用细胞遗传学技术测定芽孢杆菌的受精率

Genetics

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Summary

我们提出了一个简单的细胞遗传学技术, 利用 4 ', 6-二胺-2-苯基苯酚 (dapi) 来确定施肥率和主要性别比例的单倍体入侵害虫杆菌。

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Bondy, E. C., Hunter, M. S. Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique. J. Vis. Exp. (146), e59213, doi:10.3791/59213 (2019).

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Abstract

少数吸刺的白蝇是世界上最具破坏性的陆地害虫之一, 因为它们对作物造成了损害, 并使它们成为媒介。尽管对这些物种在不同环境中的生物学进行了大量研究, 但一个关键的生活史参数----后代性别比率----却很少受到关注, 但对预测种群动态很重要。这种单倍体昆虫的主要性别比 (产卵性别比) 从未报道过, 但通过确定单倍体昆虫的受精率可以找到。该技术包括用漂白剂对鸡蛋进行脱色, 采取一系列固定步骤, 并应用一般 DNA 荧光染色 DAPI (4 ', 6-二胺-2-苯丁胺, 一种 dna 结合荧光染料) 结合到雌性和雄性内核。在这里, 我们提出了技术, 并介绍了它的应用的一个例子, 以测试是否有一个内共生细菌, Rickettsia sp. nr。对塔巴奇的主要性别比影响. 这种方法可以帮助白蝇的人口研究, 或确定是否存在性别分配与某些环境刺激。

Introduction

研究性别分配, 或对男性和女性后代的相对投资, 是行为生态学1、23 的基石。除了测试行为适应性模型的能力外, 了解一个生物的性别分配策略还可以改进其种群动态模型。在许多物种中, 性别分配由母亲控制。为了确定性别分配, 重要的是要确定主要的性别比率或女性在卵子沉积时的比例。虽然成人出现的性别比率可能为性别分配提供线索, 但男女青少年之间不同的发育死亡率通常可能会大大扭曲成人性别比率。在一些物种的膜翅目动物, 包含蚂蚁, 蜜蜂和黄蜂的昆虫的顺序, 主要的性别比已确定与细胞遗传学检测, 染色的胚胎, 以查看基因 DNA。由于膜翅目是单倍体, 新生雄蛋是单倍体, 仅含有雌性前核 (n), 而新生的雌卵是二倍体, 同时含有雄性和雌性的前粒 (2n)。尽管被称为白翅目的真正虫子 (半翅目) 的萨比生类动物阿莱罗迪达伊也是单倍体, 但目前还没有确定的方法来寻找这些昆虫的主要性别比。考虑到对这个家庭中为数不多的世界性严重害虫的研究强度, 以及性别比例在白蝇4、56、7的竞争互动中的重要性, 这或许令人惊讶 ,8,9, 10 和一般的人口动态。在单倍体昆虫中, 性别比率也不受性别测定系统的限制, 从而有可能进行选择性受精, 并使不同环境而不稳定的性别比率。在这里, 我们提出了一种技术, 以确定主要性别比例的物种复合体的白蝇统称为甘薯白蝇, b. 塔巴奇。这个物种名称包括全球28种以上的 11种物种, 其中包括一些最具破坏性的全球入侵害虫 12,13.应用这种技术来确定 b . tabaci和其他 Aleyrodidae 中的性别分配模式, 将允许对变量进行更严格的调查, 包括温度、寄主植物、内共生细菌或平面/白粉可能会影响白度主要性别比率和白度种群动态。

我们不知道任何类似的鸡蛋染色技术 b . 塔巴奇。与其他昆虫卵14使用的染色方法相比, 该方案非常方便, 因为它省略了隔夜固定步骤, 因此可以在3小时内完成。作为一个应用的例子, 一种内共生细菌, Rickettsia sp . nr。bellii,与女性偏见有关, 在我们的实验室线b. tabaci中东-亚细亚小鱼 (meam1)15,16。在 b . tabaci meam1 实验室线路 ("TABACI", 从 Maricopa 农业中心收集) 中, 我们测试受 Rickettsia(r+) 感染的雌性是否比未感染 (r-) 雌性给更多的卵受精。

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Protocol

请注意:确保所有工作都在室温下通风良好的区域或通风罩下进行。此协议中的所有 "滴" 都定义为 5–20μl, 具体取决于操作员的偏好。

1. 初始设置

  1. 允许女性白鳍在干净的叶子上产卵。产卵竞技场的例子包括夹笼或叶子被剪下来, 以适应在培养皿中的琼脂上。在夹子笼或培养皿盖上做一个可覆盖的洞, 以插入和取出成人。或者, 迅速把收集到的成虫的容器放在冰上, 然后将它们存放在叶子上。将产卵和卵子固定之间的时间限制在不超过 60分钟, 以确保观察精子过渡到卵子中的父原核。
    请注意:没有从叶子中取出的鸡蛋可以饲养到成年, 以记录成人的性别比率。
  2. 在美白之前或期间, 用肥皂和水清洗显微镜幻灯片, 将其干燥好, 然后将一块石蜡膜拉伸一端, 确保石蜡薄膜表面不会破裂 (图 1)。
    请注意:石蜡膜具有疏水性和半不透明, 使液体更容易形成水滴和卵。

2. 分显性

  1. 用玻璃巴斯德移液器, 在石蜡膜中加入漂白剂溶液 (0.83 次氯酸钠)。
    请注意:如果每滴只有2-3 个鸡蛋, 则更容易跟踪鸡蛋。或者, 为了管理一个大的鸡蛋数量, 收集鸡蛋在滴1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。
    注意事项:漂白剂是腐蚀性的;处理漂白剂时要戴手套, 不要吸气。
  2. 从叶子上取出成年白蝇。
  3. 将叶子放在显微镜下, 以便清楚地看到鸡蛋, 并用薄薄的探针单独小心地收集鸡蛋。要制作探头, 请在45°或以舒适的工作角度将 minuten nadel 针插入熔化的移液器尖端 (图 2)。
  4. 将鸡蛋转移到漂白剂或 1个 PBS。如果使用 1x PBS, 一旦收集到所有的鸡蛋, 就用玻璃巴斯德移液器取出 1x PBS, 然后在鸡蛋中加入漂白剂。
    请注意:收集鸡蛋时, 慢慢地将鸡蛋从其底部抬起, 直到将花梗从叶子中取出。花梗是粘的, 鸡蛋通常会粘在探针尖端, 直到它浸入漂白剂。
    请注意:建议对所有试剂使用单独的玻璃巴斯德移液器, 并可对移液器进行热改造, 使吸头变窄, 减少意外吸走白卵的风险。为了防止残留和污染, 每次使用后都要用去离子水清洗移液器。
  5. 等待10分钟。如果对1小时以上的鸡蛋胚胎发育有兴趣, 将鸡蛋放在漂白剂中长达15分钟。
    请注意:对于长达1小时的鸡蛋, 10分钟就足够了。

3. 固定

请注意:这些步骤是从膜翅目协议17中执行的。

  1. 用玻璃巴斯德移液器取出漂白剂 (包含绒毛膜碎片) 并将其丢弃。加入冰醋酸滴与玻璃巴斯德移液器, 等待3分钟。
    注意事项:在通风罩下继续这一步。冰醋酸具有腐蚀性;在处理冰醋酸时戴手套, 不要吸入, 特别是与残留的漂白剂结合使用。
  2. 用玻璃巴斯德移液器取出冰醋酸, 用玻璃巴斯德移液器加入克拉克溶液 (绝对乙醇: 冰醋酸) 的滴液。等待, 直到大部分溶液已蒸发 (或最长 10分钟)。
  3. 用玻璃巴斯德移液器将70% 的乙醇滴加入鸡蛋中, 直到大部分乙醇蒸发 (或最多 10分钟)。

4. 染色

  1. 用玻璃巴斯德移液器去除任何残留的乙醇, 用玻璃巴斯德移液器在鸡蛋中加入 1x PBS 滴, 使 pH 值接近7.0。将显微镜滑块设置在湿度室中, 以防止干燥, 例如, 在一个空的移液器尖端盒子里, 里面有一条湿纸巾 (图 3)。等待至少30分钟。
    请注意:这是最好的点, 如果需要暂停, 只要湿度室可以防止干燥。
  2. 用玻璃巴斯德移液器取出 1x PBS, 并在玻璃巴斯德移液器中加入 0.1μgml DAPI (Dna 荧光染色)。将显微镜滑块设置在深色湿度的室内, 等待至少15分钟。
    注意事项:DAPI 是一种刺激物, 所以要戴上手套。

5. 清洗

  1. 用玻璃巴斯德移液器取出 DAPI。
  2. 用玻璃巴斯德移液器将 1x TBST (由30克 Tris 制成的5倍溶液、由氯化钠制成的5倍、由氯化钠制成的5毫升、5毫升的聚山梨酸盐20和 1.0 g 的 NaN na3 [ph 7.5], 用玻璃巴斯德移液器加入鸡蛋, 带到1升。等待 5分钟, 然后再使用玻璃巴斯德移液器取出 1x TBST。重复此步骤2次。

6. 安装

  1. 最后清洗后, 将石蜡膜上的所有鸡蛋仔细地移到显微镜幻灯片的干净部分。去除多余的 1x TBST;然后, 加入20Μl 的安装介质 (80% 甘油和 20% 1x TBST 与2% 正丙基没食子酸盐), 并在鸡蛋顶部放置一个干净的盖滑块。
  2. 对于长期储存, 用透明的指甲油密封盖板, 然后将滑块保存在2°c 的黑暗中, 或立即在荧光显微镜下查看。

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Representative Results

为了测试 rickettsia 是否影响b. tabaci meam1 雌性的受精率, 我们在黄豆植物 (vinauniculata) 上饲养了感染riketsia(r +) 或未感染的黄豆(r-)b. tabaci. 在27°c、70% 相对湿度和16h 光/18小时暗光周期下分离保持架。R+和 r-第四侧白蝇被小心地从叶子中取出, 并在200μl 带管中分离。当成虫出现时, 他们被收集成50% 的女性群体, 并转移到培养皿中的干净叶子 (n = ~ 50-100/叶) 进行4天的交配。小组大约20个女性和几个男性然后转移到一个干净的叶子盘 (一个为 R-成人,一个为 r + 成人) 在35毫米 petri 培养皿休息在1% 琼脂。培养皿盖已被剪掉, 用于密封的细织物网也防止了多余的冷凝。大约45分钟后, 所有成人被删除, 一些鸡蛋被收获, 以确定受精率, 没有收集的鸡蛋被饲养到成年, 以计算成人性别比。对于 R+和 r-白蝇来说, 一天的一个队列被定义为一个块。有7个街区用于计算受精率或主要性别比率, 而计算成人性别比的方块有6个方块, 因为从一个方块到后方到成年的剩余鸡蛋不足。在统计包 R 中使用了广义线性模型来确定受精率或成人性别比率是否受到立克次体感染和阻滞的显著影响。反应变量分别为受精卵的比例或女性成人的比例, 而解释变量为阻滞和立克次体感染状态。

在荧光显微镜观察时, 鸡蛋的分解和 DAPI 核染色后, 可以明确分配受精 (和胚胎性别) (图 4)。在这项实验中, 对r-b. tabaci meam1 雌性产蛋和 r+b. tabaci meam1 雌性产蛋82个进行了评分.至于成年后饲养的卵子, 有60例 r+成人.虽然在早期的研究中, 151819在成人性别比率方面一直表现出女性的偏见, 但在目前的研究中, 成人 r+性别比率 (69% 为女性, 中位数) 与 r 相比存在女性偏见-女性 (50% 女性, 中位数), 但两种治疗方法的性别比率没有显著差异 (2 = 1.02, df = 1, p = 0.31;图 5)。与 R + 性比 (44% 受精卵中位数) 相比, 主要的 R -比率 (60% 受精卵, 中位数) 有女性偏差, 但也没有显著差异 (2 = 0.51, df = 1, p = 0.51),提供无r +女性受精率提高的证据 (图 5)。阻滞对初级 (2 = 0.29, df = 1, p = 0.29) 或成人 (2 = 1.20, df = 1 , p = 0.29) 的性别比率也没有显著影响。

Figure 1
图 1: 带有石蜡膜和漂白剂滴的显微镜幻灯片的照片.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 一个用热量制成的探头的例子, 它来自一个移液器尖端和一个小的 nadelnn 引脚.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 湿度室的示例, 由一个空的移液器尖端盒和湿纸巾制成.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: b. tabaci卵的荧光显微镜图像.(a) b. tabaci meam1 受精, 新生的雌性卵子。(b) 未受精的新生雄性卵子。卵在产卵后不到1小时固定, 用 DAPI 染色。每个卵子的基部都是荧光的, 因为细菌细胞中的细菌 dna (波尔蒂拉、哈密顿菌, 可能还有里克次那), 其中包括在产蛋20,21中。在每个卵子中, 雌性的原核都在卵子的中心附近, 而在雌性卵子中, 精子在卵子的顶端附近是一个明亮的条纹, 大概是一种自发光的微囊。这些图像是从 z 堆栈生成的视频中拍摄的截图, 由激光扫描共聚焦倒置显微镜制作。刻度条是根据以前的显微镜图像估计的。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 被感染或未感染的 ricketsia的主要和成人性别比率.主要性别比块和胡须情节 (受精卵的百分比, 或女性受精卵的百分比), 与灰色、得票虫感染 (r +) 和未感染 (R ) 的成人性别比 (成年女性百分比) 相比B . tabaci meam1, "tabaci" 基因系。框和晶须图显示中间线的中值, 均值作为加号, 上四分位数和下四分位数显示为构成框的两端的线, 并且范围表示为从框延伸的外部线。R-鸡蛋得分: n = 90;r+鸡蛋得分: n = 82。对于r-成人计数: n = 60;为 R+成人计数: n = 95。在对统计包 R 中的主要性别比率 (受精卵的比例) 进行的后勤分析中, 对块 (n = 7,2 = 0.29, df = 1, p = 0.29) 或里克次体没有明显影响感染 (2 = 0.51, df = 1, p = 0.51)。成人性别比率, 受块 (n = 6) 和立克次体感染状况的影响, 同样进行了分析。在这里, 也没有发现明显的影响块 (2 = 1.20, df = 1, p = 0.27) 或对 rickettsia感染 (2 = 1.20, df = 1, p = 0.27)。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

该方案首次记录了塔巴奇的受精率或主要性别比率。这个协议的挑战是, 它需要研究人员学习如何快速处理白卵, 确保鸡蛋经过不超过 1小时, 直到它们被固定。在初步实验中, 在3小时或更长时间的产卵期固定的卵太旧, 无法观察受精, 因为已经发生了同步, 有丝分裂正在进行中。在1到3小时之间, 原核呈圆形。虽然两个细胞核的早期存在表明受精卵, 但稍晚一点, 两个细胞核在准备合成合子时的位置似乎是一个核, 后来, 第一个有丝分裂的两个产物在雄性和雌性卵子中都有发现。因此, 在这些后期的时间点, 性别之间的区别并不清楚, 我们建议将从产卵到固定的间隔限制在 1小时, 作为保守的措施。学习如何在每次转移液体时对鸡蛋保持温和也是很有挑战性的, 这样它们就不会不被意外吸入移液器。在荧光显微镜下观察鸡蛋时, 一些鸡蛋可能在协议过程中破裂, 因此这些卵不能被性别化, 被计算为原核和蛋黄可能已经逃逸。否则, 一旦操作员对这些步骤感到满意, 协议就可以在3小时内方便地完成, 因为它不需要隔夜固定步骤。它也是灵活的, 因为它可以被修改来染色旧的鸡蛋, 对于那些有兴趣捕捉发育的研究人员来说。

该协议的应用包括对性别分配的研究。尽管数十项关于白细胞生物学的研究报告了不同环境下的成人性别比率, 但成人性别比例将母亲的性别分配与仙女的性别特定发育死亡率混为一谈, 因此无法确定原因任何性别比率模式。这里描述的细胞遗传学技术允许更普遍地理解白人性别分配模式的可能性。虽然大白菜和其他害虫的大量分散种群, 如温室白化, 三叶草, 可能会导致1:1 的性别比率, 这在实验室环境中经常表现出来 22,23, 我们还预测, 生殖干扰, 内共生体, 和潜在的宿主植物质量可能会影响原性性别比。这些同样的因素也可能影响发育过程中的特定性别死亡率模式, 从而有系统地扭曲了性别比率估计数, 这突出表明需要直接衡量主要性别比率。

虽然在遗传线 "mac1"151819中一直发现与rickettsia感染相关的女性偏见, 但在目前的研究中, 成人性别比率并不显著。用细胞遗传学技术观察到的主要性别比率也没有明显的偏差。我们在仅1天的排卵开始时, 当女性4至5天时, 就对b. tabaci女性的主要和成人性别比率进行了调查, 因此所研究的性别比率可能并不代表我们在更长的时间内观察到的性别比率。尽管如此, 这项技术使得有可能确定受精率或主要性别比率, 并在这种情况下显示出主要性别比率和成人性别比率之间的对应关系。

在研究人员可能希望确定白肥人群生殖隔离类型的情况下, 确定受精也可能很有价值。虽然这是一个有争议的问题12,24,25, 但现在人们普遍认为, b. tabaci这个名字指的是数十种神秘物种, 其证据是由遗传分化和遗传差异提供的。交叉测试, 其中很少有女性生产12,25。在这些研究中, 了解隔离发生的地点将是令人感兴趣的。精子是否转移, 异种精子受精卵, 或试图交配不成功?关于主要性别比率的确定, 这种技术可以确定主要性别比率是否受到内共生体、自私遗传元素或许多其他因素之一的影响, 包括个体、竞争对手、食肉动物、寄生虫、病原体、寄主植物或非生物效应。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究的资金来自国家安全基金向 m. s. h. 提供的赠款 (deb-1020460) 和美国农业部 AFRI 赠款 (2010-03752)。作者感谢布伦南·泽尔染色白蛋与许多技巧和禅宗。作者感谢迈克·瑞勒允许使用他的荧光显微镜进行成像。作者感谢苏珊娜·凯利和马可·格比奥拉的蛋象。作者感谢苏珊娜·凯利和吉米·康威在实验的关键时刻提供的帮助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Any
1x TBST Any 5x solution made from 30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0 g NaN3 pH 7.5, and brought to 1 L with PCR grade water
Bleach Clorox Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite
Clear nail polish Any
DAPI dilactate Santa Cruz Biotechnology sc300415
Ethanol Any Dilute to 70% EtOH
Fluorescent microscope Nikon Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10x magnification can be used
Glacial acetic acid Mallinckrodt UN2789
Glycerol Any
Microscope Wild A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used
Microscope slide covers Any Methods are for 18 mm x 18 mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers.
Microscope slides Any
Minuten nadel pins BioQuip 1208SA Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips
NaCl Any
NaN3 Any
n-propyl-gallate Sigma/Santa Cruz Biotechnology P3130/sc-250794
Parafilm Bemis
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20A Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes
PCR grade water Any
Pipette tips Any Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins
Small dropper bulb Any Must fit on Pasteur pipette
Tris Any
Tween-20 Any

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References

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