Sideroforo high-throughput Screening da campioni ambientali: tessuti, Bulk terreni e suoli rizosfera della pianta

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Summary

Vi presentiamo un protocollo per lo screening rapido di campioni ambientali per sideroforo potenziale che contribuiscono alla biodisponibilità di micronutrienti e fatturato nei sistemi terrestri.

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Lewis, R. W., Islam, A. A., Dilla-Ermita, C. J., Hulbert, S. H., Sullivan, T. S. High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils. J. Vis. Exp. (144), e59137, doi:10.3791/59137 (2019).

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Abstract

Siderofori (composti di chelatazione metallo di basso peso molecolare) sono importanti in varie fenomeno ecologico che vanno dal ferro (Fe) ciclismo biogeochimici in terreni, a concorrenza di agente patogeno, promozione della crescita di pianta e cross-Unito della segnalazione. Inoltre, siderofori sono anche di interesse commerciale di bioleaching e bioweathering del metallo-cuscinetto minerali e minerali. Un mezzo rapido, conveniente e affidabile di valutare quantitativamente la produzione sideroforo in campioni complessi è la chiave per identificare gli aspetti importanti delle ramificazioni ecologiche di sideroforo attività, tra cui, romanzo sideroforo producendo i microbi. Il metodo qui presentato è stato sviluppato per valutare l'attività di sideroforo delle Comunità in tatto microbiome, in campioni ambientali, quali i tessuti del suolo o delle piante. I campioni sono sono omogeneizzati e diluiti in un mezzo di M9 modificato (senza Fe) e colture di arricchimento sono state incubate per 3 giorni. Produzione di sideroforo è stata valutata nei campioni a 24, 48 e 72 ore (ore) utilizzando una micropiastra a 96 pozzetti CAS (Chrome azurol solfonato) romanzo-saggio agar Fe, un adattamento del metodo colorimetrico tradizionalmente noioso e richiede tempo di valutazione sideroforo attività svolta su singoli isolati microbici coltivati. Abbiamo applicato il nostro metodo a 4 diversi genotipi/linee di grano (Triticum aestivum L.), tra cui Lewjain, Madsen e PI561725 e PI561727 comunemente coltivata nel nord-ovest pacifico dell'entroterra. Sideroforo produzione chiaramente è stata influenzata dal genotipo del grano con i tipi specifici di tessuti vegetali osservati. Abbiamo utilizzato con successo il nostro metodo per selezionare rapidamente per l'influenza del genotipo di pianta il sideroforo produzione, una funzione chiave negli ecosistemi terrestri e acquatici. Abbiamo prodotto molti tecnici replicati, producendo le differenze statistiche molto affidabile nel suolo e all'interno di tessuti vegetali. D'importanza, i risultati mostrano che il metodo proposto può essere utilizzato per esaminare rapidamente sideroforo produzione in campioni complessi con un alto grado di affidabilità, in un modo che permette alle comunità di essere conservato per lavoro successivo identificare taxa e geni funzionali.

Introduction

Siderofori sono importanti biomolecole coinvolte principalmente nella chelazione del ferro per biodisponibilità, ma con una vasta gamma di ulteriori finalità negli ecosistemi terrestri e acquatici che vanno da microbica quorum sensing, segnalazione di microbiche pianta-padroni di casa, Promozione della crescita di pianta, la cooperazione e la concorrenza all'interno di comunità microbiche complesse1,2. Siderofori possono essere classificati secondo la loro siti attivi e caratteristiche strutturali, creazione di quattro tipi di base: carbossilato, idrossammica, catecolati e mescolato tipi3,4. Molti microrganismi sono in grado di espellere più di un tipo di sideroforo5 e in comunità complesse, una vasta maggioranza di organismi biosintetizzare i recettori di membrana per consentire l'assorbimento di una varietà ancora più ampia di siderofori1, 6. Lavoro recente indica che i siderofori sono particolarmente importanti a livello comunitario e anche nelle comunicazioni inter-Unite e biogeochimici trasferimenti7,8,9,10 ,11.

Chrome azurol solfonato (CAS) è stato utilizzato per oltre 30 anni come un agente chelante di legare il ferro (Fe) in modo che aggiunta di ligandi (cioè, siderofori) può provocare la dissociazione del complesso CAS-Fe, creando un cambiamento di colore facilmente identificabile nel medio 12. quando il CAS è associato con Fe, il colorante viene visualizzato come un colore blu royal e come il complesso di CAS-Fe si dissocia, il mezzo cambia colore a seconda del tipo di legante utilizzato per pulire il Fe13. Il mezzo iniziale, base liquida costituito da Schwyn e Neilands nel 1987, è stato modificato in molti modi per ospitare cambiando obiettivi microbica14, abitudini di crescita e limitazioni15, nonché una varietà di metalli oltre a Fe, tra cui alluminio, manganese, cobalto, nichel cadmio, litio, zinco16, rame17e anche arsenico18.

Molti agenti patogeni umani, anche come impianto di microrganismi promuovere crescita (International) sono stati identificati come organismi produttori sideroforo3,19,20e importante rizosfera ed endophytic International spesso prova positivo per sideroforo-produzione4. Il tradizionale metodo di liquido basato su Fe è stato adattato per microtitolazione test degli isolati in coltura per sideroforo produzione21. Tuttavia, queste tecniche non riescono a riconoscere l'importanza della comunità microbica nel suo complesso (il microbioma), in collaborazione ed eventuale regolazione della produzione sideroforo nel suolo e pianta sistemi22. Per questo motivo, abbiamo sviluppato una valutazione di livello comunitario di alto-rendimento di produzione sideroforo da un determinato ambiente, basato sull'analisi CAS tradizionale, ma con replica, facilità di misurazione, affidabilità e ripetibilità in una micropiastra test.

In questo studio, un'analisi di CAS-Fe conveniente, ad alta produttività per la rilevazione di produzione sideroforo è presentata per valutare l'arricchimento della produzione sideroforo da campioni complessi (cioè, del suolo e pianta omogenati). Alla rinfusa, debolmente accoppiate e strettamente associato rizosfera suolo (in termini di come il suolo era legato alla radice) sono stati ottenuti con grano, sparare e tessuti di radice da quattro genotipi distinti frumento (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725, e PI561727. È stato supposto che differenze fondamentali in genotipi di frumento potrebbero comportare differenze nel reclutamento e nella selezione di sideroforo producendo le comunità. Di particolare interesse è la differenza tra comunità microbiche associata alla linea isogeniche di PI561725, che è in alluminio tollerante perché possiede ALMT1 (alluminio-attivato Malate Transporter 1), confrontata con l'alluminio PI561727 isogeniche linea sensitive, che possiede una forma reattiva non-alluminio del gene, almt123,24,25,26. L'obiettivo principale dello studio era di sviluppare un metodo semplice, rapido, di valutare quantitativamente la produzione sideroforo in colture di arricchimento sideroforo di tipi di campioni complessi, preservando le colture per il lavoro futuro.

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Protocol

Nota: Percorso del campo sito: Washington State University, Farm di patologia vegetale (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4" W). Semi sono stati seminati usando una piantatrice meccanica su 19 ottobre 2017. Ogni genotipo di grano è stato piantato in headrows, circa 1 metro di distanza per evitare sovrapposizioni di sistema della radice. Il 9 agosto 2018, quando le piante erano pronti per il raccolto, sono stati raccolti campioni di pianta e terreno. I campioni sono stati raccolti da tre repliche di quattro genotipi di frumento: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.

1. preparazione di modificate M9 medium

  1. Uso Na2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) e NH4Cl (1 g/20 mL) reagenti per preparare la soluzione salina M9.
  2. Utilizzare 18 g di MgSO4∙7H2O in 100 mL di acqua deionizzata doppia (ddH2O) per preparare 0,75 M MgSO4∙7H2O.
  3. Fai 1 M di CaCl2∙2H2O aggiungendo 14,7 g di CaCl2∙2H2O con 100 mL di ddH2O.
  4. Preparare la soluzione tampone sciogliendo g 6,048 dei tubi in 156 mL di ddH2O con agitazione. Regolare il pH a 6,8 con 5 M NaOH.
  5. Preparare il 20% del glucosio (destrosio monoidrato) sciogliendo 20 g di glucosio in 100 mL di ddH2O.
  6. Preparare soluzioni e autoclave tutti singolarmente ma il glucosio. Filtro sterilizzare la soluzione di glucosio per aggiunta ai media M9 dopo sterilizzazione in autoclave (0,22 µm).
  7. Preparare il supporto di M9 modificato mescolando 156 mL di soluzione tampone di tubi, 40 mL di soluzione di sali M9, 20 μL di soluzione di CaCl2·2H2O e 266 μL di MgSO4·7H2O 4 mL di soluzioni di glucosio 20% insieme alla biosicurezza gabinetto, usando una tecnica sterile.
  8. Per la conservazione della M9 modificate, sigillare il contenitore, coprire con carta stagnola per proteggere dai raggi UV e posto a 4 ° C.

2. preparazione del terreno CAS-Fe-Agar

  1. Acido lavare tutta la cristalleria in 100 mM HCl/100 mM HNO3 per un minimo di 2 h prima dell'utilizzo nell'analisi della CAS.
  2. Preparare una teglia di alluminio riempita con sabbia di grado di laboratorio e coprire con carta stagnola. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 30 min e mettere da parte.
  3. Preparare la HDTMA (bromuro di esadeciltrimetilammonio) aggiungendo 0,0365 g 20 mL ddH2O e posizionare la soluzione a 37 ° C per favorire la solubilizzazione.
  4. Preparare HCl 10 mM e 1 mM FeCl3·6H2O usando HCl 10 mM come solvente di generare. Aggiungere 0,0302 g di CAS a 25 mL di ddH2O mescolando delicatamente con una sterile ancoretta magnetica. Quindi aggiungere 5 mL di 1 mM FeCl3·6H2O (in HCl 10 mM) a 25 mL di soluzione di CAS pur continuando a mescolare delicatamente (la soluzione si trasforma in colore nero rossastro scuro).
  5. Aggiungere lentamente i 20 mL di soluzione di HDTMA, mescolando delicatamente, nella soluzione di Fe-CAS (questo produce una soluzione blu scuro).
  6. Preparare la soluzione tampone sciogliendo g 15,12 di tubi in 375 mL di ddH2O, con agitazione delicata. Regolare il pH a 6,8 con 5 M NaOH. Aggiungere acqua per portare il volume a 450 mL. Aggiungere 5 g di agarosio per la soluzione. Autoclave i tubi del buffer soluzione e la soluzione di CAS-Fe a 121 ° C per 30 min.
  7. Aggiungere con cautela la totalità della soluzione CAS-Fe per la totalità del Buffer tubi nella biosicurezza dopo ciascuno di essi è sterilizzato nell'autoclave.
  8. Posto la soluzione mista in un bagno di acqua a 50 ° C.
    Nota: Appena preparare tutti i reagenti nel CAS-Fe-agar prima di ogni analisi, come deposito a lungo termine a 50 ° C risultati in precipitazione dei risultati complessi e raffreddamento CAS-Fe in mezzo solidificata.
  9. Posizionare una barca di reagente sterile nella sabbia sterile nella cappa di biosicurezza e calore a 50 ° C. Trasferire il CAS-Fe-Agar per la barca, quindi rapidamente aliquota 100 µ l a ciascun pozzetto in una micropiastra a 96 pozzetti chiara, fondo piatto e sterile.

3. preparazione standard pioverdina/EDTA

  1. Preparazione di pioverdina
    1. Preparare standard di 800 μM pioverdina (miscela di acido succinico, 2-idrossi glutaramide e succinaminde forme di pioverdina – Vedi Tabella materiali), nel mezzo di M9 modificata precedentemente preparato.
    2. Diluire questa soluzione in 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 e 6,25 μM soluzioni.
  2. Preparazione di standard di EDTA
    1. Aggiungere 0,594 g di acido etilendiamminotetracetico disodico (EDTA: C10H14N2Na2O8.2h2O), a 500 mL di mezzo di M9 modificata precedentemente preparato per predisporre 3200 μM EDTA standard.
    2. Diluire questa soluzione nel 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 e 6,25 soluzioni μM.
  3. Generazione della curva standard
    1. Aggiungere 100 μL di ogni concentrazione di pioverdina ed EDTA per separare dei pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti contenenti 100 μL di coltura agar CAS-Fe. Rendere le repliche tecniche duplicate di ogni concentrazione. Inoltre, aggiungere pozzetti del bianco con solo M9 (senza EDTA o pioverdina).
    2. Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare l'assorbanza (a 420 nm e 665 nm) dopo 1, 6 e 24 h di incubazione a 22 ° C e misure di assorbanza di uso per generare le curve standard.
      Nota: Per misure di 420 nm, sottrarre assorbanza di spezzoni di dall'assorbanza di pioverdina o pozzetti contenenti EDTA. Per 665 nm, sottrarre l'assorbanza della pioverdina o EDTA contenente pozzi da capacità di assorbimento degli spazii in bianco. Quindi, log10(µM pioverdina o EDTA) è regredito contro le misure di assorbanza. Per facilità di interpretazione dei risultati del campione, è necessario utilizzare assorbanza come l'asse x e log10(µM pioverdina o EDTA) come l'asse y.

4. raccolta di campioni ambientali: tessuti del suolo e pianta

  1. Lavare attrezzature di campionamento (pale e forbici) con 0,22 µm filtrata ddH2O seguita da etanolo al 70% e asciugare con carta assorbente prima del campionamento e tra campioni di mantenere una tecnica sterile e ridurre la contaminazione incrociata.
  2. Asportare i tessuti vegetali (cereali e germogli) dalle piante nel campo e metterli in un sacchetto di stoccaggio di plastica con etichetta, lasciando abbastanza stoppie di sparare per facilità a sradicare i campioni di suolo e radice desiderati.
  3. Scavare una profonda radice piccola palla circa 15 cm e 23 cm di larghezza e metterla in un sacchetto di plastica separato, con etichettato per la preparazione del campione nell'ambiente di laboratorio. Questo passaggio è simile ai metodi di McPherson et al.27.
  4. Mettere tutti i campioni (grani, germogli, terreno di massa e sfere di radice in sacchetti separati) direttamente sul ghiaccio e conservare a 4 ° C fino a quando i campioni vengono elaborati per il dosaggio di produzione sideroforo.
  5. Separare campioni di suolo radice associato in massa, debolmente accoppiate rizosfera suolo e suolo rizosferico strettamente associato.
    1. Prendere le palle di radice fuori i sacchetti. Agitare delicatamente fuori suolo dalla sfera di radice. Scrollato di dosso del suolo, insieme con il terreno rimasto nella borsa comprende il terreno "alla rinfusa".
    2. Utilizzare un martello di gomma per rimuovere lo sporco più ulteriormente dalla sfera di radice. Questo è il terreno debolmente accoppiate rizosfera.
    3. Generare suolo rizosferico strettamente associato prendendo le radici con il campione di strettamente associato e metterli in una provetta da centrifuga. Aggiungere 30 mL di ddH2O e vortex per 2-3 minuti. Rimuovere le radici per ottenere la diluizione di liquami suolo rizosferico strettamente associato.

5. preparazione di colture di arricchimento sideroforo e CAS-Fe sideroforo produzione dosaggio

Nota: Tutta la cristalleria dovrebbe essere acido lavato prima di iniziare l'analisi.

  1. Preparazione del campione di terreno (per ognuno dei tipi di campione di tre suolo)
    1. Omogeneizzare ogni campione di terreno all'interno del sacchetto campione, mescolando e girando il terreno il più possibile senza aprire il sacchetto.
      Nota: Questo aiuta a ridurre la variabilità spaziale del suolo naturale e si allinea con le procedure di campionamento di suolo normale. Altri metodi possono essere utilizzati per omogeneizzare campioni ambientali, come appropriato e a seconda del design sperimentale.
    2. Dopo ogni campione è stato accuratamente miscelati, aliquotare e sospendere 2,0 g di ogni terreno in 20 mL di terreno di M9 modificata, quindi diluire 10-3 per un volume totale di 20 mL in una provetta da centrifuga sterile 50 mL con un tappo di gomma piuma sterile per permettere l'aerazione.
    3. Per i campioni strettamente associato rizosfera, aggiungere 2 mL di liquame suolo rizosferico a 20 mL di medium M9 modificate, quindi diluire 10-3 per un volume totale di 20 mL in una provetta da centrifuga sterile 50 mL con un tappo di gomma piuma sterile per permettere l'aerazione.
  2. Preparazione del campione (radice, spara e grano) del tessuto
    1. Superficie sterilizzare il campione con etanolo al 70%. Macerare 2,0 g di tessuto fresco in 20 mL di mezzo di M9 modificata utilizzando un frullatore in alto per 30 secondi. Trasferire il campione in una provetta sterile 50 mL, quindi diluire 10-3 per un volume totale di 20 mL in una provetta da centrifuga sterile 50 mL con un tappo di gomma piuma sterile per permettere l'aerazione.
  3. Arricchimento della produzione sideroforo attraverso Fe limitazione
    1. Incubare le provette centrifuga da 50 mL a temperatura ambiente e agitare a 160 giri/min.

6. saggi di agar CAS-Fe per il rilevamento della produzione sideroforo in campioni ambientali

  1. A 24, 48 e 72 h dopo l'inizio della cultura di arricchimento, rimuovere sottocampioni 1ml dai tubi arricchimento utilizzando una tecnica sterile e centrifugare a 10.000 x g per 1 min in provette da centrifuga 2 mL pelletizzare le cellule.
  2. Raccogliere il surnatante separato. Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere 100 μL del surnatante a 100 μL di soluzione di CAS-Fe-Agar in doppio o triplice copia la micropiastra. Inoltre è possibile aggiungere 100 µ l di mezzo sterile M9 (come gli spazii in bianco). Incubare la piastra a 28 ° C.
  3. Sospendere il surnatante e pellet per ogni campione (non aggiunto alla piastra per microtitolazione) rimanenti in proprio, provetta da centrifuga sterili da 2 mL. Aggiungere 400 μL di glicerolo sterile in ogni provetta di campione-supernatante e risospendere il pellet per creare scorte di glicerolo. Congelare il brodo a-80 ° C per successive analisi.
    Nota: Questo passaggio può essere modificato per generare scorte di glicerolo secondo qualsiasi protocollo di in-house preferito.
  4. Misurare l'assorbanza a 6, 24, 48 e 72 ore, a 420 Nm.
  5. Utilizzare curve standard generate da pioverdina o EDTA per interpretare misure di assorbanza del campione in termini di pioverdina equivalenti.
    Nota: Pioverdina è stato determinato per essere uno standard superiore confrontato con EDTA (vide infra), quindi EDTA non è stata utilizzata per interpretare i risultati nello studio corrente.

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Representative Results

Un pioverdina miscela biosynthesized da Pseudomonas fluorescens è stato utilizzato come standard per interpretare e quantificare assorbanza (a 420 nm) di campioni in termini di equivalenti di pioverdina in µM. la figura 1 Mostra la relazione tra assorbanza (420 Nm) e a partire di concentrazione di pioverdina (molarità di10 Log in µM). EDTA non ha fornito uno standard adeguato, perché i campioni esposti misure di assorbanza maggiore che erano raggiungibili con pioverdina e la R2 era più basso (Figura 2). Durante l'iniziale lavoro usando l'analisi di CAS-Fe come metodo di sideroforo rilevamento misurato assorbanza a 630 nm, in uno studio relativo utilizzando un metodo molto simile (CAS-Fe-Agar era misto 1:1 con M9 modificate per generare una colonna di 200 µ l in micropiastra), è stato osservato che L'assorbanza del picco è stato a 665 nm, ma che 420 nm era più riproducibile in termini di cambiamenti in assorbanza indotta da campioni (Figura 3).

Produzione di sideroforo è stato osservato in colture di arricchimento di tutti i tipi di tessuto dopo 72 h di Fe-disavanzo arricchimento e attività sideroforo è apparso per stabilizzare dopo 48 h di incubazione (complementare figura 1). Così, sideroforo attività dell'arricchimento 72h è stata valutata a 48 h di incubazione per determinare l'influenza del genotipo e campione tipo il sideroforo isolamento (Figura 4). Sideroforo attività nei campioni di terreno di massa era relativamente bassa e fatto non Mostra differenze tra il genotipo di grano da cui il terreno di massa è stata campionata (Figura 4A). Arricchimenti di vagamente associato terreno isolato dal genotipo PI561725 ha esibito una maggiore produzione di sideroforo rispetto al suolo vagamente associato da Madsen e PI561727, ma non Lewjain (Figura 4B). Produzione di sideroforo in arricchimenti dal suolo strettamente associato non è stata influenzata pesantemente dalla genotipo (Figura 4).

Colture di arricchimento del tessuto di grano ha reso relativamente basso sideroforo produzione indipendentemente dal genotipo (Figura 4). Arricchimenti di Lewjain sparare tessuto avevano produrre sideroforo significativamente inferiore rispetto gli altri genotipi, e PI561725 sparare tissue culture ha provocato la produzione sideroforo più variabile (Figura 4E). Sideroforo attività era più di 200% maggiore in colture di arricchimento del tessuto di radice di PI561725 rispetto a tutti gli altri genotipi (Figura 4F).

Figure 1
Figura 1. Assorbanza a 420 nm e 655 nm regredito rispetto alla concentrazione di log10 della pioverdina. (A) assorbanza a 420 nm regredito rispetto alla concentrazione di10 registro della pioverdina in µM. Una curva polinomiale era adatta per ottenere un'equazione esplicativa per l'interpretazione di assorbanza in termini di pioverdina equivalenti. (B) assorbanza a 665 nm è regredetto contro il Log10 concentrazione della pioverdina in µM. R2 è il quadrato del coefficiente di correlazione di Pearson, e spiega l'equazione della curva. Punti sono duplicati di misure di assorbanza a 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 e 6.25 µM pioverdina dopo 6 ore di incubazione a 28 ° C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Assorbanza a 420 nm e 655 nm regredito rispetto alla concentrazione di log10 di EDTA. (A) assorbanza a 420 nm regredito rispetto alla concentrazione di10 registro di EDTA in µM. Una curva polinomiale era adatta per ottenere un'equazione esplicativa per l'interpretazione di assorbanza in termini di pioverdina equivalenti. (B) assorbanza a 665 nm è regredetto contro il Log10 concentrazione di EDTA in µM. R2 è il quadrato del coefficiente di correlazione di Pearson, e spiega l'equazione della curva. Punti sono duplicati di misure di assorbanza a 3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 e 6.25 µM EDTA dopo 6 ore di incubazione a 28 ° C e barre di errore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Assorbanza scansioni da 315−1000 nm di pozzetti di micropiastra contenente 200 µ l colonne di 1:1 CAS-Fe-Agar e modificato M9 o M9 medium con sideroforo producendo campioni. La piastra è stata incubata a 28 ° C per 72 ore prima di misurare l'assorbanza a un lettore di micropiastre. Assorbanza scansioni mostrano gli spazii in tre bianco non contenente nessun campione (linee nere) ha reso strettamente cluster curve con un picco a 665 nm. Assorbanza scansioni Visualizza gli spazii in tre bianco contenenti sideroforo produrre i campioni (linee grigie) ha reso le curve con maggiore variabilità, ma con più coerenza assorbanza a 420 nm rispetto a 665 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Pioverdina equivalenti delle colture di arricchimento sideroforo. Pioverdina equivalenti delle colture di arricchimento sideroforo associato a massa (A) (B) vagamente associato e (C) è strettamente vincolato del suolo e in omogenati di frumento grano (D) (E) spara e radici (F). Colture di arricchimento sideroforo sono state incubate per 72 h prima trasferendo sottocampioni una micropiastra e incubazione a 28 ° C. Produzione di sideroforo è stata valutata dopo 48 h di incubazione con Chrome azurol S. genotipi/linee sono Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 e 727 = PI561727. Gli asterischi rappresentano significato presso alpha = 0.008 (dopo la correzione di Bonferroni). Le barre sono deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Complementare figura 1. Pioverdina equivalenti nel tempo. Pioverdina equivalenti delle colture di arricchimento sideroforo valutati dopo 24, 48 e 72 h di incubazione con colture di arricchimento di Chrome azurol S. Sderophore associata alla rinfusa (A) (B) vagamente associata, e (C) è strettamente vincolato del suolo, e in omogenati di grano (D) spara grano (E) e (F) radici. Colture di arricchimento sideroforo sono state incubate per 72 h prima trasferendo sottocampioni una micropiastra e incubazione a 28 ° C. e sottocampionati per valutare sideroforo produzione presso ogni timepoint. Genotipi/linee sono Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 e 727 = PI561727. Produzione di sideroforo è stata valutata dopo, 24, 48 e 72 ore di incubazione. Le barre sono deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il principale risultato di questo lavoro è la produzione di una nuova metodologia che può essere utilizzata per arricchire rapidamente per sideroforo producendo microbi durante la misurazione quantitativamente sideroforo/attività di produzione del campione ambientale. La metodologia è rapido, semplice e conveniente, e i risultati mostrano come può essere utilizzato per rilevare l'attività di sideroforo da tipi di campioni complessi e romanzo (ad es.., del suolo e pianta del tessuto). Il protocollo inoltre provoca la produzione delle scorte di glicerolo di colture di arricchimento, che può facilmente essere preso attraverso il tempo per accogliere gli studi dei cambiamenti nella struttura della comunità microbica e funzione durante la carenza di Fe attraverso DNA o RNA, basato su tecniche . Quelli interessati ad esaminare la cinetica di sideroforo attività in studi ecologici potrebbero probabilmente anche beneficiare di questo metodo. I risultati mostrano anche che gli equivalenti di pioverdina (pyoverdines sono siderofori importante in termini di ambiente28 e medicina29) forniscono un buon metodo di valutare quantitativamente la produzione sideroforo. Un'individuazione importante è quel assorbanza misurazioni a 665 nm sono insufficienti per determinare l'attività sideroforo rispetto a quelli osservati a 420 nm (Figura 1). Di particolare importanza è stata la constatazione che assorbanza a 665 nm cluster attraverso una vasta gamma di concentrazioni di pioverdina (pioverdina µM = 50-800 µM, log10(µM pioverdina) = 0,18-0,76), suggerendo un soffitto di rilevamento a questa lunghezza d'onda (Figura 1b). si noti che mentre pioverdina era uno standard superiore confrontato con EDTA, è anche costoso, quindi si suggerisce che lavoro preliminare viene eseguita con EDTA o altri chelanti conveniente affinché la metodologia è stato masterizzato prima generazione di pioverdina standard.

Ci sono diversi passaggi critici in tutto il protocollo che richiedono particolare attenzione. In primo luogo, è importante mantenere cristalleria privo di metalli e altre mercanzie ove possibile quando lavoro con metalli, in particolare quelli necessari a basse concentrazioni, come Fe. In secondo luogo, perché le culture sono state arricchite per sideroforo produzione attraverso la limitazione di Fe, è importante mantenere condizioni asettiche durante tutto il flusso di lavoro per ridurre l'influenza dei contaminanti ambientali. Infine, preparazione della CAS-Fe-agar richiede una grande attenzione al dettaglio e dovrebbe essere pronti come strettamente a descritto come possibile. Per esempio, se la soluzione di CAS-Fe-agar è tenuta in calda, ma non viene utilizzata rapidamente, il CAS-Fe precipiterà. Inoltre, è essenziale per mantenere il CAS-Fe-Agar caldo durante il trasferimento alla micropiastra. Questo è stato ottenuto utilizzando riscaldata, sabbia sterile e trasferire rapidamente il mezzo alla micropiastra in una cappa di biosicurezza.

Una limitazione della metodologia che è perché alcune piante anche producono siderofori (fitosiderofori); Questi possono contribuire a misurata sideroforo attività in colture di arricchimento di omogenati di pianta. Inoltre, c'era relativamente alta variabilità nei risultati da campo replicati, suggerendo che ulteriori replica potrebbe essere utile negli studi futuri. Un'altra limitazione della tecnica è che, mentre il metodo di micropiastre è alto-rendimento, l'esempio di raccolta e preparazione sono che richiede tempo. Ancora, perché una singola micropiastra può essere utilizzata per 96 campioni (tra cui standard), gli ingressi di tempi e costi sono molto inferiori rispetto ai tecniche esistenti. Questo è principalmente perché altri metodi esistenti si basano su esecuzione del saggio di CAS-Fe in capsule di Petri30, che sono intrinsecamente meno tempo e costo efficiente per la preparazione di una micropiastra. Inoltre, perché solubilizzate CAS-Fe complessi sono inclini a precipitazioni12, il metodo proposto utilizzando CAS-Fe-coltura agar è metodi superiore a base liquida, che hanno anche essere adattato al formato 96 pozzetti.

In termini di risultati segnalati, dato che la differenza principale tra la PI561725 e la PI561727 è la presenza di ALMT1 vs.almt1, rispettivamente, i risultati suggeriscono la presenza di ALMT1 risultati probabili nella selezione dei comunità microbiche in sia la pianta ed il terreno che hanno un maggiore potenziale per la produzione di sideroforo, come valutato tramite colture di arricchimento. Lavoro futuro dovrebbe investigare il fenomeno utilizzando un numero maggiore di ripetizioni, in particolare per chiarire se la presenza di ALMT1 in particolare seleziona per attività avanzate sideroforo.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Kalyani Muhunthan per assistenza in procedure di laboratorio, Lee Opdahl per la raccolta del grano genotipo, Consiglio di ricerca d'uva dello stato di Washington e la Washington State University Center per sostenere l'agricoltura e Risorse naturali per un BIOAg concedere per sostenere questo lavoro. Finanziamenti supplementari è stato fornito dall'USDA/catino attraverso progetto portello 1014527.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Apex LF451320014
Aluminum Baking Pan
Aluminum Foil
Ammonium chloride, granular Fiesher Scientific 152315A
Autoclave and Sterilizer Thermo Scientific
Calcium chloride dihydrate Fiesher Scientific 171428
CAS (Chrome Azurol S) Chem-Impex Int'l Inc) 000331-27168
Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder Fiesher Scientific 1521754
EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal J.T.Baker JI2476
Glycerol, Anhydrous Baker Analyzed C22634
HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide Reagent World FZ0941
Hydrochloride acid ACROS Organic B0756767
Infinite M200 PRO plate reader TECAN
Iron (III) chloride hexahydrate, 99% ACROS Organic A0342179
Laboratory Fume Hood Thermo Scientific
Laboratory Incubator VWR Scientific
Magnesium Sulfate Fiesher Scientific 27855
Niric Acid, (69-70)% J.T.Baker 72287
PIPES buffer, 98.5% ACROS Organic A0338723
Potassium phosphate, dibaisc,powder J.T.Baker J48594
Pyoverdine SIGMA-ALDRICH 078M4094V
Sand
SI-600R Shaker Lab Companion
Sodium chloride, granular Fiesher Scientific 136539
Sodium hydroxide, pellets J.T.Baker G48K53
Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% ACROS Organic A0371705

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