Etterligne og manipulere bukspyttkjertelen Acinar til Ductal Metaplasi i 3-dimensjonale cellekultur

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Primære acinar cellen aisolering, protein uttrykk eller aktivitet modulasjon, kultur og ned-stream programmer er helt nyttig i ex vivo studie av acinar til ductal Metaplasi (ADM), en tidlig hendelse i utviklingen av bukspyttkjertelkreft.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fleming Martinez, A. K., Storz, P. Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture. J. Vis. Exp. (144), e59096, doi:10.3791/59096 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Differensiering av acinar celler ductal celler under pankreatitt og i den tidlige utviklingen av bukspyttkjertelkreft er en viktig prosess som krever videre studier. For å forstå mekanismene gir regulerer acinar til ductal Metaplasi (ADM), ex vivo 3D kultur og differensiering av primære acinar celler ductal celler mange fordeler over andre systemer. Med teknikken her er modulering av protein uttrykk enkel og rask, krever bare én dag å isolere, stimulere eller virally infisere og begynne dyrking primære acinar celler for å undersøke ADM prosessen. I motsetning til hjelp av kjelleren membran matrise, den såing av acinar celle klynger i kollagen jeg ekstracellulær matrix, lar acinar celler å beholde sin acinar identitet før manipulering. Dette er viktig når testing bidrag av ulike komponenter til induksjon av ADM. Ikke bare er effekten av cytokiner eller andre ectopically administrert faktorer testbare gjennom denne teknikken, men bidraget fra vanlige mutasjoner, økt protein uttrykk eller knockdown protein uttrykk er testbare via viral infeksjon av primære acinar celler, ved hjelp av adenoviral eller lentiviral vektorer. Videre celler kan være nytt isolert fra kollagen eller kjelleren membran matrise på sluttpunktet og analysert for protein uttrykk.

Introduction

Acinar til ductal Metaplasi (ADM) er en beskyttende mekanisme pankreatitt og en viktig prosess kjører bukspyttkjertelkreft utvikling1 som krever ytterligere mekanistisk innsikt. Mens betennelse-indusert ADM er reversibel2, hindre kreftfremkallende KRAS mutasjoner, som finnes i 90% av bukspyttkjertelkreft tilfeller3, differensiering tilbake til en acinar fenotypen4,5, 6. Culturing og skille primære acinar celler i ductal celler i 3D kultur tillater studie av molekylære mekanismer regulere ADM prosessen, som er vanskelig å studere i vivo. Slike ex vivo studier aktiverer sanntids visualisering av ADM, driverne og sine regulatorer. Flere drivere av ADM prosessen, samt mekanistisk innsikt i deres nedstrøms signalveier, har blitt identifisert eller bekreftet bruker her beskrevet metoden. Disse inkluderer ADM induksjon av TGF-î± (alfa-transformere vekstfaktor)-mediert uttrykk for MMP-7 (matrise metalloproteinase-7) og aktivering av hakk7, samt RANTES (reguleres på aktivisering, normal T celle uttrykt og utskilles; også kjent som chemokine ligand 5 eller CCL5) og TNFα (tumor nekrose faktor alfa)-indusert ADM gjennom aktivering av NF-κB (kjernefysiske faktor-κB)8. En ekstra formidler av ADM er kreftfremkallende KRas9,10, som fører til en økning i oksidativt stress som forbedrer ADM prosessen gjennom økt uttrykk for EGFR (epidermal vekstfaktor reseptor) og dens ligander, EGF ( epidermal vekstfaktor) og TGF-α11.

Bruk av bukspyttkjertelkreft linjer er vanlig for in vitro studier, tilby primært cellekulturer mange fordeler. For eksempel, primære acinar celler fra ikke-transgene mus eller mus skjuler initiering mutasjoner, som KrasG12D, er den mest passende modellen for å studere hendelsen tidlig for ADM fordi cellene har noen og kontrollert mutasjoner, som kjent for å være tidlig i bukspyttkjertelkreft utvikling. Dette er i kontrast til mange bukspyttkjertelkreft cellelinjer som har flere mutasjoner og variert uttrykk basert på passering nummer12. I tillegg har signalveier identifisert av slike midler blitt bekreftet av dyrestudier. En påminnelse ved å bruke primære acinar celler er at de ikke kan være transfected som typisk kreftcelle linjer kan.

Metoden her detaljer teknikker av acinar cellen aisolering, 3D kultur som etterligner ADM ved å legge sentralstimulerende midler eller modulerende protein uttrykk via adenoviral eller lentiviral, samt re isolering av celler på endepunktet for videre analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbeid ble godkjent av Mayo Clinic IACUC.

1. utarbeidelse av materialer, løsninger og 3-dimensjonale Matrix baser

  1. Cut 500 µm og 105 µm polypropylen maskene til 76 mm ved 76 mm firkanter. Brett hver rute halvparten to ganger for å opprette en mindre brettet firkant. Sted en 500 µm og en 105 µm maske square i en autoclavable-posen.
  2. Autoclave polypropylen maske firkanter, samt to par saks og tang.
  3. Gjøre 100 mL 10 x Waymouths løsning. Rør 1 hetteglass (14 g) av Waymouths pulver i 50 mL deionisert (DI) vann og når oppløst, legge 30 mL 7,5% (75 g/L) natriumbikarbonat. Ta det siste bindet til 100 mL bruker DI vann og filteret sterilisere.
    1. Store 10 x Waymouth media på 4 ° C og bruk å forberede kollagen gels og 1 x Waymouth media. Når precipitates skjemaet forkaste.
  4. Gjøre 50 mL 1 x Waymouths komplett medier per bukspyttkjertelen ved å legge 125 µL av 40 mg/mL soyabønner trypsin inhibitor, 12.5 µL av 4 mg/mL dexamethasone og 500 µL av fetal bovin serum (FBS). Sterilisere ved filtrering og bruk innen 48 timer.
  5. Lage 3-dimensjonale matrix baser hjelp av kollagen eller kjelleren membran matrise (se tabell for materiale produktinformasjon). Når pipettering basen, Plasser platen på is, unngå bobler, og rotere plate umiddelbart etter pipettering hver brønn volumet for å sikre full dekning.
    1. Opprette kollagen baser ved å blande følgende komponenter på is i vev kultur hette: 5,5 mL av typen jeg rotte hale kollagen, 550 µL av 10 x Waymouth's Media og 366.6 µL av 0.34 M NaOH (filtrert).
      Merk: Dette er nok gjør kollagen baser for en 24-Vel, 12-godt eller 6-vel plate. En plate er tilstrekkelig for acinar isolasjon fra en bukspyttkjertelen.
    2. Bruk følgende volumer til plate kollagen base: 80 µL (8-vel objektglass), 200 µL (24-vel plate), 400 µL (12-vel plate) eller 800 µL (6-vel plate).
    3. For kjelleren membranen baserer matrix, Pipetter matrix uten tilleggskomponenter. Bruk følgende volumer for hver brønn: 50 µL (8-vel objektglass), 120 µL (24-vel plate), 240 µL (12-vel plate) eller 600 µL (6-vel plate).
    4. La baser stivne i minst 30 min i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) før du oppretter et ekstra lag av matrise med innebygde celler over disse baser (trinn 4).
  6. Holde en 600 mL kanne, tre 50 mL rør, en autoklaveres par saks, en autoklaveres par tang og en is bøtte under panseret med tre veier båter i forberedelse til acinar isolasjon. Deretter gjør 30 mL av HBSS med 300 µL av 100 x penicillin-streptomycin, setter 10 mL i hver av to veier båter og holde de siste 10 mL i en 50 mL tube (for bruk i trinn 1.8.2 og 2.1.4).
  7. Gjøre 40 mL HBSS + 5% FBS, 20 mL HBSS + 30% FBS og 5 mL av 2 mg/mL collagenase i HBSS. Sterilisere collagenase etter filtrering (0.22 µm pore) og holde ved romtemperatur. Hold hvert av HBSS løsningene på is.
  8. Montere et arbeidsområde for bukspyttkjertelen disseksjon, som kan gjøres på en lab-benken.
    1. Sted en absorberende puten på bordet, sammen med polystyren lokk dekket i folie. Plass et papirhåndkle med 4 pinner på folien.
    2. Huske på følgende innen rekkevidde disseksjon arbeidsområdet: en forbrenning bag, ett sett autoklaveres saks og tang, en sprayflaske med 70% etanol og en is bøtte (med 50 mL tube av HBSS som inneholder penicillin-streptomycin fra trinn 1.6).
  9. Angi en sentrifuge 4 ° C og en shaker til 37 ° C.

2. acinar cellen aisolering

  1. Ofre musen via CO2 induksjon, og utføre cervical forvridning. Umiddelbart dissekere bukspyttkjertelen. Analysere bukspyttkjertelen, første pin paws av musen polystyren lokket, orientere musen slik at halen vender forskeren og spray magen med 70% etanol.
    Merknad:
    musen brukes i representant resultatene var en 12 - uke gamle ikke-transgene kvinne med C57BL/6 bakgrunn. Museklikk er nærmere omtalt under diskusjon.
    1. Med en autoklaveres saks og tang, løft pels/huden med tang på midtlinjen og bruke saksen for å gjøre et snitt gjennom det fur og hud fra urethral åpningen til skiområdet membran/brystkasse.
    2. Gjøre flere snitt til venstre og høyre slik at pelsen/huden er kuttet bort for å opprette en klar visning av bukhule. Deretter kuttet i peritoneal fôr (på midten og til høyre og venstre) og trekke den fra organer, som ble gjort med pels/huden.
    3. Løft tarmen med tang og setter den til venstre museklikk oppretter du se bukspyttkjertelen, som er lys rosa farge, og knyttet til milten, som er en mørk rød ellipse. Bukspyttkjertelen vevet kjennetegnes ved sin myke, svampete tekstur. Kuttet ut bukspyttkjertelen som kjører langs magen og fletter med tarmen.
    4. Skille milten fra bukspyttkjertelen. Deretter bukspyttkjertelen innlegge en 50 mL tube som inneholder 10 mL av HBSS med 1 x penicillin-streptomycin og bringe laminær strømning panseret.
      Merk: Resten av trinnene i protokollen bør gjøres utnytte steril teknikk i laminær strømning hette.
  2. Hell bukspyttkjertelen og HBSS (med penicillin-streptomycin) i en tom veie båt og, ved hjelp av pinsett, vaske bukspyttkjertelen av virvlende det. Deretter Flytt bukspyttkjertelen med tang til et annet veier båt som inneholder HBSS (med penicillin-streptomycin). Igjen, vask bukspyttkjertelen av virvlende.
  3. Flytte bukspyttkjertelen til den tredje HBSS (med penicillin-streptomycin)-inneholder veie båt og begynne å kutte bukspyttkjertelen i små biter av 5 mm eller mindre. Deretter hell bukspyttkjertelen stykker og HBSS i en tom 50 mL tube.
    1. Å gjøre dette, bruk tang for å flytte bukspyttkjertelen brikkene i væsken som veier båten blir veltet. Hell når alle bitene er ikke lenger knyttet til veie båten. Plukk opp noen gjenværende bitene med tang og vaske tang i 50 mL tube med bukspyttkjertelen i HBSS med penicillin-streptomycin.
  4. Sentrifuge 931 x g i 2 minutter på 4 ° C, og fjern deretter HBSS (og noe fett som flyter) av pipettering det av med en 5 mL pipette.
  5. Legge til 5 mL collagenase (utvannet i HBSS i trinn 1.7) i bukspyttkjertelen. Sikre lukket lokk ved å pakke 50 mL tube i plast parafin film og deretter plassere den i en inkubator rister på 220 rpm for 20 min på 37 ° C.
    Merk: Den collagenase fordøyelsen kan variere, som nevnt i diskusjonen. På slutten av inkubering, bør ingen store biter av vev forbli.
  6. For å stoppe dissosiasjon, sett bukspyttkjertelen inneholder røret på is og legge 5 mL kaldt HBSS + 5% FBS. Sentrifuge 931 x g i 2 minutter på 4 ° C og deretter Pipetter av nedbryting bruker en 5 mL pipetter.
  7. Resuspend i 10 mL av HBSS + 5% FBS og sentrifuger 931 x g i 2 minutter på 4 ° C. Pipetter av nedbryting bruker en 5 mL Pipetter og gjenta dette med en annen 10 mL HBSS + 5% FBS.
  8. Resuspend i 5 mL av HBSS + 5% FBS og bruker en P1000, overføre 1 mL om gangen gjennom en 500 µm mesh til en 50 mL tube. Legge til en ekstra 5 mL av HBSS + 5% FBS gjennom nettet med en P1000 å vaske resten bukspyttkjertelen celler gjennom nettet.
  9. Sette celle suspensjon fra 500 µm mesh gjennom 105 µm mesh av pipettering 1 mL samtidig med en P1000. Neste, forsiktig Pipetter celle suspensjon i et rør som inneholder HBSS + 30% FBS. Et lag av cellen suspensjon vil danne øverst. på sentrifugering, vil acinar cellene synke for å danne pellets.
  10. Sentrifuger 233 x g i 2 minutter på 4 ° C. Fjern nedbryting og resuspend pellet i 1 x Waymouths komplett medier.
    1. Hvis du fortsetter direkte til forankring av celler i kollagen eller kjelleren membran matrix, resuspend i et volum på 7 mL per bukspyttkjertelen. Hvis du fortsetter å adenoviral eller lentiviral, resuspend i 4 mL per bukspyttkjertelen.

3. virusinfeksjon

  1. Som en bukspyttkjertelen er nok for to virusinfeksjoner (kontroll og eksperimentell, f.eks null og grobunn), dele celle suspensjon mellom lokkene på to 35 mm-plater. Bruker lokket på platene kan for infeksjon i suspensjon og derfor lett bevegelse på siste underlaget senere.
    1. Når du arbeider med virus, suge alle brukte pipette-spisser i 10% blekemiddel i minst 15 minutter.
      Merk: Utnyttelse av de 35 mm-platene og 4 mL volum fungerer bra for celler fra ikke-transgene mus mellom 8 og 16 uker gamle. Tallerken størrelse og volum må justeres for dyr med mindre eller større pancreata.
  2. Adenoviral infeksjon, legge viruset (med en titer på minst 107 TU/mL) på en 1:1,000 fortynning til lokket av hver plate og virvel (figur 2, GFP adenovirus). Plasser platene i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) og swirl enhver 15 minuttene for 1 h. Fortsett inkubasjonstiden for en ekstra 2 h og deretter videre til forankring av celler i kollagen eller kjelleren membran matrise.
  3. Etter endt viral arbeid i panseret, suge alle komponenter i panseret med 10% blekemiddel i minst 15 minutter og deretter rense blekemiddel av med 70% etanol.

4. forankring av celler i kollagen eller kjelleren membran matrise

  1. Gjør kollagen gel på isen ved å kombinere 7 mL skriver jeg rotte hale kollagen (3,3 mg/mL), 700 µL av 10 x Waymouth's media og 466.6 µL av 0,34 M NaOH.
  2. Tar like volum av kollagen gel og celle suspensjon, bland forsiktig. Hvis legge til stimulans eller hemmer, kombinere dette med kollagen-celle suspensjon. Plate en godt samtidig (plater fra trinn 1.5.3); holde platen på is, virvel å jevnt distribuere kollagen-celle laget.
    1. I hver brønn, Pipetter følgende mengder kollagen-celle suspensjon: 200 µL (8-vel objektglass), 500 µL (24-vel plate), 1000 µL (12-vel plate) eller 2000 µL (6-vel plate). Merk at ADM er indusert via stimulering med TGF-α (50 ng/mL) i figur 2.
  3. Forankring av celler i kjelleren membran matrix, blande en kjelleren membran matrise med to-deler cellen suspensjon. Som med kollagen, holde matrisecelle suspensjon samt plate is. Pipetter en godt samtidig bruker samme volumene i 4.2.1 og virvel for jevn fordeling.
  4. Plass platen i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 min stivne og deretter legge til 1 x Waymouths komplett medier med stimulans eller hemmer (figur 2 bruker TGF-α på 50 ng/mL). Endre media (med stimulans eller hemmer) neste dag og deretter annenhver dag. Avhengig av stimulans, kan ADM observeres mellom 3 og dagen 5.

5. høste celler fra kollagen eller kjelleren membran matrise

  1. Samle følgende materialer kreves for å høste celler fra kollagen: 30 mL 1 mg/mL collagenase fortynnet i HBSS, 40 mL kaldt HBSS, 31 mL kaldt PBS, to spatler, to 50 mL rør og is. Juster antallet spatler, rør og beløpet av løsninger hvis sammenligne mer enn to oppdrettsforholdene (der hver tilstand er ½ av en plate). Satt sentrifuge 4 ° c og satt risting inkubator til 37 ° C.
  2. Fjerne mediet og bruke spatler fjerne kollagen diskene med innebygde celler. For hvert vilkår, sette diskene i en separat, kan du tømme 50 mL tube.
  3. Legge til 10 mL 1 mg/mL collagenase i HBSS til hver 50 mL tube. Pakk rør med plast parafin film og satt i en 37 ° C rister inkubator på 225 rpm for opptil 45 minutter. Overvåke fordøyelsen og fjerne rør når det er ikke mer synlig kollagen.
  4. Sentrifuge 233 x g på 4 ° C i 2 minutter med minimum retardasjon. Ta av nedbryting og resuspend i 5 mL collagenase løsning per rør. Fordøye i en 37 ° C risting inkubator på 225 rpm i 10 min eller til det er ingen synlige kollagen.
  5. Stoppe fordøyelsen ved legge til 5 mL kaldt HBSS og senere sentrifugering 233 x g i 2 minutter på 4 ° C med minimum retardasjon.
    1. Resuspend i 15 mL kaldt HBSS og igjen sentrifuge 233 x g i 2 minutter på 4 ° C med minimum retardasjon. Gjenta.
  6. Resuspend pellet i 1 mL av PBS og flytte til 1,5 mL tube. Virvel i en swing bøtte 233 x g i 2 minutter på 4 ° C med minimum retardasjon. Fjern supernatant og snapin-fryse i flytende nitrogen eller tørris.
    Merk: Cellen pellets kan lagres ved-70 ° C eller brukes umiddelbart i ned-stream programmer.
  7. Å høste kjelleren membran matrix-embedded celler, Pipetter media fra hver brønn i en 50 mL tube på is. Deretter tilsett kjelleren membran matrix gjenopprettingsløsning hver brønn og skrape celle-gel blandingen til 50 mL tube.
    Merk: Volumet av kjelleren membran matrix gjenopprettingsløsning legge til hver brønn er som følger: 150 µL (8-vel objektglass), 420 µL (24-vel plate), 845 µL (12-vel plate) og 2000 µL (6-vel plate).
  8. Skyll godt to ganger med kjelleren membran matrix gjenopprettingsløsning, legger skyller til 50 mL tube.
    Merk: Volumet av kjelleren membran matrix gjenopprettingsløsning for hver skylling er som følger: 150 µL (8-vel objektglass), 420 µL (24-vel plate), 845 µL (12-vel plate) og 2000 µL (6-vel plate).
  9. La røret på is 1t eller til kjelleren membran matrix oppløses og følger med sentrifugering på 300 x g i 5 min på 4 ° C. Fjern nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av kaldt PBS (kan overføre til 1,5 mL tube hvis cellen pellet).
  10. Sentrifuger 3500 x g i 3 minutter på 4 ° C. Fjern nedbryting og enten fest fryse celle pellets eller legge lyseringsbuffer og direkte fortsetter nedstrøms programmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gjennomføring av protokollen her skjer innen en dag og ved stimulering, ADM er sett i 3-5 dager. Figur 1 viser en rekke metoden der trinn 1 til 4 er fullført på den første dagen. Dette inkluderer forberedelse, acinar isolasjon, virusinfeksjon og forankring i kollagen eller kjelleren membran matrix. Mens kjelleren membran matrix induserer ADM, acinar celler i kollagen jeg kreve en stimulans, som TGF-α, gjennomgå differensiering ductal celler. På dag 1, celler i kollagen eller kjelleren membran matrise har en drue runde utseende og hvis utnytte viral infeksjon med en vektor uttrykke et fluorescerende protein, infeksjon effektivitet kan kontrolleres. Dag 5, vil cellene i kollagen danne kanaler hvis gitt en stimulans til forankring og som et supplement i media, som endres på dager 1, 3 og 5. Celler i kjelleren membran matrix vil danne kanaler i fravær av en stimulans, men ved stimulering større kanaler vil form, som vist i figur 2.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk av prosedyren for å isolere murine primære acinar celler, modulerer protein uttrykk og/eller stimulere acinar til ductal Metaplasi og bygge celler i kollagen eller kjelleren membran matrise. Arbeidsflyten inneholder isolering av acinar celler, som inkluderer Disseksjon av bukspyttkjertelen, fordøyelse og filtrering av cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant resultatene av primære acinar celler belagt i kollagen eller kjelleren membran matrise etter adenoviral infeksjon og stimulering med TGF-α. Primære acinar celler fra en ikke-transgene mus var infisert med GFP-adenovirus, innebygd i kollagen jeg eller kjelleren membran matrise og stimulert med eller uten TGF-α (50 ng/mL). Tjuefire timer etter infeksjon med GFP adenovirus, bildene ble tatt for å vise infeksjon effektivitet. På fem dager etter smitte betegne bildene forskjellene i celler stimulert med eller uten TGF-α kollagen eller kjelleren membran matrise. Duct-lignende strukturer er angitt med hvite pilspisser og skala barer representerer 50 µm. bildene ble oppnådd med et AC confocal mikroskop med EF Plan-Neofluar 10 x / 0,3 M27 målet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den relativt kort tidsperiode for isolasjon, infeksjon og plating primære acinar celler er en fordel med denne metoden. Derimot dyrking acinar celler fra en explant utvekst krever lite hands-on tid, men det tar sju dager for resultatet av acinar celler13. En alternativ protokoll for acinar isolasjon14 notater en svært kort metode for å få acinar celler. men er EGF en viktig komponent i å holde acinar cellene i live når isolert bruker denne protokollen. Siden EGF stimulerer differensiering av acinar celler ductal celler, er metoden her, som ikke krever ADM-stimulerende komponenter for kultur, bedre for å studere mekanismer for induksjon eller regulering av ADM. I denne metoden opprettholdes acinar celle identitet under dyrking i kollagen hvis stimulert til å skille ut ductal celler. Videre er vanskeligheter i transfecting primære celler overvunnet via manipulere protein uttrykk av virusinfeksjon.

Denne prosedyren tilbyr direkte studie av ADM, av hvilken effekt av ductal struktur induksjon kan skje via brightfield og/eller immunofluorescence mikroskopi. For bildebehandlingsprogrammer, er kammer lysbilder (angitt i Tabellen for materiale) best. Fiksering i 15 min på 37 ° C med 4% paraformaldehyde rette celler i kjelleren membran matrise uten forstyrrende ductal strukturer. Under denne inkubasjon kjelleren membran matrix vil gjør flytende og kan være forsiktig pipetted av med paraformaldehyde. Immunofluorescence på kollagen innebygd celler er beskrevet i detalj i ytterligere protokoller15,16. Ytterligere bruksområder for analyser av involvert signalnettverk mekanismer på endepunktet for eksperimentet er Western blot, qPCR og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). En sjettedel av en bukspyttkjertelen er tilstrekkelig materiell for ett utvalg analyse via Western blot eller qPCR.

Begrensninger av denne protokollen oppstå fra bruk av kollagen eller kjelleren membran matrise, der hvert har sine fordeler og ulemper. Mens forankring av celler i kollagen vil bare produsere kanaler hvis stimuli er gitt, produsere kjelleren membran matrix forankring kanaler uten ekstra stimuli. Men er ductal størrelse i kjelleren membran matrix en målbar effekt. En ekstra begrensning er tiden involvert i høsting prosedyrene i trinn 5, som kan påvirke genuttrykk. Denne begrensningen kan begrenses ved å bekrefte resultatene fra vestlige blotting med immunofluorescence, der fiksering tiden er betydelig mindre enn høsting tid for qPCR eller Western blot analyse.

I tillegg til adenoviral infeksjon, kan lentiviral infeksjon brukes i primære celler. Lentiviral infeksjon, legge 6 µg/mL virusinfeksjon enhancer reagens (se tabell av materialer) til cellene og forsiktig swirl platene. Deretter legger lentivirus (med en titer på minst 107 TU/mL) på en 1:1,000 fortynning og igjen, forsiktig virvel. Inkuber 3-5 h (37 ° C, 5% CO2) og fortsetter deretter forankring av celler i kollagen eller kjelleren membran matrise. Vil generere lentivirus med en plasmider rundt, bruke lentiviral emballering mix angitt i tabellen av materialer.

Videre modifikasjon kan inkludere isolering av celler fra mus uttrykke KrasG12D. I mus som allerede har fibrotiske områder med ADM og PanIN lesjoner, tar collagenase fordøyelsen lengre tid. Kreves nøye overvåking av collagenase fordøyelsen, som beskrevet kritiske og feilsøking. Mer unormale vevet en mus har, jo lenger fordøyelsen ta (rundt en time for en tolv-uke-gamle p48Cre; LSL-KrasG12D mus). Siden det kan være enorm variasjon mellom mus på samme alder, anbefaler vi å isolere acinar celler fra en LSL -KrasG12D mus og utføre adenoviral eller lentiviral infeksjon utnytte grobunn for å få kreftfremkallende KRas uttrykk. Det også bemerkes at våre protokollen er optimalisert for isolering av acinar cellen å undersøke ADM prosessen. Isolasjon av ADM og PanIN celler fra KrasG12D-uttrykke mus for organoid kultur krever endret protokoller.

En kritisk trinn er mengden av tiden hakket bukspyttkjertelen i collagenase. Den ideelle collagenase fordøyelse tiden kan variere fra mus til mus og mellom masse collagenase fra samme selskap. Tiden noterte i protokollen er egnet for pancreata veiing om 0.250 g. for mye tid kan skade og drepe celler, mens for lite tid vil resultere i ufullstendige fordøyelsen og derfor færre celler som vil gjøre det gjennom filtreringsprosessen på den finalen plate. Sjekk dissosiasjon visuelt etter sammenbrudd hakket opp bukspyttkjertelen stykker; løsningen bør slå skyet. I tillegg før du stopper collagenase reaksjon med kaldt HBSS, kan løsningen tas med en 5 mL Pipetter, hvor brukervennligheten som løsningen kan tas opp angir om det er hensiktsmessig å stoppe reaksjonen. Tas er antall pancreata høstes. Hvis mer enn er én bukspyttkjertelen isolert på samme tid, fungerer best når pancreata holdes separat.

Et annet viktig poeng å sikre sunne kultur primære acinar celler er at forsiktighet bør utvises når pipettering acinar celle løsningen. Energisk pipettering kan medføre celleskader og føre til mangel på røret formasjon, selv med tillegg av kjente ADM indusere, som TGF-α. Videre, hvis det er gjennomførbarheten problemer, sentrifugering i trinn 2.4 og 2.6 2.7 kan tas til 300 x g å produsere mykere pellets.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en R01 grant (CA200572) fra NIH til PS. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Cancer Institute eller den nasjonale institutter Health.The organer ikke hadde noen rolle i studie design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere, eller manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 °C shaking incubator Thermo Scientific SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubator NUAIRE NU-5500
50 mL tubes Falcon 352070
Absorbent pad, 20" x 24" Fisherbrand 1420662
Adenovirus, Ad-GFP Vector Biolabs  1060
Aluminum foil Fisherbrand 01-213-101
BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 Fisher Scientific  305167 Use as pins for dissection 
Beaker, 600 mL Fisherbrand FB-101-600
Bleach, 8.25% Clorox 31009
Cell Recovery Solution Corning 354253 Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript.
Centrifuge  Beckman Coulter Allegra X-15R Centrifuge
Collagenase Type I, Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C.
Dexamethasone Sigma D1756 Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. 
Ethanol, 200 proof Decon Laboratories  2701
Fetal Bovine Serum  Sigma F0926-100mL
Forceps  Fine Science Tools 11002-12
Forceps  Fine Science Tools 91127-12
Glass slide, 8-well Lab-Tek 177402
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red Fisher Scientific SH3048801   
Ice bucket, rectangular Fisher Scientific  07-210-103
Instant Sealing Sterilization Pouch Fisherbrand 01-812-51
LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)  Minigrip SBL2X69S
Lentiviral Packaging Mix, Virapower Invitrogen 44-2050
Matrigel Corning 356234 Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript.
Parafilm Bemis PM992 Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript.
PBS Fisher Scientific SH30028.02
Penicillin-Streptomycin  ThermoFisher Scientific 15140122
Pipet tips, 10 µL USA Scientific 1110-3700
Pipet tips, 1,000 µL  Olympus Plastics 24-165RL
Pipet tips, 200 µL  USA Scientific 1111-1700
Pipet-Aid Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL Gilson F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL Gilson F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL Gilson F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL Gilson F123601
Pipettes, 10 mL  Falcon 357551
Pipettes, 25 mL Falcon 357525
Pipettes, 5 mL  Falcon 357543
Plate, 12-well Corning Costar 3513
Plate, 24-well plate Corning Costar 3524
Plate, 35 mm Falcon 353001
Plate, 6-well Falcon 353046
Polybrene EMD Millipore TR-1003-G Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. 
Polypropylene Mesh, 105 µm Spectrum Labs 146436
Polypropylene Mesh, 500 µm  Spectrum Labs 146418
Scissors  Fine Science Tools 14568-12
Scissors  Fine Science Tools 91460-11
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) Fisher Scientific BP328-500
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
Soybean Trypsin Inhibitor 8 Gibco 17075029
Spatula Fisherbrand 21-401-10
Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters  Millipore SCGP00525
TGF-α R&D Systems 239-A-100
Type I Rat Tail Collagen Corning 354236
Waymouth MB 752/1 Medium (powder) Sigma W1625-10X1L
Weigh boat, hexagonal, medium  Fisherbrand 02-202-101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61, (3), 449-458 (2012).
  2. Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144, (6), 1170-1179 (2013).
  3. Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18, (1), 1-6 (1995).
  4. Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22, (6), 737-750 (2012).
  5. Morris, J. P. t, Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120, (2), 508-520 (2010).
  6. Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Cancer Research. 63, (9), 2016-2019 (2003).
  7. Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (49), 19327-19332 (2007).
  8. Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202, (3), 563-577 (2013).
  9. De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (48), 18907-18912 (2008).
  10. Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (48), 18913-18918 (2008).
  11. Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14, (10), 2325-2336 (2016).
  12. Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43, (5), 577-578 (2007).
  13. Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90, (12), 1052-1060 (2011).
  14. Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  15. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 10 Unit 10 11-20 (2010).
  16. Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics