환경 샘플에서 높은 처리량 Siderophore 심사: 식물 조직, 대량 토양, 및 Rhizosphere 토양

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Summary

우리는 지구 시스템에서 미 량 영양소 bioavailability 및 매출에 기여 하는 siderophore 잠재적인 환경 샘플의 신속한 심사에 대 한 프로토콜을 제시.

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Lewis, R. W., Islam, A. A., Dilla-Ermita, C. J., Hulbert, S. H., Sullivan, T. S. High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils. J. Vis. Exp. (144), e59137, doi:10.3791/59137 (2019).

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Abstract

Siderophores (저 분자 무게 금속 화합물을 킬레이트 화) 병원 체 경쟁, 식물 성장 촉진, 그리고 크로스 왕국 신호를 토양에 철 (Fe) 생물 지구 화학적 순환에서 배열 하는 다양 한 생태 현상에 중요 하다. 또한, siderophores bioleaching 및 베어링 금속 광물 및 광 석의 bioweathering에 상업적인 관심 있습니다. 양적 평가에서 복잡 한 샘플 siderophore 생산의 급속 한, 비용 효과적이 고 강력한 수단 siderophore 활동을 포함 하 여, 소설 siderophore 생산 하는 미생물의 생태 파급 효과의 중요 한 측면을 식별 하는 키입니다. 여기에 제시 된 방법 siderophore 토양 또는 식물 조직 같은 환경 샘플에서 전술에 미생물 커뮤니티의 활동을 평가 하기 위해 개발 되었다. 샘플 했다 균질 하 고 (Fe), 없이 수정 된 M9 매체에 희석 농축 문화 3 일 동안 알을 품을 했다. Siderophore 생산에 24, 48, 및 72 시간 (h) 소설 96 잘 microplate CAS (크롬 azurol 성의)를 사용 하 여 샘플에 평가 되었다-Fe agar 분석 결과, siderophore 평가의 전통적으로 지루하고 시간이 많이 걸리는 색도계 방법의 적응 활동, 개별 재배 미생물 분리에 수행입니다. 우리 밀 (Triticum aestivum L.)의 4 가지 genotypes/라인, Lewjain, PI561725, 매드 슨, 그리고 내륙 평화로운 북 서에서 일반적으로 성장 하는 PI561727를 포함 하 여 우리의 방법을 적용. Siderophore 생산은 명확 하 게 밀, 및 식물 조직 관찰의 특정 종류는 유전자 형에 의해 영향을. 우리는 성공적으로 빠르게 siderophore 생산, 지상파와 수생 생태계에 핵심 기능 식물 유전자의 영향에 대 한 화면을 우리의 방법 사용. 우리는 매우 신뢰할 수 있는 통계적 차이가 토양 및 식물 조직 내의 저조한 많은 기술 복제, 제작. 중요 한 것은, 결과 보여 빠르게 taxa 및 기능성 유전자를 확인 후 작업 보존 사회를 허용 하는 방식으로 신뢰성의 높은 학위를 가진 복잡 한 샘플에서 siderophore 생산을 검토 하는 제안 된 메서드를 사용할 수 있습니다.

Introduction

Siderophores는 중요 한 생체 철 chelation bioavailability, 하지만 다양 한 미생물 쿼럼 감지, 미생물 공장-호스트, 신호에서 배열 하는 지상파와 수생 생태계에 추가적인 목적에 주로 관여 식물 성장 촉진, 협력 및 복잡 한 미생물 지역 사회1,2내 경쟁. Siderophores 분류할 수 있습니다 광범위 하 게 그들의 활성 사이트 및 구조 기능, 4 개의 기본 형식 만들기: 카복실산, hydroxamate, catecholate, 및 종류3,4혼합. 많은 미생물 검출 한 종류 이상의 siderophore5 및 복잡 한 사회, 생물 biosynthesize의 대부분에서에서 막 수용 체 siderophores1의 더 넓은 다양 한의 통풍 관을 허용 하도록 할 수 있다 6. 최근 작품이 나타냅니다 siderophores는 특히 중요 한 지역 사회 수준에 남북 왕국 통신 및 생물 지구 화학적 전송7,,89,10에도 ,11.

크롬 azurol 반발 (CA) 사용 되었습니다 chelating 요원으로 30 년 이상 철 (Fe)에 바인딩할 CAS Fe 복잡 한 매체에 쉽게 식별 색상 변화를 만들기의 분리에 ligands (즉, siderophores)의 추가 발생할 수 있습니다 같은 방법으로 12. 때에 CAS Fe와 바인딩되어, 염료 로얄 블루 색상으로 나타납니다 및 CAS Fe 복잡 한 분리, 매체 Fe13를 청소 하는 데 사용 하는 리간드의 종류에 따라 색상 변경. 1987 년, Schwyn 및 Neilands에 의해 설립 초기, 액체 기반 매체 미생물 대상14, 성장 습관과 제한15, 뿐만 아니라 금속 철, 외의 다양 한 변화를 수용 하기 위해 여러 가지에서 수정 되었습니다 포함 하 여 알루미늄, 망간, 코발트, 니켈 카드뮴, 리튬, 아연16, 구리17, 그리고 심지어 비소18.

많은 인간 병원 체, 뿐만 아니라 식물 성장 촉진 미생물 (PGPM)로 확인 되었습니다 siderophore 생산 생물3,,1920및 중요 한 rhizosphere와 종종 테스트 endophytic PGPM 긍정적인 siderophore 생산4. 전통적인 철 기반 액체 방법은 결정 격리 재배 siderophore 생산21의 테스트에 적응 되었습니다. 그러나, 이러한 기술을 전체 (미생물), 협력에 미생물 커뮤니티의 중요성 및 토양 및 식물 시스템22siderophore 생산의 잠재적인 규칙을 인식 하지. 그 이유로, 우리는 siderophore 생산 기반으로 전통적인 CAS 분석 결과, 하지만 복제, 측정, 안정성 및 반복성을 microplate에의 용이성, 주어진된 환경에서의 높은 처리량 커뮤니티 수준 평가 개발 분석 결과입니다.

이 연구에서는 siderophore 생산을 탐지 하기 위한 비용, 높은 처리량 CAS Fe 시험 siderophore 생산에서 복잡 한 샘플 (즉, 토양 및 식물 조직 homogenates)의 농축을 평가 하기 위해 제공 됩니다. 대량, 느슨하게 연결, 그리고 엄격 하 게 바인딩된 rhizosphere 토양 조건 (어떻게 토양 루트 였던) 곡물, 촬영, 및 4 개의 뚜렷한 밀 (Triticum aestivum L.) genotypes에서 루트 조직 취득 했다: Lewjain, 매드 슨, PI561725, 그리고 PI561727입니다. 그것은 밀 genotypes 근본적인 차이 모집 및 다양 한 커뮤니티를 생산 하는 siderophore에 차이가 발생할 수 있다는 가설 했다. 특정 관심의 이다 미생물 지역 사회는 관대 알루미늄 ALMT1 (Malate 전송 1 알루미늄 활성화)를가지고 있기 때문에, PI561725 isogenic 선, 연관의 차이와 비교 알루미늄 중요 한 PI561727 isogenic 선, 유전자, almt123,,2425,26의 비-알루미늄 반응 형태를 소유 하는. 연구의 주요 목적은 미래의 일에 대 한 문화를 유지 하면서 복잡 한 샘플 형식의 siderophore 농축 문화에서 siderophore 생산 양적 평가의 간단한, 빠른 방법 개발 했다.

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Protocol

참고: 필드 사이트의 위치: 워싱턴 주립 대학, 식물 병 리 농장 (46 ° 46'38.0 "N 117 ° 04'57.4" W). 씨앗은 기계적인 화분을 사용 하 여 10 월 19 일, 2017에 뿌린 씨. 각 밀 유전자 headrows, 대략 1 미터 떨어져 루트 시스템의 중복을 피하기 위해 심은 했다. 식물 및 토양 샘플 2018 년 8 월 9 일 때 식물은 추수에 대 한 준비에 수집 되었다. 샘플 4 밀 genotypes의 3 개의 복제에서 모았다: PI561727, PI561725, 매드 슨, Lewjain.

1입니다. 수정 된 M9 매체의 준비

  1. 사용 나24∙7H2O (12.8 g/200 mL), KH24 (0.3 g/200 mL), M9 소금 솔루션 준비에 NaCl (0.5 g/200 mL), 및 NH4Cl (1 g/20 mL) 시 약.
  2. 이중 이온된 수 (ddH2O) 100 mL에 MgSO4∙7H2O의 18 g를 사용 하 여 준비 0.75 M MgSO4∙7H2o.
  3. CaCl2∙2H2O의 1 M ddH2o.의 100 mL와 CaCl2∙2H2O의 14.7 g를 추가 하 여 확인
  4. DdH2O 감동과 156 mL으로 파이프의 6.048 g을 용 해 하 여 버퍼 솔루션을 준비 합니다. 5 M NaOH와 6.8에 pH를 조정 합니다.
  5. DdH2o.의 100 mL으로 포도 당의 20 g을 용 해 하 여 20% 포도 당 (포도 당 monohydrate)를 준비
  6. 모든 압력솥 하지만 포도 당 개별적으로 솔루션을 준비 합니다. 필터 소독 압력가 마로 소독 (0.22 μ m) 후 M9 미디어에 추가 위한 포도 당 솔루션.
  7. 파이프 버퍼 솔루션, M9 소금 솔루션의 40 mL, CaCl2·2H2O 솔루션의 20 μ의 156 mL, MgSO4·7H2O, 266 μ는 biosafety에 함께 20% 포도 당 솔루션의 4 mL를 혼합 하 여 수정 된 M9 매체 준비 캐비닛, 사용 무 균 기법입니다.
  8. 수정 된 m 9의 보존에 대 한 컨테이너를 밀봉, 커버, 자외선 으로부터 보호 하기 위해 4 ° c.에 알루미늄 호 일

2. CA-Fe-한 천 매체의 준비

  1. 산은 CAS 분석 결과 활용 이전 2 h의 최소 100 m m HCl/100 m m HNO3 모든 유리 세척.
  2. 알루미늄 베이킹 팬을 실험실 급료 모래 가득 준비와 알루미늄 호 일로 다룹니다. 30 분을 정해 121 ° C에 고압.
  3. 20 mL ddH2O 0.0365 g을 추가 하 여 HDTMA (hexadecyltrimethylammonium 브 로마 이드)를 준비 하 고 가용 화를 촉진 하는 37 ° C에서 솔루션을 배치.
  4. 10 m m HCl을 준비 하 고 1mm FeCl3·6H2O 10 m m HCl 용 매로 사용 하 여 생성. 메 마른 자기 볶음 바도 부드럽게 저 어 하는 동안 CA의 0.0302 g ddH2O 25 mL를 추가 합니다. 계속 부드럽게 (어두운 붉은 검은 색으로 솔루션 회전)을 저 어 하는 동안 CA 솔루션의 25 mL를 1 m m FeCl3·6H2O (10 m m HCl)의 5 mL를 추가 합니다.
  5. 천천히 부드럽게 교 반 (이 어두운 블루 솔루션 생성) Fe-CA 솔루션으로 하는 동안 HDTMA 솔루션의 20 mL를 추가 합니다.
  6. 375 mL ddH2O, 부드러운 교 반으로 파이프의 15.12 g을 용 해 하 여 버퍼 솔루션을 준비 합니다. 5 M NaOH와 6.8에 pH를 조정 합니다. 450 mL를 볼륨을가지고 물을 추가 합니다. Agarose의 5 g을 솔루션에 추가 합니다. 고압 파이프 솔루션 및 CAS Fe 솔루션 30 분 동안 121 ° C에서 버퍼.
  7. 신중 하 게 그들의 각각은 압력가 마로 소독 후 CA Fe 솔루션의 전체 biosafety 내각에서 파이프 버퍼의 전체에 추가 합니다.
  8. 50 ° c.에 물 욕조에 혼합된 솔루션 배치
    참고: 갓 응고 매체에 CAS-Fe, 복잡 하 고 냉각 결과의 강 수에서 50 ° C 결과에 장기 저장으로 각 시험 전에 CAS-Fe-한 천 매체에서 모든 시 약을 준비 합니다.
  9. Biosafety 내각에서 메 마른 모래와 50 ° c 열 멸 균 시 보트를 배치 보트, 분명, 평면-바닥, 살 균 96 잘 microplate에 각 음을 신속 하 게 aliquot 100 µ L를 CA-Fe-Agar를 전송 합니다.

3. Pyoverdine/EDTA 표준 준비

  1. Pyoverdine 준비
    1. 800 μ M pyoverdine 표준 준비 (호박 산, 2-hydroxy glutaramide, 및 pyoverdine-succinaminde 형태의 혼합 재료의 표참조), 이전 준비 수정된 M9 매체에.
    2. 400, 200, 100, 50, 25, 12.5에이 솔루션 및 6.25 μ M 솔루션을 희석.
  2. EDTA 표준 준비
    1. Disodium ethylenediaminetetraacetic 산의 0.594 g 추가 (EDTA: C10H14N22O8.2H2O), 3200 μ M EDTA 표준 준비 이전 준비 수정된 M9 매체의 500 ml.
    2. 1600에이 솔루션을 희석 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 그리고 6.25 μ M 솔루션.
  3. 표준 곡선 생성
    1. Pyoverdine 및 CAS 철 한 천 매체의 100 μ를 포함 하는 96-잘 microplate의 우물을 EDTA의 각 농도의 100 μ를 추가 합니다. 각 농도의 중복 기술 복제를 확인 합니다. 또한, 추가 M9와 빈 우물 (EDTA 또는 pyoverdine).
    2. Microplate 리더를 사용 하 여, 흡 광도 측정 (420에 nm, 665 nm) 22 ° C, 및 표준 곡선을 생성 하기 위해 사용 흡 광도 측정에서 1, 6, 및 24 시간 보육 후.
      참고: 420 nm 측정, pyoverdine 또는 EDTA 포함 하 웰 스의 흡 광도에서 흡 광도를 감 하십시오. 665 대 한 nm, pyoverdine 또는 우물의 흡 광도에서 포함 된 EDTA의 흡 광도 뺍니다. 그런 다음 로그10µ M pyoverdine (EDTA) 흡 광도 측정에 대 한 역행 이다. 샘플 결과 해석의 용이성에 대 한 흡 광도 사용 하 여 x 축으로 하 고 y 축으로10µ M pyoverdine (EDTA) 로그.

4. 환경 샘플의 수집: 토양 및 식물 조직

  1. 0.22 μ m 필터링 ddH2O 70% 에탄올, 다음 샘플링 장비 (삽과가 위)를 세척 하 고 샘플링 하기 전에 살 균 기술을 유지 하 고 감소를 샘플 사이 종이 타월로 닦아 교차 오염을.
  2. 삭제할 필드, 식물에서 식물 조직 (곡물 및 촬영) 하 고 쉽게 원하는 토양 및 루트 샘플을 혼돈으로 몰아 위해 충분 한 촬영 수염을 떠나 레이블이 플라스틱 스토리지 가방에 넣어.
  3. 깊은 작은 루트 공 약 15 cm와 23 c m excavate를 실험실 환경에서 샘플 준비를 위한 별도, 레이블이 지정 된 비닐 봉지에 넣습니다. 이 단계는 맥 퍼 슨 외.27의 방법에 비슷합니다.
  4. 얼음에 직접 모든 샘플 (곡물, 촬영, 대량 토양, 그리고 별도 가방에 루트 공)을 놓고 샘플 siderophore 생산 분석 결과 대 한 처리는 될 때까지 4 ° C에서 유지 합니다.
  5. 별도 루트는 대량, 느슨하게 연결 rhizosphere 토양과 밀접 하 게 바인딩된 rhizosphere 토양으로 토양 샘플을 관련.
    1. 가방에서 루트 볼을 걸릴. 루트 볼에서 토양을 부드럽게 흔들어. 토양, 떨어져 동요는 토양 함께 가방에 왼쪽 "대량" 토양 구성.
    2. 고무 망치를 사용 하 여 추가 루트 공을에서 토양을 제거. 이것은 느슨하게 연결 rhizosphere 토양 이다.
    3. 엄격 하 게 바인딩된 샘플 뿌리를 복용 하 고 원심 분리기 튜브에 넣고 단단히 바인딩된 rhizosphere 토양을 생성 합니다. 30 mL ddH2O와 소용돌이의 추가 2-3 분 위해 그것. 엄격 하 게 바인딩된 rhizosphere 토양 슬러리 희석을 뿌리를 제거 합니다.

5. siderophore 농축 문화와 CAS Fe siderophore 생산 분석 결과의 준비

참고: 모든 유리 산은 분석 실험을 시작 하기 전에 세척 되어야 합니다.

  1. (각 3 개의 토양 샘플 형식)에 대 한 토양 시료 준비
    1. 혼합 한 토양 가능한 가방을 열지 않고 샘플 가방 안에 각 토양 샘플을 균질.
      참고:이 자연 토양 공간 가변성을 줄이는 데 도움이 됩니다 및 일반 토양 샘플링 절차에 맞춥니다. 다른 방법 환경 샘플, 적절 한, 그리고 실험 설계에 따라 균질에 활용 될 수 있습니다.
    2. 후 각 샘플 철저 하 게 혼합, aliquot 및 수정 된 M9 매체의 20 mL에 각 토양의 2.0 g를 일시 중단, 다음 10-3 폭 기를 수 있도록 메 마른 거품 플러그와 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 총 볼륨을 희석.
    3. 엄격 하 게 바인딩된 rhizosphere 샘플에 대 한 수정 된 M9 매체의 20 ml rhizosphere 토양 슬러리의 2 개 mL를 추가 후 희석 폭 기를 수 있도록 메 마른 거품 플러그와 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 총 볼륨을 10-3 .
  2. 조직 샘플 (루트, 촬영 및 곡물) 준비
    1. 표면 샘플 70% 에탄올으로 소독. 30 초 동안 높은에 믹서 기를 사용 하 여 수정 된 M9 매체의 20 ml에서 신선한 조직의 2.0 g macerate 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브 샘플 전송 다음 희석 폭 기를 수 있도록 메 마른 거품 플러그와 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 총 볼륨을 10-3 .
  3. Fe 제한을 통해 Siderophore 생산의 농축
    1. 실 온에서 50 mL 원심 분리기 튜브를 품 어 고 160 rpm에 흔들.

6. CAS-Fe agar 분석 siderophore 생산 환경 샘플에서의 검출

  1. 24, 48, 및 72 h 농축 문화를 시작한 후, 1 mL 샘플이 농축 튜브를 사용 하 여 메 마른 기술 및 원심 분리기 10000 x g에서 2 mL 원심 분리기 튜브에 1 분 동안 이용할 셀에서 제거 합니다.
  2. 분리 된 상쾌한을 수집 합니다. 무 균 기술을 사용 하 여, 중복 또는 microplate에 3 중 CA-Fe-Agar의 100 μ 솔루션에는 상쾌한의 100 μ를 추가 합니다. 또한 (공백)로 살 균 M9 매체의 100 µ L를 추가 합니다. 28 ° c.에 접시를 품 어
  3. 자체 살 균 2 mL 원심 분리기 관으로 나머지 상쾌한 고 각 샘플 (결정 접시에는 추가 되지 않습니다)에 대 한 펠 릿을 일시 중단 합니다. 각 샘플 상쾌한 튜브에 살 균 글리세롤의 400 μ를 추가 하 고 글리세롤 주식을 만드는 펠 릿을 resuspend. 나중 분석-80 ° C에서 재고를 고정 합니다.
    참고:이 단계는 어떤 선호 사내 프로토콜에 따라 글리세롤 주식을 생성 하 수정할 수 있습니다.
  4. 6, 24, 48, 및 72 h 420 nm 파장에서 흡 광도 측정 한다.
  5. 표준 곡선에서 생성 pyoverdine 또는 EDTA를 사용 하 여 pyoverdine 해당 측면에서 흡 광도 측정 한 샘플을 해석 하는.
    참고: Pyoverdine EDTA에 비해 우수한 표준 결정 했다 (아래를 보라), 그래서 EDTA 현재 연구에서 결과 해석에 사용 되지 않았습니다.

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Representative Results

슈 도모 나 스 fluorescens 에 의해 pyoverdine 혼합물 biosynthesized 해석 하 고 흡 광도 측정 하는 표준으로 사용 되었다 (에서 420 nm) µ M. pyoverdine 해당 점에서 샘플의 그림 1 흡 광도 (420 사이 관계를 보여 줍니다. nm) 및 pyoverdine (µ M에서 로그10 몰)의 농도 시작. EDTA 샘플 전시 큰 흡 광도 측정 보다 R2 와 pyoverdine, 달성 했다 (그림 2) 낮은 때문에 적절 한 표준을 제공 하지 않았다. 630에서 siderophore 탐지 측정 된 흡 광도의 방법으로 CA Fe 분석 결과 사용 하 여 작업 초기 동안 매우 비슷한 방법을 사용 하 여 관련된 연구에서 nm (CAS-Fe-Agar 했다 혼합 1: 1는 미 판에서 200 µ L 열을 생성 하기 위해 수정 된 M9), 그것을 관찰 했다 665에서 최대 흡 광도 nm, 하지만 420 nm 샘플 (그림 3)에 의해 유도 된 흡 광도의 변화 측면에서 더 재현 했다.

Fe-적자 농축 및 siderophore 활동의 72 h 후 보육 (보충 그림 1)의 48 h 안정화 나타난 후 Siderophore 생산 모든 조직의 종류의 농축 문화에서 관찰 되었다. 따라서, 72 h 농축의 siderophore 활동 siderophore 절연 (그림 4)에 유전자 형 및 샘플 타입의 영향을 결정 하기 위해 부 화 48 h에 평가 했다. Siderophore 활동 대량 토양 샘플에서 상대적으로 낮은 고 있는 대량 토양은 밀 유전자 차이 하지 전시 (그림 4A) 샘플링 않았다. PI561725 유전자 형에서 고립 된 느슨하게 바인딩된 토양의 풍부 매드 슨 및 PI561727, 하지만 하지 Lewjain (그림 4B) 느슨하게 바인딩된 토양에 비해 큰 siderophore 생산 전시. 엄격 하 게 바인딩된 토양에서 풍부에 Siderophore 생산 하지 무 겁 게 영향을 받았다 유전자 (그림 4C).

농축 곡물 조직의 문화 유전자 (그림 4D)에 상대적으로 낮은 siderophore 생산 나왔고. Lewjain 촬영 조직의 풍부 했다 다른 genotypes 보다 훨씬 낮은 siderophore 생산 그리고 더 가변 siderophore 생산 (그림 4E) 귀착되 었 다 PI561725 촬영 조직 문화. Siderophore 활동 200% 이상 다른 모든 genotypes (그림 4 층)와 비교 하는 PI561725의 루트 조직 농축 문화에 큰 했다.

Figure 1
그림 1입니다. 420에 흡 광도 및 655 nm pyoverdine log10 농도 대 한 역행. 420에 흡 광도 (A) nm µ M에 pyoverdine의 로그10 농도 대 한 역행. 다항식 곡선 적합 했다 pyoverdine 해당 측면에서 흡 광도 해석 하기 위한 설명 방정식을 얻을. 665에서 흡 광도 (B) nm 되돌아간 로그에 대해10 µ M. R2 에서 pyoverdine의 농도의 피어슨 상관 계수 제곱 이며 맞춤된 곡선 방정식에 설명 합니다. 포인트는 28 ° c.에 6 h 부 화 후 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 그리고 6.25 µ M pyoverdine에서 흡 광도 측정의 중복 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 420에 흡 광도 및 655 nm EDTA의 log10 농도 대 한 역행. 420에서 흡 광도 (A) nm µ M에 EDTA의 로그10 농도 대 한 역행. 다항식 곡선 적합 했다 pyoverdine 해당 측면에서 흡 광도 해석 하기 위한 설명 방정식을 얻을. 665에서 흡 광도 (B) 로그에 대 한 역행 nm µ M. R2 에서 EDTA의10 농도의 피어슨 상관 계수 제곱 이며 맞춤된 곡선 방정식에 설명 합니다. 포인트는 3200에서 흡 광도 측정의 중복 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 그리고 28 ° C 오차 막대에서 6 h 부 화 후 6.25 µ M EDTA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 생산 하는 siderophore와 M9 매체 샘플링 또는 1:1 CAS-Fe-Agar의 200 µ L 열을 포함 하는 미 판 우물의 315−1000 nm에서 흡 광도 살펴보고 M9 수정. 접시는 microplate 리더에서 흡 광도 측정 하기 전에 72 시간 동안 28 ° C에서 알을 품는. 흡 광도 검사 표시 아무 샘플 (검은 선)을 포함 3 공백 나왔고 665에서 피크와 밀접 하 게 클러스터 된 곡선 nm. 흡 광도 검사 표시 샘플 (회색 선) 더 많은 다양성, 하지만 420에 더 일관 된 흡수도 곡선을 굴복을 생산 하는 siderophore 포함 된 3 개의 공백 nm에 비해 665 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. Pyoverdine 해당 siderophore 농축 문화. Siderophore 농축 문화의 Pyoverdine 해당 및 관련 된 느슨하게 바운스되 어, (A) 대량 (B)와 (C) 단단히 바인딩된 토양, 그리고 밀의 조직 homogenates (D) 곡물 (E) 촬영, (F) 뿌리. Siderophore 농축 문화는 microplate에 샘플이 전송와 28 ° c.에 잠복기 전에 72 h에 대 한 인 큐베이 팅 했다 크롬 azurol S. Genotypes/라인 가진 외피의 48 h 후 루 Siderophore 생산 평가 했다 = Lewjain, 매드 매드 슨, 725 = PI561725, 727 = PI561727 =. 별표 나타냅니다 알파 의미 = 0.008 (후 Bonferroni 보정). 막대기는 표준 편차 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
보충 그림 1입니다. 시간이 지남에 따라 Pyoverdine 해당. 24, 48, 및 72 h 크롬 azurol S. Sderophore 농축 문화를 가진 외피의 (A) 대량 (B) 느슨하게 바운스되 어, 연관 및 (C) 단단히 토양, 바운드 후 평가 하는 siderophore 농축 문화의 Pyoverdine 해당 고 밀 (D)의 조직 homogenates에서는 곡물 (E) 발사 하는, 그리고 (F) 뿌리. Siderophore 농축 문화는 microplate에 샘플이 전송와 28 ° c.에 잠복기 전에 72 h에 대 한 인 큐베이 팅 했다 그리고 각 timepoint에 siderophore 생산 평가 subsampled. Genotypes/선은 루 = Lewjain, 매드 매드 슨, 725 = PI561725, 727 = PI561727 =. Siderophore 생산 후, 24, 48, 및 72 h 외피의 평가 되었다. 막대기는 표준 편차 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 작품의 기본 결과 양적 siderophore 생산/환경 샘플에서 활동을 측정 하는 동안 미생물을 생산 하는 siderophore에 대 한 신속 하 게 풍부 하 게 사용할 수 있는 새로운 방법론의 생산 이다. 방법론은 빠르고, 단순 하 고 비용 효율적인, 그리고 결과 사용 하 수 있는 복잡 하 고 소설 샘플 형식에서 siderophore 활동을 탐지 하는 방법을 보여 줍니다 (예를 들어., 토양 및 식물 조직). 프로토콜 또한 농축 문화의 글리세롤 주식의 생산 귀착되는 반입할 수 있습니다 쉽게 시간을 통해 DNA 또는 RNA를 통해 철 결핍 동안 미생물 지역 사회 구조와 기능에 교대의 연구를 수용 하기 위해 기반 기술 . 그 검사 siderophore 생태 연구에서 활동의 활동에 관심이 또한 가능성이 수이 방법에서 혜택. 결과 또한 pyoverdine 등가물 (pyoverdines는 환경28 및 약29측면에서 중요 한 siderophores) 양적 평가 siderophore 생산의 좋은 방법을 제공 보여. 중요 한 발견은 그 흡 광도 측정 665 nm는 siderophore 활동 420에서 관찰 된 그들과 비교 된 결정에 대 한 적절 한 nm (그림 1). 특히 중요 했다 찾는 665에서 그 흡 광도 nm pyoverdine 농도의 광범위 한 범위에 걸쳐 클러스터 (Pyoverdine µ M 50-800 µ M, 로그10(µ M pyoverdine) = = 0.18-0.76),이 파장 (그림에서 탐지 천장 제안 1B). pyoverdine EDTA에 비해 우수한 표준 동안, 그것은 또한 비용이 많이 드는, 또는 예비 작업은 EDTA 수행 방법론을 보장 하기 위해 다른 비용 효율적인 chelators 전에 마스터 되었습니다 것이 좋습니다 그래서 주목 해야 한다 pyoverdine 표준 생성합니다.

세심 한 관심을 필요로 하는 프로토콜에 걸쳐 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 그것은 가능한 금속, 특히 그 낮은 농도에서 필요한 작업 같은 철 금속 유리 및 다른 상품을 유지 하는 것이 중요. 둘째, 문화 Fe 제한을 통해 siderophore 생산을 위한 풍부 하 게 했다, 때문에 그것은 환경 오염 물질의 영향을 줄이기 위해 워크플로 통해 무 균 상태를 유지 하는 것이 중요. 마지막으로, CA-Fe-agar의 준비 세부 사항에 세심 한 주의 필요로 하 고 밀접 하 게 가능한 설명으로 준비 되어야 한다. 예를 들어, CA-Fe-agar 솔루션 따뜻한 유지 하지만 신속 하 게 사용 되지 않습니다, CA-Fe 침전 됩니다. 또한, 그것은 microplate에 전송 하는 동안 CA-Fe-Agar을 따뜻하게 유지 하 필수적 이다. 이 온수를 사용 하 여, 메 마른 모래와 biosafety 캐비닛에 microplate에 매체를 신속 하 게 전송 하 여 달성 되었다.

방법론의 한 가지 한계는 있기 때문에 어떤 식물도 생산 siderophores (phytosiderophores); 이러한 식물 조직 homogenates의 농축 문화에서 측정된 siderophore 활동에 기여할 수 있다. 또한, 필드 복제, 더 많은 복제 미래 연구에 도움이 될 수 있는 제안에서 결과에 상대적으로 높은 다양성이 이었다. 기술의 또 다른 한계는 동안 microplate 방법은 높은 처리량, 샘플 수집 및 준비 시간이 소요 되는. 아직도, 단일 microplate 96 샘플 (를 포함 하 여 표준)에 사용할 수 있습니다, 때문에 시간 및 비용 입력은 기존 기술에 비해 낮은 훨씬. 이것은 다른 기존의 방법 접시30, CA-Fe 시험 수행에 의존 하기 때문에 주로 본질적으로 적은 시간과 비용 준비는 미 판 보다 효율적입니다. 또한, CAS Fe 단지 solubilized 강수량12경향이 있기 때문에, CA-Fe-한 천 매체를 사용 하 여 제안된 된 방법 또한 96 잘 형식에 적용할 수 있다 액체 기반의 우수한 방법 이다.

보고 된 연구 결과에서 PI561725와 PI561727 사이의 주요 차이점은 ALMT1.almt1, 각각, 그에 주어진 결과 제안 ALMT1 가능성이 결과의 선택에서의 존재 미생물 공동체는 플랜트와 토양에는 siderophore 생산, 평가 통해 농축 문화에 대 한 더 큰 가능성이 있다. 미래의 작업 ALMT1 의 존재는 구체적으로 향상 된 siderophore 활동에 대 한 선택 하는 경우를 명확 하 게 특히 복제, 더 큰 수를 사용 하 여 현상을 조사 추가 해야 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

Acknowledgments

저자는 실험실 절차, 수확 하는 밀 유전자 형에 대 한 리 Opdahl, 워싱턴 주 콩코드 포도 연구 위원회 및 자 급 농업에 대 한 워싱턴 주립 대학 센터에 Kalyani Muhunthan를 감사 하 고 싶다 고 BIOAg에 대 한 자연 자원이이 작업을 지원 하기 위해 부여 합니다. 추가 자금 해치 프로젝트 1014527 통해 미국 농 무부/NIFA에 의해 제공 했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Apex LF451320014
Aluminum Baking Pan
Aluminum Foil
Ammonium chloride, granular Fiesher Scientific 152315A
Autoclave and Sterilizer Thermo Scientific
Calcium chloride dihydrate Fiesher Scientific 171428
CAS (Chrome Azurol S) Chem-Impex Int'l Inc) 000331-27168
Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder Fiesher Scientific 1521754
EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal J.T.Baker JI2476
Glycerol, Anhydrous Baker Analyzed C22634
HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide Reagent World FZ0941
Hydrochloride acid ACROS Organic B0756767
Infinite M200 PRO plate reader TECAN
Iron (III) chloride hexahydrate, 99% ACROS Organic A0342179
Laboratory Fume Hood Thermo Scientific
Laboratory Incubator VWR Scientific
Magnesium Sulfate Fiesher Scientific 27855
Niric Acid, (69-70)% J.T.Baker 72287
PIPES buffer, 98.5% ACROS Organic A0338723
Potassium phosphate, dibaisc,powder J.T.Baker J48594
Pyoverdine SIGMA-ALDRICH 078M4094V
Sand
SI-600R Shaker Lab Companion
Sodium chloride, granular Fiesher Scientific 136539
Sodium hydroxide, pellets J.T.Baker G48K53
Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% ACROS Organic A0371705

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References

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