一种新的坏死性肠结肠炎人上皮肠素模型

Immunology and Infection

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Summary

肠类正在成为人类疾病研究的新模式。该协议描述了如何模拟人坏死性小肠结肠炎的肠素模型使用脂多糖 (LPS) 治疗从新生儿组织产生的肠内化合物。收集的肠素显示炎症变化类似于那些在人类坏死性小肠结肠炎。

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Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

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Abstract

坏死性小肠结肠炎 (NEC) 是新生儿的一种毁灭性疾病。它的特点是人类肠道上皮的多种病理生理改变, 导致肠道通透性增加, 恢复受损, 细胞死亡增加。虽然 NEC 有许多动物模型, 但对伤害的反应和治疗干预可能在物种之间差异很大。此外, 直接在人体, 特别是儿童身上研究疾病病理生理学或新型治疗药物在伦理上具有挑战性。因此, 开发一种利用人体组织的新的 NEC 模型是非常可取的。肠内化合物是从肠道上皮细胞中提取的三维有机体。它们是研究复杂生理相互作用、细胞信号转导和宿主病原体防御的理想选择。在这份手稿中, 我们描述了一个方案, 培养人类肠内化合物后, 从患者的肠道切除分离。隐孢子细胞在培养基中培养, 培养基中含有生长因子, 鼓励分化为人体肠道上皮所固有的各种细胞类型。这些细胞生长在一种合成的胶原蛋白混合物中, 作为支架, 模仿细胞外基底膜。因此, 肠体发育到顶端-基外侧极性。在培养基中联合使用脂多糖 (LPS) 会引起肠内的炎症反应, 导致组织学、遗传和蛋白质表达的改变, 类似于人类 NEC 中的变化。使用人体组织的 NEC 实验模型可以为人体试验前的药物和治疗测试提供更准确的平台, 因为我们努力确定这种疾病的治愈方法。

Introduction

人肠内化合物是一种从人体肠道组织样本的肠道隐窝中分离出的干细胞产生的体外三维培养系统。2007年, 汉斯·克莱弗斯等人在小鼠1的小肠隐窝中发现 lgr5 + 干细胞后, 开创了这一突破性模型。他们的工作为建立多种细胞类型的体外肠道上皮培养奠定了基础, 这些细胞可以在没有明显遗传或生理变化的情况下被传代2。自这一发现以来, 肠体已被用作研究正常消化生理学的新模型, 以及炎症性肠病、宿主病原体相互作用和再生医学2等肠道疾病的病理生理学.

与替代技术相比, 使用肠内生物作为肠道病理生理学研究的体外模型有几个优势。近几十年来, 动物模型和不朽的肠道癌症衍生细胞系被用于肠道生理研究3,4,5。单细胞培养并不代表正常肠道上皮细胞类型的多样性, 因此在蛋白质表达、信号和病原诱发疾病方面缺乏细胞对细胞的交叉对话和节段特异性 6.肠内细胞中的干细胞分化为主要的上皮细胞类型, 如肠细胞、Paneth 细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞等3种。它们表现出极性, 执行上皮运输功能, 并允许肠道部分特异性6。由于肠体可以重述人类肠道上皮的多种细胞类型, 他们能够克服这种公认的局限性的癌症细胞为基础的系统。随着时间的推移, 细胞系的衍生物被克隆和进化, 以显示出更大的多样性, 蛋白质表达和定位3。相反, 肠内化合物可以在没有显著遗传或生理变化的情况下进行传代2。尽管有许多 nec 的动物模型, 但对伤害的反应和治疗干预可能在物种之间差异很大。由于这些限制, 从动物模型中提取的疗法在人体试验中测试的时间有90% 的时间都在失败, 因为毒性或疗效的差异3。肠素作为有前途的临床前模型, 可以克服这些缺陷, 导致更好地了解复杂的肠道病理生理学, 从而更成功和更具成本效益的治疗创新。最近还有证据表明, 肠体产生的组织年龄在生物学上仍然重要 7.这是一个特别重要的细节, 我们的模型, 因为肠素是由新生儿组织产生, 从而保持生理相关性的 nec 患者。

肠类固醇作为人类疾病的模型的效用继续扩大, 希望找到治疗严重和普遍的疾病的方法。坏死性小肠结肠炎 (NEC) 是一种破坏性的新生儿肠道疾病, 其特点是肠道坏死, 经常导致肠壁穿孔、败血症和死亡8。由于 NEC 的复杂和多因素病理生理学, 该疾病的确切机制尚未得到充分阐明;然而, 肠道通透性的增加显然与疾病过程牵连8。鉴于 NEC 和潜在治疗药物的研究在人类主体, 特别是儿童的伦理上具有挑战性, 因此非常希望使用使用人类新生儿组织的 NEC 的生物学相关肠样模型。到目前为止, 肠体在 NEC 的研究中的作用有限。该方案描述了从人体肠道组织样本中提取的肠素作为一种新的体外模型来研究坏死性小肠结肠炎的方法。

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Protocol

获得机构审查委员会批准 (IRB #2013-15152), 以便从伊利诺伊州芝加哥安和罗伯特 H. Lurie 儿童医院接受肠道切除的病人收集组织样本。所有议定书都是按照机构和国家人类福利准则和条例执行的。在所有情况下, 在采集样本之前都需要得到父母的书面知情同意。

1. 试剂制备

  1. 为整个组织收集准备培养基库存溶液: Dulbecco 改性鹰培养基 (DMEM) 的1升、胎儿牛血清 (FBS) 的110毫升、青霉素-链霉素的11毫升 (最终浓度 1%)和1.1 毫升的过滤灭菌胰岛素 (最终浓度 0.1%)。将库存解决方案存放在4°c。
  2. 准备螯合缓冲 #1:30 毫升培养基 (如1.1 所述), 600μl 0.5 m 乙二胺四乙酸 (EDTA) (最终浓度为 10 mM), 300μl 的 Gentamicin (最终浓度 1%)和60μl 的两性霉素 B (最终浓度 0.2%)。将库存解决方案存放在4°c。
  3. 准备螯合缓冲 #2:30 毫升培养基 (如1.1 所述)、30μl 0.5 m EDTA (最终浓度 5mM)、300μl 的 Gentamicin (最终浓度 1%)和60μl 的两性霉素 B (最终浓度 0.2%)。将库存解决方案存放在4°c。
  4. 制备人的微型介质: 41.4 毫升的 DMEMCSEF-12, 5 毫升的 FBS (最后 10%), 500Μl 的青霉素链霉素 (最终浓度 1%), 500μl 的 l-谷氨酰胺 (最终浓度 1%), 500μl 的庆大霉素 (最终浓度 1%), 100μl 的两性霉素 b (最终浓度 0.2%), 500μl 的 1 m n-2-羟基乙基哌嗪-n-乙烷磺酸 (HEPES) (最终浓度为 10 mM), 500μl 的 100x N-2 补充剂, 和1毫升的 50x B-27 补充减维生素 A 的总体积为50毫升。将库存解决方案存放在-20°c。
  5. 准备完成的人的微型媒体:10 毫升的人的微型媒体 (编写于 1.4), 10μl 100μml Wnt3a (最终浓度为 100 Ng/ml), 10μl 100μml Noggin (最终浓度为 100 ng/mL), 10μl 1 mgml R-spondin (最终浓度 1Μg/ml), 10μl 500μml 表皮生长因子 (EGF) (最终浓度为 50 Ng/ml), 10μl 1 m n-乙酰半胱氨酸 (最终浓度为 1 mM), 10μl 10 mm y-27632 (最终浓度为 10Μm), 10μl 500μm a-83 (最终浓度为 500 nM), 10μl 10 mm SB202190 (最终浓度为 10ΜL)浓度 10μm)、100μl 1 m 烟酰 (最终浓度为 10Mm) 和 1μl 100Μm [leu] 15-gastrin 1 (最终浓度为 10Nm)。总成交量10毫升。将库存解决方案存放在4°c。
    请注意:解决方案必须在48小时内使用。

2. 全组织的隐分离与电镀

  1. 在手术套件中收集时, 将人体小肠组织样本放入冷杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 中。用冷 DPBS 清洗标本, 直到大便和血液消失。将样品存放在 RPMI 1640 介质中 4°C, 直至准备进行密码隔离。
    请注意:组织的储存时间不能超过24小时。
    1. 确保标本没有大便和血迹。使用精致的解剖剪刀, 去除任何多余的脂肪或手术使用的小东西等。称重标本。
      请注意:目标为一块约 0.75-2.5 g。
  2. 将试样切成0.5 厘米的碎片, 放入30毫升的螯合缓冲器 #1 (如步骤1.2 中准备的)。
    1. 在4°C 下低速晃动15分钟。
    2. 通过100μm 细胞过滤器过滤组织, 并丢弃流经。
  3. 将组织加入到 #2 的螯合缓冲器的30毫升中 (在步骤1.3 中准备)。
    1. 在4°C 下低速晃动15分钟。
    2. 通过100μm 的细胞过滤器过滤组织, 并丢弃流经。
  4. 在步骤2.8 中, 在冰上解冻500毫升基底膜基质。
  5. 在50毫升锥形管内将组织加入10毫升的冷 DMEM 中, 用手大力晃动10秒。
    1. 通过100μm 电池过滤器过滤, 并收集流经 (标签 #1)。把管子 #1 放在冰上。
    2. 将组织加入到另一个10毫升的冷 DMEM 中, 在一个单独的50毫升锥形管中, 用手大力晃动10秒。
    3. 通过100μm 电池过滤器过滤, 并收集流经 (标签 #2)。
    4. 重复两次, 直到有四个锥形管通过 (标记的管 #1-4)。
  6. 过滤管 #1 溶液通过100μm 的电池过滤器和转移流通过15毫升锥形管 (标签 #1)。对 #2-4 重复此操作。
    1. 离心15毫升管 #1-4 在 200 x g下 15分钟, 在4°c 下。
  7. 在层流罩中, 从管中取出上清液, #1-4, 然后丢弃。避免破坏颗粒上方的组织云, 即使这意味着留下一些上清液。
    1. 通过缓慢移液, 将颗粒与剩余的上清液混合在一起, #1-4。
    2. 将混合物从 #1-4 管中转移到一个单独的 2 mL 锥形管中。
    3. 在4°C 条件下, 以 200 x g离心锥形管20分钟。
  8. 取出上清液, 重新悬浮在500μl 的基底膜基质中的颗粒。
    注:
    始终将基底膜基质保持在冰上, 并快速执行下一步工作。本产品在室温下聚合速度非常快。
    1. 在24孔板的井的中心涂上50Μl 的膜基质悬浮液。这应该看起来是圆顶形的。
      请注意:使用冷移液器吸头有助于更平稳地转移悬浮液, 最大限度地减少聚合。
    2. 重复 9次, 共填充10口井。
  9. 将24孔板放置在37°c、5% CO2孵化器中 30分钟, 以便进行聚合。
  10. 在每口井中加入500Μl 的人的微型介质完成 (如步骤1.5 中准备的)。每2天更换一次。
  11. 收集肠素5-10 后, 当发芽被可视化。有关收集说明, 请参阅步骤4和5。

3. 实验 NEC 的诱导

  1. 在第0天的每口井中加入10μl 的 5 mgml 脂多糖 (LPS) 到500μl 的人 Minigut 培养基完成 (在步骤1.5 中准备) 中。每2天更换一次, 直至收集。

4. 石蜡嵌入的准备

  1. 轻轻删除介质。
    1. 加入1毫升的 PBS, 并轻轻地向上和向下移液器溶解基底膜基质, 注意不要裂解肠内。
    2. 将 Pbs/肠类混合物 lt;300 克离心 5分钟, 以颗粒和去除 pbs。
  2. 加入4% 的甲醛, 在室温下固定1小时。
  3. 离心在 & lt;300 x g 5分钟的颗粒, 然后删除 pbs。
    1. 用1毫升的 PBS 和离心机轻轻清洗5分钟至颗粒, 然后取出 pbs。
    2. 重复步骤4.3.1。
  4. 将所需的量放入锥形管中, 并在65°c 的干浴孵化器中加热 3-10, 直到液态, 从而融化足够体积的组织加工凝胶 (约 300μl)。
    1. 将组织加工凝胶加入颗粒, 轻轻搅拌。
    2. 在盖板上, 放置一个小的克隆环。
    3. 将组织处理凝胶和肠内混合物移入安装在盖板上的克隆环。
  5. 允许组织加工凝胶和肠内液混合物在4°c 下凝固1小时。
    1. 将凝固混合物的克隆环浸入70% 乙醇中, 制备石蜡包埋。

5. 用于 RNA 和蛋白质提取的肠素收集

  1. 轻轻删除人类的迷你媒体完成从每个井。
  2. 加入1毫升 PBS, 上下轻轻移液器溶解基底膜基质。注意不要分离肠内。
    1. 将 Pbs/肠内酯类混合物放入无菌的2毫升锥形管中。
    2. 离心 5分钟, 以 lt;300 x g离心。
    3. 轻轻删除 PBS, 注意不要删除肠内。
  3. 重复步骤系列5.2 两次。
  4. 冻结-80°c, 直到准备好蛋白质和/或 RNA 提取。
  5. 使用成熟的 qRT-PCR 和西方印迹技术对肠内化合物进行基因表达和蛋白质分离。

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Representative Results

电镀后, 新鲜隔离的肠道墓穴立即显示为细长的棒。在数小时内, 肠体将出现圆形外观 (图 1a)。在接下来的几天里, 肠体将开始形成球体, 如图 1b 所示。发芽应发生在5-10 之间 (图 1c), 肠体收集应在该时间发生。

生长中的肠体也会表现出极性, 包含一个集中的腔、一个顶端边界和一个基底外侧域 (图 2)。肠体还表现出结构完整性, 由坚固的肌动蛋白细胞骨架表示 (图 3)。经过几天的培养, LPS 治疗的肠内生物细胞凋亡较多, 产量将低于对照组 (图 4)。如人类 NEC 和 NEC 9 的小鼠模型所示,与对照组相比, lps 治疗的肠体中的 toll 样受体 4 (tlr4) 表达增加 (图 5)。

Figure 1
图 1: 从整个组织中形成隐培养和人的肠体形成.(a) 第一天的加密文化, 圆的, 扁平的外观。(b) 第4天形成球体的肠体。(c) 第7天有萌发的肠体 (黑色箭头)。刻度条 = 50μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 肠体的组织学外观.海莫托西林和 Eosin 染色。肠内面显示一个集中的腔, 并表现出极性, 具有顶端和基外侧域。血液毒素酶 (紫色) 代表细胞核, 而 eosin (粉红色) 代表细胞质成分。刻度栏 = 20μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 肠样肌动蛋白细胞骨架.肠体的免疫花期显微镜。肠素表现出结构的完整性, 表现为突出的肌动蛋白细胞骨架 (品红色)。用 DAPI (蓝色) 染色的核子, 刻度条 = 100μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 4
图 4:随着 LPS 的处理, 人的肠样培养产量下降.第五天的肠体在培养中, 生长从相同的整个组织样本。(a) 使用控制培养基处理的肠类。显示强劲增长。(b) 在培养基中使用 lps 治疗的肠类。只有少数存活的肠体。刻度栏 = 200μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5:增加 TLR4 在实验性 nec 肠素中的表达.(a) Qrt-pcr 显示, 暴露在 lps 中的肠内化合物中 Tlr4 MRNA 表达增加 (p = 0.03)。(b) 西方印迹分析显示, 实验人类肠素 nec 中 TLR4 的表达增加 (p = 0.02)。代表性西部污点描绘。值是指每组3个样本的± SEM。* p < 0. 5 由学生的t测试。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

这种新型的体外人体肠肠素模型可作为坏死性小肠结肠炎 (NEC) 肠道屏障功能障碍的研究方法。这里介绍的肠内处理方法是根据 Misty good 博士、Michael Helmrath 博士和 Jason Wertheim博士 101112 的前一部工作改编的。

有关整个组织收集和密码隔离时间的详细信息是本协议中的关键步骤。手术切除时必须立即收集组织, 并在组织到达实验室后立即进行处理, 以便进行隐窝隔离。我们从3个月以下的患者中选择了组织进行这种模型。如果需要, 在整个组织收集后的24小时内可能会发生延迟处理。此外, 人体组织样本的质量对隐窝分离的产量有很大的影响。健康的小肠没有潜在的病理和年轻患者 (& lt;2 月的年龄) 被发现能产生最好的结果。此外, 收集的组织应选择从最健康的区域, 通常在切除标本的远端。使用较大的肠子并不能改善与上述协议中描述的溶液量的加密隔离。长约1-2 厘米、重为 0.75-2.5 克的肠道段是最佳的。从成熟的细胞培养和动物模型中模拟了通过 LPS 暴露诱导实验 NEC 的方法。Hackam 等人的既定工作表明, tlr4 (lps 受体) 在 nec 发展中的关键作用是 9131415.TLR4 的 LPS 激活刺激促炎细胞因子, 屏障完整性的降低, 并激活细胞上皮细胞, 这些白细胞是人类 NEC 所涉及的信号事件的特征。TLR4 被认为是促进炎症的关键分子7和缺乏功能 TLR4 的动物已证明保护免受 nec 15 的发展.NEC 患者的 Lps 循环水平升高, nec 动物模型的粪便和血浆中 LPS 水平升高。LPS 在类似人类 NEC 的动物中诱发肠道炎症, 这突出了炎症在这一途径中的意义。通过 LPS 管理在肠内培养中诱导实验 nec, 是研究 nec 的一个有用的体外人类新生儿模型。与其他已建立模型中的前一次报告一致, 我们的实验 NEC 肠体显示, 与对照相比, TLR4 的表达方式有所增加。

通过 LPS 曝光诱导实验 NEC 的协议经历了一些重要的修改和改进。最初, 肠体生长 5天, 然后接种 LPS 24小时, 然后收集。该协议现在建议 LPS 在第0天接种, 在收集之前的每一个培养基媒体变化中都要继续进行曝光。此外, LPS 的用量进行了优化。在进行剂量曲线和试验几种不同的 LPS 浓度后, 选择了 5 mgml。并尝试了 LPS 在电镀时直接接种到基底膜基质-肠类混合物中的实验;然而, 这很繁琐, 并没有改善结果。

随着人类肠素模型的利用的发展, 应该解决一些限制。自2007年发现以来, 已经使用了几个不同的协议来建立和培养肠系膜。肠体维持和分化所需的多种生长因子缺乏标准化, 这可能会影响重现性。此外, 肠样培养缺乏机械力, 影响人类肠道上皮在生理条件。来自腔流和蠕动的压力可能会影响基因和蛋白质的表达, 这在这个模型中没有考虑在内。这种模式也缺乏神经, 免疫细胞, 微生物群, 血管和间充质存在于人类肠道上皮。

在这种人类肠道肠样模型中接触 LPS 会导致炎症反应, 导致组织学、遗传和蛋白质表达的改变, 类似于人类 NEC 中发现的变化。虽然目前有几种动物模型的 nec, 肠道损伤的反应和治疗干预在物种之间差别很大。由于研究疾病病理生理学或直接在人类特别是婴儿身上测试新型治疗药物在伦理上具有挑战性, 因此继续利用人体组织培育这种新型的 nec 体外模型是极其重要的。人类肠道类固醇易于基因改造, 可能是许多人类肠道疾病治疗的基础.未来的方向应该是培养人类肠素在一个渗透支架上的灌注室的顶端和亚油路流动, 以重现体内隐毛结构, 以及生理力量, 如蠕动和腔流。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了国家糖尿病、消化和肾脏疾病赠款研究所 (K08DK106450) 和美国儿科外科协会 jay Grosfeld 奖对 c. j. h. 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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