Un modello pre-clinico di trapianto di cuore ortotopico

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Summary

Qui, descriviamo un modello preclinico di grandi animali (porcine) di trapianto ortotopico del cuore che è stato saldamente stabilito e utilizzato per studiare nuove strategie cardioprotettive.

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Ribeiro, R. V. P., Alvarez, J. S., Yu, F., Adamson, M. B., Fukunaga, N., Serrick, C., Bissoondath, V., Meineri, M., Badiwala, M. V., Rao, V. A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation. J. Vis. Exp. (146), e59197, doi:10.3791/59197 (2019).

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Abstract

Cinquant'anni dopo il primo rapporto di successo, il trapianto cardiaco rimane il trattamento gold-standard per i pazienti idonei con insufficienza cardiaca avanzata. Diversi modelli di trapianto di cuore per piccoli animali sono stati utilizzati per studiare gli effetti acuti e a lungo termine di nuove terapie. Tuttavia, pochi sono testati e dimostrato successo negli studi clinici. È di fondamentale importanza valutare nuove terapie in un modello di grande animale clinicamente rilevante per una traduzione efficiente e affidabile dei risultati degli studi di base. Qui, descriviamo un modello preclinico di grandi animali (porcine) di trapianto ortotopico del cuore che è stato saldamente stabilito e precedentemente utilizzato per studiare nuove strategie cardioprotettive. Questa procedura si concentra sulla lesione acuta di ischemia-reperfusione ed è un metodo affidabile per studiare nuovi interventi che sono stati testati e convalidati in modelli sperimentali più piccoli, come il modello murino. Dimostriamo la sua utilità nella valutazione delle prestazioni cardiache durante il primo periodo post-trapianto e altre potenziali possibilità abilitate dal modello.

Introduction

Cinquant'anni dopo il primo rapporto di successo, il trapianto cardiaco rimane il trattamento gold-standard per i pazienti idonei con insufficienza cardiaca avanzata1. Anche se i tempi ischemici fino a quattro ore sono tollerati adeguatamente, un tempo ischemico superiore a sei ore è associato a esiti inferiori2. La disfunzione primaria dell'innesto rimane la causa principale della morbilità precoce e della mortalità dopo il trapianto2,3. Le cause della disfunzione primaria dell'innesto sono multifattoriali e includono l'uso di organi marginali, malattia vascolare polmonare ricevente, rigetto iperacuto e lesione ischemiva-reperfusione subita al momento del trapianto3.

Diversi studi hanno studiato nuovi metodi per la conservazione del cuore del donatore per ridurre l'incidenza della disfunzione primaria dell'innesto4 ,5,6,7. È pratica comune valutare nuove tecniche e trattamenti in modelli murini di lesioni ischemia-reperfusione o trapianto di cuore eterotopico. Inoltre, piccoli modelli animali permettono modelli di sopravvivenza e follow-up a lungo termine per studiare lo sviluppo del rifiuto e della vasculopatia di allotrapianto cardiaco11,12,13. Tuttavia, la maggior parte di queste strategie falliscono gli studi clinici iniziali del pilota o non raggiungono mai questa fase. È di fondamentale importanza valutare le nuove terapie in un modello di grande animale clinicamente rilevante per una traduzione efficiente e affidabile dei risultati degli studi di base.

Il cuore porcina è spesso considerato il più anatomicamente simile al cuore umano quando si utilizzano modelli di animali di grandi dimensioni. Come tale, è una piattaforma ideale per eseguire la ricerca chirurgica cardiaca. Tuttavia, ci sono diversi fattori importanti da considerare quando si utilizza un modello di porcina. In primo luogo, il tessuto è tipicamente descritto come fragile e friabile, soprattutto nell'atrio destro e nell'arteria polmonare, essendo incline alle lacrime14. Inoltre, il cuore di maiale è considerato sensibile alla manipolazione e incline alle aritmie, motivo per cui si dovrebbe regolarmente somministrare un anti-arrythmetic per ogni animale all'inizio dell'esperimento. Un'importante differenza anatomica tra il modello di porcina e il trapianto clinico di cuore è la vena emiaziga sinistra nel suina che drena direttamente nel sino coronario. Questo deve essere ligated durante la procedura ricevente per evitare sanguinamento continuo. Infine, il modello di suine è molto sensibile all'ischemia, ma è ancora appropriato per gli studi acuti nel trapianto di cuore15.

Questo manoscritto descrive un modello preclinico di grandi animali (porcine) di trapianto ortotopico del cuore che è stato saldamente stabilito e utilizzato per studiare nuove strategie cardioprotettive5,6,8 ,9.

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Protocol

Il comitato istituzionale per la cura degli animali ha approvato tutti i protocolli sperimentali e gli animali sono stati trattati seguendo la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" preparata dall'Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, 1996. I maiali maschi dello Yorkshire (40-50 kg) sono stati utilizzati per eseguire i trapianti di cuore ortotopici (la dimensione degli animali può variare a seconda della discrezione degli investigatori e degli obiettivi sperimentali).

1. Procedura per i donatori

  1. Induzione anestetica e preparazione animale:
    1. Presmedicare l'animale utilizzando un'iniezione intramuscolare di Ketamina (20 mg/kg), Midazolam (0,3 mg/kg) e Atropina (0,04 mg/kg). Eseguire l'induzione e la manutenzione anestetiche utilizzando l'Isoflurane inalazionale (concentrazione di marea finale: 1%–3%) - 3 L/min O2 tramite maschera facciale.
    2. Confermare l'adeguatezza anestetica garantendo un tono mandibolante rilassato e un'assenza di dolore durante il pizzico dell'aldino. L'adeguatezza anestetica deve seguire gli orientamenti istituzionali.
    3. Una volta confermata l'adeguatezza anestetica, eseguire un'intubazione orotracheale utilizzando un tubo endotracheale della taglia 6,5-8 mm.
    4. Posizionare un monitor di saturazione dell'ossigeno sull'orecchio o sul labbro inferiore per un monitoraggio continuo. Posizionare il cuscinetto dell'elettrodo cautery sulla schiena dell'animale.
    5. Inserire un accesso perviale periferico tramite vena auricolare (ad es. 20 g di Angiocath). Avviare un'infusione di manutenzione (ad es. 0,9% NaCl). Somministrare 2 g di solfato di magnesio per prevenire le aritmie.
    6. Inserire un intromotore di guaina venosa centrale percutaneo utilizzando la tecnica Seldinger nella vena giugulare destra se devono essere eseguite cateterizzazione cardiaca e misurazioni di uscita cardiaca. Posizionare l'animale in posizione Trendelenburg per facilitare l'accesso venoso. In alternativa, questo può essere fatto nella vena giugulare interna sinistra. Se non è possibile stabilire l'accesso, questo passaggio può essere eseguito seguendo la sternotomia della linea mediana sezionando la vena giugulare interna (sinistra o destra) e inserendo direttamente la guaina.
  2. Approvvigionamento del cuore del donatore:
    1. Eseguire una sternotomia midline dalla regione cervicale media al di sotto del processo xifoide utilizzando una penna cautery. Aprire lo sterno con una sega ossea. Garantire un'adeguata emostasi durante l'intera procedura (ad esempio cauterizzare lo sterno e/o l'applicazione della cera ossea).
    2. Nella regione cervicale, ritrarre il muscolo sternocleidomastoide al centro e sezionare l'arteria carotide destra (in alternativa, questo può essere fatto con l'arteria carotide sinistra). Inserire una linea di accesso arteriosa (ad esempio 20 g Angiocath) nell'arteria carotide giusta per il monitoraggio invasivo della pressione arteriosa.
    3. Dissezionare e rimuovere il timo da oltre il pericardio. Sollevare delicatamente il timo dal pericardio, utilizzando il cauterio, e sezionare la struttura dal pericardio. Per prevenire il sanguinamento, cauterizzare i piccoli vasi che provengono dall'aorta e dalla vena cava superiore (SVC) per irrigare il timo.
    4. Aprire il pericardio. Dissezionare lo spazio aortopolmonare utilizzando il cavolo. Per questo, chiedi all'assistente di ritrarre la pista di deflusso ventricolare destra in modo inferiore e l'arteria polmonare a sinistra e chiedi al chirurgo di ritrarre l'aorta a destra. Fatelo con attenzione per evitare lesioni dirette all'arteria polmonare.
    5. Cancellare l'aspetto anteriore dell'aorta ascendente dal tessuto connettivo. Ritrarre con attenzione il tratto di deflusso ventricolare destro e posizionare una sutura a corda di borsa utilizzando un prolene 4-0 sull'aorta ascendente prossimale (evitare suture di spessore pieno). Fissare questa sutura con un laccio emostatico.
    6. Amministrare 30.000 unità di eparina (>300 U/Kg) per ottenere l'anticoagulazione sistemica. Inserire la cannula di consegna cardioplegia (ad esempio cannula radice aortica DLP) nell'aorta ascendente tra la sutura portaborsa precedentemente posizionata e sicura stringendo il laccio emostatico. Preparare la soluzione cardioplegica che verrà utilizzata e connettersi alla cannula di consegna.
    7. Aprire lo SVC e la vena cava inferiore (IVC) e la vena polmonare inferiore sinistra per garantire un'adeguata ventilazione cardiaca. Posizionare il morsetto aortico sull'aorta ascendente distale (sopra la cardioplegia cannula). In alternativa, il ventricolo sinistro può essere ventilato aprendo l'appendice atriale sinistra e ponendo l'aspirazione.
    8. Avviare l'infusione di cardioplegia mirando a una pressione della radice aortica di 80 a 100 mmHg.
      NOTA: Gli autori hanno applicato un modello utilizzando 1,5 L di una soluzione cardioplegica ipercale extracellulare standard a 4 gradi centigradi. Diverse soluzioni e volumi possono essere utilizzati in base al set-up sperimentale.
    9. Mettere la fanghiglia di ghiaccio (0,9% NaCl) nella cavità toracica e sopra l'organo per il raffreddamento dopo l'avvio della cardioplegia. Dopo che l'infusione di cardioplegia è terminata, procedere con la cardiectomia in modo tradizionale. Sezionare l'aorta e l'arteria polmonare dopo l'arteria innominata e alla biforcazione, rispettivamente, per garantire una lunghezza sufficiente per l'impianto.
    10. Dopo la rimozione, mettere l'organo in un sacchetto d'organo con almeno 500 mL di soluzione di conservazione (soluzione iperkalemica extracellulare standard). Mettete questo sul ghiaccio e conservatevi a 4 gradi centigradi. Questo passaggio può essere modificato in base alla progettazione sperimentale e all'obiettivo.

2. Procedura di recipiente:

  1. Induzione anestetica e preparazione animale:
    1. Eseguire l'anestesia e il monitoraggio come descritto nella procedura del donatore (passaggi da 1.1.1 a 1.1.6).
    2. Dopo aver inserito l'introito di guaina venosa centrale percutaneo nella vena giugulare destra, inserire un catetere venoso centrale (ad esempio doppio-lumen) nella vena giugulare sinistra utilizzando la tecnica Seldinger. In alternativa, questo può essere fatto dopo la sternotomia della linea mediana come descritto sopra.
  2. Bypass cardiopolmonare (CPB):
    1. Eseguire la sternotomia della linea mediana ed esporre il cuore e i grandi vasi come descritto nella procedura del donatore (passaggi da 1.2.1 a 1.2.4).
    2. Dissetto tra lo SVC e l'arteria innominata, e l'IVC e il pericardio usando le pinze Metzenbaum e "right-angle". Circondare lo SVC e l'IVC utilizzando un nastro ombelicale (in alternativa può essere utilizzata una semplice sutura di seta O). Fissare ogni nastro / sutura con un laccio emostatico.
    3. Posizionare 2 suture concentriche a corda di borsa utilizzando una sutura di prolene 4-0 sull'aorta ascendente distale (evitare suture a tutto spessore). Posizionare suture di corda di borsa utilizzando 4-0 prolene su IVC e SVC a livello della riflessione pericardiale. Fissare queste suture con lacci emostatici.
    4. Durante la preparazione CPB, avere un assistente di installazione e prime il sistema in base alle esigenze degli investigatori e sperimentali. La procedura attuale utilizza la stessa configurazione utilizzata come Divisione di Chirurgia Cardiovascolare dell'istituzione e impiega l'aiuto di un perfusionista addestrato. Il sistema di bypass è innescato con 2 litri di soluzione cristalloide (ad esempio Plasmalyte) con 500 mg di Solumedrol.
    5. Amministrare 30.000 unità di eparina (>300 U/Kg) per ottenere l'anticoagulazione sistemica. Il tempo di coagulazione attivata (ACT) deve essere superiore a 300 s, se il test è disponibile.
    6. Cannula con una cannula arteria da 17 a 21 F. Utilizzare una cannula ossigenatore a membrana extracorporea (ECMO) (ad esempio cannula arteriosa EOPA) inserita utilizzando la tecnica Seldinger per facilitare questo passaggio ed evitare la perdita di sangue. In alternativa, è possibile utilizzare una cannula arteria bypass standard.
    7. Collegare la cannula alla linea arteriosa del circuito di bypass utilizzando un connettore 3/8-3/8. Garantire una completa degradazione per evitare l'embolia dell'aria.
    8. Eseguire una cannalinazione bicavale. Per questo, cannulare lo SVC e poi l'IVC utilizzando 24 a 28 F ad angolo retto cannula venosa monostadio (ad esempio DLP singolo lumen angolare cannula venosa).
      1. In primo luogo, fare una piccola incisione (5 mm) al centro della sutura della corda di borsa. Dilatare l'incisione con un piccolo strumento angolato (ad esempio angolo retto o uno snap). Inserire la cannula dirigendo l'angolo in modo superiore nello SVC e in modo inferiore in IVC (lontano dal cuore). Fissare stringando il laccio emostatico tenendo la sutura della corda della borsa.
      2. Tra ogni passo, coprire l'incisione con un dito per evitare un eccessivo sanguinamento. Collegare le cannule alla linea venosa del circuito di bypass utilizzando un connettore 3/8-3/8-1/2 Y. Assicurarsi la degradazione per evitare una serratura d'aria nel sistema.
    9. Avviare CPB. Regolare i flussi per mantenere una pressione arteriosa superiore a 50 mmHg (circa 4 L/min). Mantenere la normomia durante tutta la procedura.
      NOTA: queste impostazioni possono essere modificate in base al progetto sperimentale. I farmaci vasoattivi devono essere somministrati solo durante la CPB se necessario per facilitare la regolazione della pressione (ad esempio l'infusione di epinefrina).
  3. Impianto cardiaco del donatore:
    1. Dopo l'avvio del CPB, aprire la pleura sinistra e ritrarre il cuore nativo a destra. Dissezitare e circondare la vena emiadestra sinistra utilizzando uno strumento di dissezione acuto (ad esempio Metzenbaum) e un angolo retto, rispettivamente. Ligate distay con una cravatta o seta. Solo una legatura è necessaria come il cuore nativo sarà rimosso.
    2. Bloccare l'aorta ricevente prossimo alla cannula arteriosa. Incisa entrambi vena cava con i lacci emostativi precedentemente posizionati utilizzando cravatte di seta O. Rimuovere il cuore nativo del destinatario. In alternativa, il cuore può essere arrestato utilizzando cardioplegia a base di sangue ipotermica standard.
    3. Durante la cardiectomia, assicurati di mantenere grandi polsini nel ricevente per facilitare l'impianto cardiaco del donatore. Per questo, sezione l'aorta e l'arteria polmonare prossimicamente, vicino alle loro radici. Allo stesso modo, gli ariedi sinistro e destro devono essere tenuti con grandi polsini. Lasciare le appendici atriale destra e sinistra nei polsini dei destinatari, che possono essere necessarie durante le anatomosi.
    4. Preparare il cuore del donatore per l'impianto.
      1. Dissezionare l'arteria polmonare dall'atrio sinistro e separare completamente l'arteria polmonare dall'aorta. Lasciare almeno 2-3 cm di ogni recipiente da tagliare durante l'impianto, se necessario. Ligate entrambi vena cava con una cravatta di seta O. Unire tutte le vene polmonari, creando un singolo bracciale atriale sinistro per essere anastomosed.
      2. Confrontare le dimensioni delle braccia atriale lasciate (donatore e ricevente) e tagliarle in base alle esigenze per diventare dimensioni simili. L'appendice atriale lasciata del destinatario può essere accorciata, oppure il tetto atriale sinistro del donatore e l'appendice può essere aperta per questo.
    5. Consegnare la prima dose di cardioplegia al cuore del donatore utilizzando la cannula cardioplegia precedentemente posizionata come descritto al punto 1.2.6. La soluzione protettiva cardioplegica consiste di 500 mL di una miscela 2:1 di sangue:cristalloide contenente 24 mEq di potassio e consegnata a 10 gradi centigradi. Raggiungere la concentrazione di potassio desiderata aggiungendo cloruro di potassio alla miscela cardioplegica.
    6. Dopo il completamento di ogni anastomosi, fornire una dose aggiuntiva di 300 mL di cardioplegia a 10 gradi centigradi contenente 8 mEq di potassio.
    7. Dopo tutte le anastomosi e prima della rimozione del morsetto aortico, somministrare una dose aggiuntiva di 500 mL di cardioplegia ematica calda (37 -C) con 8 mEq di potassio.
    8. Togliere il cuore del donatore dallo stoccaggio e dall'impianto con la tecnica anastomonica biatriale standard nella seguente sequenza: atrio sinistro, atrio destro, arteria polmonare e aorta. Utilizzare una sutura di prolene 4-0 con un ago SH per l'atrio sinistro e destro, e l'aorta e una sutura prolene 5-0 con un ago BB per l'arteria polmonare.
      1. Atrio sinistro: posizionare una sutura di prolene 4-0 alla giunzione tra l'atrio sinistro e l'IVC (margine inferiore destro) e un altro a 180 gradi dal primo, collegando il donatore e le manette ricandite. Completa l'anastomosi della parete posteriore. Completare l'anastomosi della parete anteriore. Questo viene eseguito dalla sutura superiore alla sutura inferiore.
      2. Atrio destro: aprire l'atrio destro del donatore dall'appendice verso l'IVC, creando una cuffia del donatore che corrisponde alla dimensione della polsiera del ricevente. Partendo dall'angolo inferiore (giunzione tra IVC e atrio destro), completare la parete interna anastomosi e poi la parete laterale.
      3. Arteria polmonare: tagliare i bordi delle arterie polmonari sia riceventi che donatori per creare dimensioni corrispondenti. Posizionare una sutura di prolene 5-0 sulla parete laterale sinistra che unisce le navi donatori e ricittori e un'altra sul bordo laterale destro. Completare l'anastomosi parete inferiore e poi la parete anteriore anastomosi.
      4. Aorta: trim come descritto con l'arteria polmonare. Posizionare una sutura sulla parete laterale sinistra che collega le navi donatori e ricittori. Completare la parete inferiore e poi la parete anteriore anastomosi.
      5. Eseguire anastomosi a strati singolo, ad eccezione dell'arteria polmonare, dove è richiesto un anastomosi a doppio strato. Il tessuto porcina è estremamente fragile e deve essere maneggiato con attenzione per evitare lacrime. È importante sottolineare che l'anastomosi dell'arteria polmonare è la fase più delicata dell'impianto e deve essere eseguita con estrema cura. La tecnica di impianto può essere modificata in base alle preferenze dei chirurghi e alla progettazione sperimentale.
    9. Dopo il completamento di tutte le anatomosi e la somministrazione di dose di cardioplegia calda come descritto sopra, rimuovere il morsetto trasversale aortico. Ispezionare tutte le anatomosi per i siti di sanguinamento, dovrebbero essere corretti a questo punto.
    10. Reperfusione del cuore del donatore per 60 min su CPB. Le aritmie ventricolari possono essere trattate con defibrillazione interna (20-50 J). Se necessario, la stimolazione ventricolare può essere utilizzata per mantenere una frequenza cardiaca di 100 battiti al min. farmaci antiaritmici (ad esempio Amiodarone, Lidocaine o Solfato di Magnesio) può essere utilizzato a discrezione degli inquirenti, se necessario.
    11. Dopo 60 minuti di reperfusione, somministrare 1 g di cloruro di calcio. Iniziare lo svezzamento dal CPB diminuendo il flusso a metà, poi un quarto e poi fuori. La linea venosa centrale può essere utilizzata per monitorare la pressione venosa centrale, puntando 10 mmHg. Iniziare l'infusione di farmaci vasoattivi e inotropici (ad esempio dobutamina, epinefrina, noradrenalina e vasopressina) secondo il progetto sperimentale o la discrezione degli investigatori.
    12. Lo svezzamento è considerato riuscito se l'animale mantiene una pressione arteriosa sistolica superiore a 60 mmHg per oltre 30 min dopo l'interruzione del CPB. Poiché questo non è un modello di sopravvivenza, non invertire l'eparina; può verificarsi sanguinamento continuo da fori ad ago e strutture sezionate (ad es. sterno). I cuori dei donatori rispondono bene a piccole e ripetute dosi di sostituzione del volume utilizzando il sistema CPB. Inoltre, il modello di porcina risponde bene alla dobutamina.
      NOTA: la gestione dei destinatari deve essere adattata all'esperienza degli investigatori e alla progettazione sperimentale. Un anestesista cardiaco può aiutare in questo modo.

3. Valutazione dell'innesto:

  1. Valutazione funzionale:
    1. Questo grande modello animale ha il vantaggio di avere un approccio al torace aperto in ogni momento, che facilita la valutazione funzionale diretta. Per misurare la contrattilità cardiaca, utilizzare analisi del ciclo di volume di pressione (PV), l'ecocardiografia e/o la cateterizzazione lato destro.
    2. Loop pressione-volume10: Posizionare un nastro ombelicale intorno all'IVC e inserire un catetere di conduttura fotovoltaico nel ventricolo sinistro attraverso una piccola ventriculotomia apicale per consentire misurazioni continue delle relazioni ventricolari a sinistra. Ottenere registrazioni in stato stazionario per generare parametri dipendenti dal volume (ad esempio pressione sviluppata e lavoro di corsa) e quindi ottenere le registrazioni di occlusione in triplice copiando l'IVC per generare parametri indipendenti dal volume (ad esempio precaricadi reclutabili lavoro di ictus).
    3. Ecocardiografia: avere anestesisti cardiaci ottenere immagini epicardiche utilizzando una sonda transesofagea standard.
    4. Cateterizzazione lato destro: inserisci un catetere Swans-Ganz attraverso la guaina venosa posta all'inizio della procedura e guida verso l'arteria polmonare. Ciò consente la misurazione della pressione venosa centrale, della pressione ventricolare destra, delle pressioni dell'arteria polmonare, della pressione polmonare del cuneo capillare e dell'uscita cardiaca utilizzando la tecnica di termodiologazione.
    5. Eseguire la valutazione contrattile al basale e dopo 2 e 3 ore dopo la reperfusione del cuore donatore nel ricevente. Questo può essere modificato dai ricercatori secondo il progetto sperimentale.
  2. Valutazione metabolica:
    1. Per le valutazioni metaboliche, raccogliere campioni di sangue arterioso e venoso (in alternativa: venoso misto) e conservare il plasma per analisi successive. Occorre inoltre ottenere analisi in tempo reale dei gas sanguigni e livelli di lattato.
    2. Raccogliere questi campioni al basale nel donatore, prima dell'approvvigionamento nel donatore, al basale nel destinatario e a 15, 30 e 60 min di reperfusione del cuore del donatore (dopo la rimozione del morsetto incrociato). Questo può essere modificato secondo il progetto sperimentale.
  3. Terminazione dell'esperimento ed eutanasia:
    1. Una volta terminate tutte le valutazioni, essanguinare l'animale ricevente nel serbatoio venoso del circuito CPB aprendo il morsetto di linea venosa. In alternativa, l'escaninazione può essere ottenuta raccogliendo l'alograft cardiaco per raccogliere campioni (biopsie miocardiche).

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Representative Results

Questo modello preclinico è stato utilizzato con successo dal 19945,6,8,9. La Tabella 1 mostra i risultati rappresentativi delle relazioni pressione-volume e dei parametri ecocardiografici presi al basale e 3 ore di post-trapianto in una serie di 5 esperimenti. Anche se vediamo una diminuzione della contrattilità miocadiale dopo il trapianto, questo non era statisticamente significativo.

La figura 1 mostra i cicli rappresentativi del volume di pressione raccolti da un esperimento nello stesso momento. Durante le valutazioni "stato stabile" (Figura1, riga superiore). vengono registrati i parametri dipendenti dal volume, ad esempio la velocità massima e minima della pressione sviluppata. I parametri indipendenti dal volume si ottengono mediante occlusione intermittente dell'IVC. Con questo, il volume del ventricolo sinistro diminuisce progressivamente e possono essere calcolate diverse relazioni. Nella riga centrale della Figura 1, vediamo le relazioni end-systolic e end-diastolic pressione-volume vengono registrate, che rappresentano la relazione tra le pressioni end-systolic o end-diastolic, rispettivamente, con la corrispondente volume di fine diastolico. Nella riga inferiore od Figura 1, vediamo la registrazione del lavoro di corsa precaricabile reclutabile, che è la relazione tra il lavoro di corsa e il corrispondente volume di diastolico di fine.

Infine, come si è visto nella Figura 2, vari altri parametri metabolici (ad esempio, livelli di lattato e pH) e parametri funzionali (ad esempio, l'uscita cardiaca) possono essere misurati con questo modello per testare diverse ipotesi.

Figure 1
Figura 1 . I loop rappresentativi del volume di pressione in uno stato stabile, durante l'occlusione dell'interno Vena Cava (IVC) e le relazioni (precaricare il lavoro di ictus reclutabile). (A) Un esperimento al basale. (B) Un esperimento successivo a 3 h di riperfusione. PRSW: precarica il lavoro di ictus reclutabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Tendenze di lattazione e pH durante il protocollo di trapianto di cuore. A seguito della reperfusione, c'è un aumento significativo del lattato e la diminuzione del pH. Questo può essere gestito mantenendo un'adeguata pressione di perfusione con una corretta sostituzione del volume e l'uso di droghe vasoattive. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Linea 3 ore dopo il trapianto valore p
Catetere dell'arteria polmonare
Indice cardiaco (L/min) 3,7 - 0,8 2,8 - 0,3 0,485 (in questo da 45)
Analisi del volume di pressione
PRSW (erg-cm -3-103)
Massimo dP/dt (mmHg s-1)
Min dP/dt (mmHg s-1)
62,1 - 7
2500 X 425
-1537 - 238
53,8 x 10
1815 x 410
-1427 - 317
0,841 (in questo da fwlinkall'usd)
0.309
0,547 (in questo da fwlinka che)
Ecocardiografia
LV EF (%)
LV FAC (%)
RV FAC (%)
47,3 - 3,0
53,8 - 3,6
39,2 - 1,3
37,0 - 4,2
46,4 x 2,9
32,8 - 3,6
0,095 (in questo 09)
0.222 (in questo 022)
0.309

Tabella 1. Relazioni pressione-volume rappresentative e parametri ecocardiografici da una serie di 5 trapianti eseguiti al basale e successivi a 3 h di reperfusione. Dati presentati come media: errore standard e confrontati utilizzando il test di classificazione firmato Wilcoxon. FAC: cambio di area frazionaria. LV - ventricolo sinistro. Max dP/dt - velocità massima di variazione della pressione nel ventricolo sinistro. Min dP/dt: variazione della pressione minima del pf nel ventricolo sinistro. PRSW: precarica il lavoro di ictus reclutabile. RV - ventricolo destro.

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Discussion

Questo manoscritto descrive un modello pre-clinico di grandi animali di trapianto ortotopico del cuore. Vari piccoli modelli animali di trapianto di cuore eterotopico sono stati utilizzati con successo per studiare gli effetti di nuovi trattamenti per migliorare la conservazione degli organi e diminuire la lesione di ischemia-reperfusione11,12, 13.Inoltre, piccoli modelli animali permettono modelli di sopravvivenza e follow-up a lungo termine per studiare lo sviluppo del rigetto e della vasculopatia di allotrapianto cardiaco11,12,13. Tuttavia, la maggior parte di queste nuove terapie fallisce o non ce la fanno mai a sperimentazioni cliniche. Al fine di facilitare e semplificare la traduzione clinica, è necessario un modello di grande animale affidabile e clinicamente rilevante.

Questo protocollo è stato progettato per studiare diverse strategie di trattamento e conservazione degli organi per prevenire o ridurre la disfunzione primaria dell'innesto e la lesione da ischemia-reperfusione. Come accennato in precedenza, questo modello è stato utilizzato dal 1994. Gli autori hanno precedentemente dimostrato gli effetti benefici dell'infusione salina ipertonica nel donatore8 o del ricevente9 prima dell'approvvigionamento o dell'impianto dell'organo, rispettivamente. Inoltre, gli autori hanno studiato diversi protocolli e strategie di conservazione, come l'uso di infusioni di sangue perdono donatori durante la conservazione a freddo6 e l'effetto del completamento dell'insulina nella soluzione cardioplegica5.

La principale limitazione della tecnica qui descritta è il follow-up a breve termine. Un modello di trapianto di cuore di sucini di sopravvivenza a lungo termine sarebbe ad alta intensità di risorse e comporterebbe costi elevati. La procedura qui descritta si concentra sulla lesione acuta di ischemia-reperfusione ed è un metodo preclinico affidabile per studiare nuovi interventi che sono stati testati e convalidati in modelli sperimentali più piccoli, come il modello murino. Inoltre, questa tecnica può essere facilmente adattata per esperimenti di follow-up a lungo termine. Ciò comporterebbe un'adeguata inversione dell'eparina, decannificazione animale, emostasi adeguata e chiusura toracica.

Il cuore porcina è spesso considerato il più anatomicamente simile al cuore umano quando si utilizzano modelli di animali di grandi dimensioni. Come tale, è una piattaforma ideale per eseguire la ricerca chirurgica cardiaca. Tuttavia, è importante notare che il tessuto è tipicamente descritto come fragile e friabile, soprattutto nell'atrio destro e nell'arteria polmonare, essendo incline alle lacrime14. Inoltre, il cuore di maiale è considerato sensibile alla manipolazione e incline alle aritmie, motivo per cui il solfato di magnesio deve essere somministrato regolarmente a ciascun animale all'inizio dell'esperimento. Una differenza importante tra il modello di porcina e il trapianto clinico di cuore è la vena emiadestra sinistra nel suino, che drena direttamente nel sino coronario. Questo deve essere ligated durante la procedura ricevente per evitare sanguinamento continuo. Infine, il modello di porcina è molto sensibile all'ischemia, che sembra appropriato per gli studi acuti nel trapianto di cuore15.

La gestione del ricevente dopo il trapianto può essere difficile a volte. È importante rivedere tutte le anatomosi e garantire che non emorragie. Un'area particolarmente fastidiosa è intorno all'arteria polmonare posteriore. Come accennato in precedenza, i tessuti porcini e fragili e possono facilmente strappare; in questo caso, il chirurgo può tornare rapidamente su CPB per correggere il problema e tentare di riattivarlo. La fibrillazione ventricolare di solito si verifica durante la riperfusione iniziale; se ciò non si risolve con una semplice defibrillazione, possono essere somministrati interventi farmacologici, come 2 g di solfato di magnesio o 1 mg/kg di lidocaina, e deve essere applicata una successiva defibrillazione. Il ritmo del peccato normale può essere facilmente raggiunto in meno di 3 min.

Questa procedura richiede l'esecuzione di almeno un chirurgo addestrato; sono inoltre necessari da 3 a 5 esperimenti per ottimizzare il protocollo all'interno di ciascun gruppo di ricerca. Inoltre, il team deve assegnare un membro per eseguire esclusivamente l'anestesia animale e la gestione dei destinatari in base alle esigenze (ad esempio il supporto inotropico). A causa delle importanti considerazioni riguardanti il modello di suine descritto in precedenza, i seguenti passaggi sono fondamentali in questa procedura: induzione anestetica e intubazione (importante per evitare prolungati periodi ipossimici), manipolazione cardiaca durante la valutazione, cannolazione per bypass cardiopolmonare, e destra manipolazione dell'arteria atriale e polmonare e anastomosi. Tuttavia, poiché si tratta di passaggi di routine eseguiti nella pratica clinica, devono essere effettuati con cura e attenzione ai dettagli. La coerenza e la ripetizione porteranno a un modello ottimizzato e affidabile per vari usi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori non hanno riconoscimenti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amiodarone Purchased from institutional pharmacy
Angiocath 20G BD 381704
Calcium Chloride 1g/10ml Purchased from institutional pharmacy
Cardioplegia solution This should be chosen at the investigators discretion. 
Cautery Pencil Covidien E2515H
Central Venous Catheter double-lumen Cook Medical C-UDLM-501J-LSC
CPB pack Medtronic Custom-made cardiopulmonary bypass perfusion circuit.
D5W 5% 250ml Baxter JB1064
DLP Aortic Root Cannula/stabber Medtronic 12218
DLP single-lumen venous cannula (24F or 28F) This should be chosen at the investigators discretion. 
Dobutamine Purchased from institutional pharmacy
Electrode Polyhesive Covidien E7507
EOPA arterial cannula (17F or 21F) This should be chosen at the investigators discretion. 
Epinephrine Purchased from institutional pharmacy
Eppendorf Tubes, 1.5 mL Sarstedt  72.690.001
Gloves, nitrile, medium Fischer 27-058-52
Heparin 1000 IU/ml Purchased from institutional pharmacy
Ketalean (Ketamine) inj. 100mg/ml, 50ml/vial Health Canada Requires health canada approval
Lidocaine/Xylocaine 1% Purchased from institutional pharmacy
Magnesium Sulfate 5g/10ml Purchased from institutional pharmacy
Midazolam inj. USP 5mg/ml vial/10ml Health Canada Requires Health canada approval
MPS Quest delivery disposable pack Quest medical 5001102-AS
NACL 0.9% 1L Baxter JB1324
Organ Bag CardioMed 2990
Pipette Tips, 1 mL Fisherbrand 02-707-405
Propofol 1mg/ml Purchased from institutional pharmacy
Rocuronium Purchased from institutional pharmacy
Set Admin Prim NF PB W/Checkvalve Smith Medical 21-0442-25 Intravenous infusion pump line. Researchers should choose infusion lines compatible with the infusion pump available at their facilities
Set Intro Sheath 8.5FRx 10CM Arrow SI-09880
Sofsilk 0 wax coated Covidien S316
Solumedrol 500mg/5ml Purchased from institutional pharmacy
Suction tip Covidien 8888501023
Suction Tubing 1/4" x 120" Med-Rx 70-8120
Suture 5.0 Prolene BB Ethicon 8580H
Suture Prolene Blum 4-0 SH 36 Ethicon 8521H
Sutures 2.0 Prolene Blu M SH Ethicon 8523H
Sutures BB 4.0 Prolene  Ethicon 8881H
Tracheal Tube, 6.5mm Mallinckrodt 86449

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References

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