Détermination du taux de fécondation des oeufs de Bemisia tabaci , utilisant une Technique cytogénétique

Genetics

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Summary

Nous présentons une technique cytogénétique simple à l’aide de 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour déterminer le taux de fécondation et sex-ratio primaire du ravageur envahissantes haplodiploïdes Bemisia tabaci.

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Bondy, E. C., Hunter, M. S. Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique. J. Vis. Exp. (146), e59213, doi:10.3791/59213 (2019).

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Abstract

Quelques espèces d’aleurodes suceurs de sève sont des ravageurs plus dommageables terrestres dans le monde entier en raison des dommages causés aux cultures qu’ils infligent et phytovirus qu'ils vector. Malgré de nombreuses études sur la biologie de ces espèces dans des environnements différents, un paramètre de clé cycle biologique, progéniture sex-ratio, a reçu peu d’attention, est encore important pour prédire la dynamique de la population. Le sex-ratio primaire (sex-ratio à la ponte) de Bemisia tabaci , n’a jamais été signalé mais peut être trouvé en déterminant le taux de fécondation des oeufs d’insecte haplodiploïdes. La technique consiste à le dechorionation des oeufs avec l’eau de Javel, une série d’étapes de fixation et l’application de la tache fluorescente générale de l’ADN, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole, un colorant fluorescent de liaison à l’ADN), lier à pronucléus femelles et mâles. Nous présentons ici la technique et un exemple de son application, pour tester si une bactérie endosymbiotique, Rickettsia SP. nr. bellii, influencé le sex-ratio primaire de b. tabaci. Cette méthode peut aider dans l’étude de la population de mouches blanches, ou pour déterminer si l’attribution du sexe existe avec certains stimuli de l’environnement.

Introduction

L’étude de la répartition du sexe, ou l’investissement relatif chez les descendants mâles et femelles, est des pierres angulaires de l’écologie comportementale1,2,3. En plus de sa puissance pour tester des modèles adaptatifs de comportement, connaître la stratégie d’allocation de sexe d’un organisme peut améliorer les modèles de sa dynamique de population. Chez de nombreuses espèces, allocation de sexe est contrôlée par les mères. Pour déterminer l’allocation de sexe, il est important de déterminer le sex-ratio primaire ou la proportion des femelles au moment de la ponte. Bien que le rapport des sexes à l’émergence des adultes peut fournir des indices d’allocation de sexe, la mortalité différentielle développementale entre mâles et femelles juvéniles peut biaiser communément substantiellement le sex-ratio adult. Chez certaines espèces d’hyménoptères, l’ordre des insectes qui contient des fourmis, abeilles et guêpes, le sex-ratio primaire a été déterminé avec des analyses cytogénétiques, souillant les embryons pour afficher génétique ADN. Comme les hyménoptères sont haplodiploïdes, un œuf mâle naissant est haploïde et contient seulement le pronucleus femelle (n), tandis que naissantes œufs femelles sont diploïdes et contenant le pronucléus mâles et femelles (2n). Bien que Aleyrodidae, la famille sap qui se nourrissent des Hémiptères (Hemiptera) appelées mouches blanches, sont également haplodiploïdes, il n’a pas été un dosage établi pour trouver le sex-ratio primaire chez ces insectes. C’est peut-être surprenant étant donné l’intensité de l’étude des parasites graves peu cosmopolites dans cette famille et de l’importance du sex-ratio chez les interactions compétitives des aleurodes4,5,6,7 ,8,9,10 et dans la dynamique de la population en général. Aussi, chez les insectes haplodiploïdes sex-ratio sont sans contrainte par les systèmes de détermination sexuelle, prévoyant la possibilité de fécondation sélective et sex-ratio labile qui varient avec l' environnement2. Nous présentons ici une technique pour déterminer le sex-ratio primaire du complexe espèces d’aleurodes, connus collectivement comme les aleurodes de patate douce, b. tabaci. Ce nom d’une espèce englobe plus de 28 espèces dans le monde entier11et comprend certains des plus dommageables des ravageurs envahissants global12,13. L’application de cette technique pour déterminer les patrons d’allocation de sexe de b. tabaci et autre Aleyrodidae permettra une enquête plus rigoureuse de variables, telles que température, plante-hôte, des bactéries endosymbiotiques ou plante/aleurodes agents pathogènes, qui peuvent influencer les aleurodes sex-ratio primaire et dynamique de population des aleurodes.

Nous sommes pas au courant de toute technique de coloration à le œuf comparables pour b. tabaci. Le protocole est pratique par rapport aux méthodes de coloration utilisées pour les autres œufs d’insectes14 car il omet une nuit étape de fixation et, par conséquent, peut être complété en 3 h. Comme exemple d’une application, une bactérie endosymbiotique, Rickettsia SP. nr. bellii, est associé de partialité féminine dans nos lignes de laboratoire de b. tabaci Moyen Orient-Asie mineure 1 (MEAM1)15,16. En une seule ligne de laboratoire de MEAM1 de b. tabaci (« MAC1, » prélevés dans le centre agricole de Maricopa), nous testons si Rickettsia-fertilisent les femelles (R+) infectées plus d’oeufs que les femelles infectées (R-).

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Protocol

Remarque : Veiller à ce que tout le travail est effectué à la température ambiante dans un endroit bien ventilé ou sous une hotte aspirante. Tous les « gouttes » dans le présent protocole sont définies comme 5 – 20 µL, selon les préférences de l’opérateur.

1. première installation

  1. Permettre aux aleurodes femelles à pondent leurs oeufs sur les feuilles propres. Exemples d’arénas de la ponte des cages de clip ou de feuilles coupées pour s’adapter sur la gélose dans une boîte de pétri. Faire un trou couvrable dans la cage de clip ou le couvercle de la boîte de pétri pour insérer et retirer les adultes. Sinon, rapidement mettre un navire des adultes prélevés sur la glace et, ensuite, déposez-les sur la feuille. Limiter le temps entre la ponte et fixation de le œuf à pas plus de 60 min, afin d’assurer l’observation de la transition de sperme dans le pronucleus paternel dans les oeufs.
    Remarque : Œufs ne pas retirés de la feuille peuvent être élevés jusqu'à l’âge adulte pour enregistrer adultes sex ratios.
  2. Avant ou pendant la ponte de la mouche blanche, préparer une lame de microscope en le nettoyant avec du savon et l’eau, séchage il bien et puis qui s’étend d’un morceau de pellicule de paraffine sur une extrémité, en s’assurant que la surface de film de paraffine ne casse pas (Figure 1).
    Remarque : Le film de paraffine est hydrophobe et semi-opaque, permettant aux liquides de forme gouttes et d’oeufs pour être vu plus facilement.

2. Dechorionation

  1. Avec un verre de Pasteur, pipette, ajouter des gouttes de solution d’eau de Javel (hypochlorite de sodium 0,83 %) pour le film de paraffine.
    Remarque : Il est plus facile de garder une trace des oeufs si seulement 2 – 3 oeufs sont contenus dans chaque goutte. Sinon, pour gérer un certain nombre de gros oeuf, recueillir les oeufs en gouttes de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    Mise en garde : Eau de Javel est corrosif ; Portez des gants lorsque vous manipulez de Javel et ne pas inhalent.
  2. Retirez les aleurodes adultes de la feuille.
  3. Placez la feuille sous un microscope pour discerner les oeufs et collecter les œufs séparément et soigneusement avec une sonde fine. Pour faire une sonde, insérez une tige de nadel minuten à 45° ou à un angle de travail confortables dans un fondu de pipette (Figure 2).
  4. Transférer les oeufs à l’eau de javel ou PBS 1 x. Si vous utilisez la solution 1 PBS x, enlever le 1 x PBS avec un verre de Pasteur pipeter une fois tous les oeufs sont prélevés et, ajoutez ensuite l’eau de Javel aux œufs.
    Remarque : Lors de la collecte des œufs, soulevez lentement l’oeuf de sa base jusqu'à ce que le pédicelle est retiré de la feuille. Le pédicelle est collant, et le œuf communément collera à l’extrémité de la sonde jusqu'à ce qu’il est plongé dans l’eau de Javel.
    Remarque : Il est recommandé d’utiliser le verre séparée pipettes Pasteur pour tous les réactifs et les pipettes peuvent être modifiés avec la chaleur pour faire les pointes plus étroit et réduire le risque d’aspiration accidentellement les oeufs de la mouche blanche. Pour éviter les résidus éventuels et contamination, nettoyez les pipettes avec de l’eau désionisée après chaque utilisation.
  5. Attendez 10 min. S’il y a un intérêt dans l’embryogenèse dans les oeufs de plus de 1 h, laisser les oeufs dans l’eau de Javel pendant jusqu'à 15 minutes.
    Remarque : Pour les œufs qui sont vieux jusqu'à 1 h, 10 min est suffisant.

3. la fixation

Remarque : Ces étapes sont tirées d’un hyménoptère protocole17.

  1. Retirez l’eau de Javel (contenant les fragments de chorion) avec une pipette Pasteur en verre et jetez-le. Ajouter les gouttes d’acide acétique glacial avec un verre de Pasteur pipetter et attendent 3 min.
    Mise en garde : Procéder à cette étape sous une hotte aspirante. Acide acétique glacial est corrosif ; porter des gants lorsque manipulation d’acide acétique glacial et ne pas respirer, surtout en combinaison avec l’eau de Javel résiduelle.
  2. Retirer l’acide acétique glacial avec une pipette Pasteur en verre et ajouter des gouttes de solution de Clarke (3:1 d’éthanol absolu : acide acétique glacial) avec un verre de Pasteur pipeter. Patientez jusqu'à ce que la majeure partie de la solution se soit évaporée (ou 10 min max).
  3. Ajouter des gouttes d’éthanol à 70 % aux oeufs avec une pipette Pasteur en verre et attendre jusqu'à ce que la plupart de l’éthanol s’est évaporée (ou 10 min max).

4. coloration

  1. Supprimer toute éthanol résiduel avec une pipette Pasteur en verre et ajouter des gouttes de PBS 1 x aux œufs avec une pipette Pasteur en verre pour obtenir le pH proche de 7,0. Mettre la lame de microscope dans une chambre humide pour empêcher la dessiccation, par exemple, dans une boîte de pointe de pipette vide avec une serviette de papier humide à l’intérieur (Figure 3). Attendez au moins 30 min.
    Remarque : C’est le meilleur point si une pause est nécessaire, aussi longtemps que la chambre de l’humidité peut empêcher la dessiccation.
  2. Supprimer le PBS 1 x avec une pipette Pasteur en verre et ajouter des gouttes de 0,1 μg/mL DAPI, une tache fluorescent de l’ADN, avec un verre de Pasteur pipeter. Réglez la lame de microscope dans une chambre sombre humidité et attendre au moins 15 min.
    Mise en garde : Le DAPI est un irritant, donc le manipuler avec des gants.

5. lavage

  1. Retirez le DAPI avec une pipette Pasteur en verre.
  2. Ajouter des gouttes de 1 x TBST (5 x solution fabriqués à partir de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de polysorbate 20 et 1,0 g de NaN3 [pH 7.5] et portée à 1 L avec de l’eau de la PCR grade) aux oeufs avec un verre de Pasteur pipeter. Attendre 5 min avant de retirer le 1 x TBST avec une pipette Pasteur en verre. Répétez cette étape 2 fois.

6. montage

  1. Après le lavage final, soigneusement pipette tous les oeufs du film de paraffine sur une partie propre de la lame de microscope. Retirez l’excès 1 x TBST ; puis, ajouter 20 µL de supports de montage (glycérol 80 % et 20 % 1 x TBST avec 2 % n-gallate de propyle) et placez une lame propre de la couverture sur le dessus les oeufs.
  2. Pour le stockage à long terme, sceller le coulisseau de couverture avec vernis à ongles transparent et, ensuite stocker la diapositive dans le noir à 2 ° C ou il découvre immédiatement sous un microscope à fluorescence.

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Representative Results

Pour vérifier que Rickettsia affecte le taux de fécondation des femelles MEAM1 de b. tabaci , nous avons élevé Rickettsia-infecté (R+) ou non infecté (R-) b. tabaci sur les plantes de niébé (Vigna unguiculata) dans séparer les cages à 27 ° C, humidité relative de 70 % et une photopériode foncé h de lumière/8 h 16. R+ et R quatrième stade larvaire les aleurodes ont été soigneusement retirés des feuilles et isolés dans des tubes de bande 200 µL. Quand les adultes ont émergé, ils ont été recueillis dans les groupes de 50 % pour les filles et transféré à feuilles propres en boîtes de pétri (n = ~50-100/leaf) pour 4 jours de l’accouplement. Groupes d’environ 20 femelles et plusieurs mâles ont été ensuite transférés vers un disque propre feuille (une pour les R adultes, une pour adultes R+ ) en 35 mm pétri reposant sur 1 % d’agar. Le couvercle de la boîte de pétri avait été découpé et la maille fine de tissu utilisée pour le confinement a également empêché une condensation excessive. Après environ 45 min, tous les adultes ont été retirés, certains des oeufs ont été récoltés pour déterminer le taux de fécondation, et qui n’ont pas recueillis les oeufs ont été élevés à l’âge adulte pour calculer le ratio de sexe adult. Une cohorte pour une seule journée, pour R+ et R mouches blanches, a été définie comme un bloc. Il y avait sept blocs pour calculer le taux de fécondation ou sex-ratio primaire, alors qu’il y avait six blocs pour le calcul du ratio de sexe adult, car il n’ont a pas assez oeufs restants d’un bloc vers l’arrière jusqu'à l’âge adulte. Un modèle linéaire généralisé a été utilisé dans le logiciel de statistiques R pour déterminer si le taux de fécondation ou adultes sex ratios ont été significativement influencés par Rickettsia infection et/ou bloc. Les variables de réponse étaient la proportion de fécondés oeufs/tous les œufs, ou la proportion de femmes adultes/tous les adultes, respectivement, tandis que des variables explicatives ont été le bloc et le statut infectieux Rickettsia .

Dechorionation oeuf suivie par coloration des noyaux au DAPI a permis l’ambiguité de la fécondation (et le sexe de l’embryon) lorsque observées avec un microscope à fluorescence (Figure 4). Pour cette expérience, 90 œufs pondus par les RMEAM1 deb. tabaci femelles et 82 oeufs par R+MEAM1 deb. tabaci femelles ont été notées. En ce qui concerne les œufs élevés jusqu'à l’âge adulte, 60 R et 95 R+ adultes ont été marqués. Un biais femelle adulte sexe ratio a été montré systématiquement dans les précédentes études15,18,19, dans la présente étude, adult R+ sex-ratio (69 % de femmes, médian) étaient femelles par rapport à R femelles (50 % de femmes, médian), mais le sex-ratio chez les deux traitements n’étaient pas significativement différentes (χ2 = 1,02, df = 1, p = 0,31 ; La figure 5). Le sex-ratio primaire R(60 % fécondé les œufs, médians) étaient femelles par rapport à R+ sex-ratio (44 % fécondé les œufs, médians), mais n’étaient pas significativement différents (χ2 = 0,51, df = 1, p = 0,47), fournissant des no éléments de preuve pour le plus grandes taux de fécondation chez les femelles de R+ (Figure 5). Bloc également n’avait un effet significatif sur le primaire (χ2 = 0,29, df = 1, p = 0,59) ou adultes (χ2 = 1.20, df = 1, p = 0,27) sex-ratio.

Figure 1
Figure 1 : Photo d’une lame de microscope avec film de paraffine et de gouttes d’eau de Javel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : exemple d’une sonde, façonné avec chaleur, d’un embout de la pipette et une épingle de nadeln minuten. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : exemple d’une chambre de l’humidité, façonné à partir d’une boîte de pointe de pipette vide et une serviette de papier humide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Images de microscope à fluorescence d’oeufs de b. tabaci . (a) MEAM1 de b. tabaci fécondé et incipient ovule de la femme. (b) Unfertilized, incipient œuf mâle. Les oeufs ont été fixés à moins de 1 h après la ponte et colorées au DAPI. La base de chaque oeuf est réagissant en raison de l’ADN d’une bactérie (Portiera, Hamiltonellaet éventuellement Rickettsia) dans les cellules bacteriome, qui est inclus dans les œufs mis20,21. Dans chaque œuf, le pronucleus femelle est près du centre de le œuf, et dans l’ovule de la femme uniquement, le sperme est visible comme une traînée lumineuse près du sommet de le œuf près de ce qui est sans doute un micropyle autofluorescence. Les images sont des captures d’écran prises par une Z-cheminée générée vidéo, produit par un laser à balayage confocal microscope inversé. Les barres d’échelle ont été estimées de précédentes images de microscope. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Primaires et adultes sex-ratio de Rickettsia-infecté ou non infecté de b. tabaci. Boîte et moustaches de parcelles de la primaire sex-ratio (pourcentage d’oeufs fécondés, ou pourcentage de femelles zygotes) en noir par rapport à l’adult sex-ratio (pourcentage de femelles adultes) en gris, de la rickettsie-infecté (R+) et non infectés (R -) MEAM1 de b. tabaci , « MAC1 » lignée génétique. Les emplacements de la boîte et moustaches montrent la médiane comme quartiles supérieurs et inférieurs, comme les lignes qui font aux extrémités de la boîte de la ligne médiane et la moyenne comme un signe de plus, et la plage est représentée dans les lignes extérieures qui s’étend de la boîte. Pour les R oeufs a marqué : n = 90 ; pour les oeufs de R+ a marqué : n = 82. Pour Radultes dénombrés : n = 60 ; pour R+ adultes dénombrés : n = 95. Dans une analyse logistique le sex-ratio primaire (proportion d’oeufs fécondés) effectuée dans le logiciel de statistiques R, pas d’effets significatifs ont été trouvés pour bloc (n = 7, χ2 = 0,29, df = 1, p = 0,59) ou de Rickettsia infection (χ2 = 0,51, df = 1, p = 0,47). Adultes sex ratios, sous l’influence de bloc (n = 6) et Rickettsia infection statut, ont été analysées de la même façon. Ici, pas d’effets significatifs ont été trouvés pour bloc (χ2 = 1.20, df = 1, p = 0,27) ou d’infection à Rickettsia2 = 1,02, df = 1, p = 0,31). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole est le premier à capturer le taux de fécondation ou sex-ratio primaire de b. tabaci. Le défi du présent protocole, c’est qu’il exige des chercheurs apprendre à gérer les oeufs de la mouche blanche rapidement, veiller à ce que pas plus de 1 h est écoulé depuis que les oeufs ont été pondus jusqu'à ce qu’ils sont fixés. Au cours d’expériences préliminaires, les oeufs qui ont été fixés à 3 h ou plus ponte étaient trop vieux pour observer la fécondation, la Syngamie avait eu lieu et divisions mitotiques étaient en cours. Entre 1 à 3 h, les pronucléus a pris une forme plus rond. Tandis que la présence des deux noyaux indique un œuf fécondé, un peu plus tard, l’apposition des noyaux en prévision de syngamycan semblent être un noyau et plus tard encore, les deux produits de la première division mitotique sont trouvent dans les œufs de mâles et femelles. Par conséquent, la distinction entre les sexes n’est pas clair à ces moments plus tard, et nous conseillons de limiter l’intervalle entre la ponte et fixation à 1 h comme une mesure prudente. Il est également difficile d’apprendre à être doux avec les œufs chaque transfert de liquide afin qu’ils ne sont pas accidentellement aspirés dans la pipette. Au moment de visionner les oeufs sous un microscope à fluorescence, quelques-uns des oeufs peuvent avoir enfreint durant le protocole, donc ces œufs ne peuvent être sexés et comptés comme les pronucléus et jaune d’oeuf peut avoir échappé. Dans le cas contraire, une fois que l’opérateur sera à l’aise avec ces étapes, le protocole peut être complété idéalement à moins de 3 h, car il ne nécessite pas une étape de fixation durant la nuit. Il est aussi souple qu’elle peut être modifiée pour souiller des oeufs plus âgés, pour les chercheurs intéressés par la capture de développement.

L’application du présent protocole englobe la recherche sur l’attribution du sexe. Bien que plusieurs dizaines d’études de la biologie de l’aleurode ont signalé des adultes sex-ratio dans différents environnements, adultes sex ratios confondre allocation de sexe de la mère avec décès du développement selon le sexe des nymphes et rendent impossible déterminer la cause de n’importe quel modèle de rapport de masculinité. La technique cytogénétique décrite ici permet la possibilité d’aleurodes compréhension patrons d’allocation de sexe plus généralement. Alors que les grandes populations dispersives de b. tabaci et d’autres parasites tels que l’aleurode, Trialeurodes vaporariorum, pourrait être prédite causera sex-ratio de 1:1, aussi souvent exposé en laboratoire paramètres22, 23, nous prévoyons également que l’interférence reproduction endosymbiontes et potentiellement qualité de plante hôte pourraient influencer sex-ratio primaire. Que ces mêmes facteurs peuvent aussi influer sur profils de mortalité selon le sexe au cours du développement, systématiquement l’inclinaison sex-ratio estime, souligne la nécessité d’une mesure directe de la sex-ratio primaire.

Tandis que les femelles biais associé à Rickettsia infection a été constamment trouvé dans la lignée génétique « MAC1 »15,18,19, le sex-ratio adultes n’étaient pas significativement féminin biaisé dans la présente étude. Le sexe principaux ratios observés avec la technique cytogénétique n’étaient pas significativement biaisés ou l’autre. Nous avons recensés le sex-ratio primaire et adulte des femelles de b. tabaci sur seulement 1 jour, au début d’un combat de ponte, quand les femelles ont 4 à 5 jours, donc le rapport des sexes a étudié ne peut pas ont représenté le rapport des sexes que nous avons observé sur de longues périodes. Néanmoins, la technique a permis de déterminer le taux de fécondation ou sex-ratio primaire et, dans ce cas, a montré une correspondance entre le sex-ratio primaire et adulte.

Déterminer la fécondation peut également être utile dans les cas où les chercheurs pourraient vouloir déterminer le type d’isolement génétique entre les populations de la mouche blanche. Alors qu’il a été une question de quelques controverses12,24,25, il est maintenant généralement admis que le nom de b. tabaci se réfère à des dizaines d’espèces cryptiques, avec des éléments de preuve fournis par les deux divergence génétique et traversant les épreuves dans lesquelles quelques femelles sont produites12,25. Dans ces études, il serait intéressant de savoir où l’isolement se produit. Sperme est transféré et hétérospécifiques spermatozoïdes féconder les oeufs, ou sont les accouplements tentative infructueuse ? Au sujet de la détermination de la sex-ratio primaire, cette technique permet de déterminer si le sex-ratio primaire est influencé par endosymbiontes, éléments génétiques égoïstes ou un des nombreux autres facteurs, y compris leurs congénères, concurrents, prédateurs, parasitoïdes, agents pathogènes, la plante-hôte ou effets abiotiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par une subvention de NSF (DEB-1020460) à n235 et une subvention de l’USDA AFRI (2010-03752) à n235 Les auteurs remercient Brennan Zehr pour la coloration des oeufs de la mouche blanche avec beaucoup de compétence et Zen. Les auteurs remercient Mike Riehle permettant l’utilisation de son microscope à fluorescence pour l’imagerie. Les auteurs remercient Suzanne Kelly et Marco Gebiola pour les images de l’oeuf. Les auteurs remercient Suzanne Kelly et Jimmy Conway pour aider à des moments cruciaux au cours des expériences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Any
1x TBST Any 5x solution made from 30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0 g NaN3 pH 7.5, and brought to 1 L with PCR grade water
Bleach Clorox Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite
Clear nail polish Any
DAPI dilactate Santa Cruz Biotechnology sc300415
Ethanol Any Dilute to 70% EtOH
Fluorescent microscope Nikon Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10x magnification can be used
Glacial acetic acid Mallinckrodt UN2789
Glycerol Any
Microscope Wild A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used
Microscope slide covers Any Methods are for 18 mm x 18 mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers.
Microscope slides Any
Minuten nadel pins BioQuip 1208SA Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips
NaCl Any
NaN3 Any
n-propyl-gallate Sigma/Santa Cruz Biotechnology P3130/sc-250794
Parafilm Bemis
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20A Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes
PCR grade water Any
Pipette tips Any Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins
Small dropper bulb Any Must fit on Pasteur pipette
Tris Any
Tween-20 Any

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References

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