3-आयामी कोशिका संस्कृति में अग्नाशय कोष्ठकी-टू-डक्टर Metaplasia की नकल उतारना और हेर-फेर करना

Cancer Research

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Summary

प्राथमिक कोष्ठकी कोशिका अलगाव, प्रोटीन अभिव्यक्ति या गतिविधि मॉडुलन, संस्कृति, और नीचे धारा अनुप्रयोगों कोष्ठकी-to-डक्टर metaplasia (ADM), अग्नाशय के कैंसर के विकास में एक प्रारंभिक घटना के पूर्व vivo अध्ययन में प्रचुर मात्रा में उपयोगी होते हैं ।

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Fleming Martinez, A. K., Storz, P. Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture. J. Vis. Exp. (144), e59096, doi:10.3791/59096 (2019).

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Abstract

अग्नाशयशोथ के दौरान और अग्नाशय के कैंसर के प्रारंभिक विकास में नलिकात्मक कोशिकाओं को कोष्ठकी कोशिकाओं के भेदभाव एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है कि आगे के अध्ययन की आवश्यकता है । कोष्ठकी-to-डक्टर metaplasia (ADM) को विनियमित करने वाले तंत्रों को समझने के लिए, पूर्व विवो 3d संस्कृति और नलिकात्मक कोशिकाओं को प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं के भेदभाव अन्य प्रणालियों पर कई लाभ प्रदान करता है. तकनीक के साथ साथ, प्रोटीन अभिव्यक्ति का मॉडुलन सरल और जल्दी है, को अलग करने के लिए केवल एक दिन की आवश्यकता होती है, उत्तेजित या वायरल संक्रमित, और ADM प्रक्रिया की जांच करने के लिए प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं संवर्धन शुरू करते हैं । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का उपयोग करने के लिए इसके विपरीत में, कोलेजन मैं extracellular मैट्रिक्स में कोष्ठकी सेल क्लस्टर के सीडिंग, कोष्ठकी कोशिकाओं हेरफेर से पहले अपने कोष्ठकी पहचान बनाए रखने के लिए अनुमति देता है । यह महत्वपूर्ण है जब ADM की प्रेरण करने के लिए विभिंन घटकों के योगदान का परीक्षण । न केवल साइटोकिंस या अंय ectopically प्रशासित कारकों का प्रभाव इस तकनीक के माध्यम से परीक्षण कर रहे हैं, लेकिन आम उत्परिवर्तनों के योगदान, प्रोटीन अभिव्यक्ति वृद्धि हुई है, या प्रोटीन अभिव्यक्ति के पछाड़ना वायरल संक्रमण के माध्यम से परीक्षणीय है प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं, adenoviral या lentiviral वैक्टर का उपयोग कर । इसके अलावा, कोशिकाओं को फिर से समापन बिंदु पर कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से अलग और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया जा सकता है ।

Introduction

कोष्ठकी-to-डक्टर metaplasia (ADM) अग्नाशयशोथ के दौरान एक सुरक्षात्मक तंत्र और एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया अग्नाशय के कैंसर के विकास के ड्राइविंग1 कि आगे यंत्रवत अंतर्दृष्टि की आवश्यकता है । जबकि सूजन प्रेरित ADM प्रतिवर्ती2, oncogenic KRAS उत्परिवर्तनों, जो अग्नाशय के कैंसर के मामलों3के ९०% में मौजूद हैं, एक कोष्ठकी phenotype4,5 करने के लिए वापस भेदभाव को रोकने, 6. संवर्धन और 3 डी संस्कृति में वाहिनी कोशिकाओं में अंतर प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं ADM प्रक्रिया है, जो vivo में अध्ययन करने के लिए मुश्किल है विनियमन आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए अनुमति देता है । इस तरह के पूर्व vivo अध्ययन ADM, इसके ड्राइवरों और उसके नियामकों के वास्तविक समय दृश्य सक्षम करें । ADM प्रक्रिया के कई ड्राइवरों, साथ ही उनके बहाव संकेत मार्ग पर यंत्रवत अंतर्दृष्टि, पहचान की गई है या यहां वर्णित विधि का उपयोग कर सत्यापित । इन TGF द्वारा ADM प्रेरण शामिल-α (विकास कारक अल्फा बदलने)-एमएमपी की मध्यस्थता अभिव्यक्ति-7 (मैट्रिक्स metalloproteinase-7) और7पायदान के सक्रियकरण, साथ ही rants (सक्रियण पर विनियमित, सामान्य टी सेल व्यक्त की है और स्रावित; भी जाना जाता के रूप में chemokine ligand 5 या CCL5) और TNFα (ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा)-NF-κB (नाभिकीय फैक्टर-κB)8के सक्रियण के माध्यम से प्रेरित ADM । adm के एक अतिरिक्त मध्यस्थ oncogenic KRas9,10है, जो ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि के कारण EGFR (एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर) और उसके लाइगैंडों, EGF की वृद्धि की अभिव्यक्ति के माध्यम से ADM प्रक्रिया को बढ़ाता है, है ( एपिडर्मल वृद्धि कारक) और TGF-α11.

जबकि अग्नाशय के कैंसर के सेल लाइनों का उपयोग इन विट्रो अध्ययनों के लिए आम है, प्राथमिक सेल संस्कृतियों कई लाभ प्रदान करते हैं । उदाहरण के लिए, गैर-ट्रांसजेनिक चूहों या चूहों KrasG12Dके रूप में उत्परिवर्तनों की शुरुआत बंदरगाह, से प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं, ADM की प्रारंभिक घटना का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त मॉडल है क्योंकि कोशिकाओं को कुछ और नियंत्रित उत्परिवर्तनों है, जो अग्नाशय के कैंसर के विकास में जल्दी उपस्थित होने के लिए जाना जाता है । यह कई अग्नाशय के कैंसर सेल लाइनों जो कई उत्परिवर्तनों और विभिंन मार्ग संख्या12के आधार पर अभिव्यक्ति की है इसके विपरीत में है । इसके अतिरिक्त, इस तरह के माध्यम से पहचान संकेत मार्ग पशु अध्ययन द्वारा सत्यापित किया गया है । प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं का उपयोग कर के एक चेतावनी है कि वे विशिष्ट कैंसर सेल लाइनों के रूप में transfected नहीं किया जा सकता है ।

विधि कोष्ठकी सेल अलगाव, 3 डी संस्कृति कि उत्तेजक या adenoviral या lentiviral संक्रमण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पुन: समापन बिंदु पर कोशिकाओं के अलगाव के माध्यम से जोड़कर ADM नकल की तकनीकों का विवरण आगे विश्लेषण के लिए ।

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Protocol

सभी पशु कार्य मेयो क्लिनिक IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. सामग्री, समाधान, और 3 आयामी मैट्रिक्स कुर्सियां की तैयारी

  1. कट ५०० µm और १०५ µm के जाल ७६ mm में ७६ mm चौकों से मेष । एक छोटे जोड़ वर्ग बनाने के लिए आधा दो बार में प्रत्येक वर्ग गुना । एक autoclavable थैली में १ ५०० µm और १ १०५ µm मेष वर्ग प्लेस ।
  2. आटोक्लेव के जाल चौकों, साथ ही कैंची और संदंश के दो जोड़े ।
  3. 10x है Waymouth समाधान के १०० मिलीलीटर बनाओ । Waymouth के चूर्ण की 1 शीशी (14 ग्राम) को ५० मिलीलीटर (DI) पानी में डालें और जब भंग हो जाए, तो ७.५% (७५ g/L) सोडियम बिकारबोनिट की 30 मिलीलीटर जोड़ें । DI पानी और फिल्टर बंध्याकरण का उपयोग कर १०० मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाओ ।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10x Waymouth के मीडिया की दुकान और कोलेजन जैल और 1x Waymouth के मीडिया को तैयार करने का उपयोग करें । जब हाला रूप, त्यागें ।
  4. १२५ µ एल के ४० मिलीग्राम/एमएल सोयाबीन trypsin अवरोधक, १२.५ µ एल के 4 मिलीग्राम/एमएल डेक्समेतएसॉनी, और भ्रूण गोजातीय सीरम (µ) के ५०० FBS एल जोड़कर अग्ंयाशय के अनुसार 1x Waymouth के पूरा मीडिया के ५० मिलीलीटर बनाओ । निस्पंदन द्वारा निष्फल और ४८ एच के भीतर का उपयोग करें ।
  5. तैयार 3 आयामी मैट्रिक्स या तो कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का उपयोग कर कुर्सियां (उत्पाद जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें) । जब आधार pipetting, बर्फ पर प्लेट जगह, बुलबुले से बचने के लिए, और एक अच्छी तरह की मात्रा pipetting के बाद तुरंत प्लेट को घुमाएगी पूर्ण कवरेज सुनिश्चित करने के लिए ।
    1. एक ऊतक संस्कृति हूड में बर्फ पर निंनलिखित घटकों को मिलाकर कोलेजन कुर्सियां बनाएं: ५.५ प्रकार की मैं चूहे पूंछ कोलेजन, ५५० 10x है Waymouth मीडिया के µ एल, और ३६६.६ µ एल ०.३४ एम NaOH (फ़िल्टर्ड) की मिलीलीटर ।
      नोट: यह पर्याप्त १ २४ के लिए कोलेजन कुर्सियां बनाने के लिए समाधान है-ठीक है, 12 अच्छी तरह से, या 6-अच्छी तरह से थाली । एक प्लेट एक अग्ंयाशय से कोष्ठकी अलगाव के लिए पर्याप्त है ।
    2. कोलेजन बेस थाली के लिए निंनलिखित संस्करणों का प्रयोग करें: ८० µ एल (8-अच्छी तरह से गिलास स्लाइड), २०० µ एल (24 अच्छी तरह से थाली), ४०० µ एल (12 अच्छी तरह से थाली), या ८०० µ l (6 अच्छी तरह से प्लेट) ।
    3. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कुर्सियां के लिए, किसी भी अतिरिक्त घटकों के बिना मैट्रिक्स प्लास्टिक । प्रत्येक कुआं के लिए निंन संस्करणों का उपयोग करें: ५० µ l (8-well ग्लास स्लाइड), १२० µ l (24-वेल प्लेट), २४० µ l (12-वेल प्लेट), या ६०० µ l (6-वेल प्लेट).
    4. कुर्सियां एक सेल संस्कृति मशीन (३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2) में कम से 30 मिनट के लिए इन ठिकानों (चरण 4) के शीर्ष पर एंबेडेड कोशिकाओं के साथ मैट्रिक्स की एक दूसरी परत बनाने से पहले जमना ।
  6. कोष्ठकी अलगाव के लिए तैयार करने में १ ६०० मिलीलीटर चोंच, ३ ५० मिलीलीटर ट्यूबों, कैंची, संदंश की एक autoclaved जोड़ी, और तीन बकरों नौकाओं के साथ हुड के नीचे एक बर्फ की बाल्टी की एक autoclaved जोड़ी रखने के लिए । फिर, 100x पेनिसिलिन-streptomycin के ३०० µ l के साथ HBSS के 30 मिलीलीटर बनाने, दो वजन नौकाओं में से प्रत्येक में 10 मिलीलीटर डाल और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में अंतिम 10 मिलीलीटर रखने (चरणों में उपयोग के लिए 1.8.2 और 2.1.4).
  7. HBSS के ४० मिलीलीटर + 5% FBS, HBSS के 20 मिलीलीटर + 30% FBS, और collagenase में 2 मिलीग्राम/एमएल HBSS के 5 मिलीलीटर बनाओ । निस्पंदन द्वारा collagenase निष्फल (०.२२ µm ताकना) और कमरे के तापमान पर रहते हैं । बर्फ पर HBSS समाधानों में से प्रत्येक रखें ।
  8. अग्ंयाशय विच्छेदन, जो एक प्रयोगशाला पीठ पर किया जा सकता है के लिए एक कार्यक्षेत्र को इकट्ठा ।
    1. मेज पर एक शोषक पैड प्लेस, एक polystyrene पंनी में शामिल ढक्कन के साथ । तो पंनी के शीर्ष पर 4 पिंस के साथ एक कागज तौलिया जगह है ।
    2. विच्छेदन कार्यक्षेत्र की पहुंच के भीतर निंनलिखित मदों रखें: एक जलाए बैग, autoclaved कैंची और संदंश, ७०% इथेनॉल के साथ एक स्प्रे बोतल का एक सेट है, और एक बर्फ बाल्टी (HBSS के ५० मिलीलीटर ट्यूब के साथ-streptomycin चरण १.६ से पेनिसिलिन युक्त) ।
  9. सेट करने के लिए एक केंद्रापसारक 4 डिग्री सेल्सियस और एक शेखर के लिए ३७ ° c ।

2. कोष्ठकी सेल अलगाव

  1. 2 प्रेरण सह के माध्यम से माउस बलिदान, और गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन प्रदर्शन । अग्न्याशय को तुरंत काटना । अग्ंयाशय काटना करने के लिए, पहले polystyrene ढक्कन करने के लिए माउस के पंजे पिन, इस तरह के माउस कि पूंछ शोधकर्ता का सामना करना पड़ रहा है, और ७०% इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे ।
    नोट:
    प्रतिनिधि परिणामों में प्रयुक्त माउस एक 12 सप्ताह पुरानी गैर C57BL/6 पृष्ठभूमि के साथ ट्रांसजेनिक महिला थी । चर्चा अनुभाग में माउस चयन आगे चर्चा की जाती है ।
    1. autoclaved कैंची और संदंश का एक सेट का उपयोग करना, midline पर संदंश के साथ फर/त्वचा लिफ्ट और कैंची का उपयोग करने के लिए मूत्रमार्ग खोलने से फर और त्वचा के माध्यम से एक चीरा डायाफ्राम/ribcage क्षेत्र ।
    2. छोड़ दिया है और सही है कि फर/त्वचा दूर करने के लिए उदर गुहा का एक स्पष्ट दृश्य बनाने के लिए अतिरिक्त चीरा बनाओ । फिर, पेरिटोनियल अस्तर में कटौती (बीच नीचे और सही और बाएं) और यह अंगों से दूर खींच, के रूप में फर के साथ किया गया था/
    3. संदंश के साथ आंतों लिफ्ट और यह अंतरिक्ष बनाने माउस के बाईं ओर करने के लिए अग्न्याशय, जो रंग में हल्के गुलाबी है देखने के लिए डाल दिया, और तिल्ली है, जो एक गहरे लाल अंडाकार है करने के लिए संलग्न. अग्नाशय के ऊतकों अपनी नरम, चिमड़ा बनावट द्वारा प्रतिष्ठित है । अग्न्याशय जो पेट और आंतों के साथ जुड़वां साथ चलेंगे बाहर काट ।
    4. तिल्ली को अग्ंयाशय से अलग कर दीजिये । फिर, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में डाल अग्न्याशय HBSS के 10 मिलीलीटर से युक्त-streptomycin और लामिना प्रवाह हुड के लिए इस लाने के लिए ।
      नोट: प्रोटोकॉल के शेष कदम एक लामिना प्रवाह हुड में बाँझ तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए ।
  2. एक खाली वजन नाव में अग्ंयाशय और HBSS (पेनिसिलिन-streptomycin के साथ) डालो और, संदंश का उपयोग कर, यह घूमता द्वारा अग्ंयाशय धो लो । फिर, अग्न्याशय संदंश के साथ एक दूसरे HBSS युक्त नाव के लिए कदम (पेनिसिलिन-streptomycin के साथ). फिर, घूमता हुआ अग्ंयाशय से धो लें ।
  3. तीसरे HBSS के लिए अग्ंयाशय ले जाएं (पेनिसिलिन-streptomycin के साथ)-वजन नाव युक्त और 5 मिमी या उससे कम के छोटे टुकड़ों में अग्ंयाशय काटने शुरू करते हैं । अगले, अग्ंयाशय टुकड़े डालो और एक खाली ५० मिलीलीटर ट्यूब में HBSS ।
    1. ऐसा करने के लिए, अग्ंयाशय के टुकड़ों को तरल में ले जाने के लिए संदंश का उपयोग करें क्योंकि बकरों की नाव को इत्तला दी जा रही है । डालो एक बार सभी टुकड़ों अब वजन नाव से जुड़े रहे हैं । संदंश के साथ किसी भी शेष टुकड़े उठाओ और ५० मिलीलीटर ट्यूब में संदंश धो HBSS में अग्ंयाशय के साथ पेनिसिलिन-streptomycin से युक्त ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ९३१ x g पर केंद्रापसारक और फिर HBSS (और किसी भी वसा है कि चल रहा है) इसे बंद pipetting द्वारा एक 5 मिलीलीटर पिपेट के साथ हटा दें ।
  5. collagenase के 5 मिलीलीटर जोड़ें (कदम १.७ में HBSS में पतला) अग्ंयाशय के लिए । प्लास्टिक आयल फिल्म में ५० मिलीलीटर ट्यूब लपेटकर एक सील ढक्कन सुनिश्चित करें और फिर यह एक मशीन में मिलाते हुए २२० rpm पर 20 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस में मिली ।
    नोट: collagenase पाचन समय भिंन हो सकते हैं, के रूप में चर्चा में उल्लेख किया । मशीन के अंत में, ऊतक के कोई बड़े टुकड़े रहना चाहिए ।
  6. पृथक्करण को रोकने के लिए, बर्फ पर अग्ंयाशय युक्त ट्यूब प्लेस और ठंड HBSS के 5 मिलीलीटर + 5% FBS जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ९३१ x g पर केंद्रापसारक और फिर एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग कर supernatant बंद प्लास्टिक ।
  7. HBSS के 10 मिलीलीटर + 5% FBS में resuspend और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ९३१ x g पर केंद्रापसारक । प्लास्टिक बंद एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग कर supernatant और HBSS + 5% FBS के एक और 10 मिलीलीटर के साथ इस कदम को दोहराने ।
  8. HBSS के 5 मिलीलीटर + 5% FBS में resuspend और, एक P1000 का उपयोग कर, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में एक ५०० µm जाल के माध्यम से एक समय में 1 मिलीलीटर हस्तांतरण । जाल के माध्यम से किसी भी शेष अग्नाशय कोशिकाओं को धोने के लिए एक P1000 के साथ जाल के माध्यम से HBSS + 5% FBS के एक अतिरिक्त 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  9. एक P1000 का उपयोग कर एक समय में pipetting 1 मिलीलीटर द्वारा १०५ µm मेष के माध्यम से ५०० µm मेष से सेल निलंबन रखो । अगले, धीरे HBSS + 30% FBS युक्त एक ट्यूब में सेल निलंबन प्लास्टिक । सेल सस्पेंशन की एक परत शीर्ष पर बनेगी; केंद्रापसारक पर, कोष्ठकी कोशिकाओं को एक गोली फार्म सिंक जाएगा ।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए २३३ x g पर केंद्रापसारक । supernatant निकालें और 1x Waymouth पूरा मीडिया में गोली resuspend ।
    1. यदि कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में कोशिकाओं के एंबेड करने के लिए सीधे आगे बढ़ने, अग्ंयाशय प्रति 7 मिलीलीटर की मात्रा में resuspend । यदि adenoviral या lentiviral संक्रमण के लिए आगे बढ़ने, अग्ंयाशय प्रति 4 मिलीलीटर में resuspend ।

3. वायरल संक्रमण

  1. के रूप में एक अग्ंयाशय दो वायरल संक्रमण के लिए पर्याप्त है (नियंत्रण और प्रयोगात्मक, जैसे, नल और cre), २ ३५ mm प्लेटों के ढक्कन के बीच सेल निलंबन विभाजित । प्लेटों के ढक्कन का उपयोग निलंबन में संक्रमण के लिए अनुमति देता है और इसलिए अंतिम सब्सट्रेट पर आसान आंदोलन बाद में.
    1. वायरस के साथ काम करते समय, सभी प्रयुक्त पिपेट युक्तियों को 10% ब्लीच में ंयूनतम 15 मिनट के लिए सोख लें ।
      नोट: ३५ मिमी प्लेटों और 4 मिलीलीटर की मात्रा का उपयोग 8 और 16 सप्ताह की उम्र के बीच गैर-ट्रांसजेनिक चूहों से कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से काम करता है. प्लेट आकार और मात्रा छोटे या बड़े pancreata के साथ जानवरों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  2. adenoviral संक्रमण के लिए, एक 1:1000 कमजोर पड़ने पर प्रत्येक प्लेट और भंवर के ढक्कन (चित्रा 2, GFP एडीनोवायरस) के लिए (एक titer के साथ) वायरस जोड़ें । एक सेल संस्कृति मशीन में प्लेटें प्लेस (३७ ° c, 5% CO2) और 1 घंटे के लिए हर 15 मिनट भंवर एक अतिरिक्त 2 एच के लिए जारी रखने की मशीन और फिर कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में कोशिकाओं के एंबेड करने के लिए आगे बढ़ना ।
  3. हुड में वायरल काम पूरा करने के बाद, हूड में सभी घटकों को सोख 10% ब्लीच के साथ कम से 15 मिनट के लिए और फिर अच्छी तरह से ७०% इथेनॉल का उपयोग बंद ब्लीच साफ ।

4. कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में कोशिकाओं की एंबेडिंग

  1. 7 मिलीलीटर प्रकार मैं चूहे पूंछ कोलेजन (३.३ मिलीग्राम/एमएल), ७०० 10x है Waymouth मीडिया के µ एल के संयोजन से बर्फ पर कोलेजन जेल बनाओ, और ४६६.६ µ एल ०.३४ एम NaOH की ।
  2. कोलेजन जेल और सेल निलंबन के बराबर मात्रा लेने, धीरे मिश्रण. यदि एक उत्तेजना या अवरोध करनेवाला जोड़ने, कोलेजन सेल निलंबन के साथ इस गठबंधन । एक बार में एक अच्छी तरह से प्लेट (कदम 1.5.3 से प्लेटें); बर्फ पर थाली रखते हुए, भंवर को समान रूप से वितरित कोलेजन सेल परत ।
    1. प्रत्येक में अच्छी तरह से, प्लास्टिक निंनलिखित मात्रा में कोलेजन-सेल सस्पेंशन: २०० µ l (8-well ग्लास स्लाइड), ५०० µ l (24-वेल प्लेट), १००० µ l (12-वेल प्लेट), or २००० µ l (6-वेल प्लेट). ध्यान दें कि ADM TGF-α के साथ उत्तेजना के माध्यम से प्रेरित है (५० एनजी/एमएल) चित्रा 2में ।
  3. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में कोशिकाओं के एम्बेड के लिए, दो भागों सेल निलंबन के साथ एक हिस्सा तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण । कोलेजन के साथ के रूप में, मैट्रिक्स सेल निलंबन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बर्फ पर थाली रखें । प्लास्टिक एक ही अच्छी तरह से एक ही मात्रा का उपयोग कर 4.2.1 और भंवर में भी वितरण के लिए उल्लेख किया एक समय में ।
  4. एक सेल संस्कृति मशीन में थाली प्लेस (३७ ° c, 5% सह2) 30 मिनट के लिए जमना और फिर किसी भी उत्तेजना या अवरोध करनेवाला के साथ 1x है Waymouth पूरा मीडिया जोड़ें (चित्रा 2 का उपयोग करता है TGF-α पर ५० एनजी/एमएल) । मीडिया (उत्तेजना या अवरोधक के साथ) अगले दिन और फिर हर दूसरे दिन बदल जाते हैं । उत्तेजना के आधार पर, ADM दिन 3 और 5 दिन के बीच मनाया जा सकता है ।

5. कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से कटाई कोशिकाओं

  1. निंनलिखित सामग्री इकट्ठा कोलेजन से कटाई कोशिकाओं के लिए आवश्यक: 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase की 30 मिलीलीटर HBSS में पतला, शीत HBSS के ४० मिलीलीटर, शीत पंजाबियों के 31 मिलीलीटर, दो spatulas, २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों, और बर्फ । spatulas, ट्यूबों और समाधानों की राशि की संख्या को समायोजित करें यदि दो से अधिक संस्कृति की तुलना (जहां प्रत्येक शर्त एक थाली की ½ है) । सेट 4 ° c करने के लिए केंद्रापसारक और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए मिलाते हुए मशीन सेट ।
  2. मीडिया को निकालें और spatulas का उपयोग करने के लिए एंबेडेड कोशिकाओं के साथ कोलेजन डिस्क को हटा दें । प्रत्येक शर्त के लिए, एक अलग, खाली ५० मिलीलीटर ट्यूब में डिस्क रखो ।
  3. प्रत्येक ५० एमएल ट्यूब के लिए HBSS में 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase के 10 मिलीलीटर जोड़ें । प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ ट्यूबों लपेटें और ४५ मिनट तक के लिए २२५ rpm में एक ३७ ° c मिलाते हुए मशीन में डाल दिया । मॉनिटर पाचन और ट्यूबों को दूर जब कोई और अधिक दिखाई कोलेजन है ।
  4. 5 ंयूनतम मंदी के साथ 2 मिनट के लिए ° c पर २३३ x g पर केंद्रापसारक । supernatant बंद लो और ट्यूब प्रति 5 मिलीलीटर collagenase समाधान में resuspend । 10 मिनट या जब तक वहां कोई दिखाई कोलेजन है के लिए २२५ rpm पर एक ३७ ° c मिलाना मशीन में डाइजेस्ट ।
  5. ठंड HBSS के 5 मिलीलीटर जोड़कर पाचन बंद करो और बाद में कम से कम मंदी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए २३३ x g पर केंद्रापसारक ।
    1. ठंड HBSS के 15 मिलीलीटर में resuspend और फिर कम से कम मंदी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए २३३ x g पर केंद्रापसारक । दोहराएँ.
  6. पंजाब के 1 एमएल में गोली को फिर से सस्पेंड और १.५ एमएल ट्यूब के लिए ले जाएं । कम से कम मंदी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए २३३ x g पर एक स्विंग बाल्टी में केंद्रापसारक । तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ पर supernatant और स्नैप-फ्रीज निकालें ।
    नोट: सेल गोली-७० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है या नीचे स्ट्रीम अनुप्रयोगों में तुरंत इस्तेमाल किया ।
  7. फसल के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-एंबेडेड कोशिकाओं, एक अच्छी तरह से प्लास्टिक मीडिया बर्फ पर एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में । फिर, एक अच्छी तरह से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स वसूली समाधान जोड़ने और ५० एमएल ट्यूब में सेल जेल मिश्रण परिमार्जन ।
    नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स वसूली समाधान की मात्रा प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ने के लिए इस प्रकार है: १५० µ एल (8-खैर ग्लास स्लाइड), ४२० µ एल (24-वेल प्लेट), ८४५ µ एल (12-वेल प्लेट), और २,००० µ l (6-वेल प्लेट).
  8. एक अच्छी तरह से दो बार कुल्ला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स वसूली समाधान के साथ, ५० एमएल ट्यूब करने के लिए कुल्ला जोड़ने ।
    नोट: प्रत्येक कुल्ला के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स वसूली समाधान की मात्रा इस प्रकार है: १५० µ l (8-well ग्लास स्लाइड), ४२० µ l (24-वेल प्लेट), ८४५ µ l (12-वेल प्लेट), और २,००० µ l (6-वेल प्लेट).
  9. 1 ज के लिए बर्फ पर ट्यूब छोड़ दो या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को भंग और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक के साथ पालन करें । supernatant निकालें और ठंडी पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend (१.५ एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण हो सकता है अगर सेल गोली वांछित है) ।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ३,५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant निकालें और या तो स्नैप सेल गोली फ्रीज या lysis बफर जोड़ें और सीधे बहाव अनुप्रयोगों के लिए आगे बढ़ना ।

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Representative Results

प्रोटोकॉल के पूरा होने के साथ साथ एक दिन के भीतर और उत्तेजना पर होता है, ADM 3-5 दिनों में देखा जाता है । चित्रा 1 विधि के अनुक्रम, जिससे कदम 1 से 4 पहले दिन पर पूरा कर रहे है दर्शाया गया है । यह तैयारी, कोष्ठकी अलगाव, वायरल संक्रमण और कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एंबेड शामिल हैं । जबकि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ADM लाती है, कोलेजन के भीतर कोष्ठकी कोशिकाओं मैं ऐसी TGF-α के रूप में एक उत्तेजना की आवश्यकता होती है, के लिए अनुडक्ट कोशिकाओं को भेदभाव से गुजरना । 1 दिन, कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में कोशिकाओं को एक अंगूर की तरह गोल उपस्थिति है और अगर एक वेक्टर एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के साथ वायरल संक्रमण का उपयोग, संक्रमण दक्षता की जांच की जा सकती है । 5 दिन तक, कोलेजन में कोशिकाओं नलिकाओं फार्म अगर एंबेडिंग के समय में एक उत्तेजना दिया और मीडिया, जो दिन 1, 3, और 5 पर बदल गया है में एक पूरक के रूप में होगा । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एंबेडेड कोशिकाओं को एक उत्तेजना के अभाव में नलिकाओं फार्म होगा, लेकिन उत्तेजना पर बड़ी नलिकाओं फार्म, के रूप में चित्र 2में देखा जाएगा ।

Figure 1
चित्रा 1 : प्रक्रिया की योजनाबद्ध murine प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं को अलग करने के लिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति और/या कोष्ठकी को उत्तेजित करने के लिए डक्टर metaplasia, और कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एंबेड कोशिकाओं । कार्यप्रवाह कोष्ठकी कोशिकाओं का अलगाव शामिल है, जो अग्ंयाशय का विच्छेदन भी शामिल है, पाचन, और कोशिकाओं के निस्पंदन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्राथमिक कोष्ठकी adenoviral संक्रमण और TGF-α के साथ उत्तेजना के बाद कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के भीतर मढ़वाया कोशिकाओं के प्रतिनिधि परिणाम । एक गैर ट्रांसजेनिक माउस से प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं GFP-एडीनोवायरस, कोलेजन मैं या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एंबेडेड से संक्रमित थे, और के साथ या TGF के बिना उत्तेजित-α (५० एनजी/ चौबीस घंटे के बाद GFP एडीनोवायरस के साथ संक्रमण, छवियों को संक्रमण दक्षता दिखाने पर कब्जा कर लिया गया । पांच दिनों के बाद संक्रमण, छवियों के साथ या TGF-कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में α के बिना उत्तेजित कोशिकाओं में मतभेद निरूपित । वाहिनी की तरह संरचनाओं सफेद ऐरोहेड और पैमाने सलाखों द्वारा संकेत दिया जाता है ५० µm. images चुनाव आयोग की योजना के साथ एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किया गया-Neofluar 10x/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

अलगाव, संक्रमण, और चढ़ाना प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं के लिए समय की अपेक्षाकृत कम राशि इस पद्धति का एक लाभ है । इसके विपरीत, एक explant वृद्धि से संवर्धन कोष्ठकी कोशिकाओं को थोड़ा हाथ समय पर की आवश्यकता है, लेकिन यह कोष्ठकी कोशिकाओं13के विकास के लिए सात दिन लगते हैं । कोष्ठकी आइसोलेशन14 के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल कोष्ठकी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक बहुत ही कम विधि नोट; हालांकि, EGF कोष्ठकी कोशिकाओं जीवित जब कि प्रोटोकॉल का उपयोग कर अलग रखने में एक आवश्यक घटक है । चूंकि EGF नलिकात्मक कोशिकाओं को कोष्ठकी कोशिकाओं के भेदभाव को उत्तेजित करता है, विधि के साथ साथ, जो adm की आवश्यकता नहीं है-संस्कृति के लिए घटकों उत्तेजक, प्रेरण या ADM के विनियमन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए बेहतर है । इस विधि में, कोष्ठकी कोशिका पहचान कोलेजन में संवर्धन के दौरान बनाए रखा है जब तक अनुवाहिनी कोशिकाओं में अंतर करने के लिए प्रेरित किया । इसके अलावा, transfecting प्राथमिक कोशिकाओं में कठिनाइयों वायरल संक्रमण से प्रोटीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के माध्यम से दूर कर रहे हैं ।

यह प्रक्रिया ADM के प्रत्यक्ष अध्ययन प्रदान करता है, जिसके द्वारा अनुडक्टर संरचना प्रेरण के दृश्य brightfield और/या इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से हो सकता है । इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए, चैंबर स्लाइड ( सामग्री की तालिकामें नोट किया गया है) सबसे अच्छा कर रहे हैं । ३७ ° c पर 15 मिनट के लिए निर्धारण 4% paraformaldehyde के साथ नलिकात्मक संरचनाओं परेशान बिना तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एंबेडेड कोशिकाओं को ठीक कर देंगे । इस मशीन के दौरान, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स liquify जाएगा और धीरे से paraformaldehyde के साथ बंद pipetted जा सकता है । कोलेजन एंबेडेड कोशिकाओं पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस अतिरिक्त प्रोटोकॉल के भीतर विस्तार में वर्णित है15,16। इसके अलावा प्रयोग के समापन बिंदु पर शामिल संकेत तंत्र के विश्लेषण के लिए आवेदन पश्चिमी दाग, qPCR, और प्रतिदीप्ति-सक्रिय कोशिका छंटाई (FACS) शामिल हैं । एक अग्ंयाशय के एक छठे पश्चिमी दाग या qPCR के माध्यम से एक नमूना विश्लेषण के लिए पर्याप्त सामग्री है ।

इस प्रोटोकॉल की सीमाएं कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, जहां प्रत्येक अपने फायदे और नुकसान है के उपयोग से उत्पंन । जबकि कोलेजन में कोशिकाओं के एम्बेड केवल नलिकाओं का उत्पादन होगा अगर उत्तेजनाओं दिया जाता है, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स एम्बेड अतिरिक्त उत्तेजनाओं के बिना नलिकाओं का उत्पादन होगा. हालांकि, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में वाहिनी आकार एक औसत दर्जे का उत्पादन है । एक अतिरिक्त सीमा चरण 5 में कटाई प्रक्रियाओं में शामिल समय है, जो जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है । इस सीमा को इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ पश्चिमी सोख्ता से प्राप्त परिणामों की पुष्टि करके कम किया जा सकता है, जिसमें निर्धारण समय qPCR या पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए कटाई के समय की तुलना में काफी छोटा है.

adenoviral संक्रमण के अलावा, lentiviral संक्रमण प्राथमिक कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है । lentiviral संक्रमण के लिए, 6 µ g/mL वायरल संक्रमण बढ़ाने रिएजेंट (सामग्री की तालिका देखें) कोशिकाओं को जोड़ें और धीरे से प्लेटें घूमता है । इसके बाद, lentivirus (एक titer के साथ जोड़ने के एक 1 से कम 107 मं/एमएल): 1000 कमजोर पड़ने और फिर, धीरे भंवर । 3-5 घंटे के लिए मशीन (३७ ° c, 5% सह2) और फिर कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में कोशिकाओं के एम्बेड करने के लिए जारी है । ब्याज की एक प्लाज्मिड के साथ lentivirus उत्पन्न करने के लिए, सामग्री की तालिका में नोट lentiviral पैकेजिंग मिश्रण का उपयोग करें.

आगे संशोधन KrasG12Dव्यक्त चूहों से कोशिकाओं का अलगाव शामिल कर सकते हैं । इन चूहों में, जो पहले से ही fibrotic क्षेत्रों ADM और PanIN घावों के साथ है, collagenase पाचन अधिक समय लेता है । collagenase पाचन की सावधान निगरानी, जैसा कि महत्वपूर्ण कदम और समस्या निवारण में वर्णित है, की आवश्यकता है । अधिक असामान्य ऊतक एक माउस है, अब पाचन (एक बारह सप्ताह पुराने p48Cre के लिए एक घंटे के आसपास ले जाएगा ; LSL-KrasG12D चूहा) । के बाद से वहां एक ही उंर के चूहों के बीच अपार भिंनता हो सकती है, हम एक LSL-KrasG12D माउस से कोष्ठकी कोशिकाओं को अलग करने और adenoviral या lentiviral संक्रमण cre oncogenic अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए उपयोग Kras प्रदर्शन की सलाह । यह भी हमारे प्रोटोकॉल कोष्ठकी सेल के अलगाव के लिए ADM प्रक्रिया की जांच करने के लिए अनुकूलित है कि ध्यान दिया जाना चाहिए । organoid संस्कृति के लिए KrasG12D-एक्सप्रेस चूहों से ADM और PanIN कक्षों का अलगाव परिवर्तित प्रोटोकॉल की आवश्यकता है ।

एक महत्वपूर्ण कदम समय की राशि है कि कटा अग्ंयाशय collagenase में खर्च करता है । आदर्श collagenase पाचन समय माउस से माउस और एक ही कंपनी से collagenase के बहुत सारे के बीच भिंन हो सकते हैं । समय प्रोटोकॉल में उल्लेख किया pancreata वजन के बारे में ०.२५० g. बहुत अधिक समय नुकसान और कोशिकाओं को मार सकता है के लिए उपयुक्त है, जबकि बहुत कम समय अधूरा पाचन में परिणाम और इसलिए कम कोशिकाओं है कि यह पर फ़िल्टरिंग प्रक्रिया के माध्यम से कर देगा अंतिम प्लेट । कटा हुआ अग्ंयाशय टुकड़े के टूटने की तलाश में नेत्रहीन पृथक्करण की जांच करें; समाधान बादल बारी चाहिए । इसके अतिरिक्त, ठंड HBSS के साथ collagenase प्रतिक्रिया को रोकने से पहले, समाधान एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक के साथ लिया जा सकता है, जहां आसानी के साथ जो समाधान लिया जा सकता है अगर यह प्रतिक्रिया को रोकने के लिए उपयुक्त है संकेत होगा । एक अतिरिक्त विचार pancreata काटा की संख्या है । एक से अधिक अग्न्याशय एक ही समय में पृथक है, तो प्रक्रिया pancreata अलग रखा जाता है जब सबसे अच्छा काम करता है ।

एक अंय महत्वपूर्ण बिंदु प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं की स्वस्थ संस्कृति सुनिश्चित करने के लिए है कि देखभाल जब कोष्ठकी सेल समाधान pipetting लिया जाना चाहिए । जोरदार pipetting कोशिका क्षति और वाहिनी गठन की कमी में परिणाम हो सकता है, यहां तक कि ऐसे TGF-α के रूप में ज्ञात ADM उत्प्रेरण, के अलावा के साथ । इसके अलावा, अगर व्यवहार्यता मुद्दों रहे हैं, कदम २.४, २.६ में केंद्रापसारक, और २.७ नीचे ३०० एक्स जी के लिए एक नरम गोली उत्पादन लिया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए एक R01 अनुदान (CA200572) NIH से पी एस के द्वारा समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय कैंसर संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण में कोई भूमिका नहीं थी, के लिए निर्णय प्रकाशित करें, या पांडुलिपि की तैयारी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 °C shaking incubator Thermo Scientific SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubator NUAIRE NU-5500
50 mL tubes Falcon 352070
Absorbent pad, 20" x 24" Fisherbrand 1420662
Adenovirus, Ad-GFP Vector Biolabs  1060
Aluminum foil Fisherbrand 01-213-101
BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 Fisher Scientific  305167 Use as pins for dissection 
Beaker, 600 mL Fisherbrand FB-101-600
Bleach, 8.25% Clorox 31009
Cell Recovery Solution Corning 354253 Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript.
Centrifuge  Beckman Coulter Allegra X-15R Centrifuge
Collagenase Type I, Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C.
Dexamethasone Sigma D1756 Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. 
Ethanol, 200 proof Decon Laboratories  2701
Fetal Bovine Serum  Sigma F0926-100mL
Forceps  Fine Science Tools 11002-12
Forceps  Fine Science Tools 91127-12
Glass slide, 8-well Lab-Tek 177402
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red Fisher Scientific SH3048801   
Ice bucket, rectangular Fisher Scientific  07-210-103
Instant Sealing Sterilization Pouch Fisherbrand 01-812-51
LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)  Minigrip SBL2X69S
Lentiviral Packaging Mix, Virapower Invitrogen 44-2050
Matrigel Corning 356234 Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript.
Parafilm Bemis PM992 Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript.
PBS Fisher Scientific SH30028.02
Penicillin-Streptomycin  ThermoFisher Scientific 15140122
Pipet tips, 10 µL USA Scientific 1110-3700
Pipet tips, 1,000 µL  Olympus Plastics 24-165RL
Pipet tips, 200 µL  USA Scientific 1111-1700
Pipet-Aid Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL Gilson F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL Gilson F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL Gilson F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL Gilson F123601
Pipettes, 10 mL  Falcon 357551
Pipettes, 25 mL Falcon 357525
Pipettes, 5 mL  Falcon 357543
Plate, 12-well Corning Costar 3513
Plate, 24-well plate Corning Costar 3524
Plate, 35 mm Falcon 353001
Plate, 6-well Falcon 353046
Polybrene EMD Millipore TR-1003-G Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. 
Polypropylene Mesh, 105 µm Spectrum Labs 146436
Polypropylene Mesh, 500 µm  Spectrum Labs 146418
Scissors  Fine Science Tools 14568-12
Scissors  Fine Science Tools 91460-11
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) Fisher Scientific BP328-500
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
Soybean Trypsin Inhibitor 8 Gibco 17075029
Spatula Fisherbrand 21-401-10
Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters  Millipore SCGP00525
TGF-α R&D Systems 239-A-100
Type I Rat Tail Collagen Corning 354236
Waymouth MB 752/1 Medium (powder) Sigma W1625-10X1L
Weigh boat, hexagonal, medium  Fisherbrand 02-202-101

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References

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