут в инкубатор культуры клеток (37 ° C, 5% CO2) прежде чем создавать второй слой матрицы с встроенный клетки на вершине этих баз (шаг 4).
  6. В рамках подготовки к ацинарной изоляции Держите один стакан 600 мл, три 50 мл трубки, газобетона пару ножниц, газобетона пара щипцов и ведро льда под капотом с три лодки весят. Затем сделайте 30 мл HBSS с 300 мкл, 100 x пенициллин-стрептомицина, положив 10 мл в каждую из двух лодки весят и помня окончательного 10 мл тюбик 50 мл (для использования в шагах 1.8.2 и 2.1.4).
  7. Сделать 40 мл HBSS + 5% FBS, 20 мл HBSS + 30% FBS и 5 мл коллагеназы 2 мг/мл в HBSS. Стерилизовать коллагеназы по фильтрации (0.22 мкм поры) и держать при комнатной температуре. Держите каждое из решений HBSS на льду.
  8. Соберите рабочую область для рассечения поджелудочной железы, что может быть сделано на скамейке в лаборатории.
    1. Место Впитывающим вкладышем на таблице, вместе с крышкой из полистирола покрыты фольгой. Затем поместите бумажное полотенце с 4 штырями поверх фольги.
    2. Держите следующие пункты досягаемости рассечение рабочей: сжигание мешок, один набор газобетона ножницы, щипцы, спрей бутылку с 70% этанол и ведро льда (с 50 мл трубки HBSS, содержащих пенициллин стрептомицина из шага 1.6).
  9. Установите центрифуге до 4 ° C и шейкер до 37 ° C.

2. железистый клетки изоляции

  1. Пожертвовать мыши через CO2 индукции и выполнять шейки матки дислокации. Сразу же вскрыть поджелудочной железы. Для того чтобы рассечь поджелудочной железы, первый pin лапы мыши крышку из полистирола, Ориент мыши, таким образом, что хвост сталкивается исследователь и спрей живота с 70% этиловом спирте.
    Примечание:
    мыши, используемый в результатах представитель был 12 - неделя старый не трансгенных девушки с фоном C57BL/6. Мышь выбор более подробно рассматривается в разделе обсуждения.
    1. С помощью набора из газобетона ножницы, щипцы, поднимите мех/кожа с щипцами в средней линии и используйте ножницы, чтобы сделать надрез через мех и кожу от уретры открытия в области диафрагмы/грудной клетки.
    2. Сделать дополнительные разрезы для левой и правой, таким образом, что мех/кожа разрезается прочь, чтобы создать четкое представление о брюшной полости. Затем нарезать перитонеальный накладки (посередине и справа и слева) и потяните его от органов, как это было сделано с мех/кожа.
    3. Поднимите кишечника с щипцами и положил его на левой стороне мыши, создавая пространство, чтобы увидеть поджелудочной железы, который является свет розовый цвет и прилагается к селезенке, который является темно красный овал. Текстура мягкая, губчатая отличается ткани поджелудочной железы. Вырежьте из поджелудочной железы, которая будет проходить вдоль живота и переплетаются с кишечником.
    4. Отделите хандры от поджелудочной железы. Затем поставьте поджелудочной железы в Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл HBSS с 1 x пенициллин стрептомицином и довести это до Ламинарный шкаф.
      Примечание: Оставшиеся шаги протокола должно быть сделано используя стерильную методику в Ламинарный шкаф.
  2. Залить поджелудочной железы и HBSS (с пенициллин стрептомицином) в пустой вес лодки и, с помощью щипцов, мыть поджелудочной железы, вращая его. Затем переместите поджелудочной железы с щипцами для второй весят лодка, содержащие HBSS (с пенициллин стрептомицином). Опять же мыть поджелудочной железы, закрученной.
  3. Переместить поджелудочной железы в HBSS третьего (с пенициллин стрептомицином)-содержащих весят лодку и начала резки поджелудочной железы на мелкие кусочки, 5 мм или меньше. Затем налейте в пустой 50 мл трубки части поджелудочной железы и HBSS.
    1. Для этого используйте щипцы для перемещения части поджелудочной железы в жидкость, как лодки весят отклоняется. Залейте после того, как все куски больше не прилагается к лодки весят. Подобрать любые оставшиеся куски с щипцами и мыть щипцы в Тюбик 50 мл, содержащие поджелудочной железы в HBSS с пенициллина и стрептомицина.
  4. Центрифуга в 931 x g на 2 мин при температуре 4 ° C, а затем удалите HBSS (и любой жир, что плавает), дозирование Выкл с 5 мл пипетки.
  5. Добавьте 5 мл коллагеназы (разводят в HBSS шаге 1.7) поджелудочной железы. Обеспечить герметичные крышки, завернув Тюбик 50 мл в пластиковых парафин фильме и затем поместите его в инкубаторе встряхивания на 220 rpm для 20 минут при 37 ° C.
    Примечание: Коллагеназы пищеварение время может варьироваться, как отмечалось в ходе обсуждения. В конце инкубации должны оставаться без больших кусков ткани.
  6. Чтобы остановить диссоциации, место поджелудочной железы содержащих трубки на льду и добавить 5 мл холодного HBSS + 5% FBS. Центрифуга в 931 x g на 2 мин на 4 ° C, а затем накапайте покинуть супернатанта, с помощью пипетки 5 мл.
  7. Ресуспензируйте в 10 мл HBSS + 5% FBS и центрифуги в 931 x g на 2 мин при 4 ° C. Пипетки с супернатанта, с помощью пипетки 5 мл и повторить этот шаг с другой 10 мл HBSS + 5% FBS.
  8. Ресуспензируйте в HBSS + 5% 5 мл FBS и, используя P1000, передачи 1 мл раствора через сетку 500 мкм в 50 мл трубки. Добавить еще 5 мл HBSS + 5% FBS через сетку с P1000 стирать любые оставшиеся клеток поджелудочной железы через сетку.
  9. Положите суспензию клеток из 500 мкм сетки через сетку 105 мкм дозирования 1 мл одновременно с помощью P1000. Далее, нежно накапайте суспензию клеток в пробирку, содержащую HBSS + 30% FBS. Слой суспензию клеток образуют наверху; После центрифугирования железистый клетки утонет в форме гранул.
  10. Центрифуга на 233 x g на 2 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 x Waymouth в полный СМИ.
    1. Если перейти непосредственно к анкеровки клеток коллагена или матрицы базальной мембраны, Ресуспензируйте в объеме 7 мл на поджелудочной железы. Если продолжить аденовирусных или лентивирусные инфекции, Ресуспензируйте в 4 мл на поджелудочной железы.

3. вирусные инфекции

  1. Как один из поджелудочной железы достаточно для двух вирусных инфекций (управления и экспериментальный, например, null и cre), Сплит суспензию клеток между крышками из двух пластин, 35 мм. Использование крышки пластин позволяет инфекции в суспензии и поэтому легко движения на окончательный подложку позже.
    1. При работе с вирусом, Замочите все используемые наконечники в 10% отбеливатель для по крайней мере 15 минут.
      Примечание: Использование плиты 35 мм и объем 4 мл хорошо работает для клетки от не трансгенных мышей между 8 и 16 недель. Размер плиты и тома может потребоваться корректироваться для животных с меньшим или большим pancreata.
  2. Аденовирусных инфекций, добавьте вирус (с титр по крайней мере 107 ту/мл) на 1:1,000 разрежения на крышке каждого листа и вихрем (рис. 2, GFP аденовирус). Поместите пластины в инкубатор культуры клеток (37 ° C, 5% CO2) и вихрем каждые 15 минут за 1 ч инкубации Continue для дополнительных 2 h, а затем приступить к анкеровки клеток в матрице коллагена или базальной мембраны.
  3. После завершения вирусных работа в капюшоне, Замочите все компоненты в капот с 10% отбеливатель для по крайней мере 15 минут и затем тщательно чистить отбеливателя с использованием 70% этиловом спирте.

4. анкеровки клеток коллагена или базальной мембраны матрицы

  1. Сделать гель коллагена на льду, объединяя 7 мл тип I крысы хвост коллагена (3,3 мг/мл), 700 мкл 10 x Waymouth в СМИ и 466.6 мкл 0,34 M NaOH.
  2. Принимая равных объемах подвеска гель и клеток коллагена, аккуратно перемешайте. Если добавление стимул или ингибитор, совместить это с суспензию коллаген клеток. Пластина одной скважины в то время (пластины из шага 1.5.3); сохраняя пластину на льду, вихрем равномерно распределить слой коллагена клетки.
    1. В каждом хорошо, накапайте следующие тома коллагена клеточной суспензии: 200 мкл (8-Ну стеклянное скольжение), 500 мкл (24-ну плита), 1000 мкл (12-ну Латы) или 2000 мкл (6-ну плита). Обратите внимание, что ADM индуцируется через стимуляции с TGF-α (50 нг/мл) на рисунке 2.
  3. Для анкеровки клеток в матрице базальной мембраны смесь из одной части базальной мембраны матрица с двух частей суспензию клеток. Как и в случае с коллагеном, держите подвеска ячейку матрицы, а также пластину на льду. Накапайте один хорошо в то время, используя же томов, отметили в 4.2.1 и вихрем для равномерного распределения.
  4. Место пластину в инкубатор культуры клеток (37 ° C, 5% CO2) за 30 мин, чтобы затвердеть и затем добавить 1 x полная Waymouth в СМИ с любой стимул или ингибитора (Рисунок 2 использует TGF-α в 50 нг/мл). На следующий день и затем каждый день измените СМИ (с стимул или ингибитора). В зависимости от стимула ADM можно наблюдать между 3 и 5 день.

5. уборка клетки из коллагена или матрица базальной мембраны

  1. Соберите следующие материалы, необходимые для уборки клеток из коллагена: коллагеназа 1 мг/мл по 30 мл разбавленной в HBSS, 40 мл холодного HBSS, 31 мл холодного PBS, две лопатки, две трубы 50 мл и льда. Отрегулируйте количество шпатели, труб и количество решений, если сравнение более двух условий культуры (где каждое условие — ½ плиты). Установите центрифуге до 4 ° C и установите пожимая инкубатора 37 ° C.
  2. Удалите средства массовой информации и использовать шпатели для удаления коллагена диски с встроенных клеток. Для каждого условия, поставить диски в отдельном пустой Тюбик 50 мл.
  3. Добавьте 10 мл коллагеназы 1 мг/мл в HBSS каждый Тюбик 50 мл. Оберните Трубы пластиковые парафин пленкой и поставить в 37 ° C, пожимая инкубатор на 225 об/мин до 45 минут. Следить за пищеварение и удалить трубы, когда есть не более заметными коллагена.
  4. Центрифуга на 233 x g при 4 ° C на 2 мин с минимальным замедления. Возьмите супернатант и Ресуспензируйте в 5 мл раствора коллагеназы на трубу. Дайджест в 37 ° C, пожимая инкубатор на 225 об/мин, 10 минут или до тех пор, пока есть без видимых коллагена.
  5. Остановите пищеварение, добавив 5 мл холодного HBSS и впоследствии центрифугирования в 233 x g на 2 мин при температуре 4 ° C с минимальным замедления.
    1. Ресуспензируйте в 15 мл холодного HBSS и снова центрифуги на 233 x g на 2 мин при температуре 4 ° C с минимальным замедления. Повторите эти действия.
  6. Ресуспензируйте гранулы в 1 мл PBS и перейти к 1,5 мл. Центрифуга в ведро качели на 233 x g на 2 мин при температуре 4 ° C с минимальным замедления. Удалите супернатант и оснастки замораживание в жидком азоте или сухого льда.
    Примечание: Пелле клетки могут храниться на-70 ° C или немедленно использовать в приложениях, вниз по течению.
  7. Урожая базальной мембраны матрица встроенный клеток, накапайте СМИ от каждой скважины в 50 мл трубки на льду. Затем добавить решение восстановления матрицы базальной мембраны в каждой скважине и очистите смесь клеток гель в Тюбик 50 мл.
    Примечание: Объем базальной мембраны Матрица решения восстановления для добавления к каждой скважины является следующим: 150 мкл (8-Ну стеклянное скольжение), 420 мкл (24-ну плита), 845 мкл (12-ну плита) и 2000 мкл (6-ну плита).
  8. Промывайте хорошо дважды с базальной мембраны матрица восстановления решения, добавление полоскания Тюбик 50 мл.
    Примечание: Объем базальной мембраны Матрица решения восстановления для каждого полоскания является следующим: 150 мкл (8-Ну стеклянное скольжение), 420 мкл (24-ну плита), 845 мкл (12-ну плита) и 2000 мкл (6-ну плита).
  9. Оставьте трубки на льду за 1 ч или до базальной мембраны матрица растворяется и следовать с центрифугированием при 300 x g 5 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл холодного PBS (может передавать 1,5 мл, если ячейка Пелле).
  10. Центрифуга на 3500 x g 3 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и либо оснастки заморозить Пелле ячейки или добавить буфера lysis и непосредственно перейти к течению приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Завершение протокола здесь происходит в течение одного дня и после стимуляции, ADM рассматривается в 3-5 дней. Рисунок 1 иллюстрирует последовательность метода, которой выполнены шаги 1-4 в первый день. Это включает в себя подготовку, железистый изоляции, вирусной инфекции и анкеровки в коллагена или матрица базальной мембраны. В то время как матрица базальной мембраны индуцирует ADM, железистый клетки внутри коллаген я требуют стимул, например TGF-α, пройти дифференциации протоковой клеток. На 1 день клетки в матрице коллагена или базальной мембраны имеют вид круглых винограда как и если используя вирусной инфекции с вектором, выражая флуоресцентный белок, эффективность инфекции могут быть проверены. День 5 клетки в коллагена будет формируют воздуховодов если дали толчок в то время анкеровки и в качестве дополнения в средствах массовой информации, который изменяется на 1, 3 и 5 дней. Клетки, внедренные в матрицу базальной мембраны образуют воздуховодов в отсутствие стимула, но после стимуляции составят более крупные протоки, как показано на рисунке 2.

Figure 1
Рисунок 1 : Схема процедуры, чтобы изолировать мышиных первичной железистый клетки, модулировать выражение протеина и/или стимулирования ацинарной протоковой метаплазия и внедрять ячейки в коллагена или базальной мембраны матрица. Процесс включает в себя изоляцию железистый клетки, который включает диссекции фильтрации клеток поджелудочной железы и пищеварение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Представитель результаты первичного железистый клетки, покрытие в пределах коллагена или базальной мембраны матрицы после аденовирусных инфекций и стимуляции с TGF-α. Первичный железистый клетки от не трансгенных мыши были заражены GFP-аденовирус, встроенные в коллагена I или матрица базальной мембраны и стимулировали с или без TGF-α (50 нг/мл). Двадцать четыре часа после инфекции с GFP аденовирус, изображения были захвачены показать эффективность инфекции. На пять дней после инфицирования образы обозначим различия в стимулируется с или без TGF-α в коллагена или матрица базальной мембраны клеток. Воздуховод как структуры обозначаются белые стрелки и масштаб бары представляют 50 µm. изображения были получены с помощью Конфокальный микроскоп с целью ЕС план-Neofluar 10 x / 0,3 M27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Относительно короткий промежуток времени для изоляции, инфекции и покрытие первичных железистый клетки является преимуществом этого метода. В отличие от культивирования железистый клетки от экспланта нарост требует мало практический времени, но она занимает семь дней для нарост железистый клетки13. Альтернативный протокол для ацинарной изоляции14 отмечает очень короткий метод для получения железистый клетки; Однако EGF является важным компонентом в угаснуть железистый клетки при изоляции с помощью этого протокола. Так как EGF стимулирует дифференциация железистый клетки протоковой клетки, метод, который не требует ADM-стимулирующие компоненты для культуры, лучше для изучения механизмов индукции или регулирование адм В этом методе железистый клетки личность сохраняется во время культивирования в коллагена, если стимулировали дифференцироваться в протоковой клетки. Кроме того через Управление выражение протеина являются преодолеть трудности в transfecting клетках первичной вирусной инфекции.

Эта процедура предлагает прямое исследование ADM, на котором визуализация протоковой структуры индукции может произойти через brightfield и/или иммунофлюоресценции микроскопии. Для визуализации приложений, палата слайды (указано в Таблица материалов) являются лучшими. Фиксация на 15 минут при 37 ° C с параформальдегида 4% будет исправить клетки, встроенные в матрице базальной мембраны без тревожных протоковой структур. Во время инкубации базальной мембраны матрица будет пластика и может быть аккуратно накапаны покинуть с параформальдегида. Иммунофлюоресценции на клетках коллаген встроенных подробно в рамках дополнительных протоколов15,16. Дополнительные приложения для анализа участвующих сигнальных механизмов в конечной точке эксперимента включают Западная помарка, ПЦР и активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS). Одна шестая часть поджелудочной железы является достаточно материала для анализа одного образца через западную помарку или ПЦР.

Ограничения этого протокола возникают от использования коллагена или базальной мембраны матрицы, где каждый имеет свои преимущества и недостатки. Хотя анкеровки клеток коллагена будет производить воздуховоды только если стимулы предоставляются, базальной мембраны матрица анкеровки будет производить воздуховоды без дополнительных стимулов. Однако протоковой размер матрицы базальной мембраны является измеримого выходного. Дополнительное ограничение является время, участвующих в процедуре сбора урожая в шаге 5, которые могут повлиять на экспрессию генов. Это ограничение можно смягчить путем подтверждения результатов, полученных от Западный blotting с иммунофлюоресценции, в котором время фиксации значительно меньше, чем это время сбора урожая для ПЦР или Западный анализ помаркой.

В дополнение к аденовирусных инфекций лентивирусные инфекции может использоваться в Главные ячейки. Для лентивирусные инфекции, добавить 6 мкг/мл вирусной инфекции усилитель реагента (см. таблицу материалов) клеток и мягко вихрем пластины. Впоследствии, добавить человека (с титр по крайней мере 107 ту/мл) при разбавлении 1:1,000 и опять же, слегка взболтать. Инкубируйте 3-5 ч (37 ° C, 5% CO2), а затем продолжать анкеровки клеток в матрице коллагена или базальной мембраны. Для создания человека с плазмиду интереса, используйте смесь лентивирусные упаковки, указано в таблице материалов.

Дальнейшие модификации могут включать изоляции клеток от мышей, выражая красG12D. В этих мышей, которые уже имеют фиброзных районы с ADM и Панин поражений, коллагеназа пищеварение занимает больше времени. Тщательный мониторинг коллагеназы пищеварения, как описано в критических шагов и устранение неполадок, не требуется. Мышь имеет более атипия тканей, тем дольше пищеварение будет принимать (около часа для 12 неделю старый p48Cre; LSL-KrasG12D мышь). Поскольку огромные различия между мышей того же возраста, мы советуем вам изолировать железистый клетки от LSL -красG12D мыши и выполнять аденовирусных или лентивирусные инфекции, используя cre получить онкогенных крас выражение. Также следует отметить, что наш протокол оптимизирован для изоляции железистый клетки для изучения процесса адм. Изоляции ADM и Панин клеток от красG12D-выражая мышей органоид культура требует изменения протоколов.

Одним важным шагом является количество времени, затрачиваемое нарезанный поджелудочной железы в коллагеназы. Идеальный коллагеназы пищеварение время может варьироваться от мыши, мыши и между количеством коллагеназы из той же компании. Время, отмечается в протоколе подходит для pancreata весом около 0,250 g. слишком много времени может повредить и убить клетки, в то время как слишком мало времени приведет к неполной пищеварение и поэтому меньше клетки, что сделает его через процесс фильтрации на Заключительный плиты. Визуально проверьте диссоциации, глядя для разбивки нарезанный вверх поджелудочной железы штук; решение следует включить ясно. Кроме того перед остановкой коллагеназы реакции с холодной HBSS, решение можно take up с 5 мл пипетки, где легкость, с которой решение может быть take up будет указано, если это целесообразно прекратить реакции. Дополнительное рассмотрение является количество pancreata собирают. Если более чем одна поджелудочной железы изолирован в то же время, процедура работает лучше, когда pancreata хранятся отдельно.

Другим важным моментом для обеспечения здоровой культуры клеток первичного ацинарной является быть осторожность при дозирование раствора железистый клетки. Энергичные дозирование может вызвать повреждение клеток и привести к отсутствию формирования протока, даже с добавлением известных ADM индукторов, например TGF-α. Кроме того если есть вопросы жизнеспособности, центрифугирование в шагах 2.4, 2.6 и 2.7 могут быть приняты до 300 x g производить мягкий гранул.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана R01 Грант (CA200572) из низ в PS. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национального института рака или национальных институтов индикаторное спонсорам было никакой роли в изучать дизайн, сбора и анализа данных, решение публиковать, или подготовка рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 °C shaking incubator Thermo Scientific SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubator NUAIRE NU-5500
50 mL tubes Falcon 352070
Absorbent pad, 20" x 24" Fisherbrand 1420662
Adenovirus, Ad-GFP Vector Biolabs  1060
Aluminum foil Fisherbrand 01-213-101
BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 Fisher Scientific  305167 Use as pins for dissection 
Beaker, 600 mL Fisherbrand FB-101-600
Bleach, 8.25% Clorox 31009
Cell Recovery Solution Corning 354253 Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript.
Centrifuge  Beckman Coulter Allegra X-15R Centrifuge
Collagenase Type I, Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C.
Dexamethasone Sigma D1756 Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. 
Ethanol, 200 proof Decon Laboratories  2701
Fetal Bovine Serum  Sigma F0926-100mL
Forceps  Fine Science Tools 11002-12
Forceps  Fine Science Tools 91127-12
Glass slide, 8-well Lab-Tek 177402
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red Fisher Scientific SH3048801   
Ice bucket, rectangular Fisher Scientific  07-210-103
Instant Sealing Sterilization Pouch Fisherbrand 01-812-51
LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)  Minigrip SBL2X69S
Lentiviral Packaging Mix, Virapower Invitrogen 44-2050
Matrigel Corning 356234 Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript.
Parafilm Bemis PM992 Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript.
PBS Fisher Scientific SH30028.02
Penicillin-Streptomycin  ThermoFisher Scientific 15140122
Pipet tips, 10 µL USA Scientific 1110-3700
Pipet tips, 1,000 µL  Olympus Plastics 24-165RL
Pipet tips, 200 µL  USA Scientific 1111-1700
Pipet-Aid Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL Gilson F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL Gilson F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL Gilson F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL Gilson F123601
Pipettes, 10 mL  Falcon 357551
Pipettes, 25 mL Falcon 357525
Pipettes, 5 mL  Falcon 357543
Plate, 12-well Corning Costar 3513
Plate, 24-well plate Corning Costar 3524
Plate, 35 mm Falcon 353001
Plate, 6-well Falcon 353046
Polybrene EMD Millipore TR-1003-G Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. 
Polypropylene Mesh, 105 µm Spectrum Labs 146436
Polypropylene Mesh, 500 µm  Spectrum Labs 146418
Scissors  Fine Science Tools 14568-12
Scissors  Fine Science Tools 91460-11
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) Fisher Scientific BP328-500
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
Soybean Trypsin Inhibitor 8 Gibco 17075029
Spatula Fisherbrand 21-401-10
Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters  Millipore SCGP00525
TGF-α R&D Systems 239-A-100
Type I Rat Tail Collagen Corning 354236
Waymouth MB 752/1 Medium (powder) Sigma W1625-10X1L
Weigh boat, hexagonal, medium  Fisherbrand 02-202-101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61, (3), 449-458 (2012).
  2. Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144, (6), 1170-1179 (2013).
  3. Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18, (1), 1-6 (1995).
  4. Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22, (6), 737-750 (2012).
  5. Morris, J. P. t, Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120, (2), 508-520 (2010).
  6. Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Cancer Research. 63, (9), 2016-2019 (2003).
  7. Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (49), 19327-19332 (2007).
  8. Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202, (3), 563-577 (2013).
  9. De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (48), 18907-18912 (2008).
  10. Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (48), 18913-18918 (2008).
  11. Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14, (10), 2325-2336 (2016).
  12. Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43, (5), 577-578 (2007).
  13. Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90, (12), 1052-1060 (2011).
  14. Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  15. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 10 Unit 10 11-20 (2010).
  16. Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics