Bir roman insan epitel Enteroid nekrotizan enterokolit modeli

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Enteroids insan hastalık insan yeni bir model olarak ortaya çıkıyor. Protokol insan nekrotizan enterokolit yenidoğan dokusundan üretilen enteroids tedavisinde lipopolysaccharide (LPS) kullanarak bir enteroid modeli benzetimi açıklar. Toplanan enteroids benzer-e doğru o insan nekrotizan enterokolit görülen iltihabi yapılan değişiklikleri göstermektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Enterokolit Nekroze edici (NEC), yeni doğan bebeklerin yıkıcı bir hastalıktır. Artan bağırsak geçirgenliği için önde gelen insan bağırsak epitel içinde birden çok Etyopatogenezi değişiklikler ile karakterize, restitüsyon engelliler ve hücre ölümü arttı. NEC çok sayıda hayvan modelleri olmakla birlikte, yaralanma ve tedavi müdahaleler karşısında türler arasında son derece değişken olabilir. Ayrıca, hastalık patofizyolojisi veya insan denekler, özellikle çocuklar doğrudan roman terapötik ajanlar çalışmaya etik meydan okuyor. Bu nedenle, insan dokusu kullanarak NEC yeni bir model geliştirmek için son derece arzu edilir. Enteroids bağırsak epitel hücrelerinden elde edilen 3 boyutlu organoids vardır. Karmaşık fizyolojik etkileşimleri, hücre sinyallemesi ve ana bilgisayar-patojen savunma çalışma için idealdir. Bu el yazması biz o kültürlerin insan enteroids bağırsak rezeksiyonu geçiren hastaların bağırsak kök hücreleri izole sonra bir iletişim kuralı tanımlamak. Crypt hücre farklılaşması çeşitli hücre türleri yerli bir insan bağırsak epitel içine teşvik büyüme faktörleri içeren medya kültürlü. Bu hücreler ekstra hücresel membran taklit eden bir iskele hizmet proteinler kolajen, sentetik karışımı yetiştirilmektedir. Sonuç olarak, enteroids demiri apikal polarite geliştirmek. Lipopolysaccharide (LPS) medya ortak yönetim enteroids, histolojik, genetik için önde gelen ve protein ifade değişiklikler bu insan NEC görülen benzer bir enflamatuar yanıt neden olur. Biz bu hastalık için bir tedavi tanımlamak için çalışıyoruz gibi insan dokusu kullanarak NEC deneysel bir model uyuşturucu ve insan denemeler önce test tedavi için daha doğru bir platform sağlar.

Introduction

İnsan enteroids olan ex vivo 3 boyutlu kültür sistem kök hücreleri insan intestinal doku örnekleri bağırsak kriptalarının izole. Bu çığır açan model 2007 aşağıdaki fareler1bağırsakta kriptalarının, Lgr5 + kök hücre keşfi Hans Clevers vd tarafından öncülük. İşlerini eski bir kurmak için temeli atıldı vivo bağırsak epitel kültür önemli genetik veya fizyolojik değişiklikler2olmadan passaged birden çok hücre tiplerinin. Keşfinden bu yana enteroids, normal sindirim fizyolojisi ve inflamatuvar barsak hastalığı, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri ve rejeneratif tıp2gibi bağırsak hastalıkları Patofizyoloji çalışmaya yeni bir model olarak kullanılmıştır.

Kullanım eski bir olarak enteroids in vivo modeli bağırsak patofizyolojisi incelenmesi için alternatif teknikleri üzerinde birçok avantajı vardır. Son birkaç on yıl için hayvan modelleri ve ölümsüzleştirdi bağırsak kanseri türetilmiş hücre hatları bağırsak fizyolojisi3,4,5eğitim için kullanılmaktadır. Tek hücre kültürleri böylece hücre-hücre çapraz-hadis ve segment-özgüllük protein ifade, sinyal ve patojen kaynaklı hastalık6eksik hücre tipleri içinde normal bağırsak epiteli, mevcut çeşitliliği temsil etmemektedir. Enteroids kök hücre Binbaşı epitel hücre tipleri enterositler, Paneth hücreleri, goblet hücreleri, enteroendocrine hücreleri ve daha fazla3gibi ayırt etmek. Onlar polarite sergi, epitel taşıma iþlevlerini ve bağırsak segment özgüllük6için izin. Enteroids insan bağırsak epitel birden çok hücre türleri özetlemek beri onlar kanser hücre tabanlı sistemler tanınan bu sınırlamayı aşmak mümkündür. Zamanla, hücre hatları türevleri subcloned ve protein ifade ve Yerelleştirme3daha fazla çeşitlilik gösteren gelişmeye. Aksine, enteroids önemli genetik veya fizyolojik değişiklikler2olmadan passaged. NEC için çok sayıda hayvan modelleri mevcut olmasına rağmen yaralanma ve tedavi müdahaleler karşısında türler arasında son derece değişken olabilir. Bu sınırlamalar bir sonucu olarak, hayvan modellerden elde edilen tedavi başarısız zaman % 90 toksisite veya etkinliği3farklılıkları nedeniyle insan çalışmalarda test edilirken. Enteroids daha iyi bir karmaşık bağırsak patofizyolojisi ve bu nedenle, daha fazla anlayış için önde gelen bu yetersizliklerin üstesinden gelebilir umut verici önceden klinik modelleri hizmet başarılı ve uygun maliyetli tedavi yenilikler. Biyolojik açıdan önemli7yaşında bir enteroid kaynaklandığı doku kalır son kanıtlar da vardır. Enteroids böylece NEC ile hastaların fizyolojik alaka Bakımı, Yenidoğan dokusundan üretilen bu yana bu modelimiz için özellikle önemli bir ayrıntı var.

Enteroids yardımcı programı gibi modelleri insan hastalıkların tedavileri şiddetli ve yaygın koşullarına inanışı genişletmeye devam ediyor. Enterokolit Nekroze edici (NEC) tarafından bağırsak nekroz ile karakterize ventilasyon yıkıcı bir bağırsak hastalığı ve sık sık için bağırsak duvarı, septisemi ve ölüm8delikli açar. NEC karmaşık ve multifaktöriyel Patofizyoloji nedeniyle hastalığın kesin mekanizması henüz tam aydınlatılmamıştır değil; Ancak, artan bağırsak geçirgenliği açıkça hastalık süreci8' karıştığı olmuştur. Verilen, NEC ve potansiyel terapötik ajanlar insan denekler, özellikle çocuklar etik meydan okuyor, bu insan yenidoğan dokusu kullanarak NEC biyolojik ilgili enteroid modeli kullanmak için son derece arzu edilir. Şimdiye kadar enteroids NEC çalışmada sınırlı bir role sahip. Bu iletişim kuralı ex vivo modeli nekrotizan enterokolit çalışma için bir roman olarak insan bağırsak dokusu örneklerinden elde edilen enteroids açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Kurumsal inceleme kurulu onayı (IRB #2013-15152) elde edilen bağırsak rezeksiyonu Ann ve Robert H. Lurie Çocuk Hastanesi, Chicago, Chicago, Il geçiren hastaların doku örnekleri topluluğu için. Tüm iletişim kuralları kurumsal ve ulusal kurallara ve düzenlemelere insan refahı için uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Yazılı bilinçli ebeveyn onayı gerekli ve örnek koleksiyon her durumda önce elde.

1. reaktif hazırlık

  1. Bütün dokusu toplamalarında kültür medya hisse senedi çözüm hazırlamak: 1 L, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM), 110 mL, Fetal sığır Serum (FBS), 11 mL penisilin-streptomisin (son konsantrasyonu % 1) ve 1.1 mL filtre sterilize insülin (son konsantrasyonu % 0.1.) Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
  2. Chelating arabellek #1 hazırlamak: Kültür ortamının, (1. 1'de açıklandığı gibi) 30 mL 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 600 µL (son konsantrasyonu 10 mM), 300 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1) ve Amfoterisin b (son konsantrasyonu % 0,2) 60 µL. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
  3. Chelating arabellek #2 hazırlamak: Kültür ortamının, (1. 1'de açıklandığı gibi) 30 mL 0.5 M EDTA (son konsantrasyonu 5mM), 300 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1), 300 µL ve Amfoterisin b (son konsantrasyonu % 0,2) 60 µL. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
  4. İnsan Minigut ortam hazırlamak: 41.4 mL DMEM/F-12, 5 mL FBS (son %10), penisilin-streptomisin (son konsantrasyonu % 1), L-glutamine (son konsantrasyonu % 1), gentamisin (son konsantrasyonu % 1), amfoterisin b (final 100 µL 500 µL 500 µL 500 µL konsantrasyonu % 0,2), 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sülfonik asit (HEPES) 500 µL (son konsantrasyonu 10 mM), N-2 100 x 500 µL ek ve 50 x 1 mL B-27 ilave Vitamin A toplam hacmi 50 mL için. Hisse senedi çözüm-20 ° C'de depolayın
  5. İnsan Minigut medya tam hazırlayın: 10 mL insan Minigut medya (hazırlanan 1.4), 10 µL 100 µg/ml Wnt3a (son toplama 100 ng/mL), 100 µg/ml kafa (son toplama 100 ng/mL), 1 mg/ml R-Spondin 10 µL 10 µL (son konsantrasyonu 1 µg/mL) , 500 µg/ml Epidermal büyüme faktörü (EGF) (son konsantrasyonu 50 ng/mL), 1 10 µL 10 µL M N-Acetylcysteine (son konsantrasyonu 1 mM), 10 µL 10 mm Y-27632 (son konsantrasyonu 10 µM), 10 µL 500 µM A-83 (son konsantrasyonu 500 nM), 10 mm SB202190 (son 10 µL konsantrasyonu 10 µM), 1 M Nikotinamid 100 µL (son konsantrasyonu 10 mM) ve 100 µM [Leyi] 15-gastrin 1 (son konsantrasyonu 10 nM) 1 µL. Toplam hacmi 10 mL. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
    Not: Çözümler 48 saat içinde kullanılmalıdır.

2. crypt yalıtım ve kaplama bütün dokusundan

  1. Operatif paketindeki toplanması sırasında insan küçük bağırsak doku örneği soğuk Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS içinde) yerleştirin. Örnek içinde soğuk DPBS kadar dışkı ve kan temiz yıkayın. Numune 4 ° C'de crypt yalıtım için hazır kadar RPMI 1640 ortamda depolayın.
    Not: Doku daha 24 h depolanamaz.
    1. Numune kan ve dışkı açık olduğundan emin olun. Hassas diseksiyon makası kullanarak herhangi bir aşırı yağlı veya cerrahi klipleri/zımba vb kaldırın. Numune tartın.
      Not: Bir parça yaklaşık 0,75-2,5 g nişan al.
  2. Numune 0.5 cm parçalar halinde kesilmiş ve tampon #1 şelat 30 mL (1.2 adımda hazırlanan gibi) yer.
    1. 4 ° C'de 15 dakika düşük hızda sallamak
    2. Doku 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve akışı aracılığıyla atın.
  3. Doku şelat arabellek # 2 30 mL (Adım 1.3 hazırlanırken) ekleyin.
    1. 4 ° C'de 15 dakika düşük hızda sallamak
    2. Doku 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve akışı aracılığıyla atın.
  4. Membran matris kullanılmak üzere adım 2.8 buzda 500 mL çözülme.
  5. Soğuk DMEM 50 mL konik tüp 10 mL doku eklemek ve el 10 tarafından şiddetle çalkalanır s.
    1. 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve (etiket #1) aracılığıyla akış toplamak. Tüp #1 buz üzerinde tutun.
    2. Başka bir 10 mL soğuk DMEM ayrı 50 mL konik tüp içinde doku eklemek ve el 10 tarafından şiddetle çalkalanır s.
    3. 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve akış (etiket #2) toplamak.
    4. Dört konik tüpler (etiketli tüpler #1-4) ile akışı ile olana iki ek kere tekrar edin.
  6. Filtre #1 solution'ı bir 100 µm hücre süzgeç ve aktarım akış 15 mL konik tüp (etiket #1) içine tüp. #2-4 için yineleyin.
    1. 15 mL tüpler #1-4'te 200 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
  7. Laminar akış başlıklı süpernatant tüpler #1-4 kaldırmak ve atın. Bazı süpernatant geride bırakarak anlamına gelse bile bulut hemen üstündeki Pelet doku engellemeden kaçının.
    1. Yavaş yavaş pipetting tarafından Pelet artık #1-4 tüplerde süpernatant ile karıştırın.
    2. Karışım tüpler #1-4 bir tek 2 mL konik tüp içine aktarın.
    3. Konik tüp vasıl 200 x g 4 ° C'de 20 dk santrifüj kapasitesi
  8. Süpernatant kaldırmak ve Pelet membran matris 500 µL içinde yeniden askıya alma.
    Not:
    membran matris buz üzerinde sürekli ve hızlı bir şekilde çalışmak için sonraki adımlar. Bu ürün çok hızlı bir şekilde oda sıcaklığında polymerizes.
    1. Numune/Bodrum membran matris süspansiyon 50 µL 24-şey plaka bir kuyuda ortasına uygulayın. Bu kubbe seklinde görünmesi gerekir.
      Not: Soğutulmuş pipet ipuçları kullanımını polimerizasyon en aza indirerek daha düzgün aktarımda süspansiyon, yardımcı olur.
    2. 10 toplam wells doldurmak için 9 kere tekrar edin.
  9. 24-şey plaka 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka polimerizasyon izin vermek 30 dakika yerleştirin.
  10. Bir insan Minigut medya (1.5 adımda hazırlanırken) tam 500 µL her şey için ekleyin. Yerine 2 günde.
  11. Enteroids 5-10 gün sonra ne zaman tomurcuklanan görselleştirildiği, toplamak. Adımları 4 ve 5 koleksiyonu yönergeler için bkz:.

3. indüksiyon deneysel NEC

  1. 5 mg/mL lipopolysaccharide (LPS) 10 µL 500 µL insan Minigut medya (1.5 adımda hazırlanırken) tam her iyi bir gün 0 ekleyin. 2 günde koleksiyonu kadar değiştirin.

4. parafin katıştırma için hazırlık

  1. Medya yavaşça çıkarın.
    1. PBS 1 mL ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı membran matris enteroids koşullar değil özenle çözülmeye pipet.
    2. PBS/enteroid karisimin santrifüj kapasitesi < 300 x g cips ve PBS kaldırmak 5 min için.
  2. 1s için oda sıcaklığında düzeltmek için %4 paraformaldehyde ekleyin.
  3. Santrifüj kapasitesi < 300 x g cips ve PBS kaldırmak 5 min için.
    1. Yıkama yavaşça 1 mL PBS ve, santrifüj kapasitesi < 300 x g cips ve PBS kaldırmak 5 min için.
    2. 4.3.1 arasındaki adımları yineleyin.
  4. Konik bir tüp içinde istenilen miktarda yerleştirip sıvı kadar bir kuru banyo kuluçka 65 ° C'de 3-10 min için Isınma jel (yaklaşık 300 µL) işleme doku yeterli hacim eritebilir.
    1. Jöleye Pelet işleme doku ekleyin ve karışımı yavaşça.
    2. Bir coverslip küçük bir klonlama halka yerleştirin.
    3. Jel ve enteroid karışımı coverslip monte edilmiş bir klonlama halka içine işleme doku pipette.
  5. 1s için 4 ° C'de kuvvetlendirmek için jel ve enteroid karışımı işleme doku sağlar.
    1. Klonlama yüzük katılaşmış karışımı ile % 70 etanol parafin katıştırma için hazırlık içine daldırın.

5. Enteroid koleksiyonu için RNA ve Protein çıkarma

  1. Yavaşça insan Minigut medya tam her kuyudan çıkarın.
  2. 1 mL PBS ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı membran matris çözülmeye pipet. Enteroids ayırmak değil dikkatli olun.
    1. PBS/enteroid karışımı bir steril 2 mL konik tüp içine yerleştirin.
    2. Santrifüj kapasitesi < 300 x g cips 5 min için.
    3. PBS, dikkat çekici enteroids değil çıkarmak için yavaşça çıkarın.
  3. Adım serisi 5.2 iki kez daha tekrarlayın.
  4. Protein ve/veya RNA ayıklama için hazır kadar-80 ° C'de dondurmak.
  5. Gen ifade ve protein izole edilmesi enteroids köklü qRT-PCR ve Western Blot teknikleri kullanarak gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hemen sonra kaplama, taze izole bağırsak kriptalarının uzun çubuklar görüntülenir. Saat içinde bir yuvarlak görünüşüne (şekil 1bir) enteroid alacak. Önümüzdeki birkaç gün boyunca, enteroids küre Resim 1bgörüldüğü gibi şekillendirme başlar. Tomurcuklanma (şekil 1c) 5-10 gün arasında oluşması ve enteroid koleksiyonu o zaman olmamalıdır.

Büyüyen enteroids de polarite, merkezi bir lümen, apikal bir kenarlık ve demiri etki alanı (Şekil 2) içeren sergileyecek. Enteroids da sağlam aktin sitoiskeleti (şekil 3) tarafından temsil edilen yapısal bütünlük gösterir. Birkaç gün sonra kültür, tedavi LPS enteroids daha fazla apoptosis deneyim ve kontrol grubu (şekil 4) daha düşük bir verim olacaktır. İnsan NEC ve fare modelleri NEC9' da görüldüğü gibi artan bir ifade Toll benzeri reseptör 4 (TLR4) (şekil 5) kontrollere göre tedavi LPS enteroids bulundu.

Figure 1
Şekil 1: Crypt kültür ve insan enteroid oluşumu bütün dokusundan. (bir) gün 0 crypt kültür yuvarlak, düz görünümü ile. (b) 4. gün enteroids küresel oluşumu ile. tomurcuklanma ile (c) gün 7 enteroids (siyah ok). Ölçek çubukları 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 2
Resim 2 : Bir enteroid histolojik görünümünü. Haemotoxylin ve Eozin boyama. Enteroid merkezi bir Lümen görüntüler ve polarite, hem bir apikal ve demiri etki alanıyla birlikte sergiler. Sitozolik bileşenler Eozin (pembe) ise haemotoxylin (mor) çekirdeği, temsil eder. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Enteroid aktin sitoiskeleti. Bir enteroids Immunoflorescence test. Enteroid yapısal bütünlüğü önemli aktin cystoskeleton (macenta) tarafından gösterildiği gibi görüntüler. Çekirdeklerin lekeli DAPI (mavi) ölçek çubuk 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: İnsan enteroid kültür verim LPS tedaviyle azaldı. Aynı bütün doku örneğineait yetiştirilen kültür, gün 5 enteroids. (bir) Enteroids denetim kültür medya ile tedavi. Güçlü büyüme görüntüler. (b) Enteroids kültür medyada LPS ile tedavi. Sadece bir kaç hayatta enteroids. Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Deneysel NEC enteroids ifadede arttı TLR4. (bir) qRT PCR gösterdi arttı LPS için maruz enteroids ifadede TLR4 mRNA (p = 0,03). (b) Western blot analizi gösteren deneysel insan enteroid NEC TLR4 ifadede arttı (p = 0.02). Temsilcisi western blot tasvir. Anlamına gelir ± SEM grup başına 3 örneklerinin değerlerdir. * p < 0.05 öğrenci t testi tarafından. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu roman ex vivo insan bağırsak enteroid modeli bağırsak bariyer disfonksiyonu Nekroze edici enterokolit (NEC) içinde çalışma için yararlı bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Burada sunulan enteroid işleme yöntemleri Drs. Misty iyi, Michael Helmrath ve Jason Wertheim10,11,12önceki işten uyarlandı.

Ayrıntılar tüm çevreleyen doku toplama ve zamanlama crypt yalıtım bu protokolündeki kritik adım vardır. Doku hemen ameliyat rezeksiyon anda toplanan ve laboratuarda doku gelir gelmez crypt yalıtım için işlenen gerekir. Biz bu model için daha az 3 aylık hastalardan doku seçildi. Gecikmeli işleme içinde 24 h gerekirse bütün doku toplandıktan sonra oluşabilir. Ayrıca, insan doku örneği kalitesini büyük ölçüde crypt yalıtım verimini etkiler. Sağlıklı ince bağırsak temel patoloji olmadan ve genç hastalarda (< 2 ay-in yaş) en iyi sonuçlar için bulduk. Buna ek olarak, toplanan doku genelde rezeke numune distal ucunda sağlıklı alanı seçilmelidir. Daha büyük bir parça bağırsak kullanarak crypt yalıtım protokolünde, yukarıda açıklanan çözüm birimlerle iyileştirmez. Bağırsak 0,75-2,5 ağırlığında yaklaşık 1-2 cm uzunluğunda, kesim g en iyi. LPS pozlama ile deneysel NEC indüksiyon köklü hücre kültür ve hayvan modelleri örnek alınarak tasarlanmıştır. Kurulan iş Hackam vd TLR4 kritik rolü gösterdi (LPS reseptör) NEC geliştirme9,13,14,15dakika sonra. TLR4 aktivasyonu LPS uyarır proinflamatuar sitokinler, bariyer bütünlüğünü ve sinyal olaylar insan NEC dahil karakterize subepithelial lökosit aktivasyonu. TLR4 iltihabı7 ve fonksiyonel TLR4 vardır eksikliği koruma NEC15geliştirilmesi göstermiştir hayvanlar teşvik önemli bir molekül olarak karıştığı olmuştur. NEC olan hastalarda yüksek ve dışkı ve plazma NEC hayvan modellerin yüksek LPS dolaşımdaki düzeyleri şunlardır. LPS hayvanlarda bu yolu iltihabı önemini vurgular insan NEC benzer bağırsak iltihabı neden olmaktadır. Kurulan hücre kültürü ve NEC hayvan modelleri yansıtma, LPS yönetim enteroid kültür yoluyla deneysel NEC indüksiyon ex vivo insan yenidoğan modeli NEC incelenmesi için yararlı olduğunu düşünüyoruz. Kurulan diğer modelleri önceki raporlar doğrultusunda bizim deneysel NEC enteroids TLR4 kontrollere göre artan ifadesi gösterdi.

İletişim kuralı LPS pozlama ile deneysel NEC indüksiyon için birkaç önemli değişiklikler ve geliştirmeler uğramıştır. Başlangıçta, enteroids 5 gün için yetiştirilen sonra 24 saat LPS ile aşılanmış ve daha sonra toplanan. İletişim kuralı şimdi LPS aşılama gün 0 her kültür medya değişikliği devamı maruz kalma ile toplama kadar önerir. Ayrıca, LPS doz optimize edildi. Bir doz eğri ve trialing birkaç farklı LPS konsantrasyonları gerçekleştirdikten sonra 5 mg/mL seçildi. Zaman LPS aşılama, kaplama-membran matris/enteroid karışımı içine doğrudan ile deneme Ayrıca yargılandın. Ancak, bu hantal ve sonuçları artırmak değil.

İnsan enteroid model kullanımı geliştikçe bu ele alınması gereken sınırlamalar vardır. 2007 yılında keşif beri birkaç farklı protokolleri kurmak ve enteroids kültür için kullanılmaktadır. Çok sayıda büyüme faktörleri tekrarlanabilirlik etkileyebilecek enteroid bakım ve farklılaşma eksikliği standardizasyon, gerekli. Ayrıca, enteroid kültür insan bağırsak epitel fizyolojik koşullarda etkiler mekanik Kuvvetleri yoksun. Luminal akışı ve bağırsakların baskısı için bu modelde muhasebesi değil gen ve protein ifade etkileyebilir. Bu model ayrıca sinir, bağışıklık hücreleri, microbiome, damarlara ve insan bağırsak epitel içinde mevcut olan Mezenşim yoksun.

LPS maruz bu insan bağırsak enteroid model için histolojik, genetik önde gelen bir enflamatuar yanıt neden olur ve insan NEC protein ifade değişikliklere benzer bulundu. NEC çeşitli geçerli hayvan modeller olmakla birlikte, bağırsak yaralanma ve tedavi müdahaleler karşısında yaygın türler arasında değişir. Ondan beri onun'etik zorlu hastalık patofizyolojisi çalışmaya veya doğrudan insanlarda, özellikle bebeklerde, roman terapötik ajanlar test etmek için bu romanı ex vivo insan dokusu kullanarak NEC modelinin yetiştirmeye devam etmek son derece önemlidir. İnsan enteroids genetik değişiklik mükellef bulunmaktadır ve birçok insan bağırsak hastalıkları16için tedavilerin geliştirilmesi temel olabilir. Gelecekteki yön apikal ile perfüzyon odasında geçirgen bir iskele üzerinde kültür insan enteroids amacı gerektiği ve peristaltizm ve luminal akışı gibi demiri akışı için içinde vivo crypt-villus mimarisi de fizyolojik çoğaltmak için zorlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüsü Enstitüsü diyabet ve sindirim ve böbrek hastalığı Grant (K08DK106450) ve C.J.H. için Amerikan Pediatrik cerrahi Derneği'nden Jay Grosfeld Ödülü tarafından desteklenmiştir

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291, (8), 3759-3766 (2016).
  3. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239, (9), 1124-1134 (2014).
  4. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, (3), 736-749 (1989).
  5. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7, (9), 902-910 (1990).
  6. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, (11), 633-642 (2016).
  7. Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, (4), 549-568 (2018).
  8. Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51, (12), 1907-1913 (2016).
  9. Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190, (7), 3541-3551 (2013).
  10. Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
  11. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
  12. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23, (4), 399-405 (2014).
  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179, (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176, (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143, (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, (1), 81-83 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics