Пациент полученных ортотопические ксенотрансплантат Модели для человека Уротелиальной карциномы клеток и колоректального рака опухоли роста и спонтанного метастаза

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот протокол описывает поколение пациентов полученных ортопедических ксенотрансплантатмоделей моделей внутри-vesically прививая высококачественные клетки уротелиальной клетки карциномы или внутриректично инъекционных колоректальных раковых клеток в нетупозированную диабетическую/ тяжелую комбинированную иммунодефицита (NOD/SCID) мышей для первичного роста опухоли и спонтанных метастазов под воздействием лимфатических узлов стромальных клеток, которые имитируют прогрессирование метастатических заболеваний человека.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Moret, R., Hellmers, L., Zhang, X., Gills, J., Hite, N., Klinger, A., Maresh, G. A., Canter, D., Bardot, S., Margolin, D. A., Li, L. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. J. Vis. Exp. (147), e59223, doi:10.3791/59223 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Онкологические больные имеют плохие прогнозы, когда лимфатический узла (LN) участие присутствует в обоих высококачественных уротелиальных клеток карциномы (HG-UCC) мочевого пузыря и колоректального рака (CRC). Более 50% пациентов с инвазивной мускулистой UCC, несмотря на лечебную терапию для клинически локализованных заболеваний, будут развиваться метастазаи и умирают в течение 5 лет, и метастатическая CRC является ведущей причиной смерти, связанной с раком в США. Ксенотрансплантат модели, которые последовательно имитируют UCC и CRC метастазировать видели у пациентов необходимы. Это исследование направлено на создание пациента полученных ортотопических ксенотрансплантата (PDOX) модели UCC и CRC для первичного роста опухоли и спонтанных метастазов под влиянием Стромальных клеток ЛН имитирует прогрессирование человеческих метастатических заболеваний для скрининга наркотиков. Свежие опухоли UCC и CRC были получены от согласованных пациентов, проходящих резекцию для HG-UCC и колоректальной аденокарциномы, соответственно. Совместно с LN стромальной клетки (LNSC) аналоговые клетки HK, luciferase-tagged UCC клетки были внутри-vesically (IB) привили в женских не-ожирения диабетической / тяжелой комбинированной иммунодефицита (NOD / SCID) мышей, и КЛЕТКи CRC были внутриректированных (IR) вводили в мужские мышей NOD/SCID. Рост опухолей и метастазы отслеживались еженедельно с помощью биолюминесценционной визуализации (BLI). При жертве, первичные опухоли и органы мыши были собраны, взвешены, и формалин-фиксированной для гематаксилина и эозина и иммуногистохимии окрашивания. В наших уникальных моделях PDOX опухоли ксенотрансплантата напоминают предимплантационные опухоли пациента. В присутствии hK-клеток обе модели имеют высокие показатели имплантации опухоли, измеряемые БЛИ и массами опухоли, 83,3% для UCC и 96,9% для CRC, а также высокие показатели метастазов органов (33,3% обнаруженных метастазов печени или легких для UCC и 53,1% для CRC). Кроме того, обе модели имеют нулевую смертность от этой процедуры. Мы создали уникальные, воспроизводимые модели PDOX для человека HG-UCC и CRC, которые позволяют для формирования опухоли, роста и метастазирования исследований. С помощью этих моделей тестирование новых терапевтических препаратов может быть выполнено эффективно и в клинически-миметической манере.

Introduction

Было показано, что метастазы лимфатических узлов (LN) является плохим прогностическом показателем во многих твердых злокачественных новообразований органов, в том числе высококачественной уротелиальной клеточной карциномы (UCC) мочевого пузыря и колоректального рака (CRC)1,2. Более половины пациентов с инвазивной мускулистой UCC (MIUCC), несмотря на лечебную терапию для клинически локализованных заболеваний, будут развивать метастазы и умирают в течение 5 лет. Метастатическая CRC является ведущей причиной смерти, связанной с раком в США.

По оценкам, 81 190 новых пациентов и 17 240 случаев смерти от рака, как ожидается, произойдет в 2018 году в Соединенных Штатах из-за UCC мочевого пузыря3,4. В то время как пациенты будут преимущественно (70%) настоящее время с немышечными инвазивными заболеваниями, 30% будет иметь MIUCC5. Несмотря на лечебную терапию (радикальную цистэктомию с системной химиотерапией или без нее) при клинически локализованном заболевании,у половины пациентов с MIUCC мочевого пузыря все равно разовьется метастазы и они умирают в течение 5 лет 3. Участие лимфатических узлов встречается примерно у 20%-25% пациентов, перенесших RC6,7,8. Пятилетняя выживаемость у положительных пациентов СЛ составляет менее 35% даже после RC, что свидетельствует о том, что участие LN в качестве важнейшего отрицательного предиктора прогноза у пациентов СКК.

Колоректальный рак является третьим наиболее распространенным раком диагностируется у мужчин и женщин в Соединенных Штатах. Исходы пациентов в значительной степени зависят от характеристик опухоли и микроокружения опухоли, таких как глубина вторжения, участие LN, и отдаленные метастазы органа. Хотя смертность в CRC снизилась в последнее десятилетие из-за скрининга и эффективных операций, по оценкам, почти 50% пациентов CRC будет развиваться метастазаили или рецидивирующие заболевания9.

Малые модели животных обеспечивают оперативную, воспроизводимую и модифицируемую платформу для изучения прогрессирования опухоли и различных метастатических моделей. Есть в настоящее время не описанные модели ксенотрансплантата, которые последовательно имитируют CRC и Метастаз UCC видели у пациентов. Основной путь рака отдаленных метастаз через лимфатические распространения. Новые исследования показывают, что LNs обеспечивают опухоли с уникальной микросредой, и не только просто стационарные цели, где раковые клетки временно проходят, но и играют важную роль, взаимодействуя с раковыми клетками в метастатическом процессе. Действительно, наши исследования показали, что, в дополнение к обучению и содействию прогрессирования опухоли и метастазирования, LN стромальной микросреды также несет ответственность за лекарственную устойчивость в CRC10,11. Наша лаборатория недавно подтвердила опухолевые эффекты LN стромальных клеток (LNSCs) на CRC и UCCs с использованием пациента полученных ортотопический ксенотрансплантат (PDOX) модели мыши12,13.

Разработка моделей PDOX является важной платформой для трансляционных исследований рака14,15. Поддерживая основные гистологические и генетические характеристики их донорской опухоли, модели PDOX остаются стабильными через проходы и сделать хорошие платформы для трансляционных исследований рака12,15. Модели PDOX используются для доклинической оценки лекарственных средств, идентификации биомаркеров и доклинической оценки персонализированных стратегий медицины, позволяющих прогнозировать клинические исходы. В настоящее время нет описанных моделей ксенотрансплантата, которые учитывают важность участия LN и способны последовательно воспроизводить первичную опухоль и отдаленные метастазы органов в CRC и UCC. В этом исследовании мы описываем разработку моделей PDOX у мышей NOD/SCID с размножением метастатических заболеваний CRC и UCC с участием LNSC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные в этих исследованиях на животных, были проведены в соответствии с утвержденными руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и использованию системы здравоохранения Ochsner и в соответствии с руководящими принципами исследований на животных. Все опухоли пациентов для этого исследования были собраны у пациентов, перенесённых на операцию по резекции рака в соответствии с Советом по обзору системы здравоохранения Ochsner и этическими стандартами Институционального комитета по правам человека Экспериментов. Сертифицированные патологоанатомы системы здравоохранения Ochsner определили патологические диагнозы образцов пациентов на основе микроскопических особенностей опухолевых клеток, их гистологического типа и уровня класса.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол описывает шаги для двух отдельных моделей ксенотрансплантата, модель UCC через электрокаутеризацию стенки мочевого пузыря, чтобы привить клетки UCC и внутриректальную инъекцию клеток CRC для изучения в модели CRC. Все шаги, готовящихся к экспериментам и отслеживая их, идентичны для обеих моделей, в то время как разделы 7 и 8 конкретно описывают процедуру закапывания UCC и инъекций CRC, соответственно.

1. Культивирование клеточных линий

  1. Выращивайте клетки HK в полной среде RPMI-1640, дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота плода, 2 нМ глутамина, 100 U/mL пенициллина G и 100 мг/мл стрептомицина при 37 градусах по Цельсию в 5% CO2 увлажненного инкубатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: HK клетки являются нормальными человеческими фолликулярными дендритных клеток и могут быть выращены и расширены для 15 проходов в пробирке16.
  2. Чтобы подготовиться к эксперименту, попробуйте клетки.
    1. Удалить средства массовой информации и добавить 2 мл 1% трипсина в сбалансированном солей раствор Хэнка (HBSS) в клетки. Поместите клетки обратно в 5% CO2 увлажненный инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение 4 мин.
    2. Соберите клетки из тарелки в трубку 15 мл с помощью портативной помощи труба с 10 мл серологического пайпета прилагается. Добавьте 8 мл полной среды RPMI-1640.
    3. Объедините 40 qL клеток и 40 л трипан синего в одном колодце из 96 хорошо пластины. Добавьте 10 кл/л смеси к гемоситометру и посчитайте живые клетки. Добавьте 1 миллион клеток в 25 мл полной RPMI-1640 среды 150 мм стерильной ткани культуры обработанных блюдо продолжать расти клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HK подвеска клеток подготовлена в этом шаге должны быть использованы в течение часа, чтобы смешать с опухолевыми клетками для инъекций.

2. Коллекция образцов пациентов

  1. Соберите опухоли UCC от согласованного пациента 15 (BlCaPt15, pT3b N1 M0) и 37 (BlCaPt37, pT3b pN0 M0) при резекции хирургии.
  2. Соберите опухоли CRC от согласованного пациента 155 (CoCaPt155, T1 N0 M0) и 302 (CoCaPt302, T1 N0 M0) при резекции хирургии.

3. Расширение опухоли пациента

  1. Сбор опухолей при операции в холодной стерильной среде Маккой, содержащий пенициллин G (500 U/mL) и стрептомицин (500 мг/мл).
  2. Имплантирует опухоли непосредственно в левый и правый фланг женщин-самок NOD/SCID.
    1. Механически фарш ткани на мелкие кусочки (1 мм3) с помощью небольших хирургических ножниц.
    2. Имплантирование ткани подкожно на левый и правый фланг с помощью 13 G асписации костного мозга биопсии иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Имплант общей объемом 8 мм3 делится равномерно с обеих сторон фланга.

4. Пометка и обогащение опухолей с маркировкой люциферазы

  1. Измеряйте рост опухоли раз в неделю с помощью цифрового калибровки.
  2. При диаметре 1 см преобразуй опухоль. Непосредственно вводить в опухоль с одной дозой Люк / красный флуоресцентный белок (RFP)-лентивирус (50 Л/ опухоли, 1:30 разбавления из концентрированного высокого титра лентивирусного запаса) с использованием 1 см шприца с 27 G иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоль пациента обычно достигает 1 см в диаметре в 1'2 месяцев. Тем не менее, темпы роста чрезвычайно изменчивы и основаны на ряде факторов, включая сорт опухоли и тип.
  3. Мониторинг опухоли еженедельно биолюминесцентной визуализации (BLI) у живых животных.
    1. Взвесьте мышей. Введите сознательную мышь с 150 мг/кг люциферина интраперитонена и ждать 5 минут для субстрата, чтобы циркулировать в теле мыши.
    2. Анестезируйка мыши с 2,5% изофлуран в 100% кислорода, 1 л / мин в индукционной камере.
    3. Поместите мышь на живот в машине визуализации BLI с изофруранте течет и изображение. Возьмите последовательные изображения, чтобы подтвердить наличие Luc /RFP положительных опухолевых регионов (ложноцветное биолюминесцентное изображение). Вернуть мышь в клетку после завершения изображения.

5. Выберите подходящую часть опухоли для ферментативного пищеварения

  1. В день процедуры UCC или CRC, изображение мыши с люциферазы помечены опухоли, как в шагах 4.3.1 и 4.3.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность времени для подкожной опухоли расти зависит от скорости роста опухоли и планируемого числа животных, которые будут введены в эксперименте.
  2. Урожай опухоли с мышеловки фланг и изображение.
    1. Эвтаназия мыши с помощью вдыхания CO2 после визуализации. Поместите мышь в камеру CO 2, включите газ при 1,4 л/мин до остановки дыхания и оставьте на 3 мин. Следуйте этому с вывихом шейки матки.
    2. Чистая кожа с 70% этанола. Палатка кожи непосредственно над опухолью. С помощью хирургических ножниц сделайте небольшой разрез на коже. Отделить кожу от опухоли ножницами.
    3. Удалить опухоль и поместить в стерильный петри-блюдо. Изображение всего блюда в аппарате визуализации.
  3. Используйте стерильные ножницы или скальпель, чтобы отделить люциферазы-отрицательные участки от люциферазы положительных секций в опухоли и повторного изображения.
  4. Повторяйте до тех пор, пока не останутся только самые положительные опухолевые кусочки.

6. Ферментативное пищеварение опухоли

  1. Под ламинарным капотом потока, фарш luciferase положительные части опухоли (шаг 5.4) в мельчайшие возможные куски с помощью стерильных хирургических ножниц и положить их в стерильной 50 мл конической трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обнучивание опухоли в мельчайших возможных частей даст больше отдельных клеток.
  2. Приготовьте раствор дайджеста, добавив 10 мл коллагеназы IV (1,5 мг/мл), 80 мл гиалуронидаза (20 мг/мл) и 160 л дезоксирибонулеза I (0,1 мг/мл) до 40 мл HBSS. Смешайте решение путем инвертирования.
  3. Добавьте 35–40 мл раствора дайджеста в рубленую опухоль. Инкубировать при 37 градусах Цельсия с непрерывным вращением в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Энергично встряхнуть трубку периодически на протяжении инкубации, чтобы предотвратить опухолевые ткани от слипания.
  4. Фильтр всего пищеварения через стерильные 100 мкм ячейки ситечко следуют 40 мкм ячейки ситечко для удаления мусора. Сохранить поток через и отбросить мусора.
  5. Вымойте свободные клетки, добавив 20 мл HBSS и центрифуги на 329 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и resuspend гранулы в 30 мл HBSS.
  6. Смешайте 10 злклеетового раствора и 90 зл трипан-голубого в одном колодце пластины из 96 скважин. Считайте живые клетки с помощью гемакитометра.
  7. Передача 1 х 104 х 1 х 106 опухолевых клеток на мышь в стерильной 15 мл конической трубки. Добавьте 3 х 105 HK-клеток от шага 1.2.3 на мышь, в ту же трубку с опухолевыми клетками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильную коническую трубку 50 мл, если общий объем превышает 15 мл. Всегда вычисляйте больше доз для дополнительных животных в исследовательской группе, чтобы объяснить потерю жидкости во время использования шприца. Например, если группа содержит 5 мышей, сделайте достаточное количество клеток для 6 или 7 мышей.
  8. Центрифуга при 329 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант либо путем аспирации или пипетки.
  9. Повторное использование ячеек в 50 л на мышь для модели UCC или 10 л на мышь для модели CRC в полных носителях RPMI. Держите клеточной подвески на льду до готовности к использованию.

7. Модель мыши UCC

  1. Подготовка мышей к процедуре
    1. Получить шесть-восемь недель женщина NOD / SCID мыши. Бритье нижней части спины мыши с помощью крема для удаления волос. Анестезируйка мыши в индукционной камере с изофлураном (2,5% в 100% кислороде, 1 л/мин).
    2. После успокоительного, место мыши в положении на спине с мордой в изофларанном носовой конус и голой спиной твердо заземлены на дисперсивный электрод.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь полностью успокоительное, если не реагирует на нос щепотку.
  2. Привить UCC клетки, подготовленные в шаге 6.9 мочевого пузыря с помощью ангиокатетера(Рисунок 1Aa,Ab).
    1. Настройка монополярной электрокаутерной машины и установить на мощность 4 W. Lubricate 24 G стерильный ангиокатетер с смазкой желе и вставить через уретру женской мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое сопротивление может ощущаться. Аккуратно нажмите вперед или удалить ангиокатетер и повторить. Не заставляйте. Если катетер изгибается при входе, вставьте стерильный направляющий провод (см. 7.2.2) на полпути в катетер, чтобы обеспечить стабильность.
    2. Полностью вставьте 0,025 " фиксированной основной прямой провод направляющий 1 мм мимо конца ангиокатетера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проволока помечена лентой перед процедурой, чтобы указать точку остановки 1 мм и обеспечить последовательность.
    3. Держите монополярный штифт на направляющий провод в течение 1 с, что позволяет электрическое раздражение слизистой оболочки мочевого пузыря.
    4. Прикрепите свежий стерильный ангиокатер на 1 куб-лок шприц и составить 200 л собранных клеток со ступени 6.9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, 100 л теряется от ангиокатетера до шприца. Компенсировать объем потерь при расчете объема необходимой подвески клеток.
    5. Удалите направляющий провод и ангиокатетер из мочеиспускательной уретры мыши. Вставьте ангиокатетер со шприцем клеток, прикрепленных в мочеиспускательный уретру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продвижение должно быть проще, чем раньше.
    6. Привить 50 л клеток в мышеловочный пузырь. Подождите несколько секунд, прежде чем удалить анджокатер, чтобы клетки придерживаться стенки мочевого пузыря.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки остаются в мочевом пузыре и развиваются в первичную опухоль.
  3. Удалите мышь из изофруранового носового конуса и заземляющей площадки. Наблюдайте мышь в течение 1 ч следующей процедуры. Ищите признаки бедствия, т.е. сгорбившись назад, затрудненное дыхание и т.д.

8. модель мыши CRC

  1. Анестезия от шести до восьми недель мужчина NOD / SCID мыши с изофлуран (2,5% в 100% кислорода, 1 л / мин) в индукционной камере. Подтвердите успокоите с щепоткой.
  2. Поместите анестезирующую мышь в положение на спине под рассекающим микроскопом, убедившись, что они закрепят свою мруя к изофларанному носекону и защитите свои передние конечности лентой для стабильности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лупы могут быть использованы вместо расчленяющего микроскопа. Небольшой объект может быть использован для улучшения видимости и угла при размещении под основанием хвоста, поднимая анус. Как правило, небольшие участки марли сворачиваются в цилиндровую форму диаметром 1 дюйм.
  3. Упья анальный канал с изогнутыми смазочными тупыми наконечниками щипцы подвергать дистальной анальной и ректальной слизистой оболочки. Удалите фекалии.
  4. Используйте стерильную 30 G съемной иглы на 50 л стеклянный шприц, чтобы ввести 10 л опухоли и HK клеток (от шага 6.9) в дистальной задней ректальной субмукозы 1 до 2 мм над анальным каналом. Скобы иглы должны быть покрыты слизистой оболочкой. Будьте осторожны, чтобы не пройти в тазовой полости.
  5. Удалите мышь из изолюранового носового конуса. Наблюдайте мышь в течение 1 ч следующей процедуры. Ищите признаки бедствия, т.е. сгорбившись назад, затрудненное дыхание и т.д.

9. Биолюминесцентная визуализация

  1. Мониторинг первичной опухоли, печени и легких метастатического бремени еженедельно с помощью биолюминесцентной системы визуализации для люциферазы деятельности.
    1. Получить мышь из UCC или CRC эксперимент и взвешивать. Введите 150 мг/кг люциферина интраперитоневого и ждать 5 минут для субстрата циркулировать в теле мыши.
    2. Анестезируйская мышь с 2,5% изофлуран омовением в 100% кислороде, 1 л/мин в индукционной камере.
    3. Поместите мышь в машину BLI Imaging с носом, закрепленным в носеконе. При разоблачении для изображения, убедитесь, что область интереса сталкивается с камерой. Для инъекций UCC и CRC, брюшная сторона должна смотреть на камеру для каждого изображения. Изображение мыши в положении на спине.

10. Сбор органов и опухоли

  1. Когда первичное сияние люминесценции опухоли достигает 1 х 1011 фотонов или если мыши проявляют признаки бедствия (т.е. потеря веса, сгорбившись назад, суровое/трудиться дыхание и т.д.), эвтаназии мышей с помощью вдыхания CO2 (как в шаге 5.2.1) после люциферина инъекции и визуализации всего тела.
  2. Удалить печень и легкие, место в чашку Петри и изображение для выявления любых метастазах. Удалить опухоль, взвесить и изображение. Исправить органы и опухоли в 10% нейтральный буферный формалин для 48 ч при температуре окружающей среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите / протрите ножницами и щипками между каждым органом, чтобы избежать передачи ткани.

11. Гистологическая оценка

  1. Встраивайте формалин фиксированными тканями в парафин и нарезайте ткани толщиной 5 мкм на микротоме для гематоксилина и эозина (Н и Е) и иммуногистохимического (IHC) окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все Н И E окрашивание парафина слайды было сделано в лаборатории патологии Ochsner системы здравоохранения, и все IHC окрашивания в этой работе была выполнена в исследовательской лаборатории Системы здравоохранения Ochsner после высокотемпературных антигенов поиска с помощью Ki67 и цитокератин 20 антител, а затем биотинилаповые вторичные антитела, и авидуин-биотин-пероксидаза комплексов в соответствии с инструкциями производителя13,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В модели UCC PDOX, Клетки BlCaPt15 или BlCaPt37 пациентов UCC были внутривилистически (IB) привиты в присутствии клеток HK в женский МООН/SCID мышиный мочевой пузырь(рисунок 1A). Двадцать пять из тридцати (83,3%) животные генерировали первичные опухоли и отображали зависящий от времени первичный рост опухоли на основе еженедельного BLI(рисунок 1B,C и Таблица 1). Аналогичным образом, в модели CRC PDOX 31 из 32 (96,9%) мышей вырос первичной опухоли, когда внутри-ректально (ИК) вводили с пациентами CoCaPt155 или CoCaPt302 клеток плюс HK клеток(Рисунок 1D-F и таблица 1). В зависимости от опухоли пациента, рост опухоли мыши имел другой период задержки, что отражает разницу в клинических характеристиках пациента(рисунок 1C, F).

В обоих IB и ИК-моделей, инъекции опухолевых клеток не только генерируется ортотопические первичные опухоли(Рисунок 2A, B, синие стрелки), но многие мыши испытания также разработали печени и / или легких метастазов. В 10 из 30 (33,3%) и 17 из 32 (53,1%) мышей, привитых клетками UCC и CRC с клетками HK, соответственно, мы обнаружили отдаленные метастазы органа через ex vivo BLI(Рисунок 2A,B и Таблица 1).

Для подтверждения подобной морфологии тканей, H и E и IHC окрашивания были выполнены сравнения ксенотрансплантатов и первичных опухолей пациента. Гистопатология рака мочевого пузыря пациента поддерживалась в ксенотрансплантатах от BlCaPt15 и BlCaPt37(рисунок 3A). Результаты показывают, ксенотрансвтат опухоли, соответствующие мышечной инвазивной модели роста первичных опухолей пациентов. Антитела, характерные для маркера пролиферации клеток человека Ki67, использовались в IHC. Положительное ядерное окрашивание Ki67 указывает на высокопроникативные, быстрорастущие опухолевые клетки человека. Результаты окрашивания от ксенотрансплантатов были аналогичны исходным хирургическим биопсиям. Аналогичным образом, в иК-модели окрашивание Н и E указывает на сходство архитектуры между ксенотрансплантатами и опухолями пациентов как CoCaPt155, так и CoCaPt302. IHC с использованием антител против цитокератина 20 также показали аналогичную картину роста опухоли в обеих моделях PDOX(Рисунок 3B). Таким образом, наша модель PDOX резюмировала клиническую прогрессию пациента UCC и CRC.

Figure 1
Рисунок 1: ортотопические модели мыши UCC и CRC. (A-C) Внутривезикл (IB) закапывание клеток UCC в мышеловочный пузырь13. (Аа) Ангиокатетер был вставлен в мочевой пузырь женщины NOD / SCID мыши и электрокаутерный шок был нанесен на стенку мочевого пузыря через направляющий провод. (Аб) Luciferase помечены UCC опухолевых клеток, BlCaPt15 (2 х 104 клетки), или BlCaPt37 (5 х 105 клеток) с добавлением 3 х 105 LN стромальных hK клеток, были внушены в NOD / SCID мыши мочевого пузыря через ангиокатетер. (D-F) Внутриректальное (ИК) инъекция клеток CRC в подмукозный слой ткани прямой кишкимыши 17. (D) Анальный канал был расширен с смазкой тупыми наконечниками щипцы, чтобы обеспечить доступ к дистальной анальной и ректальной слизистой оболочки и 30 G иглы был вставлен в дистальный задний ректальный submucosa 1'2 мм над анальным каналом, пока сбелине не был покрыт до инъекция происходит. Люцифераза помечены CRC опухолевых клеток, CoCaPt155 (5 х 105 клеток), или CoCaPt302 (1 х 104 клетки) с добавлением 3 х 105 HK клеток были введены. Опухолевое бремя отслеживалось и оценивалось с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI; B и E). Рост опухоли luciferase помечены UCC или CRC клетки отслеживаются кинетически через BLI и проанализированы с помощью программного обеспечения анализа изображений (C и F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Модели PDOX производят спонтанные отдаленные метастазы органов. Представитель мышей (верхние панели) из тех же экспериментов, как в Рисунке 1, например, привили внутри-vesically с люциферазы помечены UCC опухолевых клеток, BlCaPt15 или BlCaPt37 клеток с HK клеток (A) или внутри-ректально с luciferase помечены опухоли CRC клетки, CoCaPt155 или CoCaPt302 клетки с HK клетки (B) показаны. желтые стрелкиуказывают на мышеловачный пузырь (A ). Фотографии, сделанные во время жертвоприношения, указывают на ортотопические образования опухолей (синие стрелки). Печень, легкие и опухоли (средние панели), собранные при некропсии и их ex vivo BLI (нижние панели) показали метастазы печени и легких, а также опухоли с активностью люциферазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Опухоли ксенотрансплантата напоминают опухоли предимплантации пациента. Парафин встроенных опухолевых тканей из опухоли пациента или опухолей, собранных у мышей в тех же экспериментов, как в Рисунке 1 были разделены и окрашенные Н И Е (A и B) или IHC с антителами против человека Ki67 (A) или цитокератин 20 (CK20; B). Коричневый цвет указывает на положительное окрашивание. Н И окрашивание показывает опухолевые гнезда рассекается в гладкие мышечные пучки (A). Фотографии были сделаны с помощью цифрового деконволутирующего микроскопа и проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Шкала баров: 100 мкм. Все изображения были сделаны в оригинальном увеличении на 200 ". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Опухолевый имплантат (%) Метастазирования легких и печени (%) Смертность (%)
UCC, n'30 83,3 33.3.2.2.2.2.2 0.00
CRC, n'32 96,9 53.1 0.00

Таблица 1: Резюме образования опухолей, метастаз и смертности в IB и ИК-моделях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метастатическое заболевание является причиной большинства случаев смерти больных раком. В доклинических терапевтических тестах крайне важно установить модели мыши, которые наиболее точно эмулируют рост опухоли человека спонтанными дистанционными метастазами органов. Использование моделям мурин с имплантированной опухоли пациента производных раковых клеток (xenografts) позволяет лучше понять биологии опухоли и прогностических биомаркеров, а также тестирование и прогнозирование антинеопластических эффектов новых методов лечения18. Многие модели были использованы, чтобы показать UCC и CRC метастаз в экспериментах murine, таких как внутривенные инъекции хвостовой вены, показывающие способность производить болезни легких19 или подкожной имплантации опухолевых клеток или фрагментов опухоли в фланг для локализованный рост опухоли20,21. Одна лаборатория ранее сообщила мочевого рака мурина модель с помощью соляной кислоты лечения успешно содействовать поглощения опухоли22. Хотя эти методы производят надежный локальный рост и могут продемонстрировать некоторые метастатические действия, они специально не напоминают естественное течение рака, разработанных у людей и не используют метастатического механизма видели у пациентов18, 23. Другие модели мурин, как сообщается, имитировать рост опухоли путем введения опухолевых клеток непосредственно в органы, такие как печень или мезонтерии, но они несут риски утечки опухолевых клеток и не производят значительные метастаза.

Ранее мы продемонстрировали корреляцию между содержанием раковых клеток в первичной опухоли и LN участие24 и роль раковых клеток / LN стромального взаимодействия в ходе первичной прогрессии опухоли метастатического заболевания10 , 12 Лет , 17. Включая нашу предыдущую работу о влиянии стромальной микросреды LN в метастатической прогрессии, мы установили ортотопические модели (особенно модели PDOX), которые имитируют естественный ход метастатического распространения, являются технически воспроизводимый, сохранить неоднородность оригинальных опухолей пациента, и генерировать последовательные первичные опухоли и метастатические результаты12,13,17. Использование опухолевых эффектов Стромальной микросреды LN имеет важное значение, поскольку она обеспечивает аналогичную микроокружение опухоли в человеческих UCC и CRC, развивает все шаги в метастатическом каскаде, уменьшает количество раковых клеток, необходимых в модели мыши, которая сводит к минимуму количество ксенотрансвтатных проходов, и приводит к надежной модели, которая тесно имитирует рост опухоли и метастазов в человеке.

Мы создали уникальный метод электростимуляции IB с использованием совместного внушения клеток HK, который производит надежную модель для разработки MIUCC. Наша модель имитирует естественный ход прогрессирования UCC путем имплантации опухоли, начиная с слизистой оболочки, что приводит к мышечной, а затем метастазирование в легкие13.

Наши результаты также показывают, что ИК-модель безопасна, воспроизводима и успешна. Ортотопическая модель мыши CRC имеет первичный рост опухоли и спонтанные отдаленные метастазы12,17. ИК-процедура быстрая, легкая в освоении, технически проста в исполнении и не слишком напряженная на животных. Группы IB и IR имели нулевую смертность(таблица 1) в послеоперационном периоде до окончательного измерения BLI. Тем не менее, техника требует практики. Если внутриректальная инъекция успешно, не должно быть видимых "пузырь", который образуется, как жидкость вводится в ректальной субмукозы и приведет к первичному росту опухоли, которая в конечном итоге станет ощутимым, как показано на рисунке 1. Если опухоль была введена слишком глубоко в тазовой полости, она будет не привязана к колоректального тракта и растет очень большой, чтобы заполнить таз, иногда вызывая обструкцию. Если инъекция слишком мелкой или не входит в ректальный подмукозный слой на всех, она будет утечка в результате сокращения или отсутствия первичной опухоли бремя.

Мы создали уникальные, воспроизводимые модели PDOX для человека HG-UCC и CRC. Эти модели позволяют для формирования опухоли и метастазических исследований. Теперь мы можем использовать эти модели в качестве основного метода для дальнейшего изучения стромальной микросреды LN и ее взаимодействия с первичными опухолями пациента. Эти модели также позволят нам исследовать методы лечения, которые мешают про-опухолевого воздействия LNSC на первичной опухоли. С помощью этих моделей тестирование новых терапевтических препаратов может быть выполнено эффективно и в клинически-миметических манерах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Это исследование было частично поддержано Ochsner Translational Medicine Research Initiative Grant 2014. Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарят Брайана Ройтера, Даниэль Бертони, Питера Миллера и Шеннона Маккесни, которые помогли начать эти исследования за отличную техническую поддержку. Авторы также благодарят Хизер Грин Матрана, Маргарет Вариано, Сунила Талвара и Марию Латис за помощь в согласовании пациентов и предоставлении опухолевых образцов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avidin-biotin-peroxidase Vector Labs Inc PK-6100
Biotinylated secondary antibody Vector Labs Inc BA-1000
Collagenase IV (1.5 mg/mL) Worthington Biochemical Corporation LS004189
Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) Sigma D4263
D-Luciferin (150 mg/kg) Perkin Elmer 122796
Formalin (10% neutral buffered) Leica 46129
glutamine (2 nM) Fisher Scientific 35050061
Hair Removal Cream Church & Dwight Co., Inc 1 (800) 248-8820
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific SH30016.02
Hyaluronidase (20 mg/mL) Sigma H3884
Isoflurane Henry Schein Animal Health 108333
Luc/RFP-lentivirus From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018).
McCoy’s medium Life Technologies 110862
penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) Fisher Scientific 15140-122
RPMI-1640 Medium American Type Culture Collection 110636
Trypan Blue Sigma T6146
Trypsin/EDTA Life Technologies 15400-054
Name Company Catalog Number Comments
Gas
100% Oxygen Airgas Inc OX USP200
100% CO2 Airgas Inc CD USPE
Name Company Catalog Number Comments
Mice
6-8 week old NOD/SCID Mice (male) Jackson Lab 001303
6-8 week old NOD/SCID Mice (female) Jackson Lab 001303
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Hematoxylin Sigma GHS232
Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody Thermo Scientific RM-9106-S
Name Company Catalog Number Comments
Tools
40 µm cell strainer Fisher Scientific 08-771-1
100 µm cell strainer Fisher Scientific 08-771-19
15 mL Conical Tube Sarstedt 11799
50 mL Conical tube Sarstedt 15762
150 mm Tissue Culture Dish USA Scientific Inc CC7682-3614
96 Well plate USA Scientific Inc CC7682-7596
Forceps Symmetry Surgical Inc 06-0011
Surgical scissors Symmetry Surgical Inc 02-2011
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
5% CO2 humidified incubator Thermo Scientific 3110
Bioluminescent (BLI) Imaging Machine Perkin Elmer CLS136334
BLI Imaging Machine Software Perkin Elmer CLS136334
Centrifuge Beckman 366830
Deconvoluting Microscope Intelligent Imaging Innovations Marianas
Deconvoluting Microscope Imaging Software Intelligent Imaging Innovations +1 (303) 607-9429 x1
Digital caliper Fowler Tools and Instruments 54-115-330
Dissecting microscope Precision Instruments LLC (504) 228-0076
Electrosurgical generator ValleyLab FORCE1C20
Isoflurane Induction Chamber Perkin Elmer 119038
Microtome American Optical Corporation 829
Pipet Aid Fisher Healthcare 13-681-15E
Serological pipet (10 mL) Sarstedt 86.1254.001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer--prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
  2. Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
  3. National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Bladder Cancer. Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/urinb.html (2018).
  4. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
  5. Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
  6. Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
  7. Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, discussion 764-755 758-764 (1993).
  8. Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
  9. National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2017).
  10. Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
  11. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
  12. Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
  13. Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
  14. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
  15. Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
  16. Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
  17. Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
  18. Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
  19. Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
  20. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
  21. Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
  22. Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
  23. Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
  24. Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics