从 lck 中分离恶性和非恶性 b 细胞: egfp斑马鱼

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Summary

转基因lck: egfp斑马鱼在 t 淋巴细胞中表达 gfp 的高度, 并已被用于研究 t 细胞发育和急性淋巴细胞白血病。这条线可以用来研究 b 细胞, b 细胞在较低的水平上表达lck 。该协议描述了从lck: egfp斑马鱼的恶性和非恶性 b 细胞的纯化。

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Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish. J. Vis. Exp. (144), e59191, doi:10.3791/59191 (2019).

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Abstract

斑马鱼 (daio rerio)是研究淋巴细胞发育的一个强有力的模型。像哺乳动物一样, d. rerio拥有包括 b 和 t 淋巴细胞在内的适应性免疫系统。斑马鱼淋巴生成的研究是困难的, 因为抗体识别d. rerio 细胞表面标记物一般是不可用的, 使分离和表征不同的淋巴细胞群, 包括 b 系细胞。具有血统特异性荧光体表达的转基因线经常被用来规避这一挑战。转基因lck:egfp系已被用于研究d. rerio t 细胞的发育, 也被用于模型 t 细胞发育和急性淋巴细胞白血病 (t-all)。虽然lck:egfp鱼被广泛用于分析 t 系, 但它们还没有被用来研究 b 细胞。最近, 我们发现, 许多斑马鱼 b 细胞也表达了 lck, 尽管水平较低。因此, lck:egfp b 细胞同样表达低 gfp 水平。基于这一发现, 我们开发了一个从lck: egfp斑马鱼净化 b 系细胞的协议, 我们在这里报告。我们的方法描述了如何利用荧光激活细胞分选器 (facs) 从lck: egfp鱼或相关的线, 如双转基因的 ragycb 细胞纯化;egfp 鱼。在这些细胞中, b 细胞, 特别是不成熟的 b 细胞, 在较低但可检测的水平上表达 gfp, 使它们能够与 t 细胞区分开来, 从而高度表达 gfp。b 细胞可以从骨髓、胸腺、脾脏、血液或其他组织中分离出来。该方案提供了一种净化d. rerio b 细胞的新方法, 使研究的重点是 b 细胞发育和 b 淋巴细胞恶性肿瘤等主题。

Introduction

斑马鱼具有强大的特性, 如遗传操纵能力、高繁殖力、光学半透明和快速发育, 有助于利用遗传方法研究脊椎动物的发育。这些优势, 再加上远端和哺乳动物造血的共同特征, 使d. rerio 成为在体内分析淋巴细胞和淋巴细胞功能的理想选择, 从它们在整个成年期间在幼虫中的最早出现。斑马鱼的血液发育依赖于与哺乳动物共享的保存良好的遗传过程, 这些过程延伸到适应性免疫系统。此外, 斑马鱼和哺乳动物之间的分子机制在淋巴发育方面得到了显著的保护。

在过去的20年里, 在这些血统中缺乏的特定血液谱系和突变系的转基因d. rerio 系已经被创造出来 2,3,4,5。其中, lck: egfp转基因线, 利用斑马鱼淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶 (lck) 启动子来驱动 gfp 表达 6.该基因由 t 系前体和成熟的 t 淋巴细胞高度表达, 可通过流式细胞仪7在体内跟踪胸腺 t 细胞的发育和 t 系细胞的体外纯化.以前, 我们在前瞻性遗传 enu 突变屏幕中使用这条线来识别容易发生 t-all 的种系突变体, 并研究与 t 细胞肿瘤发生 8,9有关的体细胞获得的基因事件。

最近, 我们的实验室进一步扩大了lck 的效用: egfp斑马鱼。在双转基因的 rmyc (人 myc), lck:egfp d. rerio,已知开发 t-all 10,我们发现 b-血统 all 也发生11。与 t-all 在这个模型中不同的是, 由于 gfp 表达较高, t-all 荧光明亮, 由于 gfp 水平较低, 允许 b-all 的鱼与使用荧光显微镜的鱼区别开来。这种差异 gfp 表达还允许使用流式细胞管制11将 gfp lo b-all 细胞与 gfphit-all 细胞分离.此外, 低lck表达并不是斑马鱼 b-all 所独有的, 因为人类 b-all 也表达低lck11,12。同样, d. rerio、小鼠和人类的正常 b 系细胞表达的 lck/lck/lck 水平也很低, 不成熟的 b 细胞的表达最高11,13. 在每个细胞的基础上, b-沿袭细胞在lckegfp zzbrafish 或衍生物线表示1-10 尽可能多的 gfp t 淋巴细胞。这些 gfplo细胞表达典型的 b 细胞 mrna, 如pax5cd79bblnk、btk、 ighmighm等, 可以从骨髓、胸腺、脾脏或外周中纯化血11。因此, b-和 t 系细胞都可以从lckegfp zebrafish 中分离, 在rag2hMYClckegfp动物、b-和 t-all 细胞的情况下, 也可以分离出11。

在这里, 我们提出了我们的方案, 以有效地 facs 纯化非恶性 b 细胞从 lck: egfp斑马鱼, 和非恶性或恶性 b 细胞的 rag2hMYC; egfp鱼, 使用各种来源组织。如果需要, 这种细胞同样可以通过流式细胞术量化, 而无需流式细胞仪分离。低lck表达的发现--因此, 低 gfp 表达 b 细胞为lckegfp zzbrafish 的实验可能性打开了新的大门, 例如体内b 细胞的发育研究。因此, 这条在2004年首次报道的转基因线, 有了新的生命, 因为我们试图利用它来收集关于斑马鱼适应性免疫的新见解。

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Protocol

所有涉及斑马鱼的程序都得到了俄克拉荷马大学健康科学中心动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。

1. 从转基因 lck 中分离非恶性 b 和 t 淋巴细胞: egfp

  1. 在鱼系水中使用0.02% 的滴虫 (ms-222) 对鱼类进行麻醉。
  2. 检查2-6个月大的鱼荧光胸腺, 这是位于斑马鱼和其他心灵的分枝腔的背侧, 14.使用荧光显微镜 (470/40 激发波长和 2525-50 发射滤波器) 检测 gfp。
  3. 事先准备50毫升的过滤消毒1x 罗斯威尔公园纪念研究所媒体 (rpmi) 含有1% 的胎牛血清和1% 的青霉素链霉素 (分选介质)。未使用的分类介质可在4°c 下存储长达2个月。
  4. 将鱼放入含有0.2% 的三胺的烧杯中, 使其浸渍约 5分钟, 然后浸泡冰浴。通过停止手术 (刺) 运动来确认死亡。
  5. 将安乐死的鱼放入培养皿中, 解剖感兴趣的淋巴器官, 使用荧光显微镜解剖 gfp+胸腺14, 并在明亮的现场显微镜设置中解剖肾骨髓和脾脏15。这里介绍的结果是使用3个月大的鱼。淋巴细胞比例和绝对数字因年龄和基因型而异 (详见讨论)。
  6. 将每个解剖器官放置在含有500μl 冷分选介质的 1.5 ml 管中。
  7. 使用微管均质机对冰上的组织进行均质化。
  8. 通过35μm 网格过滤器通过均质组织, 生成单个细胞悬浮液。将细胞放在冰上, 直到分析。

2. 从双基因 rag2:hMYC;lck:eGFP 斑马鱼中分离恶性淋巴细胞

  1. 从2-4 开始, 显微镜下筛选rag2: hmyc;用于异常 gfp模式的 egfp 鱼。
    注:
    b 细胞是 gfp lo 在 lck: egfp背景, 所以 b-all 需要实践识别;t-all 是显而易见的, 因为 t 细胞是 gfp喜.因此, rag2: hmyc, lck:egfp双基因线有两种表型: 明亮荧光 t-all, 通常产生于胸腺并延伸到体内, 和昏暗荧光 b-all。
    1. 使用荧光显微镜, 使用 "低曝光" 设置 (200 毫秒, 2.4 x 增益) 筛选鱼, 以识别明亮的 t-all (图 1a) 和 "高曝光" (1.5 s, 3.4 x 增益), 以识别暗淡的 b-all (图 1 a)。wt 控制和白血病前鱼类仅在胸腺中定位 gfp (图 1b)。
  2. 按照步骤1.1–1.2 中的说明对鱼类进行麻醉和检查。
  3. 使用简单的三个类别系统, 根据 gfp 荧光的范围对鱼类进行分类:
    请注意:第1级: 荧光表现为胸腺肿瘤, 局部扩散有限。
    第2级: 荧光出现在胸腺之外, 涉及 lt;50 的身体。
    第3级: 荧光延伸到身体的50% 以上。
  4. 把鱼和 all 和没有癌症的鱼分开。每月一次监测白血病前鱼类 (即没有 gfp+肿瘤的鱼), 用于新的 all 的发展。~ 9个月后, 所有的 rag2: hmyc, lck: egfp鱼开发 t-all, b-all, 或两者兼而有之。
  5. 对于 t-或 b-all 细胞隔离, 选择3级鱼 (all 占身体的 gt;50%), 它产生超过 2 x10 6 all 细胞, 通常会产生更多细胞。
  6. 按照步骤1.4 中的步骤1.4 对鱼进行安乐死。
    请注意:获得所有细胞的方法有两种: 全身同质化和腹膜清洗技术16。这些方法在收集用于排序的单元格的绝对数量上有所不同, 因此, 在流式细胞系统所需的时间和成本方面也有所不同 (有关详细信息, 请参阅讨论)。
  7. 无论哪种方法, 首先将安乐死的鱼放在培养皿中, 并使用剃须刀片, 取出头部, 包括胸腺区域。如果需要, 可以单独处理, 也可以用于组织学染色。
  8. 腹膜清洗方法
    1. 使用 p1000 移液器, 用500μl 的冷分选介质清洗鱼腹膜腔, 在5毫升管中收集细胞和培养基。
    2. 使用新鲜的移液器尖端, 再向体腔中注入200–300μl 的冷分选介质。然后, 使用移液器的尖端, 对鱼体施加温和的压力, 将细胞挤出体腔。收集此介质并添加到 5 ml 管。
    3. 重复步骤 2.8.2 2-3 次。将收集的单元格保存在冰上的培养基中。
    4. 在流式细胞仪/流式细胞仪之前, 通过35μm 网状过滤器对细胞悬浮液进行过滤, 并将细胞保持在冰上, 直到进行分析。
  9. 全身同质化
    1. 取下鱼头后, 将阀体放入含有200μl 分选介质的 1.5 ml 管中。
    2. 使用双管均质机对人体进行均质化。
    3. 添加额外的300μl 冷分选介质。通过35μm 网格过滤器对细胞悬架进行过滤。根据需要添加分拣介质, 通过过滤器清洗所有细胞, 直到滤清器上只保留组织碎片。将细胞放在冰上, 直到分析。

3. 正常或恶性 b 淋巴细胞的细胞学分析

  1. 根据制造商的指导, 设置流式细胞仪分析和流式细胞仪参数。
  2. 获取所需数量的事件, 以初步描述样本的特征。在排序之前分析 1 x 10 4 到 5 x10 4 事件, 以确定后续分选步骤的特定门。
    1. 确定门: 使用向前散射 (fsc) 和侧向散射 (ssc) 参数 (包括细胞碎片) 17 定义淋巴细胞和祖细胞门.fsc 和 ssc 分别对应于细胞大小直径和粒度。
      请注意:gfp-、gfplo和 gfp喜细胞在 gfp 荧光强度方面相差10到 100倍, 使这些人群的分离变得简单 (图 2-5)。此时可使用丙酸碘 (pi) 或 7-氨基放线菌素 d (7-aaad) 染色的可行性来评估活死歧视。先前的 pi 实验通常显示和 gt;95 的能力的 gfp + 细胞后 facs.
    2. 根据所使用的流式细胞仪机的参数排除单元双头。
    3. 在淋巴和/或前驱门内, 确定 gfp+细胞的数量和百分比。
  3. 使用植物菊酯 (pe) 和 gfp 强度, 定义 gfp 与 gfp 与 gfp与 gfphi细胞的门.
    请注意:b 细胞表现出暗淡的 gfp 荧光, t 细胞在lck: egfp线中表现出明亮的 gfp。许多淋巴器官或肿瘤样本同时包含 gfp+群体。b 系细胞/-all 是 gfplo和 t-沿袭细胞/all 是 gfphi。定义用于区分 gfp-、gfplo和 gfphi细胞的门, 并分别收集这些群体 (图 2a-c,3a-c,图 4 a图5a)。
  4. 将每个细胞群分为含有2毫升分选介质的不同15毫升聚丙烯管, 或直接放入含有适当缓冲液的不同 1.5 ml 管中进行进一步分析 (例如, rna、dna 或蛋白质提取、同种异体移植等)。
  5. 在进一步分析之前, 将纯化的细胞保存在冰上。

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Representative Results

我们采用流式细胞仪分析和流式细胞仪分离胸腺、肾骨髓和脾脏的 gfp lo 和 gfphi 细胞 : egfp转基因斑马鱼。对3个月大的鱼类的分析显示, 胸腺主要含有 gfp+淋巴细胞。gfp+细胞主要局限于 traver 等人先前描述的淋巴门.在胸腺中可以观察到两个不同的gfp + 种群, gfplo和 gfphi.gfphi淋巴细胞占较高的百分比, ~ 60%, 而 gfplo细胞不太丰富, 占胸腺淋巴细胞总数的 40% (表 1)。与哺乳动物不同的是, 鱼类造血骨髓是局限于肾脏, 而不是骨骼内。我们确定, 存在于肾脏骨髓中的 b 细胞也表达了较低的 gfp 水平 (图 2b图 3b)。骨髓中的 gfplo细胞丰富, 而 gfp细胞稀缺 (图 2b图 3b)), 这表明3个月大的骨髓中只有一小部分 t 淋巴细胞存在。脾脏样本的 gfp 值也高于 gfp细胞 (图 2c 图 3c)。我们还分析了双转基因 lck 胸腺、骨髓和脾脏的非恶性淋巴细胞: egfp; rag2: hmyc斑马鱼, 它们同时容易出现 t-all11.在尚未开发出 all 的鱼类中, 胸腺、骨髓和脾脏的结果类似于单转基因lck: egfp鱼。然而, 每个器官淋巴细胞的数量增加 (图 3), 大概是由于 myc 驱动的未成熟 b 和 t 细胞群的扩张, 其中rag2启动子是活跃的。

我们还分析了双转基因鱼类与 b-and/或 t-all 已经发展了荧光癌症6个月。可以预见, 患有荧光素的 b-all 鱼主要含有 gfplo细胞 (图 4a)。相反, 荧光明亮的鱼可以容纳孤立的 t-all 或混合种群的 gfplo b-all和 gfp 喜 t-all 细胞 (图 5).此处显示了混合 all 的一个示例, 其中包含不同的 b-和 t-all (图 5)。为了确定 gfplo和 gfphi细胞的身份, 分别为 b-和 t-谱系, 我们用定量实时 pcr (qrt-pcr) 对 b 细胞和 t 细胞特异性转录进行了分析。我们的研究结果显示, gfplo细胞表达的 b 细胞转录量较高, gfphi细胞表达的 t 细胞基因水平较高 (图 2d,3d,4 b此外, lck 和gfp在 gfplo all中的表达与 b-all体内模糊的 gfp 荧光相对应 (图 2d,3d,4 b和图5b;borga 等人先前描述的 qrt-pcr 条件和引物序列)11个

Figure 1
图 1: 不同的荧光模式在 lck: egfp转基因鱼.(a)荧光灯显微镜图像的 rag2: hmyc; lck: egfp鱼与明亮荧光 t-all (左) 或暗荧光 b-all (右)。在低曝光设置下, t-all 是可见的;只有使用高曝光才能看到 b-all。(b) 高暴露设置显示野生型lck (egfp鱼 (左) 和 rag2: hmyc 鱼的胸腺荧光微弱 (黄色圆圈); lck: 没有all 的 egfp 双转基因鱼类 (右)。刻度条 = 20 毫米. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: lck 淋巴细胞群: egfp斑马鱼。在顶部的图像显示了3个月大的 wt, lck: egfp鱼与高曝光设置或计算机增强 (以方便可视化)。鳞片条 = 20 毫米胸腺 (a)、骨髓 (b) 和脾脏 (c) 的流动细胞学分析。左面板显示 fsc (x 轴) 和 ssc (y 轴), 黑色椭圆形表示淋巴细胞门。中间面板使用 gfp (x 轴) 和 pe (y 轴) 描述基于荧光的门控。显示了 gfp hi (蓝色矩形) 、gfp lo (绿色矩形) 和 gfp- (黑色椭圆形) 种群。右面板显示 gfphi 和gfplo细胞的直方图。虚线表示中间面板中的门控条件。(d) wt lck:egfp thymi 为 gfphi (蓝色) 和 gfplo (绿色) 排序。b 细胞基因 (pax5)、t (cd4) 细胞特异性基因的表达、lckgfp的表达。结果归一化为家畜群基因 (β-肌动蛋白eef1a1l1), 并显示为折叠变化±标准误差 (s. e)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3:2: 白血病前的淋巴细胞群2: hmyc; lck: egfp斑马鱼.顶部的图片显示了3个月大的rag2: hmyc; lck: egfp 鱼, 高, 计算机增强的暴露。刻度条 = 20 毫米. a-d 零件的面板以与图 2相同的格式描绘。(d) pacs 纯化胸腺gflo (绿色) gfp hi (蓝色) lck (egfp 鱼)中 pax5、 cd4lck 和 gfp 表达. qrt-pcr 结果显示为折叠式±s. e. 请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: b-all rag2: hmyc 分析; lck: egfp转基因鱼类.(a) 顶部: 6个月大的 rag2: hmyc; lck: 使用高曝光设置的 b-all 的 egfp鱼。从鱼类体内分离出的肿瘤细胞的流式细胞仪分析与图 2的格式相同。(b) b-all gfplo 细胞(图 4a 中的绿色门)、 rag2: hmyc 中的绿色门、lck: egfp胸腺细胞 (图 3a 中的蓝门) 和 t-all gfp细胞 (图 5 a 中的蓝门) 中的基因表达).b (pax5, cd79a) 和 t (cd4) 细胞特异性基因、 lckgfp的表达。结果被归化为家养基因 (β-肌动蛋白eef1a11), 并显示为折叠变化±s. e. 缩放条 = 20 毫米. 请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 5
图 5: 混合所有rag2: hmyc 的分析; lck: egfp转基因鱼类.(a) 顶部: 6个月的rag2: hmyc; lck: 使用高曝光设置的混合所有鱼。从鱼类体内分离出的肿瘤细胞的流式细胞仪分析与图 2的格式相同。(b) gfphi (蓝色) 和 gfplo (绿色) 流式细胞仪门。b (pax5, cd79a) 和 t (cd4) 细胞特异性基因、 lckgfp的表达。结果被归化为家养基因 (β-肌动蛋白eef1a11), 并显示为折叠变化±s. e. 缩放条 = 20 毫米. 请点击这里查看这个数字的更大版本.

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Discussion

我们开发并提供了一种从 lck 中分离 b 细胞的协议: egfp转基因斑马鱼, 并将其添加到其他带有 b 系标签 3,4的 d . rerio 模型。有些令人惊讶的是, 自2004年描述以来, 这一行中 gfplo b 细胞的识别没有引起注意。一般来说, lck被认为是 t 细胞特有的6, 但最近的研究发现, 自然杀手和骨髓细胞, 以及 b 细胞中的意外 lck 表达, 如这里所示18,19. 与我们的发现一致, 斑马鱼 b 细胞是 gfplo, 前 b, 幼稚, 和成熟的 b 细胞在人类中也表达了低lck11,13

由于这些鱼类的 b 细胞和 t 细胞中的 gfp 水平不同, 现在可以从这条线中分离出这两个谱系的细胞。虽然这些动物已被经典地用于研究胸腺 t 淋巴细胞的发育和跟踪, 我们证明, 类似的研究也是可能的 b 细胞。为此, 我们在胸腺、肾骨髓和脾脏中, 在前工作的其他地方, 确定 b 细胞 11.

rag2: hmyc 中识别 b-all;egfp鱼需要敏锐的眼睛, 但通过练习, 很简单。接下来, 选择用于净化所有细胞的方法至关重要。在这里, 我们提出了两种方法: 腹膜清洗和全身同质化。腹膜清洗产生的总细胞数量要低得多, 但 gfp+细胞的比例非常高。因此, 几乎不需要外地资产管制系统所需的时间, 从而最大限度地降低了成本。对于总产量不那么重要的下游应用 (例如 qrt-pcr), 这样做更有效。或者, 整个身体同质化导致较大的单个细胞悬浮液含有更多的细胞, 但较低比例的细胞将是 gfp+。因此, 需要更多的流式细胞仪时间来收集与腹膜清洗相同数量的 gfp+细胞, 但还需要数百万细胞可以纯化。对于下游研究来说, 高收益很重要 (例如, 西方印迹), 这可能会抵消增加的成本。此外, 对于 all 研究, 全身同质化捕获存在的癌细胞的多样性, 更准确地表示肿瘤异质性。虽然没有在我们的协议中列出, 它也是可行的, 它是唯一的 gfp+身体区域/器官从鱼与 all 通过粉碎在培养皿中的均质化, 从而减少总流式细胞仪的时间和成本, 类似于腹膜清洗。

胸腺 gfp 在lck:egfp鱼中的表达表明, gfp 早在 5 dpf6就可以检测到。我们在这里的研究是在3个月或3个月以上的成年鱼类身上进行的, 结果表明, 在这个年龄, b 细胞在肾骨髓和脾脏中含量很高, 但 t 细胞是罕见的。随后对不同年龄的鱼类进行研究, 以确定 t 细胞在不同的时间点是否更普遍。同样, 在3个月时, 胸腺中的 t 细胞被丰富, 但也存在相当数量的胸腺 b 细胞。如果这些淋巴细胞群在不同的年龄变化目前是未知的, 但总体来说, 胸腺荧光消失在lck: egfp鱼开始在性成熟 (~ 3个月), 所以它很可能是 t 细胞数量减少随着年龄的增长, b 细胞可能也。同样, 当 gfplo b 细胞殖民斑马鱼胸腺目前是未知的。使用lck:egfp鱼, 现在可以监测胸腺 b 和 t 细胞的发育, 流入, 流出, 以及这些事件的具体动力学。此外, 这些问题也与 b 细胞所在的其他解剖部位有关, 如肾骨髓、脾脏、血液和肠道 (未显示数据)。

除了 b 细胞发育研究, 我们最近在lck 发现了 b-all: egfp;rag2: hmyc双转基因鱼11。转基因rag2: hmyc 被认为诱导 t-all10,但 b-all 已经不被识别。由于这种癌基因的高渗透率, 这两种类型的 all 是普遍的, 在这些鱼, 许多鱼实际上同时开发这两种类型的所有类型11。由于 b-all 是 gfplo, 而 t-all 是 gfphi,不同的 gfp 表达式允许这两个实体被流式细胞仪隔离, 即使发生在同一动物中也是如此 (图 5a)。至关重要的是, 在正常和恶性淋巴细胞中, qrt-pcrregent 表明, gfplo和 gfphi细胞分别与 b-和 t 系一致 (图 2图 3)。

lck 的未开发潜力: egfp鱼是这项工作的核心, 这突出表明, 许多先前存在的转基因线路可能具有超出其预期目的的效用。在这里, 我们提出了一个新的协议, 以分离 b和 t 细胞从 d. rerio 与转基因lck: egfp, 打开了关于正常和恶性 b 淋巴细胞的新的研究途径的大门。这些研究的结果无疑将重新激活已经成为造血、淋巴和癌症生物学领域宝贵资源的东西。

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Disclosures

提交人声明没有利益冲突。

Acknowledgments

我们要感谢梅加马龙-佩雷斯对斑马鱼的护理, 以及 ouhsc 流式细胞仪的核心。这项工作得到了现代希望车轮、俄克拉荷马科学和技术促进中心 (hrp-067)、nihx\ igms inbre 试点项目奖 (p20 gm103447) 的资助。jkf 担任急诊室 & 西尔玛·盖洛德, 担任儿童医院基金会儿科血学-肿瘤学主席。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 µm mesh Sefar Filter technology 7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap Falcon Corning Brand 352235
50 mL conical tube VWR international 525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope Nikon
Cytoflex Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 Sigma E-10521
FACSJazz BD Biosciences
Fetal bovine Serum Thermo Fisher 10437028
FlowJo v10.2 FlowJo, LLC
lck:eGFP See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software Nikon Version 4.13
Penicilin-Streptomycin Sigma P4333
Pestle micro-tube homogenizers Electron Microscopy Sciences 64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x Life Technologies 11835-030

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References

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