酵素の抗原 Nonrecombinant 表示システムとして胞子吸着

Immunology and Infection

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Summary

このプロトコルは細菌の胞子の様々 な生物活性を持つ異種分子を吸着する「ライブ」nanobiotechnological ツールとしての使用に焦点を当てください。吸着の効率を測定する方法も示します。

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Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens. J. Vis. Exp. (145), e59102, doi:10.3791/59102 (2019).

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Abstract

細菌の胞子は、周囲の水分を取り除かれた細胞質の保護層のシリーズによって形成された、静止代謝セルです。この独特な構造は胞子は、非常に安定して強いと胞子の異種分子を表示するためのプラットフォームとしての使用を示唆しています。ところ、組換えアプローチによって最初とし、シンプルで効率的な nonrecombinant 法による様々 な抗原、酵素を枯草菌と他のいくつかの種の胞子に表示されています。Nonrecombinant ディスプレイ システムは、組換え系統の建設と環境で遺伝子組み換え細菌のリリースを回避する胞子表面に異種分子の直接吸着に基づいています。吸着分子が安定し、抗原の急速な劣化と不利な条件で酵素活性の損失を制限する胞子との相互作用によって保護されました。利用、一度胞子を吸着した酵素を活動の最小の縮小を簡単に収集し、追加反応ラウンドで再利用できます。本稿では、枯草の精製胞子モデル分子を吸着する方法、吸着の効率を評価する方法、新しい反応のためリサイクルすること使用される胞子を収集する方法に表示されます。

Introduction

ディスプレイ システムは、微生物の表面の生理活性分子を提示し、様々 な分野医療・環境バイオ テクノロジー工業用からのアプリケーションを見つけることを目指しています。また、されている細菌胞子ファージ1,2と様々 なグラム陰性菌および肯定的な種の3,4,5,67、セルに加えて2 つのアプローチ8,9で表示システムとして提案。

その特異な構造、すなわち保護層10のシリーズに囲まれて脱水細胞質のため胞子はバクテリオファージとセルベースのディスプレイ システムの8,9以上のいくつかの利点を提供します。最初の利点は、極端な堅牢性とすべて他セル10,11劇物になる条件下で胞子の安定性から来ています。胞子表示抗原、酵素が安定後長期保管常温12低 pH と高温13劣化から保護します。胞子の 2 番目の利点は、胞子形成の多くの種の安全性です。枯草、B. 遺伝子のクローニング、B. coagulans、および他のいくつかの種プロバイオティクスとして世界的に使用され、数十年14,15に人間または動物の使用のための市場にされています。この例外的な安全記録は表面ディスプレイ システムの明白な一般的な要件特定の関連性の場合とシステムは、人間や動物の使用16用です。3 分の 1、胞子型ディスプレイ システムの重要な利点は公開するには分子のサイズに制限はありません。バクテリオファージ ベースのシステムで大規模な異種タンパク質構造に影響可能性がありますキャプシドのセルベースのシステム中、膜の構造に影響を与える可能性がありますか膜移行手順17を制限/損なうことがあります。胞子を取り巻く保護層は 70 以上の異なるタンパク質10で構成され、明らかに構造上の欠陥または機能障害8なし大型外国蛋白質を受け入れる柔軟性します。さらに、両方の胞子ベースの表示システムによる異種タンパク質の膜移行は必要な8,9ではありません。確かに、異種の蛋白質か母細胞質で作ら、同じ細胞で形成され、成熟した胞子8,9に吸着した胞子の組み立ています。

胞子表示は当初胞子表面18をエンジニア リングする遺伝的システムの開発によって得られました。この遺伝的システムは、私に基づいていた) (キャリアとして使用) 胞子コート蛋白質の遺伝子のコーディングとするタンパク質の遺伝子のコーディングの遺伝子融合の構造表示されます -、内因性の転写と翻訳のシグナルの存在遺伝子は融合、および ii の発現を制御する) 遺伝的安定性を付与する枯草染色体のキメラ遺伝子の統合。様々 な抗原、酵素はキャリアと様々 な応用を目指して、生体触媒、バイオ センサー、バイオレメディエーション、粘膜ワクチンに至る様々 な胞子表面蛋白質を使用して、この組換え方法によって表示されているかバイオ分析ツール8,13

最近では、胞子の表示の異なるアプローチは、開発19をされています。この 2 番目のシステムは nonrecombinant、胞子表面9分子の自発的な非常にタイトな吸着します。抗原19,20と酵素13,21は、効率的が表示されているし、このメソッドは組換えのものよりも大幅に効率化を明らかにしました。この nonrecombinant アプローチ ネイティブ フォーム20の蛋白質の表示が可能、死胞子19オートクレーブで使用もできます。吸着の分子メカニズムはまだ完全に解明されていません。胞子の疎水性と負の電荷は、吸着13,19,22の関連するプロパティとして提案されています。最近では、モデル蛋白質、サンゴDiscosoma胞子を吸着したときの赤色蛍光タンパク質 (mRFP) はインナー コート23でローカライズする表面層を介して侵入することが示されています。他の蛋白質の真の証明、異種の蛋白質の内部のローカリゼーションは胞子23に吸着したとき彼らの高められた安定性を説明できます。

最近の研究では、2 つの酵素が触媒するキシラン分解経路の 2 つの連続する手順はあったB. 枯草菌の胞子に独立して表示されないとときに、一緒に、培養された両方の分解手順21を実行することができます。胞子は、反応がまだ活躍し新鮮な基板21の付加にキシランの分解を続けることができる後に収集されました。最終製品の約 15% の損失は、第 2 反応21で観察された、場合でも複数のステップと同様に、単一反応吸着酵素の再利用性は胞子表示システムの追加の重要な利点です。

パンら24報告胞子表面に異種タンパク質を表示する追加のアプローチ: 母細胞で胞子形成中に生産の異種の蛋白質 (エンドグルカナーゼ タンパク質と β-ガラクトシダーゼの 1 つ) が自発的にキャリアを必要とせず、成形の胞子コートを包んだ。この追加胞子ディスプレイ システムは、これまで説明した 2 つのアプローチの組み合わせです。確かに、それは遺伝子組換え異種タンパク質がコート内でそのアセンブリは自発だった一方、胞子形成期母細胞で表される設計されたので、したがって、nonrecombinant24。ただし、この追加方法の表示の効率化は、テストと同じ異種タンパク質を利用した他の 2 つのアプローチと比較して残ります。

この議定書は胞子生産のプロセスを除外し、精製されている広範囲の場所24説明しました。吸着反応、ドットしみが付くことおよび蛍光顕微鏡による吸着の効率性の評価が含まれています、ラウンド追加反応吸着酵素のリサイクルします。

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Protocol

1. 吸着反応

  1. 2、5、および mRFP枯草野生型精製胞子ロッキング シェーカー (図 1) で 25 ° C のバッファー、50 mM クエン酸ナトリウム、pH 4.0 (16.7 mM クエン酸ナトリウム二水和物; 33.3 mM クエン酸) 1 h のバインディングを 200 μ l 添加の 2 × 109 10 μ g を孵化させなさい.
  2. 遠心分離機のペレット (P2、P5、および P10) と清 (S2、S5 と S10) を分別するバインディングの混合物 (13,000 x gで 10 分間)。3.2 の手順で吸着性の間接評価の培養上清を保存します。
  3. 2 ペレットを洗浄バッファーとバッファーに格納し、次の解析のために使用バインドの 100 μ L でそれらを再懸濁しますバインドの 200 μ L と x。
    注: 結合の反作用は優先的に、タンパク質の等電点より低い pH 値で発生します通常、1.5 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 4.0、または 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 4.0 を使用します。

2. 直接吸着の効率評価

  1. 西部のしみの分析および表面タンパク質の抽出
    1. MRFP 吸着胞子再懸濁 (P2、P5、および手順 1.3 の P10) の 50 μ L を取り、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) x 2 を 50 μ l 添加-ジチオトレイトール (DTT) (0.1 M トリス-HCl、pH 6.8; 2 %sds; 0.1 M の DTT) 胞子表面タンパク質を可溶化します。
    2. 無料、精製された mRFP と吸着はありません蛋白質に正と負のコントロールとしてそれぞれの胞子の同じ量の抽出物を使用します。
    3. 65 ° C で培養の 45 分後に遠心分離機 (13,000 x gで 10 分間) の混合物と、彼を認識する抗彼抗体抽出されたタンパク質 (上澄み) 西部のしみ、モノクローナル抗体との 10 μ L を分析タグ mRFP (の N 末端に存在図 2A)。
  2. 蛍光顕微鏡観察
    注: 蛍光の異種の蛋白質を使用または蛍光分析の実行、だをローカライズし、蛍光顕微鏡による吸着分子を定量化することが可能。
    1. 手順 1.3 から吸着胞子を再懸濁の 5 μ L を取るし、95 μ L の 1 × PBS、pH 4.0 〜 106胞子/μ L × 1 を入手するを追加します。
    2. 顕微鏡のスライドの懸濁液の場所 5 μ L は既治療の 30 のポリ-l-リジン coverslip でそれをカバー s、蛍光顕微鏡下で観察して。
    3. 各フィールドの位相差顕微鏡像と蛍光顕微鏡画像 (図 2B) を保存します。
      注: また、蛍光胞子に cytofluorimetry で分析できます。106胞子の合計吸着 1 mL の 1x PBS、pH 4.0 では、異種の蛋白質と非吸着や流れの cytometer (図 2C) を使用して懸濁液の分析を再懸濁します。
  3. ImageJ を用いたデータ解析
    1. ImageJ ソフトウェア (http://rsbweb.nih.gov/ij/) とすべての画像が 8 ビットの形式を確認して蛍光顕微鏡画像を開く (画像 |種類 |8 ビット)。
    2. 必要に応じてコントラストを調整 (画像 |調整 |明るさコントラスト) イメージのスケールがピクセルであることを確認し、(画像 |縮尺を設定する)。
    3. [分析] メニューから測定を設定を選択します。エリア集積密度、および選択した平均グレー値を持っていることを確認します。
    4. 描画/選択ツールのいずれかを使用して興味の胞子で境界線を引く (すなわち、円、多角形、またはフリー フォーム) (図 3)。
    5. [分析] メニューからメジャーを選択 (またはコマンド + Mを押す)。この最初の胞子の値のスタックとポップアップ ボックスが表示されます (図 3)。
    6. 測定する選択フィールドのビューで他の少なくとも 50 の胞子のこれらの 2 つの手順を繰り返します。
    7. (、蛍光を持たない) 胞子なしいくつかの地域を選択し、測定を繰り返しますこれは、背景になります。
      注: サイズは重要ではありません。これらの対応するバック グラウンド蛍光の値は、手動で背景を引くに使用されます。
    8. 結果ウィンドウですべてのデータを選択し、スプレッドシートに結果をコピーします。
    9. 集積密度領域選択した胞子とバック グラウンド蛍光値の平均を計算して修正された合計のセルごとの蛍光 (CTCF) 数式を使用してを取得するそれらを使用: CTCF = 平均集積密度 - (平均バック グラウンド蛍光 x 平均面積)。
      注: また、すべての胞子がよく分離表示する場合だ粒子の分析、ImageJ の命令を次の関数を使用してイメージ フィールドのすべての胞子を分析することが可能。ソフトウェアが特定の蛍光または胞子集計を読み取ることを避けるため、粒子の次元に pixelˆ2 を設定するのには 50 - 200 (図 4)。

3. 間接吸着の効率評価

  1. 浄化された蛋白質のシリアル希薄を準備します。
    1. 精製 mRFP 0.5 ng/μ l、結合バッファーを使用して最終濃度で 250 μ L を含む最初の 1.5 mL チューブを準備します。このボリュームは、2 つのレーンをロードするのに十分です。
    2. 6 二重シリアルの希薄の 250 μ L (最終巻)、各バインディングのバッファーを使用してを実行します。
  2. 二重 (S2、S5、およびステップ 1.2 から S10) 吸着反応の非連結 mRFP 画分を含む上清サンプルのシリアル希薄を準備します。
    1. 1.5 mL チューブにそれぞれの上清の 100 μ L を入れ、結合バッファーの 100 μ L を追加します。6 二重シリアルの希釈液 200 μ L (最終巻)、各結合バッファーを使用してを実行します。
  3. 6 (希薄の数) ドット x 5 (サンプル数) の区域をカバーするサイズで、ニトロセルロース膜 (0.45 μ カットオフ) 9 cm × 10 cm をカットします。膜は、ドットのしみ装置のガスケットの端を越えて拡張しないでください。
  4. ドットのしみ装置における prewet 膜を配置します。膜とガスケットの間に閉じ込められた空気を取り除きます。空気がそれらの井戸を移動するを防ぐためにテープまたはパラフィン フィルム装置の未使用部分をカバーします。
  5. ドットのしみ装置製造業者によって記述を組み立てます。
  6. 組み立て中に真空を使用する場合は、100 μ L/ウェル 1x PBS 抗原の制服のバインドを確認し、ハローや弱い検出信号を防ぐための膜を水分補給します。
  7. 優しく真空によって井戸からバッファーを削除します。緩衝液は、すべての井戸から排水、真空ポンプを停止、それを外します。
  8. 2 つのほとんどの外部の車線の標準および中間 (図 5) でサンプルをロードします。各希釈の 100 μ L で適切な井戸を埋めます。各ウェルに使用される同じボリュームは、すべてのサンプルの井戸の均一なろ過を確認してください。
  9. 2 分の真空ポンプをオンに、それを停止し、重力流によるメンブラン フィルターをサンプルします。
  10. 洗浄バッファーの後別の 5 分間実行する真空ポンプが装置から完全に排出された PBS せ x 1 の 100 μ L でのすべての井戸を洗浄します。
  11. 真空のネジを緩め、ドットのしみ装置を慎重に開いています。
  12. 真空をオフに、膜を取るし、次の西部のしみのプロトコル処理します。
  13. ImageJ などの適切なソフトウェアを使用して、フィルターのデンシトメトリーの分析を実行します。
    1. 同じエリアのサークルと、それらの概要と分析/測定コマンドを使用して各ドットの集積密度を測定します。
    2. 空の領域に円を描くとその統合密度測定またはバック グラウンド プロセス/削除コマンドを使用して、イメージのバック グラウンド補正を行います。
    3. 読み込まれた蛋白質の量と標準のドットの集積密度を関連付けるし、検量線 (校正曲線は 0.95 以上する必要がありますは R2値) を取得します。
    4. MRFP サンプル ドットごとの濃度を推定するのに検量線を使用します。
    5. 非連結の分数に残って mRFP の濃度を計算します。
      注: ドットしみ装置と、したがって、件名に正しい終了を確保するため均一圧膜ネジを斜めに交差の方式に従うことによってより強くネジを締めて真空ポンプの開き。

4. コレクションの胞子し、再利用

  1. 吸着の胞子のリサイクル、精製された XA GH10 キシラナーゼの 10 μ g と 1.1-1.3 (図 6A) の手順に記載されている精製 GH3 XT β-キシロシダーゼ、10 μ g 109精製胞子 x 2.0 の 2 つの吸着反応を実行します。
  2. 酵素を吸着した胞子を含むペレットを収集し、最適なバッファー (ph 6.5 50 mM リン酸ナトリウム緩衝; 2.48689 グラム/L の Na2HPO4、 4.88991 g/L NaH2PO4), 酵素反応の試金のための 50 μ L でそれらを再懸濁します胞子を吸着 GH10 XA や GH3 XT の 100 μ L の混合物を得る一緒にそれらをミックスします。
  3. 基板 (5 mg/mL 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) を追加し、65 ° C で 16 時間起こる酵素反応
  4. (13,000 × gで 15 分) の反応混合物を遠心分離し、酵素反応生成物を含む上清を保存します。
  5. 新しい基板 (MGX) (図 6B) 存在下で ph 6.5 新鮮な 50 mM リン酸ナトリウム緩衝の 100 μ L にペレットを再懸濁します。
    注: 1 つ以上の酵素を吸着するには、じゃない一緒に両方を吸着することが可能か、一つずつ独立しています。後者の可能性吸着効率の反応に必要な各酵素の化学量論的バランスをできるように、各酵素の活性の定量分析が容易になります。

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Representative Results

西部にしみが付くことによって成功した吸着を評価できます。反応混合物を遠心分離によって分別し、洗浄、ペレットの割合 (図 1) を使用して表面のタンパク質を抽出します。抽出はポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜を electrotransferred (ページ)、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分画し、第一次および二次抗体に対して反応しました。吸着の胞子のエキスで読み込まれるレーンでのみ、予想されるサイズのタンパク質の存在は、成功した吸着反応 (図 2A) を表しています。

吸着反応の効率は、直接的および間接的な方法で評価できます。使用されている、蛍光顕微鏡 (図 2B) とペレットの割合で cytofluorimetry (図 2C) が実行できる異種タンパク質に依存する吸着効率の直接評価後吸着反応の分別。胞子の存在の蛍光信号の定量化は、ImageJ ソフトウェア (図 3および図 4) を使用して実行できます。非連結蛋白質 (図 1) を含む上清画分の分析 (図 5A) しみが付くことの点で吸着効率の間接的な分析を実行できます。自由な蛋白質 (図 5B) のデンシトメトリー分析科学者が直接に胞子に吸着させたタンパク質の量を計算する、できるようになります。

2 つの連続した反応は、2 つの特定の酵素 (図 6A) のいずれかを表示する胞子の混合物により触媒されることができます。吸着分解は、単純なの遠心分離のステップ、洗浄し、新鮮な基板を用いた新しい反応サイクル (図 6B) インキュベートを収集できます。

Figure 1
図 1:吸着実験の一般的なスキームこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: MRFP ディスプレイの効率の直接解析します。(A) 西部のしみの mRFP 特異抗体を持つ。C + = 無料精製 mRFP;C-=; タンパク質に吸着されず胞子からのタンパク質抽出物P2 ・ P5/P10 それぞれ 2、5、および 10 mg mRFP を吸着した胞子から抽出したタンパク質を =。(B) 吸着胞子の蛍光顕微鏡観察。かに (FITC) と共役蛍光二次抗体と吸着タンパク質を認識する一次抗体と免疫反応が行われました。左側のパネルは、右側のパネルは、FITC 結合抗体の蛍光グリーンを示しています赤組み込み mRFP 蛍光を示しています。(C) 吸着胞子フローサイトメトリー解析。胞子は mRFP 特異抗体と二次抗体の FITC 結合反応や、その後、cytofluorimetry により分析しました。全体胞子人口 (アンゲート 10,000 イベント) の分析を行った。左側のパネルで赤黒、mRFP 吸着胞子に胞子のない吸着を示します。右側のパネルでは、前方および側面の散布 (FSC SSC) ドット プロットを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: ImageJ による蛍光信号の手動定量化します。ImageJ ソフトウェアで解析、赤の蛍光タンパク質 mRFP を吸着した胞子の蛍光顕微鏡像。黄色の円は、薄層クロマトグラフィー データ (拡大画像) を取得する 1 つの胞子を描画されています。ポップアップ ボックスには、選択した胞子のデンシトメトリーの分析の結果が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: ImageJ による蛍光信号の同時定量します。(A)粒子の分析を選択するときにポップアップ ボックスが取得します。50-200 ピクセルの間隔値 ^2 は胞子23に設定します。図 3Aの画像のセグメンテーションを分析粒子(左)、および相対的なデンシトメトリー分析結果 (右) を使用した後 (B)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5:ドットのしみが付くとデンシトメトリー分析します。(A) ドット (Std1および Std2) 重複と mRFP、それぞれ23の 2 μ g、5、10 で吸着反応の上澄み (S2、S5、S10) 精製 mRFP のシリアル希薄としみが付きます。(B) ドットはパネルAのしみが付くことは、デンシトメトリーの分析に使用されます。円を表す信号の密度を用いた。右側のパネルは、デンシトメトリーの分析で得られた結果の例を報告します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6:再利用可能な胞子によるキシランの変換。(A) キシランの分解の一般的な方式です。一緒に混在している場合に、キシラナーゼや β-キシロシダーゼ酵素を表示 (B) 胞子は、キシランの 2 段階の分解を触媒します。反応後、サンプルは、遠心分離によって分画しました。上清には、ペレット新鮮な基板を追加することによって再利用できる胞子結合酵素が入っている間の反応生成物が含まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

この胞子吸着プロトコルは非常に簡単です。反応は反応バッファーの pH に依存、吸着の効率は酸性 pH 値 (pH 5.0 以下) に最適です。中性条件下で吸着効率が低くとアルカリ pH 値で吸着が発生しません。最適な吸着は、ロッキング シェーカーで 1.5 mL チューブ (または同じような比率を維持する) に 200 μ L のボリュームを使用して取得されます。

吸着は非常にタイトと反応バッファーの同じ pH のバッファーで洗浄吸着タンパク質のすべてのリリースが発生しません。最小限のアルカリ ・ バッファーで洗浄があります (一般的に未満 1526) 吸着タンパク質のリリース。

ドットのしみが付くことによって吸着性の間接評価は、精製と非連結のタンパク質のいくつかの希釈液が分析され、デンシトメトリーの分析が正しく実行されます信頼性の高い。異種蛋白質の低下の証拠には、報告された25されていません。吸着性の直接評価大幅吸着タンパク質によって異なります。タンパク質がされる場合は蛍光標識、ImageJ 援用解析提供蛍光の蛍光分子の量の定量は、胞子に提示します。蛋白質は酵素の活性は、特定酵素試金は胞子に存在するタンパク質の量の表示を提供できます。しかし、それは胞子13との相互作用による安定化効果増胞子に関連付けられた酵素活性が知られています。吸着タンパク質蛍光ではない酵素の活動がない場合は、ドットは、徹底的な条件の下での抽出の胞子にしみが付くことによって吸着の効率を評価できます。

使用される胞子のコレクションは、非常に簡単な手順で行うことができます。反応バッファーで洗浄工程は、新鮮な基質の添加が新しい反応21の開始に不可欠ですが、反応副生成物を削除することが重要かもしれません。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、l. Baccigalupi、プロジェクトのタイトルに「Finanziamento ・ ディ ・ Ricerca ・ ディ ・ アテネオ」によって支えられた「SP レイ: タンパク質ディスプレイ用 live プラットフォームとしては細菌の胞子します」.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Poly-L-lysine solution Sigma P8920
0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane Sartorius M_Blotting_Membranes
100× objective UPlanF1  Olympus microscope equipment
Bacillus subtilis strain NCIB3610 Bacillus Genetic Stock Center 3A1
BD ACCURI C6 PLUS BD flow cytometer
BX51 Olympus Fluorescent microscope
Clarity Biorad 1705060
DP70 digital camera a Olympus microscope equipment
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC Thermo fisher F-2754
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)  Abcam ab6721
Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody Sigma A7058-1VL used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal 
SecureSlip glass coverslip Sigma S1815-1PAK
Superwhite Uncharged Microscope Slides VWR 75836-190
U-CA Magnification Changer  Olympus microscope equipment

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References

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