एगरोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स और एगरोबैक्टीरियम रिजोजिनीज-मध्यांतर में आलू का रूपांतरण और गस धुंधला द्वारा एक suberin जीन के प्रमोटर गतिविधि

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Summary

यहां, हम आलू के पौधों को बदलने के लिए दो प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एगरोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स रूपांतरण एक पूर्ण ट्रांसजेनिक संयंत्र की ओर जाता है जबकि एगरोबैक्टीरियम rhizogenes एक जंगली प्रकार के शूट में ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों का उत्पादन करता है जो आत्म प्रचारित किया जा सकता है । हम तो बदल जड़ों में धुंधला गस द्वारा प्रमोटर गतिविधि का पता लगाने ।

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Fernández-Piñán, S., López, J., Armendariz, I., Boher, P., Figueras, M., Serra, O. Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. J. Vis. Exp. (145), e59119, doi:10.3791/59119 (2019).

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Abstract

एगरोबैक्टीरियम sp. सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है ट्रांसजेनिक पौधों को प्राप्त करने के रूप में यह हस्तांतरण और संयंत्र जीनोम में अपने ही टी डीएनए एकीकृत करने की क्षमता है । यहां, हम आनुवंशिक रूप से संशोधित करने के लिए दो परिवर्तन प्रणाली वर्तमान आलू (Solanum ट्यूमोसम) पौधों । एक. tumefaciens परिवर्तन में, पत्तियों संक्रमित हैं, परिवर्तित कोशिकाओं का चयन कर रहे हैं और एक नया पूरा बदल संयंत्र 18 हफ्तों में phytohormones का उपयोग कर पुनर्जीवित किया है. एक. rhizogenes रूपांतरण में, उपजी एक सुई के साथ बैक्टीरिया इंजेक्शन से संक्रमित हैं, नए उभरे हुए बदल बालों वाली जड़ों एक लाल फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग कर पता चला रहे हैं और गैर-रूपांतरित जड़ों को हटा रहे हैं । 5-6 सप्ताह में, जिसके परिणामस्वरूप संयंत्र पूरी तरह से विकसित बदल बालों की जड़ों के साथ एक जंगली प्रकार शूट का एक समग्र है । बायोमास को बढ़ाने के लिए, रूपान्तरित बालों की जड़ों excised और आत्म प्रचारित किया जा सकता है । हम एक सुबेरिन bioसंश्लेषित जीन प्रमोटर द्वारा संचालित गस रिपोर्टर जीन व्यक्त जड़ों को प्राप्त करने के लिए दोनों एगरोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन विधियों को लागू किया । गस धुंधला करने की प्रक्रिया प्रदान की जाती है और प्रमोटर प्रेरण के सेल स्थानीयकरण की अनुमति देता है । दोनों विधियों में, रूपान्तरित आलू जड़ों suberized एंडोडर्मिस और exodermis, और अतिरिक्त में गस धुंधला दिखाया, और साथ ही, एक में rhizogenes बदल जड़ों गस गतिविधि भी पार्श्व जड़ों के उद्भव में पाया गया था । इन परिणामों का सुझाव है कि एक. rhizogenes एक तेजी से वैकल्पिक उपकरण जीन है कि जड़ों में व्यक्त कर रहे है अध्ययन किया जा सकता है ।

Introduction

आर्थिक हित के अलावा, ट्रांसजेनिक पौधों की पीढ़ी अनुसंधान में अपनी प्रासंगिकता के लिए जीन के अंतिम कार्य को प्रदर्शित करने और बेहतर संयंत्र शरीर विज्ञान और विकास को समझते हैं । संयंत्र डीएनए प्रविष्टि के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि एगरोबैक्टीरियम-mediated परिवर्तन है । एगरोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स अपने ट्यूमर-inducing (Ti) प्लाज्मिड की कार्रवाई से कई पौधों की प्रजातियों के संक्रमित ऊतक में मुकुट वाइरल उत्पन्न करने में सक्षम है । प्लाज्मिड में जीन के समुच्चय के साथ टी-डीएनए क्षेत्र होता है जो पादप जीनोम में एकीकृत होगा तथा ऊतक विविभेद1,2को प्रेरित करेगा । ट्रांसजीन द्वारा टी-डीएनए के भीतर इन जीनों के आदान-प्रदान से विशिष्ट पादप संशोधनों के उत्पादन की अनुमति दी गई है जो लक्षणप्ररूपी प्रभाव3से परहेज करते हैं । टी-डीएनए में ट्रांसजीन क्लोनिंग की सुविधा के लिए, टी-डीएनए क्षेत्र को बाइनरी प्लाज्मिड नामक एक स्वतंत्र प्लाज्मिड में उत्तेजित किया गया है, जबकि Ti प्लाज्मिड (वाइरलेंस जीन जो टी-डीएनए अंतरण और संमिलन तंत्रों की अनुमति देते हैं) के शेष जीन एक सहायक प्लाज्मिड में रखा गया । संयंत्र जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान के लिए, एक tumefaciens द्वारा परिवर्तन कई फायदे हैं: यह महंगा उपकरणों की जरूरत नहीं है, दोनों स्थिर और क्षणिक संयंत्र परिवर्तन उत्पन्न करने में सक्षम है, और जीन प्रतियों की कम संख्या में एकीकृत कर रहे हैं गुणसूत्र4. हालांकि, ज्यादातर पौधों के लिए, लेकिन नहीं arabidopsis, स्थिर परिवर्तनकारी पीढ़ी के एक एकल या कुछ कोशिकाओं बहिर्जात phytoहार्मोन्स का उपयोग करने से संयंत्र उत्थान की आवश्यकता है, इस प्रक्रिया श्रमसाध्य और समय लेने बनाने । ए rhizogenes भी संयंत्र जीनोम को संशोधित करने में सक्षम है, बालों की जड़ों या संक्रमण की अभिव्यक्ति के कारण साइटों पर आकस्मिक जड़ों का उत्पादन (जड़ loci) जड़ में इनकोडिंग जीन-inducing (आरआई) प्लाज्मिड5। हालांकि एक. tumefaciensसे कम अध्ययन किया, एक rhizogenes भी ट्रांसजेनिक जड़ों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल होता है । इस मामले में, एक rhizogenes आरआई प्लाज्मिड में मूल टी डीएनए और एक दूसरे टी डीएनए transgene ले जाने के साथ एक द्विआधारी प्लाज्मिड शामिल हैं । जब संक्रमण साइट उपजी या hypocotyls में है, एक समग्र संयंत्र प्राप्त किया जा सकता है, नए बालों ट्रांसजेनिक जंगली प्रकार की शूटिंग से उभर जड़ों के साथ । वैकल्पिक रूप से, बालों में बदल जड़ें स्वायत्त कार्बन स्रोत आदानों के साथ मीडिया में विट्रो में विकसित कर सकते हैं । के बजाय ए. rhizogenes का उपयोग एक. tumefaciens के लिए ट्रांसजेनिक ऊतक का उत्पादन प्रासंगिकता प्राप्त कर रहा है जब जड़ लक्ष्य अंग है, क्योंकि संयंत्र पुनर्जनन की आवश्यकता नहीं है और इसलिए यह तेजी से और कम महंगा है । पिछले अध्ययनों में जड़ विशिष्ट जीन के लक्षणप्ररूपी लक्षण वर्णन6,7,8,9के लिए विनिकृत इस पद्धति का प्रदर्शन किया है ।

आलू (solanum ट्यूबरोसम) दुनिया में चौथी सबसे महत्वपूर्ण फसल संयुक्त राष्ट्र के खाद्य और कृषि संगठन (fao) के अनुसार है के बाद से कंद विटामिन का एक अच्छा स्रोत होने के लिए मानव उपभोग के लिए पोषण प्रासंगिकता है और खनिज । उस कारण से, आलू को कृषि जैव प्रौद्योगिकी की सुर्खियों में रखा गया है और आनुवंशिक और विकासात्मक अध्ययनों के लिए एक अच्छा जैविक मॉडल के रूप में भी माना जाता है10,11. आलू परिवर्तन काफी suberized और मोम जैव संश्लेषण में शामिल जीन के लक्षण वर्णन के माध्यम से suberized ऊतकों अंतर्निहित अणुओं तंत्र की समझ में योगदान12,13,14 ,15,16,17, सुबा्न मोनोमर ट्रांसपोर्ट18 और ट्रांसक्रिप्शन रेगुलेशन19. सुबेरिन फ्रोलोयल ट्रांस्फ़्रेज़ जीन, fht, इन विशेषता जैव सिंथेटिक जीन में से एक है; इसकी डाउनरेगुलेशन परित्वक् संरक्षण की एक मजबूत हानि को जंम देता है, जो आलू कंदों में सुबेरिन और waxes के ferulate एस्टर में एक मजबूत कमी के साथ सहसंबद्ध है14। सहवर्ती रूप से, अराबीडापोसिस की जड़ों और बीजों में, इसके ख्यात ऑर्थोलोग (एएसएफटी/RWP1) की पीटकर भी20,21में अल्किल फर्लेट्स के उत्पादन में अपनी भूमिका का प्रदर्शन किया । आलू में, fht transअपंग रिपोर्टर लाइन और fht एंटीबॉडी क्रमशः दिखाया है कि प्रमोटर गतिविधि और प्रोटीन exodermis में स्थित हैं, endodermis, phellogen-डेरिवेटिव और घायल ऊतकों में15

इस काम में, हम विस्तार से एक प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक. rhizogenes कि एक जंगली प्रकार गोली मार में बनाए रखा है ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों का उत्पादन, संयुक्त आलू के पौधों का उत्पादन, या के लिए स्वायत्त रूप से विकसित करने के लिए excised विट्रो में। हम भी एक. tumefaciens का उपयोग कर प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए पूरा ट्रांसजेनिक आलू के पौधे प्राप्त करते हैं । एक मामला अध्ययन के रूप में, ए. rhizogenes और एक ही द्विआधारी सदिश के साथ तब्दील tumefaciens का उपयोग fht प्रमोटर ड्राइविंग गस रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति के साथ जड़ें प्राप्त करने के लिए किया जाता है । परिणाम रिपोर्ट और तुलना कर रहे हैं ।

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Protocol

ए. rhizogenes परिवर्तन प्रोटोकॉल अनुकूलित और हॉर्न एट अल.7 से संशोधित किया गया था और जीनोटाइप परीक्षण किया गया एस. ट्यूमोसम एसएसपी। ट्यूरोजोसम (cv. désirée). ए tumefaciens परिवर्तन प्रोटोकॉल अनुकूलित और बनर्जी एट अल.22 से संशोधित किया गया था और जीनोटाइप परीक्षण एस. ट्यूरोसम एसएसपी थे ट्यूमोसम (Cv. désirée) और एस. ट्यूरोसम एसएसपी. अंडिगेना। दोनों प्रक्रियाओं के मुख्य कदम क्रमशः चित्रा 1 और चित्रा 2में संक्षेप हैं ।

नोट: सभी विट्रो स्थानान्तरण में प्रदर्शन प्रक्रिया के चरणों में, इतनी तेजी से करते हैं, और जब संभव हो, प्लेटें या बर्तन बंद बनाए रखने, इस प्रकार हवा के लिए संयंत्र जोखिम को कम करने के लिए म्लानि और संदूषण से बचने के । अंयथा कहा गया है कि सभी पादप इंक्यूबेशंस 24 ° ब् के 12 ज की शर्तों के तहत अलमारियां में किए गए थे । 20 डिग्री सेल्सियस की लाइट/ अंयथा कहा गया है, सभी बैक्टीरिया हेरफेर प्रदर्शन और एक लेमिनर फ्लो हुड में अपूतित शर्तों में विट्रो संयंत्र हस्तांतरण में । सभी एगरोबैक्टीरियम के लिए मीडिया व्यंजनों और विट्रो संयंत्र संस्कृतियों में तालिका S1में प्रदान की जाती हैं ।

चेतावनी: सभी आनुवंशिक रूप से संशोधित बैक्टीरिया और पौधों को विनिकृत अपशिष्ट कंटेनर में जमा करें ।

1. एगरोबैक्टीरियम संस्कृतियों परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया

नोट: एक. rhizogenes परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया तनाव था C58C1: Pri15837 (कृपया Dr. ईंगे broer द्वारा प्रदान की) और कि ए TUMEFACIENS के लिए GV2260 था (कृपया डॉ salomé prat द्वारा प्रदान की) । ए rhizogenes द्विपदीय वेक्टर PK7GWIWG2_II-RedRoot (Vib-विश्वविद्यालय में संयंत्र प्रणाली जीव विज्ञान के विभाग के साथ बदल गया था http://gateway.psb.ugent.be) कि एक टी डीएनए एक परिवर्तन मार्कर ले जाने के लिए बालों की जड़ की निगरानी में शामिल है गठन. एक. rhizogenes और एक tumefaciensद्वारा उत्पंन बदल जड़ों की तुलना करने के लिए, दोनों द्विआधारी वेक्टर PKGWFS7 जो एक टी डीएनए शामिल है fht प्रवर्तक के साथ बदल रहे थे β-GLUCORONIDASE (गस) रिपोर्टर जीन ड्राइविंग और Kanamycin प्रतिरोध जीन एक चयन मार्कर15के रूप में ।

  1. एगेरोबैक्टीरियम की एक कॉलोनी उठाओ और यह (ओ/एन) के 5 मिलीलीटर में yeb के साथ पूरक एंटीबायोटिक्स (तालिका S1) ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर 28 डिग्री सेल्सियस में मिलाते हुए २०० rpm के साथ ।
  2. एक. tumefaciens परिवर्तन के लिए, ऑप्टिकल घनत्व, जो ओडी६०० = 0.6-1.0 होना चाहिए उपाय ।
    1. यदि ऑप्टिकल घनत्व अधिक है, एक उपसंस्कृति इसे कम करने के लिए आयुध डिपो६०० = ०.३ ताजा मीडिया के साथ और संस्कृति तक पहुंचने तक प्रतीक्षा करें ओडी६०० = 0.6-1 ।
  3. एक बेंच-शीर्ष सेंट्रीफ्यूज में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ३,००० एक्स जी में एगरोबैक्टीरियम संस्कृति के सेंट्रीफ्यूज 1 मिलीलीटर ।
  4. अधिनतांत को पिख्ता करके हटा दें, और बिना एंटीबायोटिक्स के ताजा येब मीडियम के 1 एमएल में कोशिकाओं को रीसपेंड करें । एंटीबायोटिक दवाओं की पूरी तरह से हटाने सुनिश्चित करने के लिए इस कदम को दोहराएं ।
    1. के लिए एक. tumefaciens रूपांतरण, पिछले resuspension में उपयुक्त yeb मात्रा जोड़ने के लिए एक अंतिम ऑप्टिकल घनत्व प्राप्त करने के लिए आयुध डिपो६०० = ०.८ ।
  5. पौधों को संक्रमित होने के लिए तैयार करते समय कोशिकाओं को बर्फ पर रखें ।

2. परिवर्तन के लिए संयंत्र सामग्री

  1. एक या दो नोड स्टेम cuttings या तो विट्रो आलू के पौधों (दाता पौधों) में बाँझ से शीर्ष या सहायक कलियों युक्त बनाने; 3 से 4 सप्ताह (चित्रा 1a और चित्रा 2ms) के लिए बर्तन में ठोस 2ms माध्यम में उन्हें विकसित.

3. एक. rhizogenes का उपयोग कर संयंत्र रूपांतरण (चित्रा 1)

नोट: यह प्रक्रिया बदल बालों की जड़ों के प्राप्त करने की अनुमति देता है । ट्रांसजीन व्यंजक का मूल्यांकन करने के लिए, एक ऋणात्मक नियंत्रण की आवश्यकता होती है. नकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए, एक. rhizogenes तनाव या तो अपरिवर्तित या खाली सदिश है कि परिवर्तन मार्कर जीन शामिल है के साथ बदल का उपयोग कर प्रक्रिया का पालन करें ।

  1. नए मीडिया प्लेट्स का उपयोग करें; वैकल्पिक रूप से, प्लेट 4 डिग्री सेल्सियस पर ढक्कन की ओर से रखा जा सकता है, कसकर पारदर्शी फिल्म के साथ बंद करने के लिए मीडिया निर्जलीकरण से बचें । वर्ग मीडिया प्लेट्स तैयार करने के लिए, उंहें ~ 15 ° इच्छा, एमएस के ४० मिलीलीटर के साथ भरें, और उंहें जमना । यह माध्यम के साथ संयंत्र के हवाई भाग के संपर्क को कम कर देगा ।
  2. बहुत सावधानी से एक १२० मिमी x १२० मिमी वर्ग प्लेट के लिए 2MS माध्यम से एक दाता संयंत्र स्थानांतरण ।
  3. एक स्टेम इंटरनोड 3 μL एक सर्जिकल सुई का उपयोग कर एक. rhizogenes संस्कृति के लिए सुई और जब संभव हो अलग internode में इसे दो बार प्रति संयंत्र दोहराएँ.
    नोट: प्रत्येक इंजेक्शन एक स्वतंत्र परिवर्तन घटना (चित्र 1b) के रूप में विचार करें ।
  4. तुरंत पूरे संयंत्र ठोस एमएस ०.१ मिमी acetosyringone के साथ पूरक के साथ एक वर्ग प्लेट के लिए स्थानांतरण । प्रति प्लेट 2 पौधों को समायोजित ।
    नोट: DMSO में 1 M एसीटोसीरिंगोन स्टॉक समाधान तैयार किया गया है और-20 ° c पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  5. सील थाली सर्जिकल टेप का उपयोग कर और यह एक विकास कैबिनेट के भीतर खड़ी की व्यवस्था 4 दिनों के लिए ।
  6. एक नई वर्ग प्लेट के लिए संयंत्र हस्तांतरण के साथ एमएस मध्यम सेफोटक्षिमे सोडियम के साथ पूरक [५०० μg/एमएल] एक. rhizogenesको मारने के लिए ।
  7. 10-12 दिनों के बाद, बालों की जड़ों को प्रदर्शित करना शुरू कर देंगे (चित्रा 1 सी,1 डी) । फिर, उत्पाद संयंत्र के मूल जड़ों, और एमएस के साथ एक नया वर्ग प्लेट के लिए संयंत्र हस्तांतरण सेफोटक्षिमे सोडियम के साथ पूरक अनुपूरक [५०० μg/
    नोट: बदल बालों की जड़ों लाल प्रतिदीप्ति द्वारा जांच की जा सकती है जब एक DsRed परिवर्तन मार्कर का उपयोग कर (चित्रा 3 डी) ।
  8. एक संयुक्त संयंत्र (चित्रा 1e) प्राप्त करने के लिए, ट्रांसजेनिक बालों की जड़ें MS मध्यम में 3-4 सप्ताह के लिए बढ़ने सेफोटक्षिमे सोडियम के साथ पूरक (५०० μg/एमएल] (मध्यम हर हफ्ते बदल) ।
  9. इस उद्देश्य पर निर्भर करता है, ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों और नकारात्मक नियंत्रण का पालन के रूप में प्रचारित ।
    1. व्यापक विकास के लिए अनुमति देने के लिए एक hydroponic (तालिका S2) या मिट्टी के माध्यम से पूरे समग्र संयंत्र हस्तांतरण ।
    2. व्यक्तिगत रूप से बदल बालों की जड़ों का प्रचार करने के लिए, एक स्केलपेल का उपयोग कर लाल फ्लोरोसेंट परिवर्तन मार्कर (DsRed प्रोटीन) व्यक्त जड़ों जब वे 4-8 सेमी लंबी (चित्रा 1E) कर रहे है और उंहें Gamborg B5 ठोस माध्यम के साथ एक पेट्री डिश में स्थानांतरण 2% सुक्रोज और सेफोटक्सिम सोडियम [५०० μg/एमएल] के साथ पूरक । प्लास्टिक प्रयोगशाला फिल्म के साथ प्लेटें सील और उंहें 20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में हो जाना ।
      नोट: जड़ों बाँझ शर्तों के तहत प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए सुसज्जित एक stereomicroscope के तहत हेरफेर किया जा सकता है ( सामग्री की मेजदेखें).
    3. बायोमास उत्पादन के लिए (यानी, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण), एक 5 सेमी लंबे बालों की जड़ में कटौती और यह एक १५० मिलीलीटर erlenmeyer फ्लास्क में 20 मिलीलीटर के साथ gamborg B5 तरल मध्यम पूरक 2% सुक्रोज और सेफोटक्सिम सोडियम [५०० μg/ 20 डिग्री सेल्सियस और ६० rpm पर अंधेरे में 6 हफ्तों के लिए यह हो जाना ।

Figure 1
चित्रा 1: एक. rhizogenesका उपयोग आलू ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों को प्राप्त करने के लिए समयरेखा । संचयी सप्ताह परिवर्तन प्रक्रिया के प्रत्येक चरण तक पहुँचने के लिए और बालों की जड़ों को विकसित करने के लिए अनुवर्ती कदम दिखाए जाते हैं. विभिंन चरणों के प्रतिनिधि छवियां चित्रित कर रहे हैं: 3 का उपयोग कर प्रक्रिया की दीक्षा विट्रो पौधों में सप्ताह पुराने (), तो पौधों का इंजेक्शन द्वारा संक्रमण एक. rhizogenes (बी), प्रफलन के गठन ऊतक (सी, तीर) उभरते बालों की जड़ों के साथ (डी), और विकसित बालों लाल फ्लोरोसेंट परिवर्तन मार्कर dsred () व्यक्त जड़ों । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. संयंत्र रूपांतरण का उपयोग कर एक tumefaciens (चित्रा 2)

नोट: यह प्रक्रिया रूपांतरित पौधों के प्राप्त होने की अनुमति देती है । ट्रांसजीन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण की जरूरत है । एक विकल्प के लिए प्रक्रिया का पालन करने के लिए है एक एक. tumefaciens खाली वेक्टर के साथ बदल दिया । वैकल्पिक रूप से, जंगली प्रकार के पौधों का इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. कट और 3-4 से एक पत्ती जगह सप्ताह पुराने पौधों (चित्रा 2a) एक पेट्री डिश में । एक स्केलपेल का उपयोग कर डंठल को बाहर करने और अनुप्रस्थ कटौती बनाने (1-3 पत्ती के आकार पर निर्भर करता है) पत्ती के केंद्र से उंहें काटने से परहेज किनारों को (चित्रा 2B) ।
  2. तुरंत पत्ती एक पेट्री डिश में ताजा 2ms तरल मीडिया के 10 मिलीलीटर पर अपाक्ष पक्ष के साथ प्लेस और थाली बंद । सीवी के लिए 15 पत्तियों को समायोजित कदम दोहराएँ. Désirée और 25 पत्ते एसएसपी के लिए. एकndigena (पत्ती के आकार पर निर्भर करता है) ।
  3. तुरंत एक. tumefaciens संस्कृति के ८० ΜL आयुध डिपो में६०० = ०.८ तरल मीडिया में जोड़ें और प्लेट मैंयुअल रूप से 1 मिनट के लिए बैक्टीरियल समाधान वितरित करने के लिए homogenize ।
  4. फिल्म सील, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर और 24 डिग्री सेल्सियस पर एक चैंबर में 2 दिनों के लिए सेते के लिए परिवर्तन होने जाने के साथ ध्यान से मुहर ।
  5. cim माध्यम (चित्रा 2b) के लिए अपाक्ष पक्ष रखने के पत्ते स्थानांतरण और एक सप्ताह के लिए उंहें एक वृद्धि कैबिनेट में सेने ।
    1. सीआईएम माध्यम को चिमटी से कुरेदना ताकि पत्तियों को बेहतर ढंग से मीडिया पर समायोजित किया जा सके ।
  6. स्थानांतरण सिम मध्यम (चित्र 2c) के लिए अपाक्ष पक्ष रखने और उंहें एक विकास कैबिनेट में सेते, हर 7-10 दिन मध्यम ताज़ा, जब तक शूटिंग के बारे में 2 सेमी लंबा कर रहे हैं ।
    1. सिम मीडियम को चिमटी से कुरेदना ताकि पत्ते पूरी तरह से मीडिया से घिरे रह सकें । जब उभरे हुए शूट ढक्कन तक पहुँचते हैं, तो लंबा पेट्री व्यंजन (१०० x 20 मिमी, ऊँचाई x व्यास) के साथ काम करते हैं ।
      नोट: कैलस सिम माध्यम में 2-3 सप्ताह (चित्र 2 डी) और 6-7 सप्ताह (चित्रा 2e) के बाद शूटिंग के बाद फार्म का होगा । गोली मारता है स्वतंत्र परिवर्तन की घटनाओं के रूप में माना जाएगा जब वे स्वतंत्र घावों से गठित घट्टा से उभरने ।
  7. कट तीन गोली मारता है प्रत्येक घट्टा से उभरा (एक ही परिवर्तन घटना माना जाता है) (चित्रा 2e), उंहें स्थानांतरित करने के साथ संस्कृति बोतल है मिलीग्राम सेफोटक्षिमे सोडियम के साथ पूरक [२५० मिलीग्राम/L] पक्ष की अनुमति के लिए, एक संख्या के साथ सबसेट लेबल और 3-4 सप्ताह के लिए एक वृद्धि कैबिनेट में सेते या जब तक शूटिंग जोरदार (चित्रा 2f) हैं ।
    नोट: जब शूटिंग काटने, अच्छी तरह से घटक हटाने अंयथा जड़ फार्म नहीं होगा ।
    1. चरण के रूप में कई बार स्वतंत्र पंक्तियाँ के रूप में की आवश्यकता है दोहराएँ । अप करने के लिए 5 अलग परिवर्तन घटनाओं 8 सेमी के एक व्यास के साथ एक संस्कृति फ्लास्क में रखा जा सकता है कि विभिन्न घटनाओं से पौधों मिश्रित नहीं कर रहे हैं पूर्ण विश्वास में काम करने के लिए ।
  8. प्रत्येक घटना के सबसे जोरदार संयंत्र का चयन करें, 3-4 internodes के साथ शूट के शीर्ष खंड में कटौती और यह एक नई संस्कृति कुप्पी में 2ms माध्यम सेफोटक्सिम सोडियम [२५० मिलीग्राम/L] के साथ पूरक के साथ जगह है ।
    नोट: 3-6 सप्ताह में संयंत्र कुशलता से विकसित होगा, एक जोरदार शूट और जड़ों का विकास ।
    1. कक्ष में वापस लाओ गैर चयनित शूटिंग जब तक संयंत्र का चयन पूरी तरह से विकसित किया है ।
  9. संयंत्र से स्टेम सेगमेंट में कम से एक इंटरनोड या पिकल बड के साथ काटें और उन्हें सेफोटक्सिम [२५० mg/L] के साथ नए 2MS मीडियम सप्लीमेंट में ट्रांसफर करें । उन्हें विकास मंत्रिमंडल में सेते हैं.
    1. प्रत्येक 3-4 सप्ताह को दोहराने के लिए इन विट्रो रूपांतरित लाइनों में स्थापित करने के लिए ।
      नोट: सेफोटक्षिमे सोडियम की जरूरत है कम से कम तीन में बाद में स्थानान्तरण 2ms मध्यम करने के लिए एक. tumefaciensको मारने के लिए सुनिश्चित हो; बाद में, अगर एक tumefaciens अतिवृद्धि मनाया जाता है, पौधों को फिर से 2ms सेफोटक्सिम सोडियम के साथ पूरक मीडिया के लिए स्थानांतरण ।
  10. संयंत्र phenotype की विशेषता के लिए, अपने पूर्ण लक्षण वर्णन या जड़ निरीक्षण के लिए हीड्रोपोनिक्स संस्कृति के लिए मिट्टी के लिए पौधों का हस्तांतरण ।
    1. मिट्टी में उत्पादित कंद का प्रचार करने और स्थापित लाइनों को बनाए रखने के लिए रखें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक. tumefaciensका उपयोग कर आलू बदल पौधों को प्राप्त करने के लिए समयरेखा । रूपांतरण प्रक्रिया के प्रत्येक चरण तक पहुँचने के लिए संचयी सप्ताहों और पौधों को उगाने के लिए अनुवर्ती चरण दिखाए जाते हैं. विभिंन चरणों के प्रतिनिधि छवियां चित्रित कर रहे हैं: 3 से पत्तियों का उपयोग कर प्रक्रिया की दीक्षा विट्रो पौधों में सप्ताह पुराने (), घायल और संक्रमित पत्तियों के cim मीडिया के लिए स्थानांतरण (), पत्तियों जब स्थानांतरित करने के लिए सिम मीडिया (सी), सिम मीडिया (डी) में 2-3 सप्ताह के बाद घायल क्षेत्रों के आसपास घटक के दृश्य, सिम मीडिया में 9-11 सप्ताह () के बाद शूट गठन, और शूटिंग के बाद एमजी मीडिया (एफ) को हस्तांतरित किया जा रहा है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

5. हाइड्रोपोनिक कल्चर

  1. एक 10 एल बाल्टी में एक आधा शक्ति (0.5 x) (तालिका S2) के लिए होगलैंड समाधान तैयार करें ।
  2. समामेती और उचित ऑक्सीजन की स्थिति को बनाए रखने के लिए एक मछलीघर पंप विसर्जित कर दिया ।
  3. डार्क स्थितियों में जड़ों को विकसित करने के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ बाल्टी की दीवारों को कवर ।
  4. जड़ नुकसान से बचना, विट्रो पौधों में hydroponic संस्कृति के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: पानी में डूबे जड़ों को ध्यान से मिलाते हुए ऊष्मायन के दौरान सूक्ष्मजीव प्रसार से बचने के लिए जड़ों से विट्रो माध्यम में किसी भी शेष को हटा दें ।
  5. एक glouse की तरह पारदर्शी फिल्म के साथ पौधों को कवर करने के लिए पर्याप्त acclimatization और बढ़ चैंबर में सेते अनुमति देते हैं ।
  6. 3 दिन के बाद फिल्म में छेद करें और इसे पूरी तरह से एक हफ्ते बाद हटा दें ।
  7. हर 10 दिन में ताज़ा मीडिया से बदलें ।

6. गस ऊतक-रसायन रिपोर्टर जीन परख

नोट: हमारे मामले में गस विश्लेषण 2-3 हीड्रोपोनिक्स या विट्रोमें उगाया सप्ताह की जड़ों के साथ प्रदर्शन किया था ।

  1. ९०% ठंडा एसीटोन के साथ जड़ों को ठीक (v/v) और यह बर्फ पर 20 मिनट के लिए सेते ।
  2. डिस्टिल्ड वॉटर के साथ दो धुलाई करते हैं ।
  3. ताजा गस धुंधला समाधान (तालिका 1) जोड़ें और वैक्यूम (-७० फिलीस्तीनी अथॉरिटी) 20 मिनट के लिए लागू होते हैं ।
  4. 4 ज के लिए सहज गस की रक्षा के लिए अंधेरे में ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते या जब तक एक नीला रंग दिखाई देता है ।
    नोट: गुस विलयन में फेरी-एण्ड फेरोसाइनाइड की उपस्थिति अभिक्रिया उत्पादों के विसरण को कम करती है तथा अधिक सटीक स्थानीयकरण उपलब्ध कराती है ।
    चेतावनी: एक धूआं हुड का प्रयोग करें और गस समाधान में विषाक्त साइनाइड डेरिवेटिव हैंडलिंग जब सुरक्षात्मक कपड़े पहनते हैं (पोटेशियम फ्रीसायनाइड और पोटेशियम फेरोसाइनाइड) । गस सब्सट्रेट और निपटान सामग्री सुरक्षित रूप से निपटा जाना चाहिए ।
  5. गस धुंधला समाधान निकालें और उपयुक्त कंटेनरों में इसे छोड़ दें ।
  6. इथेनॉल ७०% (v/v) के साथ दो धोने प्रदर्शन ।
  7. एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण ।
    नोट: गस धुंधला कुछ हफ्तों के लिए स्थिर है; हालांकि, पहले सप्ताह के दौरान, गस सिग्नल स्पष्ट और पड़ोसी कोशिकाओं में कम diffuses है । लंबे समय तक भंडारण के लिए, ट्यूब सील और 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।

Table 1
तालिका 1: गस धुंधला समाधान नुस्खा ।

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Representative Results

एगरोबैक्टीरियम रिजोजेनिज़ -mediated आलू परिवर्तन

इस पांडुलिपि में, कदम दर कदम प्रक्रिया एक. rhizogenes के साथ बदल जड़ प्राप्त करने के लिए स्थापित किया है । चित्रा 1 प्रक्रिया है, जो पूरी तरह से लगभग 5-6 सप्ताह लेता है के एक सिंहावलोकन प्रस्तुत करता है ( एक. rhizogenes के इंजेक्शन से पूरी तरह से विकसित बालों की जड़ों को प्राप्त करने के लिए) । फिर, संयंत्र एक संयुक्त (जंगली प्रकार शूट, ट्रांसजेनिक रूट) या ट्रांसजेनिक बालों की जड़ क्लोन के रूप में अध्ययन किया जा सकता है और उत्तेजित किया जा सकता है ठोस Gamborg B5 मध्यम 2% sucrose साथ पूरक में स्वायत्त । वैकल्पिक रूप से, बालों की जड़ों बड़े पैमाने पर तरल Gamborg B5 मीडिया का उपयोग कर प्रचारित किया जा सकता है । प्रस्तुत की गई प्रक्रिया को एस. ट्यूगोसम spp. ट्यूरोसम (Cv. désirée) के साथ किया गया है ।

प्रक्रिया की निगरानी करने के लिए और आलू ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों को प्राप्त करने के लिए विधि एक परिवर्तन मार्कर के रूप में DsRed के साथ एक द्विआधारी सदिश का उपयोग कर मान्य किया गया है (PK7GWIWG2_II-VIB-विश्वविद्यालय में संयंत्र प्रणाली जीव विज्ञान विभाग से RedRoot). यह लाल प्रतिदीप्ति द्वारा गैर ट्रांसजेनिक से ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों के भेद की अनुमति दी । उस के अनुसार, चित्रा 3 में तब्दील बालों की जड़ों लाल प्रतिदीप्ति जब हरी प्रकाश के साथ प्रबुद्ध का प्रदर्शन किया । अरूपान्तरित एगरोबैक्टीरियम का उपयोग करते हुए ऋणात्मक नियंत्रण में कोई लाल प्रतिदीप्ति (चित्र 3c), समग्र रूप से ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों की पहचान करने के लिए dsred परिवर्तक मार्कर की उपयुक्तता को दर्शाया गया है (चित्र 3d) । अंय परिवर्तन मार्कर जैसे एंटीबायोटिक प्रतिरोध के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता अंय लेखकों द्वारा वर्णित23,24; हालांकि, मीडिया में एंटीबायोटिक्स मार्कर से युक्त ट्रांसजेनिक जड़ों में वृद्धि की देरी का उत्पादन कर सकते हैं ।

Figure 3
चित्रा 3: आलू की फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों (cv. Désirée) ए. rhizogenesद्वारा बदल दिया । बालों की जड़ों को एक गैर परिवर्तित ए. rhizogenes (तनाव C58C1: pRI1583) (और सी) और के साथ एक. rhizogenes (तनाव C58C1: pRI1583) का उपयोग कर प्राप्त किए गए खाली वेक्टर pK7GWIWG2_II-लाल जड़ एक ले जाने के साथ DsRed परिवर्तन मार्कर (बी और डी) । बालों की जड़ों दोनों संक्रमण (ए, बी) में बनते हैं, लेकिन लाल प्रतिदीप्ति केवल बालों की जड़ों में मनाया जाता है एक. rhizogenes युक्त द्विआधारी सदिश के साथ बदल दिया । छवियों के साथ लिया गया एक stereomicroscope एक दीपक और एक विशिष्ट फिल्टर के साथ सुसज्जित करने के लिए लाल प्रतिदीप्ति कल्पना । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एगरोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स -mediated आलू परिवर्तन

इस पांडुलिपि में वर्णित दूसरे प्रोटोकॉल को प्राप्त करने के लिए स्थापित है, कदम दर कदम, एक पूरा आलू एक. tumefaciensके साथ बदल संयंत्र । चित्रा 2 प्रक्रिया है, जो पूरी तरह से 15-18 सप्ताह के बीच लेता है के एक सिंहावलोकन प्रस्तुत करता है (पत्ती संक्रमण से एक. tumefaciens के साथ पूरी तरह से पुनर्जीवित पौधों को प्राप्त करने के लिए) । प्रक्रिया का सबसे अधिक समय लेने वाला हिस्सा organogenesis द्वारा संयंत्र उत्थान है । इस विशेष कदम इस विधि एक. rhizogenesका उपयोग करने से अधिक श्रमसाध्य बनाता है । यह प्रक्रिया एस. ट्यूमोसम एसपीपी. ट्यूरोसम (Cv. désirée) और एस. ट्यूरोसम एसएसपी. एंडिजेनाके साथ की गई है, जो कम दिन के लिए ट्यूमराइजेशन को प्रेरित करने पर निर्भर है

एक. tumefaciens-मध्यस्थता परिवर्तन में, एक. rhizogenes-मध्यस्थता परिवर्तन के विपरीत, पुनर्जीवित पौधों पूरी तरह से ट्रांसजेनिक जीवों रहे हैं । हालांकि, हालांकि ट्रांसजेनिक पौधों एक kanamycin चयनात्मक मीडिया में पुनर्जीवित कर रहे हैं, नहीं सभी लाइनों कुशलता से ट्रांसजेनिक व्यक्त करते हैं । इसलिए, transgene अभिव्यक्ति की मांयता की जरूरत है ।

का उपयोग कर प्राप्त जड़ों में FHT प्रमोटर गतिविधि की तुलना a. ट्यूमेफेशियन्स और ए. रिजोजन्स

aforementioned प्रक्रियाओं Fht जीन के प्रवर्तक के तहत गस जीन व्यक्त जड़ों का उत्पादन करने के लिए लागू किया गया । एक. tumefaciens के साथ पूरा बदल पौधों पहले15की सूचना दी थी, बाइनरी वेक्टर युक्त fht प्रमोटर pKGWFS7 का उपयोग कर । अब, इस द्विआधारी सदिश का प्रयोग किया गया है नए रूपान्तरित बालों की जड़ों के ऊतकों की तुलना करने के लिए जहां प्रवर्तक सक्रिय है और इसलिए प्रमोटर सक्रियण का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में बालों की जड़ प्रणाली का परीक्षण करने के लिए ।

चित्रा 4 एक . tumefaciens द्वारा प्राप्त ट्रांसजेनिक पौधों (चित्र4 ए, बी) और ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों से प्राप्त एक. rhizogenes (चित्रा 4c, डी, ई, एफ) के जड़ों में धुंधला दाग दिखाता है, क्रमशः. के रूप में देखा जा सकता है, जड़ें एक. tumefaciens के साथ तब्दील हो और विट्रो में विकसित की endodermis में नीले धुंधला दिखाना (चित्र 4a), प्रांतस्था और stele के बीच एक सेल परत । अधिक विकसित जड़ों में, ब्लू लेबलिंग बाह्य परत (चित्रा 4B) के लिए इसी बाहरी स्तर में बद है । में बदल बालों वाली जड़ों हीड्रोपोनिक्स में हो, गस मार्कर विशेष रूप से endodermis में स्थित था (चित्रा 4C, ई), पार्श्व जड़ों के उद्भव में(चित्रा 4c, ई), घायल क्षेत्रों में (चित्रा 4c ) और exodermis में (चित्रा 4f) । जड़ों को नकारात्मक नियंत्रण में कोई गस दाग है कि या तो Promfht बिना बालों की जड़ें: गस टी डीएनए कैसेट या जंगली प्रकार की जड़ें दिखाई ।

Figure 4
चित्र 4: ट्रांसजेनिक आलू की जड़ों का हिस्टोकेमिकल प्रेक्षण, एफएचटीके प्रवर्तक द्वारा संचालित गस रिपोर्टर जीन को अभिव्यक्त करता है । संपूर्ण ट्रांसजेनिक पौधों से जड़ें एक. tumefaciens (एस. ट्यूमोसम ssp. एंडिजेना) ट्रांस्फ़ॉर्मेशन (a-B), एंडोडर्मिस (a) और exodermis (b) में नीले रंग के दाग दिखाती हैं । ट्रांसजेनिक बालों की जड़ें एक. rhizogenes (एस. ट्यूमोसम ssp. ट्यूमोसम सीवी. désirée) ट्रांस्फ़ॉर्मेशन (c-F) के प्रदर्शन गस धुंधला में एंडोडर्मिस (सी और), पार्श्व रूट में उद्भव (डी और), घाव-चिकित्सा क्षेत्र में () और exodermis (एफ) में । Endodermis (EN); Exodermis (उदा.); Xylem (एक्स्ट्रा लार्ज); पार्श्विक मूल (एलआर) का प्रिमोर्डिया. लाल तीर घायल क्षेत्र को इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका S1: मीडिया व्यंजनों बैक्टीरिया और विट्रो पौधों में बढ़ रही के लिए इस्तेमाल किया ।  कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें

तालिका S2: hydroponics में बढ़ रही आलू के पौधों के लिए आधा शक्ति Hoagland समाधान । कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

आलू में, स्थिर पूर्ण ट्रांसजेनिक पौधों को प्राप्त करने के लिए सबसे आम प्रणाली एगरोबैक्टीरियम tumefaciens उपभेदों द्वारा परिवर्तन का उपयोग करता है कि बहिर्जात phytoहार्मोन्स का उपयोग कर ऑर्गेनोजेनेसिस की आवश्यकता होती है. यद्यपि एगरोबैक्टीरियम आधारित प्रोटोकॉल्स में गैर-टी-डीएनए वेक्टर अनुक्रम25को एकीकृत करने की क्षमता है, इस पद्धति में आलू के पौधों को बदलने के लिए अभी भी सबसे आसान और कम खर्चीला उपलब्ध है । पिछले वर्षों के दौरान, एक rhizogenesमें रुचि-मध्यस्थता परिवर्तन शोधकर्ताओं का ध्यान एक tumefaciensका उपयोग करने से कम समय में ट्रांसजेनिक जड़ों को प्राप्त करने की अनुमति के लिए मिल गया है. ए rhizogenes अभी भी जड़-inducing (आरआई) प्लाज्मिड कि phytohormone ऑक्सिन नियंत्रण और सायटोकायनिन biosynthesis के लिए एंजाइम एंकोडिंग जीन का एक सेट किया जाता है, और जरिए26के लिए एंकोडिंग को बरकरार रखता है । एक बार जब आरआई टी डीएनए मेजबान जीनोमिक डीएनए में डाला जाता है, नई हार्मोनल संतुलन विनियमन जड़ों proliferating, बालों की जड़ों कहा जाता है, संक्रमण के अंक में उभर के गठन उत्प्रेरण कोशिकाओं27। जब एक विदेशी डीएनए को एकीकृत करने के लिए एक अतिरिक्त द्विआधारी सदिश का उपयोग किया जाता है, आरआई प्लाज्मिड के संरक्षण संभावना प्रदान करता है के लिए एक exogenously लागू phytohormones का उपयोग कर ऑर्गेनोजेनेसिस की कोई जरूरत नहीं के साथ बदल बालों वाली जड़ों28। बालों की जड़ों जंगली प्रकार एक समग्र संयंत्र पैदा गोली मार से जुड़ी बनाए रखा जा सकता है या आत्म प्रचारित किया जा सकता है । बालों की जड़ों की यह क्षमता स्वयं को प्रचारित करने के लिए कई पौधों में उत्पादन के लिए शोषण किया जा रहा है बालों की जड़ों के लिए एक जैविक प्रणाली के रूप में बड़े पैमाने पर उत्पादन मूल्यवान चयापचयों या विदेशी प्रोटीन, औषध विज्ञान और यहां तक कि phytoremediation क्षेत्रों में हितों का सृजन ( समीक्षा के लिए देखें29,30) । आलू (प्रि. कुफरी बहार) में ट्रांसजेनिक पूर्ण पौधे जंगली टाइप ए से संक्रमित थे । rhizogenes तनाव बालों की जड़ों का उत्पादन करने के लिए हेपेटाइटिस बी सतह एंटीजन (HBsAg) व्यक्त23। वैकल्पिक रूप से, एक पूर्ण ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों से पुनर्जीवित संयंत्र प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन आलू संयंत्र और कंद untransformed नियंत्रण की तुलना में विशिष्ट विकास दिखाया । phenotype में इन मतभेदों के कारण मूल आरआई टी डीएनए जीनोम31,३२के भीतर एकीकृत कर रहे हैं ।

इस कार्य में, ट्रांसजेनिक स्थिर बालों की जड़ों को प्राप्त करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं a. rhizogenes और ट्रांसजेनिक स्थिर पौधों का उपयोग करते हुए एक. tumefaciens का प्रयोग करके प्रस्तुत की जाती हैं (चित्र 1 और चित्र 2) । पूरी तरह से विकसित ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों 5-6 सप्ताह में प्राप्त किया गया, जबकि ट्रांसजेनिक जड़ों का उपयोग कर एक. tumefaciens बदल कोशिकाओं से ऑर्गेनोजेनेसिस की आवश्यकता के कारण 15-18 सप्ताह की जरूरत है, और चयन और परिवर्तित पौधों का प्रचार । हमारे हाथों में, ए tumefaciens परिवर्तन प्रक्रिया एस में कुशलता से काम करता है । ट्यूरोसम ssp . एंडिजेना और एसएसपी. ट्यूमोसम (cv. désirée), के साथ एक रिपोर्ट परिवर्तन दक्षता के आसपास ३५%22 और ४८% 12, क्रमशः । वर्णित एक. rhizogenes परिवर्तन प्रक्रिया है कि हॉर्न7, जो एक उच्च दिखाया द्वारा रिपोर्ट पर आधारित है (80-100%) सीवी में रूपांतरण क्षमता. Désirée और अन्य तीन आलू की खेती (अलफारोस, सबीना और सत्राना).

एक. rhizogenes आलू कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक परिवर्तन प्रणाली के रूप में पेश करने के लिए और यह इंगित करने के लिए कि क्या आरआई टी डीएनए की प्रारंभिक उपस्थिति चिंता का विषय था, हम दोनों प्रणालियों का इस्तेमाल किया एक ही द्विआधारी सदिश के साथ आलू की जड़ों को बदलने के लिए कि एक सुबेरिन जैव सिंथेटिक जीन (fht) गस रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति ड्राइविंग के एक प्रमोटर के साथ एक टी डीएनए निहित । ऊतक-रसायन विश्लेषण से पता चला कि एक. tumefaciens में बदल पौधों, fht प्रमोटर की गतिविधि जड़ों की भीतरी और बाहरी suberized परतों में था (endodermis और exodermis, क्रमशः) (चित्र 4a,B ) और यह भी पत्ती, स्टेम और कंद के घायल क्षेत्रों में15एक. rhizogenes बालों की जड़ों में बदल गया, गतिविधि भी endodermis और exodermis में और घायल जड़ क्षेत्रों में पाया गया था (चित्रा 4e) । दोनों प्रकार की रूपांतरित जड़ों में सुबाइन प्रवर्तक गतिविधि की सह-घटना यह दर्शाती है कि आरआई इंटीग्रेटेड टी-डीएनए इन मूल ऊतकों में कम से उपलीकरण से संबंधित विकासात्मक प्रक्रियाओं को प्रभावित नहीं कर रहा है । बदल बालों वाली जड़ों में हम भी पार्श्व जड़ों के उद्भव (चित्रा 4D,) के आसपास के क्षेत्रों में fht प्रमोटर की गतिविधि का पता चला । यह ABCG11/WBC11३३,३४,३५,३६ या नियामक के रूप में सुबेरिन मोनोमर के परिवहन में शामिल अन्य जीन द्वारा सूचित प्रमोटर गतिविधि के साथ सहमत हैं StNAC103 19. एक सुबेरिन जीन का अध्ययन करने के लिए एक. rhizogenes द्वारा आलू परिवर्तन पहले से ही हाल ही में३७ और यह भी है कि मामले में बालों की जड़ों को CYP86A33, एक फैटी एसिड के प्रमोटर सक्रियण दिखाने की अनुमति दी गई है की सूचना दी गई है ω-hydroxylase. हालांकि, जड़ों में धुंधला गस एक फ्लोरोमेट्रिक परख का उपयोग कर मात्रा मात्रा निर्धारित था, इसलिए suberized ऊतकों में विशिष्ट अभिव्यक्ति ही माना गया था ।

कुल मिलाकर ये परिणाम प्रमाण है कि ए. rhizogenes परिवर्तन एक तेजी से वैकल्पिक उपकरण के लिए सेल प्रकार-जड़ों में suberin से संबंधित जीन है, जो अंय प्रक्रियाओं के आधार पर अध्ययन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है की विशिष्ट प्रमोटर सक्रियण का पता लगाने है कि जड़ों में होते हैं । समझौते में, कुछ अन्य कार्यात्मक आनुवंशिक अध्ययन में आलू, टमाटर और नीलगिरी में एक. rhizogenes का उपयोग करने में सफल रहा है जीन समारोह का प्रदर्शन करने के लिए6,7,8,9, अध्ययन करने के लिए हार्मोनल प्रतिक्रिया३८,३९ या प्रमोटर गतिविधि४०,४१। हालांकि, इस रणनीति अभी भी सीमाओं, विशेष रूप से जब कड़ाई से नियंत्रित विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन है कि आरआई टी डीएनए द्वारा विनियमित किया जा सकता है या जब पूरे संयंत्र या कंद या अंय जड़ों से अलग अंगों का अध्ययन किया जाना चाहते हो सकता है । इन स्थितियों में, एक tumefaciens परिवर्तन प्रणाली अभी भी पसंद है ।

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई विरोध प्रकट करना है.

Acknowledgments

यह काम Ministerio डी Innovación वाई Ciencia द्वारा समर्थित (AGL2009-13745, FPI अनुदान पंजाब के लिए), Ministerio डी Economía वाई Competitividad और FEDER धन (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R), और Girona विश्वविद्यालय (एस एफ के लिए पीएचडी अनुदान, और अनुदान SING11/1). लेखक डॉ ईंगे Broer के लिए आभारी है (भूमि उपयोग के लिए संस्थान, रोस्टॉक विश्वविद्यालय, रोस्टॉक, जर्मनी) और डॉ Salomé Prat (सेंरो Nacional डे Biotecnología, मैड्रिड, स्पेन) एक. rhizogenes और एक. tumefaciens तनाव प्रदान करने के लिए, क्रमशः, और डॉ. Marçal Soler और डॉ अन्ना Plasencia मदद और सहायता के लिए एक. rhizogenes परिवर्तन प्रयोगों (टूलूज़ III पॉल Sabatier विश्वविद्यालय-Cnrs, संयंत्र अनुसंधान प्रयोगशाला (LRSV), Castanet Tolosan, शुरू करने में प्राप्त समर्थन के लिए फ्रांस) । लेखक सारा Gómez (Departament डे Biologia, UdG, Girona) धंयवाद प्रयोगशाला काम ले जाने और पौधों की देखभाल में उसे मूल्यवान सहायता के लिए, और Ferran Fontdecaba और कार्ला Sánchez जो प्रयोगों में से कुछ के साथ मदद की है जबकि वे कर रहे थे उनकी अंतिम डिग्री परियोजनाओं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Acetone

Panreac

1.310.071.21

Acetosyringone

Acros

115540050

Aquarium pump

Prodac

MP350

Autoclave

Ragpa Strelimatic

Bacteriological agar

Lab Conda

1800

BAP

Duchefa

B0904

Beef extract

Lab Conda

1700

Plant growing cabinet

Nuaire

Carbenicillin

Duchefa

C0109

Cefotaxime sodium

Duchefa

C0111

DMSO

Merck

1029310161

Ecotron infors

HT

29378

Ethanol

Merck

1,009,831,011

Falcon tube

Control tecnica

CFT011500

Ferricyanate

Sigma

101001081

Ferrocyanate

Sigma

100979088

Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture

Apiglass

ref16

GA3

Sigma

G7645

Gamborg B5 media

Duchefa

G0210

Gelrite

Duchefa

G1101

Glucosa

Sigma

G5767

Kanamycin

Sigma

K1377

Leukopor tape

BSN Leukopor

BDF47467

Lupe

Wild-Heerbrugg

M420

Magnetic shaker

Agimatic

7000243

MES hydrate

Sigma

M2933-25G

MgSO4

Panreac

131404

Microscope

Olympus

Minufugue centrifugue 5415R

Eppendorf

Murashige and Skoog media

Duchefa

M0254.0050

Na2HPO4

Panreac

131679

NAA

Duchefa

N0903

NaCl

Panreac

131659

NaH2PO4

Sigma

58282

NightSea Stereo

SFA Moonting Adapter

Parafilm

Anorsa

PRFL-001-001

Peptone

Lab Conda

1616

Petri dishes (90 x 14)

Anorsa

200200

pHmetre

Crison

Phytotron

Inkoa

RFTI-R5485

Plant Agar

Duchefa

P1001

Refrigeratot

Liebherr Medline

Rifampicin

Duchefa

R0146

Spectinomycin

Sigma

59007

Spectrophotometer

Shimadzu

Square plates (120 x 120)

Deltalab

200204

Streptomycin

Sigma

S6501

Sucrose

Panreac

131621

Surgical blades

Swann-Morton

201

Surgical needle

NIPRO

015/0204

Triptone

Lab Conda

1612

Triton

Serva

37240

Unimax 1010 shaker

Heidolph

Vacuum

Dinko

x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)

Biosynth

B-7398

Yeast extract

Lab Conda

1702.00

Zeatin riboside

Sigma

1001042850

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References

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