癌地致小鼠膀胱肿瘤的磁共振成像评价

Cancer Research

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Summary

小鼠膀胱肿瘤是由 n-丁基-n-(4-羟基丁基) 亚硝胺致癌物 (BBN) 诱导的。膀胱肿瘤的产生是异质性的;因此, 在随机化进行实验治疗之前, 需要对肿瘤负担进行准确的评估。在这里, 我们提出了一个快速, 可靠的 MRI 方案, 以评估肿瘤的大小和阶段。

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Glaser, A. P., Procissi, D., Yu, Y., Meeks, J. J. Magnetic Resonance Imaging Assessment of Carcinogen-induced Murine Bladder Tumors. J. Vis. Exp. (145), e59101, doi:10.3791/59101 (2019).

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Abstract

小鼠膀胱肿瘤模型是评估新的治疗方案的关键。n-丁基-n-(4-羟基丁基) 亚硝胺 (BBN) 致癌物质诱导的膀胱肿瘤优于基于细胞的模型, 因为它们密切复制人类肿瘤的基因组特征, 与细胞模型和异种移植不同, 它们提供了很好的机会, 可以研究免疫疗法。然而, 膀胱肿瘤的产生是异质性的;因此, 在随机化进行实验治疗之前, 需要对肿瘤负担进行准确的评估。本文介绍了 BBN 小鼠模型和方案, 以评估膀胱癌肿瘤负担在体内使用快速和可靠的磁共振 (mr) 序列 (真正的 fisp)。这种方法简单可靠, 因为与超声波不同, MR 是独立于操作器的, 并且允许简单的采集后图像处理和审查。利用膀胱的轴向图像, 分析沿膀胱壁和肿瘤感兴趣的区域, 可以计算膀胱壁和肿瘤区域。此测量与体外膀胱重量 (rs= 0.37, p = 0.009) 和肿瘤阶段 (p = 0.0003) 相关。总之, BBN 产生非均质性肿瘤, 是评估免疫治疗的理想选择, MRI 可以在随机化实验治疗臂之前快速可靠地评估肿瘤负担。

Introduction

膀胱癌是全球第五大最常见的癌症, 2017年在美国造成约 80 000个新病例和 16, 000 例死亡1。在经历了大约30年没有取得重大进展的系统治疗膀胱癌2之后, 最近的抗 pd-1 和抗 pd-1 检查点抑制剂试验在晚期患者中表现出令人兴奋的、偶尔持久的反应泌尿系上皮癌 3,4,5。然而, 只有约20% 的患者对这些治疗方法表现出客观的反应, 还需要进一步研究, 以扩大膀胱癌患者免疫治疗的有效使用。

小鼠膀胱癌模型是临床前评价新治疗方法 67 的关键工具。为了控制小鼠在随机进行不同治疗时的肿瘤大小, 必须在治疗组之间进行评估和控制。以前的研究使用超声波或生物发光来评估原位细胞线基础膀胱癌模型8,9,10,11。但是, 这两种技术都有几个缺点。超声测量可能会受到操作人员技能的影响, 缺乏三维特征和较高的空间分辨率。生物发光方法只能提供肿瘤细胞的半定量评价, 不允许膀胱解剖和形态的可视化。此外, 生物发光只能用于基于细胞系的模型, 这些模型在无毛小鼠或白外套小鼠中表达生物发光基因。

另一方面, 磁共振成像 (MRI) 在获取高分辨率解剖图像方面具有独特的灵活性, 具有广泛的组织对比度, 可实现对肿瘤负担的准确可视化和定量评估无需表示生物发光特性。MR 图像更易于重现与适当的分析管道和保证的膀胱三维可视化。MRI 最大的限制是检查所需的时间长度以及相关的高成本, 这些成本限制了高吞吐量检测。然而, 一些研究表明, MR 序列可以提供高质量的诊断图像, 可用于有效地检测和监测细胞线为基础的膀胱肿瘤;因此, 它们可用于高吞吐量分析9,12

在这里, 我们描述了一种非侵入性的基于 mr 的方法, 以可靠和有效地表征致癌物诱导的小鼠膀胱肿瘤。为了实现这一目标, 我们使用了具有稳态进动 MR 技术 (true FISP) 的快速成像技术, 该技术保证了较短的扫描过程, 同时仍可提供高质量和高空间分辨率 (~ 100 微米), 用于检测和测量膀胱肿瘤13。此外, 为了确认这种非侵入性 MRI 检测的准确性, 我们描述了 mri 衍生参数与外膀胱重量以及病理证实的肿瘤阶段之间的相关性。

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Protocol

这里描述的所有方法都得到了西北大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准。

1. BBN 诱导肿瘤

  1. 获得雄性 c57bl6 小鼠, 每个小鼠至少6周大。
    注: 雄性小鼠比雌性小鼠迅速、持续地发展膀胱癌。
  2. 在饮用水中加入 n-nitrosobutyl(4-羟基丁胺 (BBN), 剂量为0.05%。将其存放在不透明的容器中, 并将其作为饮用水提供给老鼠16
    注: 将 BBN 溶液存放在透明容器中会降解致癌物质17
  3. 每周更换 0.05% BBN 水两次。
  4. 通过检查与膀胱肿瘤有关的痛苦迹象 (包括血尿、稳固膀胱和肿块) 来监测动物。每周检查两次或按照当地的 IACUC 指南检查小鼠。
  5. 预计肿瘤会在接触后16至24周之间发展到18

2. 核磁共振成像设置

  1. 在 ML 前10分钟进行无菌盐水注射 (使用 25–27 g 针和1毫升注射器 0.1–0.2 ml), 以促进膀胱充盈。
  2. 将每只小鼠用 100% O2 和异氟醚的气体混合物进行麻醉 (必要时为 2%-4%)。在进行试验前, 通过测试戒断反射 (脚趾捏), 验证足够的麻醉平面。将无菌眼药膏涂在动物身上。
  3. 将鼠标转移到装有鼻酮的成像支架上, 用于输送吸入异氟醚 (0.5%-3%)。
  4. 使用连接到生理记录计算机的直肠温度探头监测体温和呼吸。
    注: 使用动物 MR 支架中内置的循环热水回路保持正常体温 (36–37°c)。温度通过直肠传感器测量, 并使用专用的生理监测软件记录在生理监测计算机上。同样的系统用于记录呼吸和心电图信号测量通过一个气动枕头放置在肋骨下和通过3铅心电图电极. 呼吸信号也用于触发 MRI 采集和减少与呼吸运动相关的伪影。

3. MRI 图像采集

  1. 利用正交体线圈进行激励。
  2. 将4通道接收器线圈放置在正在扫描的鼠标下腹部, 以便能够优化检测来自感兴趣区域的信号。
  3. 通过集成的成像软件启动自动调整, 以获取整个鼠标体的三轴图像集。从这一组参考图像中, 确定感兴趣的区域 (在这种情况下, 是膀胱区域)。
  4. 使用辐射参照系获取沿轴向、冠状和矢状面的三组正交切片图像。
  5. 利用真正的 FISP 成像序列 (包括作为集成成像软件中的功能之一) 具有以下 MR 参数: TR = 900 毫秒, TE = 2 毫秒, FA = 70, 14 平均值。
    注: 这一组参数允许快速成像, 具有较高的诊断质量, 包括 ttut2 加权 & lt;10 分钟每只鼠标。
  6. 空间分辨率和切片厚度由用户通过集成成像平台的图形界面选择的几何参数确定。这导致在整个膀胱的一系列切片0.5 毫米厚, 平面内分辨率为0.148 毫米。

4. MR 图像分析

  1. 确定覆盖整个膀胱的 0.5 mm 厚度和 0.148 mm 的平面内分辨率的切片。
  2. 通过选择具有相应图像的文件夹 (分析格式) 导出到医学图像分析软件。
  3. 选择 "有代表性的轴向视图" 在膀胱的中心进行定量分析, 通过滚动生成的图像和识别在膀胱中点的切片, 从而实现膀胱壁和腔的可视化。
    注: 中心切片应为所选直径最大的切片。
  4. 通过手动跟踪膀胱外缘 (BLA out) 周围和膀胱内腔 (BLAin) 周围的边界, 仔细划分感兴趣的区域 (roi) (参见图 2中的示意图和代表性数字)在选定的代表性轴向视图。
  5. 从外缘减去内腔, 计算膀胱壁的表面积。
    BLA= bla输出-bla
    注: 没有肿瘤的对照膀胱的表面积预计将小于膀胱肿瘤的表面积。

5. 安乐死和膀胱解剖

  1. 在接触 BBN 20周后, 按照当地的 IACUC 指南, 使用标准操作规程对小鼠进行安乐死。
  2. 用70% 乙醇清洁切口区域, 然后用钳子抓握并抬起腹壁皮肤。
  3. 做一个中线切口 , 从联合到西普斯过程。
  4. 用钳子抓和用剪刀切割, 使腹腔锐化。
  5. 识别位于中线下腹部的膀胱。
  6. 识别并切断连接膀胱圆顶与脐带和腹壁的中位脐韧带。
  7. 用钳子抓住膀胱的圆顶, 提供反力, 并将膀胱从周围的结构 (包括精囊、直肠和脂肪) 解剖。
  8. 识别进入膀胱的输尿管, 并用剪刀剪断靠近膀胱的剪刀。
  9. 抬起膀胱头, 用剪刀割断尿道, 取出膀胱。
  10. 用 PBS 冲洗膀胱后, 立即称重膀胱。

6. 膀胱组织的组织学检查

  1. 在室温 (RT) 下, 将膀胱组织固定在10% 中性缓冲福尔沙林中36–48小时。
  2. 将组织嵌入石蜡块中, 将滑块切割成后续检查, 并用血红素和 eosin 染色幻灯片进行显微镜检查, 如前第1920 所述。
  3. 对小鼠膀胱在低 ( 2 . 5 倍和 10 倍 ) 和高 ( 20x 和 40x ) 放大率进行显微镜检查 , 检查宏观病变、增生、原位癌、状瘤、 状瘤和新浸润性肿瘤 19,21岁

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Representative Results

使用所述方案 (图 1), 对 c57b6 雄性小鼠的膀胱肿瘤进行诱导。MRI 在16周时进行, 小鼠在20周时进行安乐死。记录了每只老鼠的体内膀胱重量 (bw)。幻灯片被血红素和 eosin 染色, 并对所有组织学幻灯片进行肿瘤分期回顾。

为了用 MR 分析肿瘤负担, 从膀胱壁外腔 (BLA out)中减去膀胱壁内腔 (bla in) 计算膀胱壁 (bla 壁) 的厚度 (图 2).3A-F 显示了具有代表性的真实 fisp mr 图像、膀胱壁三维重建和对照小鼠 (即无肿瘤)病理图像, 图 33-l显示了大肿瘤小鼠。

mri 衍生参数 BLA壁与体外bw 弱相关 (rs = 0.37, p = 0.009;图 4)。对 mri 衍生的 BLA参数和 bw 数据的检查表明与肿瘤分期有关 (Kruskal-Wallis 测试 mri p = 0.0003,图 5a;BW p = 0.0006;图 5b), 以及非肌肉浸润性膀胱癌和肌肉浸润性膀胱癌分层病理时的关联 (Mannman-whitney u 测试 mri p = 0.0002,图 5B;BW p < 0.0001,图 5d)。图 5e显示了 bla和 bw 测定肌肉浸润性膀胱癌的性能。BLA壁曲线下的面积 (auc = 0.81, 95% ci 0.68-093) 在统计上与 BW 的 auc 相似 (auc = 0.81, 95% ci 0.80-0.98; p = 0.81)。

Figure 1
图 1: BBN 诱导膀胱肿瘤的模式以及 mri 和安乐死的时间.BBN 在饮用水中的浓度为0.05%。小鼠在16周时接受核磁共振检查。小鼠在20周时被安乐死, 每个小鼠的膀胱都用免疫组织化学检查。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 原理图图形描述的方法, 以获得 BLA墙和具有代表性的 mr 图像与相应的轮廓.利用 MRI 图像的强度, 确定膀胱的外壁, 并绘制红色轮廓 (BLA 输出).用绿色 (BLAin) 概述了高强度膀胱腔, 得到了相应的膀胱腔面积。这两个量的减法产生了 BLA参数, 该参数对应于图形图像中的浅灰色圆盘。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 具有代表性的真实 FISP mr 图像、膀胱壁三维重建以及对照小鼠 (即无肿瘤) (A-F) 和大肿瘤 (g-l) 小鼠的病理图像.(a)无肿瘤小鼠的代表 mr 图像。(b)膀胱壁面积 (bla) 的分割, 以红色概述, 定义为膀胱腔 (bla in) 和膀胱外壁(bla 输出) 之间的区域.(c)通过控制鼠标在膀胱的每个切片上定义 bla 壁, 从而使膀胱壁具有三维渲染.绿色箭头在转换为三维渲染的二维图像上说明膀胱。(d)从控制鼠标对 bla壁的切断子进行三维渲染。(e)同一鼠标膀胱的低功耗 (2.5 x) 和(f)高功率 (10倍) 图像。(g)具有大肿瘤的小鼠的代表 mr 图像。(h)膀胱壁面积 (bla) 的分割, 以红色概述, 定义为膀胱腔 (bla in) 和膀胱外壁(bla 输出) 之间的区域.(i)有大肿瘤的小鼠膀胱壁的三维渲染。(j)三维渲染有大肿瘤的小鼠膀胱的切口, 通过在膀胱的每一片中定义 bla而产生。绿色箭头在转换为三维渲染的二维图像上说明膀胱。(k)同一鼠标膀胱的低功耗 (2.5 x) 和(l)高功率 (10倍) 图像。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: mri 衍生的 bla壁与最终膀胱重量之间的相关性.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 47只小鼠病理分期与 mri 衍生参数 BLA的比较。(A)所有病理阶段和 MRIbla 壁的比较 (kruskal-wallis 测试)。(b)所有病理阶段和膀胱重量的比较 (kruskal-wallis 测试)。(c)非肌肉浸润性膀胱癌 (阶段≤t1) 和肌肉浸润性膀胱癌 (≥t2 期) 与 MRIbla 壁的比较 (mannd-whttney u 试验)。(d)非肌肉浸润性膀胱癌 (阶段≤t1) 与肌肉浸润性膀胱癌 (≥t2 期) 与膀胱重量的比较 (Mannd-whttney u 试验)。(e) mri 衍生膀胱面积的 roc 曲线和最终膀胱重量测定肌肉浸润性膀胱癌 (期≥t2)。列出的 p 值是两个 Auc 之间的差异。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

准确的肿瘤模型成像是必要的适当的安乐死分期和动物随机化之前开始实验治疗。利用这里介绍的程序, 我们演示了方法, 以产生膀胱肿瘤使用 BBN 致癌物和 (2) 分层膀胱肿瘤负担, 通过使用 mr. a rr 衍生面积测量 (BLA壁)显着相关体外膀胱重量与病理肿瘤分期有关。

通过采用在高空间分辨率 (真正的 FISP) 和高诊断质量下获取时间短的快速成像方法, 我们可以在治疗随机化之前, 对肿瘤发育的中间阶段的小鼠进行高通量检测。我们的报告与先前关于细胞系肿瘤植入物 9,12的磁共振成像报告是一致的, 并证实了它作为优化大学科数量药物研究的工具的潜力。

在这个 MRI 协议中, 重要的是要用一个完整的膀胱对小鼠进行成像, 以获得高质量的图像, 并描述肿瘤和膀胱腔之间的差异。我们发现, 在成像前10分钟给每只老鼠注射盐水可以对膀胱进行充分的成像。进一步的关键步骤包括使用设置在小鼠肋骨笼子下的气动枕头检测到的呼吸信号可靠地触发 MRI 采集, 并获取足够数量的 MR 切片, 从而覆盖整个膀胱。

其他选择的成像发展和进展的小鼠膀胱肿瘤包括超声 8和生物发光10,11。植入 MBT-2 细胞的显微超声成像检测了15只小鼠的肿瘤, 其中13只经组织学证实有肿瘤8例。超声体积与肿瘤立体体积显著相关, 但未对肿瘤重量和分期进行研究。生物发光已被用来准确地监测细胞系肿瘤植入物, 但它不能用于监测致癌物诱发的癌症, 而不将致癌物衍生肿瘤从一只小鼠转移到另一个小鼠。准确监测致癌癌症诱发癌症的能力至关重要, 因为这些模型与细胞系模型相比有几个优势。基于细胞系的模型在基因上是同质的, 来自已经逃避免疫监测的肿瘤, 植入的肿瘤生长迅速, 没有慢性炎症微环境22。bbn 模型已经成功使用了 30多年, 它仍然是了解膀胱癌发展和治疗的关键模型 23, 24,25.此外, bbn 模型还显示了类似于人类膀胱癌的突变和基因表达特征, 同时仍保留完整的免疫系统, 以便研究潜在的免疫治疗药物 26,27.

在多个机构提供专门的小动物核磁共振成像作为共有资源, 使这一技术对新疗法的基础研究和筛选具有优势和实用性。但是, 也有一些限制。小鼠只在一个时间被成像, 而不是在肿瘤发展过程中连续成像。然而, 根据我们的统计结果, 我们认为单时间点值能够准确地将小鼠分层为不同的组, 它代表了一个理想的, 非侵入性参数, 分类和分配对象到不同的组。使用 BBN 产生多个肿瘤阶段, 从 Ta 到 T4 不等。然而, 这些可能被分层 (如图 5C-d示) 为肌肉浸润 (t2 或更高) 和非肌肉侵入 (t1 或更少), 因为这是人类膀胱癌28的标准管理。

另一个潜在的限制是, BLA参数是通过每个膀胱的单个切片获得的, 而不是所有可用的切片覆盖它。选择这些标准是为了减少分析管道的要求 (即在多个切片上绘制多个 Roi 的要求), 并被认为足以进行快速、定量的分析。可以对主题进行更复杂的体积分析 (如图 3所示, 以供说明), 但不可避免地需要更多的努力和费用。自动图像处理算法可用于膀胱区域的自动划分;然而, 这些方法在单个小鼠中的膀胱形状和大小存在内在的变异性, 需要在临床前研究29中可靠采用之前进行大量的测试和验证。

体积数据的定性评估表明, 这种单片方法足以满足这种类型的检测。但是, 更高级的检测可能需要此附加的数据图像处理步骤。从获取的角度来看, 可以获得几个额外的扫描, 这可能会进一步增加预测肿瘤进展的能力, 同时也揭示更微妙的肿瘤微环境变化。这些附加技术包括动态对比增强 MRI、扩散加权 MRI 和其他序列30 , 从而能够对膀胱壁进行全面的多参数表征。然而, 对成本和效率的考虑导致我们将我们的分析限制在本协议中描述的范围内。

最后, 我们描述了 tent2 加权快速成像 MR 序列 (真正的 FISP) 获取覆盖整个小鼠膀胱的多层图像的方法。我们证明, 这些图像可用于确定肿瘤的程度, 在一个基于癌症的模型的小鼠膀胱癌。MRI 数据与膀胱组织重量相关, 并与肿瘤阶段有关。这些结果支持在实验治疗随机化之前使用这种快速可靠的 MRI 检测对小鼠进行分层。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

J. J. M. 由退伍军人卫生管理局资助。J. J. M. 还得到西北大学罗伯特·H·卢里综合癌症中心约翰·汉森癌症研究基金会的支持。我们感谢翻译成像中心提供的 MRI 采集和处理。资金来源在撰写手稿或决定提交出版方面没有任何作用。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 664 Mice
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN) TCI American B0938 Carcinogen
0.9% normal saline Hospira, Inc NDC 0409-488-02
Isoflurane Piramal HealthCare 60307-120-25 Anesthetic
7Tesla ClinScan MRI Bruker NA Dedicated Small Animal Imaging MRI
Syngo Siemens NA MR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating System Small Animal Instruments, Inc. (SAII) NA Small animal physiologic monitoring
Formalin, Neutral Buffered, 10% Sigma HT501128 Fixative
Eosin Y Fisher Scientific NC1093844 Histologic staining agent
Hematoxylin Fisher Scientific 23-245651 Histologic staining agent
Jim7 Xinapse Systems NA Medical image analysis software
GraphPad Prism v7.04 Graphpad NA Graphing software
R v3.4.2 The R Project for Statistical Computing NA Statistical software
R package pROC v1.10.0. The R Project for Statistical Computing NA ROC analysis

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