Determinar la tasa de fertilización de huevos de Bemisia tabaci mediante una técnica citogenética

Genetics

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Summary

Presentamos una sencilla técnica citogenética 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para determinar la tasa de fertilización y primaria cociente del sexo de la plaga invasora del haplodiploid Bemisia tabaci.

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Bondy, E. C., Hunter, M. S. Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique. J. Vis. Exp. (146), e59213, doi:10.3791/59213 (2019).

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Abstract

Algunas especies de moscas blancas chupando savia son algunas de las plagas más dañinas de terrestres en todo el mundo debido a los daños que causan y que vector de virus de plantas. A pesar de numerosos estudios de la biología de estas especies en diferentes ambientes, un parámetro clave historia de la vida, proporción de sexos de crías, ha recibido poca atención, sin embargo, es importante para predecir la dinámica de la población. El principal sex ratio (cociente del sexo en oviposición) de Bemisia tabaci no se ha divulgado nunca pero puede encontrarse determinando la tasa de fertilización de huevos de este insecto haplodiploid. La técnica implica la dechorionation de huevos con bleach, una serie de pasos de fijación y la aplicación de la general mancha fluorescente del ADN, DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole, un colorante fluorescente de ADN), para enlazar a los pronúcleos femeninos y masculinos. Aquí, presentamos la técnica y un ejemplo de su aplicación, para probar si una bacteria endosimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, había influenciado la principal proporción de sexos de B. tabaci. Este método puede ayudar en los estudios de población de mosca blanca, o determinar si existe asignación sexo con ciertos estímulos ambientales.

Introduction

El estudio de asignación de sexo, o la inversión relativa en la descendencia masculina y femenina, es una piedra angular de la ecología conductual1,2,3. Además de su poder para probar modelos adaptativos de comportamiento, conocer la estrategia de asignación de sexo de un organismo puede mejorar modelos de la dinámica de su población. En muchas especies, asignación de sexo es controlada por las madres. Para determinar la asignación de sexo, es importante determinar la proporción de sexos primaria o la proporción de hembras en el momento de la deposición del huevo. Aunque el cociente del sexo en adultos aparición pueden proporcionar pistas para la asignación de sexo, mortalidad desarrollo diferencial entre los juveniles masculinos y femeninos puede comúnmente sesgar la proporción de sexos adultos substancialmente. En algunas especies de himenópteros, la orden de insectos que incluye hormigas, abejas y avispas, la principal proporción de sexos se ha determinado mediante ensayos citogenéticos, tinción de los embriones para ver genética ADN. Porque agroecosistemas son haplodiploid, un incipiente huevo macho es haploide y contiene sólo el pronúcleo femenino (n), mientras que huevos mujer incipientes son diploides y contienen pronúcleos masculinos y femeninos (2n). Aunque Aleyrodidae, la familia sap-alimentación de chinches (Hemiptera) conocido como moscas blancas, son también haplodiploid, no ha sido un ensayo establecido para encontrar la proporción de sexos primaria en estos insectos. Esto quizás es sorprendente dada la intensidad de estudio de los pocos parásitos serios cosmopolitas en esta familia y la importancia de la proporción de sexos en interacciones competitivas de moscas blancas4,5,6,7 ,8,9,10 y en la dinámica de la población general. En los insectos haplodiploid, cocientes del sexo no tienen restricciones de sistemas de determinación del sexo, permitiendo la posibilidad de la fertilización selectiva y lábiles cocientes del sexo que varían con el medio ambiente2. Presentamos aquí una técnica para determinar la proporción de sexos primaria del complejo de especies de moscas blancas conocidos colectivamente como la mosca blanca del camote, B. tabaci. Este nombre de una especie abarca más de 28 especies en todo el mundo11e incluye algunos de los más dañinos plagas invasoras global12,13. La aplicación de esta técnica para determinar los patrones de asignación de sexo en B. tabaci y otra Aleyrodidae permitirá una investigación más rigurosa de las variables, como temperatura, planta huésped, las bacterias endosimbióticas o planta/mosca blanca patógenos, que pueden influir en mosca blanca primaria sexo relaciones y dinámica de poblaciones de mosca blanca.

Somos inconscientes de cualquier técnica de manchas de huevo comparable de B. tabaci. El protocolo es conveniente en comparación con métodos de tinción utilizados para otros insectos huevos14 ya que omite un paso de fijación durante la noche y por lo tanto, se puede terminar dentro de 3 h. Como un ejemplo de una aplicación, una bacteria endosimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, se asocia con sesgo femenino en nuestras líneas de laboratorio de B. tabaci Medio Oriente Asia menor 1 (MEAM1)15,16. En una línea de laboratorio MEAM1 B. tabaci («MAC1,"recogidos desde el centro agrícola de Maricopa), probamos si Rickettsia-infectados (R+) hembras fertilizan más huevos que las hembras no infectadas de (R).

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Protocol

Nota: Asegúrese de que todo trabajo se realiza a temperatura ambiente en un área bien ventilada o bajo una campana de humos. Todas las 'gotas' en el presente Protocolo se definen como 5-20 μl, según la preferencia del operador.

1. primera instalación

  1. Permiten que las moscas blancas a ovipositan en las hojas limpias. Arenas de oviposición por ejemplo jaulas de clip o las hojas cortadas para caber en el agar en una placa Petri. Hacer un agujero coverable de la jaula clip o cubierta de la placa de Petri para insertar y retirar a los adultos. Como alternativa, poner rápidamente un vaso de adultos recogidos en el hielo y, después, depositarlos sobre la hoja. Limitar el tiempo entre la oviposición y fijación de huevo a no más de 60 minutos, para asegurar la observación de la transición de esperma en el pronúcleo paterno en los huevos.
    Nota: Huevos no eliminados de la hoja pueden criarse a la edad adulta para grabar cocientes del sexo adulto.
  2. Antes o durante la oviposición de la mosca blanca, preparar un portaobjetos de microscopio limpiándolo con agua y jabón, secarlo bien y luego estirar un pedazo de parafina película sobre uno de los extremos, asegurándose de que no se rompa la superficie de la película de parafina (figura 1).
    Nota: La película de parafina es hidrófoba y Semiopaco, líquidos para formar gotas y huevos para ser visto más fácilmente.

2. Dechorionation

  1. Con un vaso Pasteur pipeta, añada gotas de solución de lejía (hipoclorito sódico al 0,83%) a la película de parafina.
    Nota: Es más fácil hacer un seguimiento de huevos si sólo son 2 – 3 huevos en cada gota. Por otra parte, para gestionar un número de huevo grande, recoger los huevos en gotas de 1 x de tampón fosfato salino (PBS).
    PRECAUCIÓN: El blanqueador es corrosivo; Use guantes cuando maneje blanqueador y no inhalan.
  2. Eliminar la mosca blanca adulta de la hoja.
  3. Coloque la hoja debajo de un microscopio para ver claramente los huevos y recoger los huevos por separado y con cuidado con una sonda fina. Para hacer una punta de prueba, inserte un pasador de nadel minuten en 45° o en un ángulo de trabajo cómodo en una punta de pipeta fundido (figura 2).
  4. Transferir los huevos a bleach o PBS 1 x. Si utiliza 1 x PBS, retire 1 x PBS con un vidrio Pasteur pipeta una vez todos los huevos se recogen y, luego, añadir lejía a los huevos.
    Nota: Al recoger huevos, levante lentamente el huevo desde su base hasta que el pedicelo se extrae de la hoja. El pedicelo es pegajoso, y el huevo se adhieren comúnmente a punta de la sonda hasta que se sumergió en el blanqueador.
    Nota: Se recomienda utilizar Pipetas Pasteur de vidrio separado para todos los reactivos, y las pipetas pueden ser modificadas con el calor para hacer las puntas más estrechas y reducir el riesgo de aspiración accidental de huevos de mosca blanca. Para evitar la contaminación y residuos, limpiar las pipetas con agua desionizada después de cada uso.
  5. Espere 10 minutos. Si hay un interés en la embriogénesis en mayores de 1 h de huevos, dejar los huevos en lejía hasta 15 min.
    Nota: Huevos que son hasta 1 h de edad, de 10 minutos es suficiente.

3. fijación

Nota: Estos pasos son tomados de un protocolo de himenópteros17.

  1. Quitar el cloro (que contienen los fragmentos del chorion) con un pipeta Pasteur de vidrio y deséchelo. Agregar gotas de ácido acético glacial con un vidrio Pasteur pipeta y esperan 3 minutos.
    PRECAUCIÓN: Proceder con este paso bajo una campana de humos. Ácido acético glacial es corrosivo; usar guantes al manipular ácido acético glacial y no inhalar, especialmente en combinación con el cloro residual.
  2. Quitar el de ácido acético glacial con un pipeta Pasteur de vidrio y agregue gotas de solución de Clarke (3:1 de etanol absoluto: ácido acético glacial) con un vaso Pasteur pipeta. Espere hasta que se haya evaporado la mayor parte de la solución (o máximo 10 minutos).
  3. Añadir gotas de etanol al 70% a los huevos con una pipeta Pasteur de vidrio y espere hasta que se haya evaporado la mayor parte del etanol (o 10 minutos máximo).

4. coloración

  1. Retire cualquier residual etanol con un pipeta Pasteur de vidrio y agregue gotas de 1 x PBS para los huevos con un vaso de pipeta Pasteur para obtener el pH cerca de 7.0. Coloque el portaobjetos en una cámara de humedad para evitar la desecación, por ejemplo, en una caja de punta de la pipeta vacía con una toalla de papel húmeda dentro (figura 3). Espere al menos 30 minutos.
    Nota: Esto es lo mejor si una pausa es necesaria, como la cámara de humedad puede prevenir la desecación.
  2. Quitar el PBS 1 x con un pipeta Pasteur de vidrio y agregue gotas de 0,1 μg/mL DAPI, una tinción fluorescente del ADN, con un vaso Pasteur pipeta. Establecer el portaobjetos en una cámara oscura y espere al menos 15 minutos.
    PRECAUCIÓN: DAPI es un irritante, para manejar con guantes.

5. lavado

  1. Retire el DAPI con un pipeta Pasteur de vidrio.
  2. Añadir gotas de 1 x TBST (5 x solución de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de polisorbato 20 y 1,0 g de NaN3 [pH 7.5] y llevado a 1 L con agua de grado de polimerización en cadena) a los huevos con un vaso Pasteur pipeta. Esperar 5 minutos antes de retirar el 1 x TBST con un pipeta Pasteur de vidrio. Repetir este paso 2 veces.

6. montaje

  1. Después del último lavado, Pipetear cuidadosamente todos los huevos de la película de parafina sobre una parte limpia de la diapositiva del microscopio. Quitar exceso 1 x TBST; Luego, añada 20 μl de medio de montaje (glicerol al 80% y 20% 1 x TBST con 2% n-propyl-gallate) y coloque un portaobjetos limpia cubierta encima de los huevos.
  2. Para almacenamiento a largo plazo, sello de la diapositiva de cubierta con esmalte de uñas transparente y, luego, guardar la diapositiva en la oscuridad entre 2 ° C o inmediatamente lo ve bajo un microscopio de fluorescencia.

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Representative Results

Para probar si la Rickettsia afecta la tasa de fertilización de las hembras MEAM1 B. tabaci , cría Rickettsia-infectados (R+) o no infectados (R) de B. tabaci en plantas de caupí (Vigna unguiculata) en separar jaulas a 27 ° C, 70% de humedad relativa y un fotoperíodo oscuro h 16 h luz/8. R+ R cuarto ínstar moscas blancas fueron cuidadosamente extraídos de hojas y aislados en tubos de tira de 200 μl. Cuando adultos, se recolectaron en grupos de 50% hembras y transferida a las hojas limpias en cajas Petri (n = ~50-100/leaf) por 4 días del apareamiento. Grupos de aproximadamente 20 hembras y varios machos fueron trasladados luego a un disco limpio de hojas (una para R adultos, una para adultos R+ ) en cajas Petri de 35 mm en 1% de agar. La tapa de la caja de Petri había cortada hacia fuera y la malla de tejido fino utilizada para la contención también prevenir condensación excesiva. Después de aproximadamente 45 minutos, se retiraron todos los adultos, algunos de los huevos fueron cosechadas para determinar la tasa de fertilización y los huevos que no fueron recogidos fueron criados a la edad adulta para calcular el cociente del sexo adulto. Una cohorte para un solo día, para R+ y R moscas blancas, se definió como un bloque. Había siete cuadras para el cálculo de la tasa de fertilización o primaria de masculinidad, mientras que hubo seis bloques para el cálculo de la proporción de sexos adultos, ya que hay no hay suficiente huevos sobrantes de una cuadra a la posterior a la edad adulta. Se utilizó un modelo lineal generalizado en el paquete estadístico R para determinar si la tasa de fertilización o cocientes del sexo adulto fueron significativamente influidos por Rickettsia infección o bloque. Las variables de respuesta fueron la proporción de fertilizados huevos, todos huevos, o la proporción de mujeres adultas/todos los adultos, respectivamente, mientras que las variables explicativas fueron el bloque y el estatus de infección por Rickettsia .

Dechorionation de huevo seguida de tinción nuclear DAPI permitió la asignación inequívoca de fertilización (y el sexo del embrión) cuando observa con un microscopio de fluorescencia (figura 4). Para este experimento, 90 huevos puestos por Rhembras MEAM1B. tabaci y se anotaron 82 huevos por las hembras R+MEAM1B. tabaci . En cuanto a huevos criados a la edad adulta, se anotaron 60 R y 95 adultos R+ . Mientras que un sesgo femenino en cocientes del sexo adulto se ha demostrado en anteriores estudios15,18,19, en el actual estudio, adultos R+ cocientes del sexo (69% mujeres, mediana) fueron parciales de mujer comparado con el R hembras (50% mujeres, mediana), pero los cocientes del sexo en los dos tratamientos no fueron significativamente diferentes (χ2 = 1.02, df = 1, p = 0,31; Figura 5). Los cocientes del sexo Rprimarios (huevos fertilizado el 60% mediana) fueron sesgados por la mujer en comparación con cocientes del sexo R+ (huevos fertilizado el 44%, mediana) pero también no fueron significativamente diferentes (χ2 = 0.51, df = 1, p = 0,47), que no evidencia de una mayor tasa de fertilización por hembras R+ (figura 5). Bloque también no tenía un efecto significativo en el primario (χ2 = 0.29, df = 1, p = 0,59) o adulto (χ2 = 1.20, df = 1, p = 0.27) cociente del sexo.

Figure 1
Figura 1: foto de un portaobjetos de microscopio con la película de parafina y gotas de lejía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: ejemplo de una sonda, con calor, de una punta de pipeta y un pin de nadeln minuten. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: ejemplo de una cámara de humedad, de una caja de punta de la pipeta vacía y una toalla de papel húmeda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes de microscopio de fluorescencia de B. tabaci huevos. (un) B. tabaci MEAM1 incipiente, fertilizado óvulo. (b) Unfertilized incipiente huevo hombre. Los huevos se fija en menos de 1 h después de la oviposición y teñidos con DAPI. La base de cada huevo es fluorescencia debido a la DNA bacteriana (Portiera, Hamiltonellay Rickettsia) en la célula del progenitor de bacteriome, que está incluida en el huevo puesto20,21. En cada huevo, el pronúcleo femenino está cerca del centro del huevo, y en el óvulo femenino, el espermatozoide es visible como una raya brillante cerca del ápice del huevo cerca de lo que es probablemente un micrópilo de autofluorescing. Las imágenes son imágenes tomadas de una pila Z generada video, producido por un láser de barrido confocal microscopio invertido. Se estimaron las barras de escala de las anteriores imágenes de microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Adultos y primarias cocientes del sexo de Rickettsia-infectados o no infectados de B. tabaci. Diagramas de caja y bigote de la proporción de sexos primaria (porcentaje de huevos fertilizados, o porcentaje de zigotos femenino) en negro en comparación con la proporción de sexos adultos (porcentaje de las hembras adultas) en gris, de la Rickettsia-infectados (R+) y no infectados (R -) MEAM1 B. tabaci , línea genética «MAC1». Los diagramas de caja y bigotes muestran la mediana de la línea media, la media como un signo más, como los cuartiles superiores e inferiores que las líneas que hacen que los extremos de la caja, y la gama es en las líneas exteriores que se extienden desde la caja. R huevos anotadas: n = 90; R+ huevos anotadas: n = 82. Para adultos Rcontados: n = 60; para adultos R+ contados: n = 95. En un análisis logístico de la primaria sex ratio (proporción de óvulos fecundados) en el paquete estadístico R, se encontró ningún efecto significativo para el bloque (n = 7, χ2 = 0.29, df = 1, p = 0,59) o por Rickettsia infección (χ2 = 0.51, df = 1, p = 0,47). Cocientes del sexo adulto, como influenciado por el bloque (n = 6) y el estado de infección por Rickettsia , asimismo fueron analizados. Aquí, se encontró ningún efecto significativo para bloque (χ2 = 1.20, df = 1, p = 0.27) o por infección por Rickettsia2 = 1.02, df = 1, p = 0,31). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo es el primero en capturar la tasa de fertilización o de masculinidad primaria de B. tabaci. El reto de este protocolo es que requiere de los investigadores a aprender cómo manejar los huevos de la mosca blanca rápidamente, asegurándose de que no más de 1 h ha pasado desde que los huevos eran ovipositaron hasta que son fijos. En experimentos preliminares, huevos que fueron fijados en 3 h o más postoviposition eran demasiado viejos para observar fecundación, como había ocurrido syngamy y divisiones mitóticas estaban en marcha. Entre 1 a 3 h, los pronúcleos tomaron una forma más redonda. Mientras que la presencia temprana de dos núcleos indica un óvulo fertilizado, un poco más tarde, la aposición de los dos núcleos en la preparación de syngamycan parecen ser de un núcleo y más adelante otra vez, los dos productos de la primera división mitótica se encuentran en los huevos de tanto hombres como mujeres. Por lo tanto, la distinción entre los sexos no es claro en estos momentos más adelante, y se aconseja limitar el intervalo de oviposición para fijación a 1 h como una medida conservadora. También es un reto para aprender a ser gentil con los huevos en cada transferencia de líquido para que no se aspiran accidentalmente dentro de la pipeta. En el momento de ver los huevos con un microscopio fluorescente, algunos de los huevos pueden haber infringido durante el protocolo, por lo que los huevos no ser sexuados como los pronúcleos y yema de huevo puede haber escapado. De lo contrario, una vez que el operador se encuentre cómodo con estos pasos, el protocolo puede terminar convenientemente dentro de 3 h, como no requiere un paso de fijación durante la noche. También es flexible en que puede ser modificado para teñir huevos más viejos, para aquellos investigadores interesados en la captura de desarrollo.

Una aplicación de este protocolo incluye investigación sobre asignación de sexo. Aunque muchas docenas de estudios de la biología de la mosca blanca se divulgado adultos cocientes del sexo en diferentes ambientes, cocientes del sexo adulto confundir asignación de sexo de la madre con sexo-desarrollo mortalidad de ninfas y hacen imposible determinar la causa de cualquier patrón de masculinidad. La técnica citogenética que se describe aquí permite la posibilidad de mosca blanca comprensión patrones de asignación de sexo en general. Mientras que la dispersión grandes poblaciones de B. tabaci y otras plagas como la mosca blanca del invernadero, Trialeurodes vaporariorum, podría predecirse en proporción 1:1, tantas veces expuesto en laboratorio configuración22, 23, también predecimos que interferencia reproductiva, endosimbionte y calidad de la planta huésped podrían influir en primarias cocientes del sexo. Que estos mismos factores también podrían influir los patrones de mortalidad por sexo durante el desarrollo, sistemáticamente sesgar cociente del sexo estima, pone de relieve la necesidad de una medida directa de la relación primaria del sexo.

Mientras que sesgo femenino asociado a infección por Rickettsia se ha encontrado constantemente en la línea genética «MAC1»15,18,19, los cocientes del sexo adulto no eran significativamente femeninos parcial en el estudio actual. El sexo primario cocientes observados con la técnica citogenética no eran significativamente sesgado cualquiera. Tenemos censados los cocientes del sexo de las hembras B. tabaci en solo 1 día, en el comienzo de una pelea de la oviposición, cuando las hembras eran 4 a 5 días, por lo que los cocientes del sexo estudió primarios y adultos no han representado los cocientes del sexo que observamos durante períodos más prolongados. Sin embargo, la técnica permitió determinar la tasa de fertilización o de masculinidad primaria y, en este caso, mostró una correspondencia entre las proporciones de sexo de primarias y adultos.

Determinar la fertilización también puede ser valiosa en los casos en que los investigadores quieran determinar el tipo de aislamiento reproductivo entre las poblaciones de mosca blanca. Mientras que ha sido objeto de cierta controversia12,24,25, ahora es generalmente aceptado que el nombre de B. tabaci se refiere a decenas de especies crípticas, evidencia por tanto divergencia genética y cruce de pruebas en el que las hembras algunos son producidos12,25. En estos estudios, sería interesante saber donde se produce el aislamiento. Se transfiere el esperma, ¿heteroespecíficas esperma fecundar óvulos y son apareamientos intento fracasado? En cuanto a la determinación de la relación primaria del sexo, esta técnica puede determinar si la principal proporción de sexos está influenciada por los endosimbiontes, elementos genéticos egoístas o uno de muchos otros factores, como sus congéneres, competidores, depredadores, parasitoides, patógenos, la planta huésped o efectos abióticos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue financiada por una subvención de NSF (DEB-1020460) a M.S.H. y una subvención del USDA AFRI (2010-03752) a M.S.H. Los autores agradecen que Brennan Zehr coloración de huevos de mosca blanca con mucha habilidad y Zen. Los autores agradecen que Mike Riehle permitiendo el uso de su microscopio de fluorescencia para la proyección de imagen. Los autores agradecen a Suzanne Kelly y Marco Gebiola para las imágenes de huevo. Los autores agradecen a Suzanne Kelly y Jimmy Conway para ayudar en momentos cruciales durante los experimentos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Any
1x TBST Any 5x solution made from 30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0 g NaN3 pH 7.5, and brought to 1 L with PCR grade water
Bleach Clorox Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite
Clear nail polish Any
DAPI dilactate Santa Cruz Biotechnology sc300415
Ethanol Any Dilute to 70% EtOH
Fluorescent microscope Nikon Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10x magnification can be used
Glacial acetic acid Mallinckrodt UN2789
Glycerol Any
Microscope Wild A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used
Microscope slide covers Any Methods are for 18 mm x 18 mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers.
Microscope slides Any
Minuten nadel pins BioQuip 1208SA Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips
NaCl Any
NaN3 Any
n-propyl-gallate Sigma/Santa Cruz Biotechnology P3130/sc-250794
Parafilm Bemis
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20A Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes
PCR grade water Any
Pipette tips Any Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins
Small dropper bulb Any Must fit on Pasteur pipette
Tris Any
Tween-20 Any

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References

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