Determinare il tasso di fertilizzazione dell'uovo di Bemisia tabaci utilizzando una tecnica citogenetica

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Genetics

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Summary

Vi presentiamo una semplice tecnica citogenetica usando 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per determinare il tasso di fertilizzazione e rapporto primario del sesso del parassita invasivo haplodiploid Bemisia tabaci.

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Bondy, E. C., Hunter, M. S. Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique. J. Vis. Exp. (146), e59213, doi:10.3791/59213 (2019).

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Abstract

Poche specie di aleurodidi sap-succhiare sono alcuni dei più dannosi parassiti terrestri in tutto il mondo a causa i danni alle colture che infliggono e virus vegetali che hanno vector. Nonostante i numerosi studi della biologia di queste specie in ambienti diversi, un parametro chiave vita storia, prole rapporti del sesso, ha ricevuto poca attenzione, è ancora importante per prevedere la dinamica di popolazione. Il rapporto primario del sesso (rapporto del sesso alla deposizione delle uova) di Bemisia tabaci non è stato segnalato mai, ma può essere trovato determinando il tasso di fertilizzazione dell'uovo di questo insetto haplodiploid. La tecnica prevede il dechorionation di uova con candeggina, una serie di passaggi di fissazione e l'applicazione della generale macchia fluorescente DNA, DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole, una tintura fluorescente DNA-binding), da associare alla pronuclei maschili e femminili. Qui, presentiamo la tecnica e un esempio della sua applicazione, per verificare se un batterio endosimbiotica, Rickettsia SP. nr. bellii, influenzato il rapporto primario del sesso di b. tabaci. Questo metodo può aiutare negli studi di popolazione di aleurodidi, o determinare se allocazione sesso esiste con determinati stimoli ambientali.

Introduction

Lo studio dell'allocazione di sesso, o il relativo investimento nella prole maschio e femmina, è una pietra angolare di ecologia comportamentale1,2,3. Oltre alla sua potenza per test adattivi modelli di comportamento, sapendo che la strategia di allocazione del sesso di un organismo può migliorare modelli delle sue dinamiche di popolazione. In molte specie, allocazione di sesso è controllata dalle madri. Per determinare l'allocazione di sesso, è importante determinare il rapporto primario del sesso o la percentuale di femmine al momento della deposizione dell'uovo. Anche se il rapporto del sesso adulto emersione può fornire indicazioni di attribuzione di sesso, mortalità differenziale dello sviluppo tra i giovani maschi e femminili comunemente comunque alterare il rapporto del sesso adulto sostanzialmente. In alcune specie di imenotteri, l'ordine di insetti che contiene le formiche, API e vespe, il rapporto primario del sesso è stato determinato con analisi citogenetiche, gli embrioni per visualizzare DNA genetico di colorazione. Perché imenotteri sono haplodiploid, un incipiente uovo maschio è aploide e contiene solo il pronucleo femmina (n), mentre incipiente uova femminile sono diploidi e contengono pronuclei maschili e femminili (2n). Anche se Aleyrodidae, la famiglia di insetti Rincoti (Hemiptera) conosciuto come whiteflies, sap-alimentazione sono anche haplodiploid, non c'è un'analisi consolidata per trovare il rapporto primario del sesso in questi insetti. Questo è forse sorprendente dato l'intensità di studio dei pochi parassiti gravi cosmopoliti in questa famiglia e l'importanza dei rapporti del sesso in interazioni concorrenziali di aleurodidi4,5,6,7 ,8,9,10 e in dinamica di popolazione in genere. In haplodiploid insetti troppo, rapporti del sesso non sono vincolati dai sistemi di determinazione del sesso, consentendo la possibilità di fecondazione selettiva e labili rapporti del sesso che variano con l' ambiente2. Qui presentiamo una tecnica per determinare il rapporto primario del sesso del complesso specie di aleurodidi conosciuti collettivamente come il sweetpotato whitefly, b. tabaci. Questo nome di una specie comprende più di 28 specie in tutto il mondo11e comprende alcuni dei più dannosi parassiti invasivi globale12,13. L'applicazione di questa tecnica per determinare gli schemi di allocazione di sesso in b. tabaci e altri Aleyrodidae permetterà una più rigorosa indagine di variabili, tra cui temperatura, pianta ospite, endosymbiotic batteri o pianta/whitefly agenti patogeni, che possono influenzare whitefly primaria rapporti del sesso e dinamica di popolazione di mosche bianche.

Siamo ignari di qualsiasi tecnica di uovo-macchiatura paragonabile per b. tabaci. Il protocollo è conveniente rispetto ai metodi di colorazione utilizzate per altre uova dell'insetto14 come viene omesso un passaggio di fissazione durante la notte e, di conseguenza, può essere completato in 3 h. Come un esempio di un'applicazione, un batterio endosimbiotica, Rickettsia SP. nr. bellii, è associato con bias femminile nelle nostre linee di laboratorio di b. tabaci Medio Oriente-Asia minore 1 (MEAM1)15,16. In una sola riga di laboratorio b. tabaci MEAM1 ("MAC1," raccolto dalla Maricopa Agricultural Center), verifichiamo se Rickettsia-infetti (R+) femmine fertilizzano più uova rispetto alle femmine (R.) non infette.

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Protocol

Nota: Garantire che tutto il lavoro è eseguito a temperatura ambiente in una zona ben ventilata o sotto una cappa aspirante. Tutte le 'gocce' in questo protocollo sono definiti come 5 – 20 µ l, a seconda delle preferenze dell'operatore.

1. il primo programma di installazione

  1. Consentire whiteflies femminile a oviposit su foglie di pulito. Sono esempi per arene di deposizione delle uova gabbie clip o foglie tagliate per adattarsi su agar in una capsula di Petri. Fare un buco copribile nella gabbia di clip o copertura di Petri da inserire e rimuovere gli adulti. In alternativa, rapidamente mettere un vaso di adulti raccolti sul ghiaccio e, quindi, li depositi sulla foglia. Limitare il tempo tra la deposizione delle uova e la fissazione di uovo a non più di 60 min, per garantire l'osservazione della transizione dello sperma nel pronucleo paterno nelle uova.
    Nota: Uova non rimosse dalla foglia possono essere allevate fino all'età adulta per registrare i rapporti del sesso adulti.
  2. Prima o durante la deposizione delle uova di mosche bianche, preparare un vetrino da microscopio di pulirlo con acqua e sapone, asciugarlo bene e poi si estende un pezzo di pellicola di paraffina su un'estremità, facendo attenzione a che non rompere la superficie della pellicola di paraffina (Figura 1).
    Nota: Il film di paraffina è idrofobo e semi-coprente, consentendo liquidi per formare gocce e uova per essere visto più facilmente.

2. Dechorionation

  1. Con un bicchiere di Pasteur pipetta, aggiungere gocce di soluzione di candeggina (ipoclorito di sodio 0,83%) per il film di paraffina.
    Nota: È più facile tenere traccia delle uova se solo 2-3 uova sono in ogni goccia. In alternativa, per gestire un numero di grande uovo, raccogliere le uova in gocce di 1x tampone fosfato salino (PBS).
    Attenzione: Bleach è corrosivo; indossare guanti durante la manipolazione candeggina e non inalano.
  2. Rimuovere il whiteflies adulti dalla foglia.
  3. Posizionare la foglia al microscopio per vedere chiaramente le uova e raccogliere le uova singolarmente e accuratamente con una sonda sottile. Per rendere una sonda, è necessario inserire un pin di nadel minuten a 45° o a un angolo di lavoro confortevole in un puntale fuso (Figura 2).
  4. Trasferire le uova a candeggina o 1X PBS. Se si utilizza 1X PBS, togliere il 1X PBS con un vetro Pasteur pipetta una volta tutte le uova sono raccolti e, quindi, aggiungere candeggina per le uova.
    Nota: Quando si raccolgono le uova, sollevare lentamente l'uovo dalla sua base fino a quando il pedicello è rimosso dalla foglia. Il pedicello è appiccicoso, e l'uovo comunemente si attaccherà alla punta della sonda fino a quando si è tuffato nella candeggina.
    Nota: Si raccomanda di utilizzare pipette Pasteur separata di vetro per tutti i reagenti e le pipette possono essere modificate con calore a restringere le punte e ridurre il rischio di aspirare accidentalmente uova di mosche bianche. Per evitare residui e contaminazioni, pulire le pipette con acqua deionizzata dopo ogni uso.
  5. Attendere 10 min. Se c'è un interesse nell'embriogenesi in uova oltre 1 h, è possibile lasciare le uova in candeggina per fino a 15 min.
    Nota: Per le uova che sono fino a 1h di vecchia, 10 min è sufficiente.

3. fissazione

Nota: Questi passaggi provengono da un protocollo dell'ordine dei Hymenoptera.17.

  1. Rimuovere la candeggina (che contiene i frammenti di corion) con un pipetta Pasteur di vetro ed eliminarlo. Aggiungere gocce di acido acetico glaciale con un vetro Pasteur pipetta e attendere 3 min.
    Attenzione: Procedere con questo passaggio sotto cappa aspirante. Acido acetico glaciale è corrosivo; indossare guanti quando movimentazione acido acetico glaciale e non inalare, specialmente in combinazione con la candeggina residua.
  2. Rimuovere l'acido acetico glaciale con un pipetta Pasteur di vetro e aggiungere gocce di soluzione di Clarke (3:1 di etanolo assoluto: acido acetico glaciale) con un bicchiere di Pasteur pipetta. Attendere fino a quando la maggior parte della soluzione è evaporata (o 10 minuti max).
  3. Aggiungere gocce di etanolo al 70% per le uova con un vetro pipetta Pasteur e attendere fino a quando la maggior parte dell'etanolo evaporato (o 10 min max).

4. colorazione

  1. Rimuovere qualsiasi residuo etanolo con un pipetta Pasteur di vetro e aggiungere gocce di PBS 1X le uova con un vetro pipetta Pasteur per ottenere il pH vicino a 7.0. Impostare il vetrino in una camera umida per evitare dissecazione, ad esempio, in una casella di punta di pipetta vuoto con un tovagliolo di carta bagnato all'interno (Figura 3). Attendere almeno 30 min.
    Nota: Questo è il punto migliore se è necessaria una pausa, come camera umidostatica può prevenire l'essiccazione.
  2. Rimuovere il PBS 1x con un pipetta Pasteur, di vetro e aggiungere gocce di 0,1 μg/mL DAPI, una macchia fluorescente DNA, con un bicchiere di Pasteur pipetta. Impostare il vetrino in una camera umida scuro e aspettare almeno 15 minuti.
    Attenzione: DAPI è un irritante, quindi maneggiare con guanti.

5. lavaggio

  1. Rimuovere il DAPI con un pipetta Pasteur di vetro.
  2. Aggiungere gocce di 1 x TBST (5 x soluzione fatta da 30 g di Tris, 43,8 g di NaCl, 5 mL di polisorbato 20 e 1,0 g di NaN3 [pH 7.5] e portato a 1 L con acqua grado PCR) per le uova con un bicchiere di Pasteur pipetta. Attendere 5 minuti prima di rimuovere la 1 x TBST con un pipetta Pasteur di vetro. Ripetere questo passaggio 2 volte.

6. montaggio

  1. Dopo il lavaggio finale, Pipettare attentamente tutte le uova dal film di paraffina su una parte pulita del vetrino da microscopio. Rimuovere l'eccesso 1 x TBST; quindi, aggiungere 20 µ l di supporti di montaggio (glicerolo 80% e 20% 1 x TBST con 2% n-gallato di propile) e posizionare un vetrino pulito sopra le uova.
  2. Per l'archiviazione a lungo termine, sigillare il vetrino di copertura con smalto trasparente e, quindi, conservare il vetrino al buio a 2 ° C o visualizzarlo immediatamente sotto un microscopio a fluorescenza.

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Representative Results

Per verificare se la Rickettsia colpisce il tasso di fertilizzazione di b. tabaci MEAM1 femmine, abbiamo allevato Rickettsia-infettati (R+) o non infetti (R.) b. tabaci su piante di fagiolo dall'occhio (Vigna unguiculata) in separare le gabbie a 27 ° C, umidità relativa 70% e un fotoperiodo di 16 h luce/8 h scuro. R+ e R quarto instar whiteflies erano accuratamente rimosso dalle foglie e isolato in tubi in striscia 200 µ l. Quando gli adulti emersero, erano raccolti in gruppi di 50% femmine e trasferito a foglie pulite in capsule di Petri (n = ~50-100/leaf) per 4 giorni di accoppiamento. Gruppi di circa 20 femmine e parecchi maschi sono state poi trasferite su un disco pulito foglia (uno per R adulti, una per adulti R+ ) in 35 mm piastre di Petri che riposa sull'agar di 1%. Il coperchio della scatola di Petri era stato tagliato e la maglia di tessuto pregiato utilizzata per il contenimento ha impedito anche condensa in eccesso. Dopo circa 45 min, tutti gli adulti sono stati rimossi, alcune delle uova sono state raccolte per determinare il tasso di fertilizzazione e le uova che non sono state raccolte sono state allevate fino all'età adulta per calcolare il rapporto di sesso adulto. Una coorte per un solo giorno, per R+ e R aleurodidi, è stata definita come un blocco. C'erano sette blocchi per calcolare il tasso di fertilizzazione o rapporto primario del sesso, mentre c'erano sei isolati per calcolare il rapporto del sesso adulto, come c'era non abbastanza uova rimanenti da un blocco al posteriore all'età adulta. Un modello lineare generalizzato è stato utilizzato nel pacchetto statistico R per determinare se i tassi di fertilizzazione o rapporti del sesso adulti sono stati influenzati significativamente da Rickettsia infezione e/o blocco. Le variabili di risposta erano la proporzione di fecondato uova/tutte le uova, o la percentuale di femmine adulte/tutti gli adulti, rispettivamente, mentre anche variabili esplicative sono stati il blocco e lo stato di infezione della Rickettsia .

Uovo dechorionation seguita dalla macchiatura nucleare DAPI ha permesso l'assegnazione univoca della fecondazione (e del sesso dell'embrione) quando osservata con un microscopio a fluorescenza (Figura 4). Per questo esperimento, 90 uova deposte da RMEAM1 dib. tabaci femmine e 82 uova dalle femmine R+b. tabaci MEAM1 sono state segnate. Per quanto riguarda le uova allevate fino all'età adulta, 60 R e 95 R+ adulti sono stati segnati. Mentre una polarizzazione femmina nei rapporti del sesso adulti ha dimostrata costantemente in precedenti studi15,18,19, nello studio corrente, adulto R+ rapporti del sesso (69% femmine, mediano) erano donna-biased rispetto a R femmine (50% femmine, mediana), ma i rapporti del sesso in due trattamenti non erano significativamente differenti (χ2 = 1,02, df = 1, p = 0,31; Figura 5). I rapporti del sesso Rprimari (60% fecondato uova, mediana) erano donna-biased rispetto ai rapporti del sesso R+ (44% fecondato uova, mediana), ma anche non erano significativamente differenti (χ2 = 0,51, df = 1, p = 0,47), fornendo no prova per i maggiori tassi di fertilizzazione da femmine R+ (Figura 5). Blocco anche non ha avuto un effetto significativo sul primario (χ2 = 0.29, df = 1, p = 0,59) o adulti (χ2 = 1.20, df = 1, p = 0,27) rapporto del sesso.

Figure 1
Figura 1: foto di un vetrino da microscopio con il film di paraffina e gocce di candeggina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: esempio di una sonda, modellato con calore, da un puntale e un pin di nadeln minuten. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: un esempio di una camera umida, ricavata da una casella di punta della pipetta vuoto e un tovagliolo di carta bagnato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Immagini del microscopio fluorescente di b. tabaci uova. (un) MEAM1 di b. tabaci fertilizzato, incipiente uovo femminile. (b) Unfertilized, incipiente uovo maschio. Le uova erano fissi a meno di 1 h dopo la deposizione delle uova e macchiate con DAPI. La base di ogni uovo è che reagiscono a causa di DNA batterico (Portiera, Hamiltonellae possibilmente Rickettsia) nella cellula progenitore bacteriome, che è incluso nell'uovo rilassato20,21. In ogni uovo, il pronucleo femmina è vicino al centro dell'uovo e nell'uovo femmina solo, lo sperma è visibile come una striscia luminosa vicino all'apice dell'uovo vicino a ciò che è presumibilmente un micropilo autofluorescing. Le immagini sono screenshot prelevati da uno Z-stack generato video, prodotta da un laser a scansione confocale microscopio invertito. Le barre di scala sono state stimate da precedenti immagini al microscopio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Primari e adulti rapporti del sesso della Rickettsia-infettati o non infetti di b. tabaci. Casella e whisker trame del rapporto primario del sesso (percentuale di uova fecondate, o la percentuale degli zigoti femminile) in nero rispetto al rapporto del sesso adulto (percentuale di femmine adulte) in grigio, della Rickettsia-(R.+) di infetti e non infetti (R -) MEAM1 di b. tabaci , linea genetica "MAC1". La scatola e baffi grafici mostrano la mediana come la linea mediana, la media come un segno più e quartili superiori e inferiori, come le linee che rendono le estremità della scatola, e l'intervallo è rappresentato nelle linee esterne che si estende dalla casella. Per R uova segnate: n = 90; per R+ uova segnate: n = 82. Per gli adulti di Rconteggiati: n = 60; per gli adulti di R+ conteggiati: n = 95. In un'analisi logistica del rapporto primario del sesso (proporzione di uova fecondate) eseguita nel pacchetto statistico R, gli effetti non significativi sono stati trovati per blocco (n = 7, χ2 = 0.29, df = 1, p = 0,59) o per Rickettsia infezione (χ2 = 0,51, df = 1, p = 0,47). Rapporti del sesso adulti, come influenzato dal blocco (n = 6) e lo stato di infezione della Rickettsia , allo stesso modo sono stati analizzati. Qui pure, gli effetti non significativi sono stati trovati per blocco (χ2 = 1.20, df = 1, p = 0,27) o per l'infezione della Rickettsia2 = 1,02, df = 1, p = 0,31). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo è il primo a catturare il tasso di fertilizzazione o rapporto primario del sesso di b. tabaci. La sfida del presente protocollo è che richiede ai ricercatori di imparare a gestire le uova di mosche bianche rapidamente, garantendo che non più di 1 h è passato dal momento che le uova erano oviposited fino a quando non sono fissi. Durante gli esperimenti preliminari, uova che sono stati corretti alle 3h o più postoviposition erano troppo vecchie per osservare la fecondazione, come singamia aveva accaduto e divisioni mitotiche erano in corso. Tra 1 a 3 h, i pronuclei ha assunto una forma più rotonda. Mentre la prima volta la presenza di due nuclei indica un ovulo fecondato, un po' più tardi, l'apposizione dei due nuclei in preparazione per syngamycan sembrano essere un nucleo e più tardi ancora una volta, i due prodotti della prima divisione mitotica si trovano nelle uova sia maschile che femminile. Di conseguenza, la distinzione tra i sessi non è chiaro in questi intervalli di tempo più tardi, e si consiglia di limitare l'intervallo dalla deposizione delle uova alla fissazione per 1h come misura conservativa. È anche stimolante per imparare a essere gentile con le uova ad ogni trasferimento di liquido in modo che essi non sono accidentalmente aspirati nella pipetta. Al momento della visualizzazione le uova sotto un microscopio a fluorescenza, alcuni delle uova potrebbero essersi rotto durante il protocollo, quindi quelle uova non possono essere sessuate e considerate come i pronuclei e tuorlo può essere sfuggito. In caso contrario, una volta che l'operatore diventa confortevole con questi passaggi, il protocollo può essere completato comodamente all'interno di 3 h, come non richiede un passaggio di fissazione durante la notte. Inoltre è flessibile in quanto possa essere modificate per macchiare le uova più grandi, per quei ricercatori interessati a catturare lo sviluppo.

Un'applicazione di questo protocollo comprende ricerche sulla ripartizione del sesso. Anche se molte decine di studi di biologia di mosche bianche sono segnalati rapporti del sesso adulti in ambienti diversi, rapporti del sesso adulti confondere allocazione di sesso della madre con sesso-specifici mortalità inerente allo sviluppo di ninfe e l'impossibilità di determinare la causa di qualsiasi modello di rapporto del sesso. La tecnica citogenetica qui descritta consente la possibilità di mosche bianche comprensione schemi di allocazione di sesso più in generale. Mentre le grandi popolazioni dispersive di b. tabaci e altri parassiti come la mosca bianca della serra, Trialeurodes vaporariorum, potrebbe essere preveduta per provocare i rapporti 1:1 del sesso, come spesso esposti in laboratorio impostazioni22, 23, prevediamo anche che disturbi riproduttivi, endosimbionti e potenzialmente qualità della pianta ospite potrebbe influenzare primari rapporti del sesso. Che questi stessi fattori potrebbero anche influenzare il sesso-specifici di mortalità durante lo sviluppo, inclinazione sistematicamente il rapporto del sesso stime, sottolinea l'esigenza di una misura diretta del rapporto primario del sesso.

Mentre female bias connesso con l'infezione della Rickettsia è stata trovata costantemente in linea genetica "MAC1"15,18,19, i rapporti del sesso adulti non erano significativamente femminili prevenuto nello studio corrente. Il primario sesso rapporti osservati con la tecnica citogenetica non erano significativamente sia prevenuto. Abbiamo censiti i rapporti del sesso primari e adulti di b. tabaci femmine solo 1 giorno, all'inizio di un incontro di deposizione delle uova, quando le femmine erano 4 o 5 giorni di vita, quindi ha studiato i rapporti del sesso può non hanno rappresentato i rapporti del sesso che abbiamo osservato in periodi più lunghi. Tuttavia, la tecnica ha permesso di determinare il tasso di fertilizzazione o rapporto sessuale primario e, in questo caso, ha mostrato una corrispondenza tra i rapporti di sesso primari e adulti.

Determinare la fecondazione può anche essere utile in casi in cui i ricercatori potrebbero voler determinare il tipo di isolamento riproduttivo tra le popolazioni di mosche bianche. Anche se è stata una questione di qualche polemica12,24,25, ora è generalmente accettato che il nome di b. tabaci si riferisce a decine di specie criptiche, con prove fornite da entrambi divergenza genetica e attraversando le prove in cui poche femmine sono prodotte12,25. In questi studi, sarebbe interessante sapere dove si verifica l'isolamento. Lo sperma viene trasferito e heterospecific sperma fertilizzare le uova, o accoppiamenti tentativi non hanno esito positivo? Per quanto riguarda la determinazione del rapporto sessuale primaria, questa tecnica può determinare se il rapporto primario del sesso è influenzato da endosimbionti, elementi genetici egoisti o uno dei molti altri fattori, tra cui conspecifici, concorrenti, predatori, parassitoidi, agenti patogeni, la pianta ospite o effetti abiotici.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata finanziata da una sovvenzione di NSF (DEB-1020460) a M.S.H. e una sovvenzione di USDA AFRI (2010-03752) a M.S.H. Gli autori ringraziano Brennan Zehr per la macchiatura uova di mosche bianche con molta abilità e Zen. Gli autori ringraziano Mike Riehle per consentire l'uso del suo microscopio a fluorescenza per l'imaging. Gli autori ringraziano Suzanne Kelly e Marco Gebiola per le immagini di uovo. Gli autori ringraziano Suzanne Kelly e Jimmy Conway per aiutare nei momenti cruciali durante gli esperimenti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Any
1x TBST Any 5x solution made from 30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0 g NaN3 pH 7.5, and brought to 1 L with PCR grade water
Bleach Clorox Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite
Clear nail polish Any
DAPI dilactate Santa Cruz Biotechnology sc300415
Ethanol Any Dilute to 70% EtOH
Fluorescent microscope Nikon Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10x magnification can be used
Glacial acetic acid Mallinckrodt UN2789
Glycerol Any
Microscope Wild A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used
Microscope slide covers Any Methods are for 18 mm x 18 mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers.
Microscope slides Any
Minuten nadel pins BioQuip 1208SA Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips
NaCl Any
NaN3 Any
n-propyl-gallate Sigma/Santa Cruz Biotechnology P3130/sc-250794
Parafilm Bemis
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20A Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes
PCR grade water Any
Pipette tips Any Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins
Small dropper bulb Any Must fit on Pasteur pipette
Tris Any
Tween-20 Any

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References

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