نماذج Xenograft المتوارثية المستمدة من المريض لسرطان الخلايا البولية البشرية ونمو ورم سرطان القولون والمستقيم وورم الانبثاث العفوي

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يصف هذا البروتوكول توليد نماذج xenograft المتقوّدة من قبل المريض من خلال غرس خلايا سرطان الخلايا البولية عالية الجودة أو خلايا سرطان القولون والمستقيم داخل المستقيم في مرض السكري غير البدين / شديد مجتمعة الفئران نقص المناعة (NOD / SCID) لنمو الورم الأولي والانبثاث التلقائي تحت تأثير الخلايا اللمفية سترومال العقدة، والتي تحاكي تطور الأمراض النقيلية البشرية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Moret, R., Hellmers, L., Zhang, X., Gills, J., Hite, N., Klinger, A., Maresh, G. A., Canter, D., Bardot, S., Margolin, D. A., Li, L. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. J. Vis. Exp. (147), e59223, doi:10.3791/59223 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يعاني مرضى السرطان من ضعف التكهن عند وجود مشاركة العقدة الليمفاوية (LN) في كل من سرطان الخلايا البولية عالي الجودة (HG-UCC) من المثانة وسرطان القولون والمستقيم (CRC). أكثر من 50٪ من المرضى الذين يعانون من UCC الغازية العضلات، على الرغم من العلاج العلاجي للأمراض الموضعية سريريا، سوف تتطور الانبثاث ويموتون في غضون 5 سنوات، وCRC النقيلي هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في الولايات المتحدة. هناك حاجة إلى نماذج Xenograft التي تحاكي باستمرار UCC وCRC الانبثاث ينظر في المرضى. تهدف هذه الدراسة إلى توليد نماذج xenograft (PDOX) المستمدة من المريض من UCC وCRC لنمو الورم الأولي والانبثاث التلقائي تحت تأثير الخلايا سترومال LN تقليد تطور الأمراض النقيلية البشرية لفحص المخدرات. تم الحصول على أورام جديدة UCC وCRC من المرضى الذين تمت الموافقة عليهم الذين يخضعون لعملية استئصال لHG-UCC وسرطان الغدة الدرقية القولون والمستقيم، على التوالي. التلقيح المشترك مع الخلايا السترومال LN (LNSC) الخلايا التناظرية هونج كونج، والخلايا UCC الموسومة لوسيفيراز كانت داخل vesically (IB) غرست في الإناث غير السمنة السكري / شديدة الفئران نقص المناعة مجتمعة (NOD / SCID)، وكانت خلايا CRC داخل المستقيم (IR) حقن في ذكر NOD / SCID الفئران. تم رصد نمو الورم وورم خبيث أسبوعيا باستخدام التصوير الإنارة الحيوية (BLI). عند التضحية، تم حصاد الأورام الأولية وأجهزة الماوس، ووزنها، وثبت رسميًا للهيماتوكسيلين وإيوسين وتلطيخ الكيمياء المناعية. في نماذج PDOX الفريدة من نوعها، تشبه أورام xenograft أورام المريض قبل الزرع. في وجود خلايا هونج كونج، كلا النموذجين لديها معدلات زرع الورم عالية تقاس بـ BLI وأوزان الورم، 83.3٪ لUCC و 96.9٪ للجنة حقوق الطفل، وارتفاع معدلات الانبثاث عن الأعضاء البعيدة (33.3٪ الكشف عن الكبد أو سرطان الرئة لUCC و 53.1٪ لCRC). وبالإضافة إلى ذلك، فإن كلا النموذجين لا يحتويان على أي معدل وفيات بسبب هذا الإجراء. لقد أنشأنا نماذج PDOX فريدة من نوعها قابلة للاستنساخ لـ HG-UCC وCRC البشرية، والتي تسمح لتكوين الورم، والنمو، ودراسات الانبثاث. مع هذه النماذج، يمكن إجراء اختبار الأدوية العلاجية الجديدة بكفاءة وبطريقة تمثيلية.

Introduction

وقد تبين أن العقدة الليمفاوية (LN) الانبثاث هو مؤشر التكهن الفقراء في العديد من الأورام الخبيثة الأعضاء الصلبة، بما في ذلك سرطان الخلايا البولية عالية الجودة (UCC) من سرطان المثانة والقولون والمستقيم (CRC)1،2. أكثر من نصف المرضى الذين يعانون من UCC الغازية العضلات (MIUCC)، على الرغم من العلاج العلاجي للمرض الموضعي سريريا، سوف تتطور الانبثاث ويموتون في غضون 5 سنوات. تعتبر اتفاقية حقوق الطفل النقيلية أحد الأسباب الرئيسية للوفاة المرتبطة بالسرطان في الولايات المتحدة.

ومن المتوقع أن يحدث ما يقدر بـ 81,190 مريض جديد و17,240 حالة وفاة خاصة بالسرطان في عام 2018 في الولايات المتحدة بسبب UCC من المثانة3,4. في حين أن المرضى سوف في الغالب (70٪) الحالي مع مرض الغازية غير العضلات، وسوفيكون 30٪ MIUCC 5. على الرغم من العلاج العلاجي (استئصال المثانة الجذري [RC] مع أو بدون العلاج الكيميائي الجهازي) للمرض الموضعي سريريا، فإن نصف المرضى الذين يعانون من MIUCC من المثانة لا تزال تتطور الانبثاث ويموتون في غضون 5 سنوات3. تم العثور على مشاركة العقدة الليمفاوية في ما يقرب من 20٪ -25٪ من المرضى الذين خضعوا RC6،7،8. معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات في المرضى إيجابية LN هو أقل من 35٪ حتى بعد RC، مما يشير إلى مشاركة LN كتوقع سلبي حاسم للتشخيص في المرضى UCC.

سرطان القولون والمستقيم هو ثالث أكثر حالات السرطان شيوعًا في كل من الرجال والنساء في الولايات المتحدة. تعتمد نتائج المريض إلى حد كبير على خصائص الورم والبيئة الدقيقة للورم، مثل عمق الغزو، ومشاركة LN، ونقائل الأعضاء البعيدة. على الرغم من أن معدل الوفيات في لجنة حقوق الطفل انخفض في العقد الماضي بسبب الفحص والعمليات الجراحية الفعالة، ويقدر أن ما يقرب من 50٪ من مرضى CRC سوف تتطور الانبثاث أو الأمراض المتكررة9.

توفر النماذج الحيوانية الصغيرة منصة سريعة وقابلة للاستنساخ وقابلة للتعديل لدراسة تطور الورم وأنماط النقيلي المختلفة. لا توجد حاليًا نماذج xenograft موصوفة تحاكي باستمرار CRC وUCC metastasis ينظر إليها في المرضى. الطريق الرئيسي للورم النقي للسرطان هو عن طريق انتشار اللمفاوية. تشير الأبحاث الجديدة إلى أن الـ LNs توفر الأورام ببيئة دقيقة فريدة من نوعها، وليست مجرد أهداف ثابتة حيث تمر الخلايا السرطانية بشكل عابر، ولكنها تلعب أيضًا دورًا أساسيًا من خلال التفاعل مع الخلايا السرطانية في العملية النقيلية. في الواقع، اكتشفت دراساتنا أنه، بالإضافة إلى تعليم وتعزيز تطور الورم والانبثاث، فإن البيئة الدقيقة سترومال LN مسؤولة أيضا عن مقاومة المخدرات في CRC10،11. أكد مختبرنا مؤخرا الآثار السرطانية للخلايا سترومال LN (LNSCs) على CRC وUCCs باستخدام نماذج الماوس xenograft المتوارثية المستمدة من المريض (PDOX)12،13.

تطوير نماذج PDOX يوفر منصة هامة لبحوث السرطان الترجمة14،15. من خلال الحفاظ على الخصائص الأنسجة والوراثية الرئيسية للورم المانح، نماذج PDOX تبقى مستقرة عبر الممرات وجعل منصات جيدة لبحوث السرطان الترجمة12،15. يتم استخدام نماذج PDOX لتقييم الأدوية قبل السريرية، وتحديد العلامات الحيوية، والتقييم قبل السريرية لاستراتيجيات الطب الشخصية التي تسمح للتنبؤ بالنتائج السريرية. حاليا، لا توجد نماذج xenograft الموصوفة التي تنظر في أهمية مشاركة LN وقادرة على استنساخ باستمرار الورم الأساسي وورم الأعضاء البعيد في CRC وUCC. في هذه الدراسة، ونحن نصف تطور نماذج PDOX في الفئران NOD / SCID مع استنساخ CRC النقيلي والأمراض UCC مع مشاركة LNSC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت جميع الأساليب الموصوفة في هذه الدراسات الحيوانية بموجب المبادئ التوجيهية المعتمدة للجنة الرعاية والاستخدام الحيوانية المؤسسية لنظام أوشسنر الصحي ووفقا ً للمبادئ التوجيهية للبحوث الحيوانية. تم جمع جميع أورام المرضى لهذه الدراسة من المرضى الذين تمت الموافقة عليهم الذين يخضعون لعمليات جراحية لاستئصال السرطان وفقا ً لمجلس مراجعة التحقيق في نظام أوشسنر الصحي والمعايير الأخلاقية للجنة المؤسسية المعنية بالبشر التجريب. حدد أخصائيو الأمراض المعتمدون من المجلس في نظام Ochsner الصحي التشخيصات المرضية لعينات المرضى استنادًا إلى السمات المجهرية للخلايا السرطانية، ونوعها النسيجي، ومستوى الصف.

ملاحظة: يصف البروتوكول التالي الخطوات الخاصة بنموذجين منفصلين من نماذج xenograft، وهو نموذج UCC عن طريق الكي الكهربائي لجدار المثانة لغرس خلايا UCC وحقن داخل المستقيم لخلايا CRC للدراسة في نموذج CRC. وجميع الخطوات التي تعد وترصد التجارب متطابقة بين النموذجين، بينما يصف الفرعان 7 و8 على وجه التحديد الإجراء المتعلق بغرس الغرس في الاتفاقية وحقن لجنة حقوق الطفل، على التوالي.

1. زراعة خطوط الخلايا

  1. تنمو خلايا هونج كونج في كامل RPMI-1640 المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني، 2 نم الجلوتامين، 100 U / مل البنسلين G، و 100 ملغ / مل العقديات في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 المرطبة 5٪.
    ملاحظة: خلايا هونج كونج هي الخلايا الدنية الجريبية البشرية العادية ويمكن زراعتها وتوسيعها ل ≤ 15 الممرات في المختبر16.
  2. للتحضير لتجربة، جرّب الخلايا.
    1. إزالة الوسائط وإضافة 2 مل من 1٪ تريبسين في محلول الملح متوازن ة هانك (HBSS) إلى الخلايا. ضع الخلايا مرة أخرى في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 الرطبة بنسبة 5% عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
    2. جمع الخلايا من طبق في أنبوب 15 مل باستخدام المساعدات pipet المحمولة مع الأنابيب المصلية 10 مل المرفقة. أضف 8 مل من الـ RPMI-1640 متوسطة كاملة.
    3. الجمع بين 40 درجة مئوية من الخلايا و 40 درجة مئوية من الأزرق تريبان في بئر واحد من لوحة بئر 96. إضافة 10 ميكرولتر من الخليط إلى مقياس الهيموكيتومات وحساب الخلايا الحية. إضافة 1 مليون خلية في 25 مل كاملة RPMI-1640 المتوسطة إلى 150 ملم معقمة الأنسجة المعالجة بزراعة الطبق لمواصلة نمو الخلايا.
      ملاحظة: يجب استخدام تعليق خلية هونج كونج المعدة في هذه الخطوة في غضون ساعة للاختلاط مع الخلايا السرطانية للحقن.

2. جمع عينات المريض

  1. جمع أورام UCC من المريض وافق 15 (BlCaPt15، pT3b N1 M0) و 37 (BlCaPt37، pT3b pN0 M0) في جراحة الاستئصال.
  2. جمع أورام CRC من المريض موافقة 155 (CoCaPt155، T1 N0 M0) و 302 (CoCaPt302، T1 N0 M0) في جراحة الاستئصال.

3. توسيع ورم المريض

  1. جمع الأورام في الجراحة في وسط McCoy العقيمة الباردة التي تحتوي على البنسلين G (500 U / مل) والعقدية (500 ملغ / مل).
  2. زرع الأورام مباشرة في الجناح الأيسر والأيمن من 6-8 أسابيع من الإناث الإناث NOD / SCID الفئران.
    1. الأنسجة mince ميكانيكيا إلى قطعصغيرة (~ 1 مم 3) باستخدام مقص الجراحية الصغيرة.
    2. زرع الأنسجة تحت الجلد إلى الجناح الأيسر والأيمن باستخدام 13 G نخاع العظم شفط خزعة الإبر.
      ملاحظة: زرع حجم إجمالي من 8 مم3 مقسمة بالتساوي إلى كلا الجانبين من الجناح.

4. وضع العلامات وإثراء الأورام المسمى لوسيفيراز

  1. قياس نمو الورم مرتين في الأسبوع باستخدام الفرجار الرقمي.
  2. في 1 سم في القطر، ورم تحويل. حقن مباشرة في الورم مع جرعة واحدة من البروتين الفلورسنت لوك / الأحمر (RFP)-lentivirus (50 μL / الورم، 1:30 تخفيف من الأسهم ارتفاع titer lentivirus مركزة) باستخدام حقنة 1 سم مكعب مع إبرة 27 G.
    ملاحظة: يصل عمق ورم المريض عادة ً إلى 1 سم في 1-2 شهر. ومع ذلك، فإن معدل النمو متغير للغاية ويستند إلى عدد من العوامل بما في ذلك درجة الورم ونوعه.
  3. مراقبة الورم أسبوعيا عن طريق التصوير الحيوي (BLI) في الحيوانات الحية.
    1. وزن الفئران. حقن الماوس واعية مع 150 ملغ / كغ لوسيفيرين داخل اقعيان وانتظر 5 دقائق لالركيزة لتعميم في جسم الماوس.
    2. التخدير الماوس مع 2.5٪ isoflurane في الأكسجين 100٪، 1 L / دقيقة في غرفة التعريفي.
    3. وضع الماوس على المعدة في آلة التصوير BLI مع isoflurane تتدفق والصورة. التقاط الصور المتسلسلة لتأكيد وجود مناطق الورم الإيجابي لوك / RFP (صورة ملونة بيولوجيا كاذبة الإنارة). عودة الماوس إلى القفص بعد اكتمال التصوير.

5. حدد الجزء المناسب من الورم للهضم الأنزيمي

  1. في يوم إجراء UCC أو CRC، وسم الماوس الصور مع لوسيفيراز الورم كما هو الحال في الخطوات 4.3.1−4.3.3.
    ملاحظة: يعتمد طول الوقت لنمو الورم تحت الجلد على سرعة نمو الورم والعدد المخطط للالحيوانات التي سيتم حقنها في التجربة.
  2. حصاد الورم من جانب الماوس والصورة.
    1. قتل الماوس عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون بعد التصوير. ضع الماوس في غرفة CO 2، قم بتشغيل الغاز بسرعة 1.4 لتر/دقيقة حتى توقف الجهاز التنفسي واتركه لمدة 3 دقائق.
    2. بشرة نظيفة مع الإيثانول 70٪. خيمة الجلد مباشرة فوق الورم. مع مقص الجراحية جعل شق صغير في الجلد. فصل الجلد عن الورم مع مقص.
    3. إزالة الورم ومكان في طبق بيتري معقمة. صورة طبق كامل في آلة التصوير.
  3. استخدم مقص معقم أو مشرط لفصل المقاطع السلبية لوسيفيراز عن المقاطع الإيجابية لوسيفيراز في الورم وإعادة الصورة.
  4. كرر حتى تبقى قطع الورم الأكثر إيجابية للغاية.

6. الهضم الأنزيمي للورم

  1. تحت غطاء تدفق اللامينار، mince luciferase قطع الورم الإيجابية (الخطوة 5.4) في أصغر القطع الممكنة باستخدام مقص الجراحية العقيمة ووضعها في أنبوب مخروطي معقمة 50 مل.
    ملاحظة: فرم الورم إلى أصغر القطع الممكنة سوف تسفر عن المزيد من الخلايا الفردية.
  2. إعداد محلول هضمي عن طريق إضافة 10 مل من الكولاجين الرابع (1.5 ملغ / مل)، 80 ميكرولتر من hyaluronidase (20 ملغ / مل)، و 160 ميكرولتر من ديوكسيريبونوكليس الأول (0.1 ملغ / مل) إلى 40 مل من HBSS. مزيج الحل عن طريق عكس.
  3. أضف 35-40 مل من محلول الهضم إلى الورم المفروم. حضانة في 37 درجة مئوية مع دوران مستمر لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: هز أنبوب بقوة بشكل دوري في جميع أنحاء الحضانة لمنع أنسجة الورم من التكتل.
  4. تصفية الهضم بأكمله من خلال مصفاة خلية معقمة 100 ميكرومتر تليها مصفاة خلية 40 ميكرومتر لإزالة الحطام. حفظ تدفق من خلال وتجاهل الحطام.
  5. غسل الخلايا الحرة عن طريق إضافة 20 مل من HBSS والطرد المركزي في 329 × ز لمدة 5 دقائق.
  6. الجمع بين 10 درجة مئوية من محلول الخلية و 90 درجة مئوية من الأزرق تريبان في بئر واحد من لوحة بئر 96. عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الهيميسي.
  7. نقل 1 × 104 إلى 1 × 106 خلايا الورم لكل ماوس إلى أنبوب مخروطي معقمة 15 مل. إضافة 3 × 105 خلايا هونج كونج من الخطوة 1.2.3 لكل ماوس، إلى نفس الأنبوب مع الخلايا السرطانية.
    ملاحظة: استخدم أنبوب مخروطي معقم 50 مل إذا تجاوز الحجم الإجمالي 15 مل. دائما حساب المزيد من الجرعات للالحيوانات الإضافية لكل مجموعة دراسة لحساب فقدان السوائل أثناء استخدام الحقنة. على سبيل المثال، إذا كانت المجموعة تحتوي على 5 فئران، قم بإجراء خلايا كافية لـ 6 أو 7 فئران.
  8. الطرد المركزي في 329 × ز لمدة 5 دقائق.
  9. إعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر لكل ماوس لنموذج UCC أو 10 ميكرولتر لكل ماوس لنموذج CRC في وسائط RPMI كاملة. احتفظ بتعليق الخلايا على الثلج حتى يصبح جاهزاً للاستخدام.

7. UCC نموذج الماوس

  1. إعداد الفئران للإجراء
    1. الحصول على ستة إلى ثمانية أسابيع من العمر الإناث NOD / SCID الماوس. حلاقة أسفل ظهور الماوس باستخدام كريم إزالة الشعر. التخدير الماوس في غرفة التعريفي مع isoflurane (2.5٪ في الأكسجين 100٪، 1 لتر / دقيقة).
    2. مرة واحدة مخدر، وضع الماوس في موقف supine مع وضعها في مخروط الأنف isoflurane وعارية مرة أخرى ترتكز بقوة على قطب التشتت.
      ملاحظة: يتم تخدير الماوس تماماً إذا لم يستجب لقرصة اصبع القدم.
  2. غرس خلايا UCC المعدة في الخطوة 6.9 إلى المثانة باستخدام قسطرة وعائية (الشكل1Aa, Ab).
    1. قم بإعداد آلة إحتكار الكي الكهربائي وتعيينها إلى قوة 4 W. تليين 24 G القسطرة الوعائية العقيمة مع هلام التشحيم وإدراج من خلال مجرى البول من الماوس الإناث.
      ملاحظة: قد يشعر مقاومة طفيفة. دفع بلطف إلى الأمام أو إزالة القسطرة الوعائية وتكرار. لا تجبري إذا انحنين القسطرة عند الدخول، أدخل سلكًا إرشاديًا معقمًا (انظر 7.2.2) في منتصف الطريق إلى القسطرة لتوفير الاستقرار.
    2. أدخل بالكامل سلك توجيه النواة الثابتة الثابتة 0.025 بوصة 1 مم بعد نهاية القسطرة الوعائية.
      ملاحظة: يتم وضع علامة على السلك مع الشريط قبل الإجراء للإشارة إلى نقطة التوقف 1 مم وتأمين التناسق.
    3. عقد دبوس مونوبولي إلى سلك دليل ل1 s السماح لتهيج الكهربائية من الغشاء المخاطي للمثانة.
    4. إرفاق قسطرة وعائية معقمة جديدة إلى 1 سم مكعب luer-lok حقنة ورسم 200 ميكرولتر من الخلايا التي تم جمعها من الخطوة 6.9.
      ملاحظة: يتم فقدان ما لا يقل عن 100 ميكرولتر من القسطرة الوعائية إلى الحقنة. التعويض عن حجم الخسارة عند حساب حجم تعليق الخلية المطلوبة.
    5. إزالة الأسلاك الإرشادية والقسطرة الوعائية من مجرى البول الماوس. أدخل القسطرة الوعائية مع حقنة الخلايا المرفقة في مجرى البول.
      ملاحظة: يجب أن يكون التقدم أسهل من ذي قبل.
    6. غرس 50 ميكرولتر من الخلايا إلى المثانة الماوس. انتظر بضع ثوان قبل إزالة القسطرة الوعائية للسماح للخلايا بالتمسك بجدار المثانة.
      ملاحظة: تبقى الخلايا في المثانة وتتطور إلى ورم أساسي.
  3. إزالة الماوس من مخروط الأنف isoflurane وسادة التأريض. مراقبة الماوس لمدة ساعة 1 الإجراء التالي. ابحث عن علامات الشدة، أي الظهر الحدس، والتنفس المجهد، الخ.

8. نموذج الماوس CRC

  1. التخدير ستة إلى ثمانية أسابيع من العمر الذكور NOD / SCID الماوس مع isoflurane (2.5٪ في الأكسجين 100٪، 1 لتر / دقيقة) في غرفة التعريفي. تأكيد التخدير مع قرصة اصبع القدم.
  2. وضع الماوس التخدير في موقف supine تحت المجهر تشريح، والتأكد من تأمين خطفهم إلى أنف isoflurane وتأمين أطرافهم الأمامية مع الشريط للاستقرار.
    ملاحظة: يمكن استخدام Loupes بدلاً من مجهر تشريح. يمكن استخدام كائن صغير لتحسين الرؤية والزاوية عند وضعها تحت قاعدة الذيل، ورفع فتحة الشرج. عادة، يتم توالت أجزاء صغيرة من الشاش في شكل اسطوانة من قطر 1 بوصة.
  3. قم بفصل القناة الشرجية باستخدام ملقط مشحم مشحم مشحم مشحم لكشف الشرج القاصي والغشاء المخاطي المستقيمي. إزالة البراز.
  4. استخدم إبرة قابلة للإزالة بوزن 30 غ معقمة على حقنة زجاجية بوزن 50 ميكرولتر لحقن 10 ميكرولتر من الخلايا السرطانية وخلايا هونج كونج (من الخطوة 6.9) في تحت الغشاء الفرعي المستقيمي الخلفي القاصي القاصي 1 إلى 2 مم فوق القناة الشرجية. يجب تغطية شطبة الإبرة بالغشاء المخاطي. يجب الحرص على عدم المرور إلى تجويف الحوض.
  5. إزالة الماوس من مخروط الأنف isoflurane. مراقبة الماوس لمدة ساعة 1 الإجراء التالي. ابحث عن علامات الشدة، أي الظهر الحدس، والتنفس المجهد، الخ.

9- التصوير الإنارة الأحيائية

  1. مراقبة الورم الأولي, الكبد, والرئة عبء النقيلي أسبوعيا باستخدام نظام التصوير bioluminescent لنشاط لوسيفيراز.
    1. الحصول على ماوس من UCC أو CRC التجربة والوزن. حقن 150 ملغ / كغ لوسيفيرين داخل اقابي وانتظر 5 دقائق لالركيزة لتعميم في جسم الماوس.
    2. التخدير الماوس مع 2.5٪ isoflurane في الأكسجين 100٪، 1 L / دقيقة في غرفة التعريفي.
    3. وضع الماوس في آلة التصوير BLI مع الأنف ثابتة في أنف. عند الكشف عن الصورة، تأكد من أن منطقة الاهتمام تواجه الكاميرا. بالنسبة لحقن UCC وCRC، يجب أن يواجه الجانب البطني الكاميرا لكل صورة. صورة الماوس في موقف supine.

10. حصاد الأعضاء والورم

  1. عندما يصل تألق الإنارة الورم الأولي 1 × 1011 فوتونأو إذا كانت الفئران تظهر علامات الشدة (أي فقدان الوزن، حدس الظهر، والتنفس القاسي / المجهد، وما إلى ذلك)، قتل الفئران عن طريق استنشاق CO2 (كما هو الحال في الخطوة 5.2.1) بعد لوسيفيرين الحقن والتصوير لكامل الجسم.
  2. إزالة الكبد والرئة، ووضعها في طبق بيتري وصورة لتحديد أي الانبثاث. إزالة الورم والوزن والصورة. إصلاح الأعضاء والورم في 10٪ محايدة المخزنة الرسمية لمدة 48 ساعة في درجة الحرارة المحيطة.
    ملاحظة: تنظيف / مسح مقص وملقط بين كل عضو لتجنب نقل الأنسجة.

11. التقييم النسيجي

  1. تضمين الأنسجة الثابتة formalin في البارافين وشريحة الأنسجة في سمك 5 ميكروتومي على ميكروتومي للهيماتوكسيلين ويوسين (H & E) والمناعية الكيميائية (IHC) تلطيخ.
    ملاحظة: تم إجراء جميع H & E تلطيخ الشرائح البارافين في مختبر علم الأمراض من نظام الصحة Ochsner، وتم تنفيذ جميع تلطيخ IHC في هذه الورقة في مختبر البحوث من نظام الصحة Ochsner بعد ارتفاع درجة الحرارة مستضد استرجاع باستخدام Ki67 و سيتوكيراتين 20 الأجسام المضادة، تليها الأجسام المضادة الثانوية biotinylated، ومجمعات أفيدين البيوتين بيروكسيداز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة13،17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في نموذج PDOX UCC، كانت خلايا BlCaPt15 أو BlCaPt37 المرضى UCC داخل vesically (IB) غرست في وجود خلايا هونج كونج في الإناث NOD / SCID المثانة الماوس (الشكل1A). خمسة وعشرون من أصل ثلاثين (83.3 في المائة) الحيوانات ولدت الأورام الأولية وعرض نمو الورم الأولية تعتمد على الوقت على أساس BLI الأسبوعية (الشكل1B،C والجدول 1). وبالمثل، في نموذج PDOX CRC، 31 من أصل 32 (96.9٪) نمت الفئران الورم الأولي عندما داخل المستقيم (IR) حقن مع خلايا المرضى CoCaPt155 أو CoCaPt302 بالإضافة إلى خلايا هونج كونج (الشكل1D-F والجدول 1). اعتمادا على ورم المريض، وكان نمو ورم الماوس فترة الكمون مختلفة، مما يعكس الفرق في الخصائص السريرية للمريض (الشكل1C،F).

في كل من نماذج IB والأشعة تحت الحمراء، حقن الخلايا السرطانية ليس فقط ولدت الأورام الأولية تقويم العظام (الشكل2A،B، السهام الزرقاء)، ولكن العديد من الفئران اختبار وضعت أيضا الكبد و / أو الرئة الانبثاث. في 10 من أصل 30 (33.3 في المائة) و 17 من أصل 32 (53.1 في المائة) الفئران غرست مع خلايا UCC وخلايا CRC مع خلايا هونج كونج، على التوالي، اكتشفنا الانبثاث الجهاز البعيد عن طريق السابق ينفي بلي (الشكل2A،B والجدول 1).

لتأكيد مورفولوجيا الأنسجة مماثلة، تم إجراء تلطيخ H&E وIHC مقارنة xenografts وأورام المريض الأولية. تم الحفاظ على أمراض الأنسجة من سرطان المثانة المريض في xenografts من BlCaPt15 و BlCaPt37 (الشكل3A). تظهر النتائج ورم xenograft المقابلل لنمط نمو العضلات الغازية للأورام الأولية للمرضى. تم استخدام الجسم المضاد الخاص بعلامة انتشار الخلايا البشرية Ki67 في IHC. Ki67 تلطيخ نووي إيجابي يشير إلى تكاثر ية للغاية، والخلايا السرطانية البشرية سريعة النمو. كانت نتائج تلطيخ من xenografts مماثلة لتلك التي من الخزعات الجراحية الأصلية. وبالمثل، في نموذج الأشعة تحت الحمراء، H & E تلطيخ يشير إلى التشابه في الهندسة المعمارية بين xenografts وأورام المريض من كل من CoCaPt155 و CoCaPt302. IHC باستخدام الأجسام المضادة ضد السيتوكيراتين 20 أظهرت أيضا نمط نمو الورم مماثلة في كل من نماذج PDOX (الشكل3B). وهكذا، لدينا نموذج PDOX تلخيص UCC وCRC تطور المريض السريرية.

Figure 1
الشكل 1: نماذج الماوس UCC وCRC تقويم العظام. (A-C) داخل الحويصلة (IB) غرس خلايا UCC في المثانة الماوس13. (أأ) تم إدخال قسطرة وعائية في المثانة من فأرة NOD/SCID أنثى وتم تطبيق صدمة الكي الكهربائي على جدار المثانة عبر سلك دليل. (أب)هل أنابخير؟ لوسيفيراز الموسومة الخلايا السرطانية UCC, BlCaPt15 (2 × 104 الخلايا), أو BlCaPt37 (5 × 105 خلايا) مع إضافة 3 × 105 LN سترومال خلايا هونج كونج, تم غرسها في المثانة الماوس NOD / SCID من خلال القسطرة الوعائية. (D-F) حقن داخل المستقيم (IR) من خلايا CRC في طبقة الأنسجة تحت المخاطية من مستقيم الماوس17. (D) تم توسيع القناة الشرجية بملقط مشحم ذو رؤوس حادة للسماح بالوصول إلى الغشاء المخاطي للالشرج والمستقيم القاصي وإبرة 30 G تم إدخالها في تحت الغشاء المخاطي المستقيمي الخلفي القاصي 1−2 مم فوق القناة الشرجية حتى تم تغطية الشطبة من قبل الحقن يحدث. لوسيفيراز الموسومة خلايا الورم CRC, CoCaPt155 (5 × 105 خلايا), أو CoCaPt302 (1 × 104 الخلايا) مع إضافة 3 × 105 تم حقن خلايا هونج كونج. تم رصد عبء الورم وتحديده كمياً من خلال التصوير الإنارة الحيوية (BLI; B و E). تم رصد نمو الورم من لوسيفيراز الموسومة UCC أو CRC الخلايا حركيا عن طريق BLI وتحليلها باستخدام برنامج تحليل الصور(C و F). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نماذج PDOX تنتج الانبثاث الجهاز البعيد عفوية. الفئران التمثيلية (الألواح العليا) من نفس التجارب كما هو الحال في الشكل 1، على سبيل المثال ، غرست داخل vesically مع لوسيفيراز الموسومة خلايا الورم UCC ، BlCaPt15 أو BlCaPt37 الخلايا مع خلايا هونج كونج (A) أو داخل المستقيم مع لوسيفيراز الموسومة ورم CRC يتم عرض الخلايا، CoCaPt155 أو CoCaPt302 الخلايا مع خلايا هونج كونج (B). تشير الأسهم الصفراءإلى المثانة الماوس (A). الصور التي التقطت في وقت التضحية تشير إلى تكوين الورم تقويم العظام (الأسهم الزرقاء). أظهر الكبد والرئة والورم (الألواح الوسطى) التي تم جمعها في necropsy وBLI في الجسم الحي السابق (لوحات أسفل) الكبد الماوس وورم خبيث وكذلك الورم مع نشاط لوسيفيراز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تشبه أورام Xenograft أورام المريض قبل الزرع. البارافين جزءا لا يتجزأ من أنسجة الورم من ورم المريض أو الأورام التي تم جمعها من الفئران في نفس التجارب كما هو الحال في الشكل 1 تم تقسيمها وملطخة من قبل H & E (A و B)أو IHC مع الأجسام المضادة ضد الإنسان Ki67 (A) أو السيتوكيراتين 20 (CK20; B).اللون البني يشير إلى تلطيخ إيجابي. H & E تلطيخ يظهر أعشاش الورم تشريح فيحزم العضلات الملساء (A). وقد التقطت الصور الفوتوغرافية باستخدام مجهر رقمي للdeconvoluting وتم تحليلها باستخدام برنامج تحليل الصورة. قضبان الحجم: 100 درجة مئوية. تم التقاط جميع الصور في التكبير الأصلي من 200 ×. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

زرع الورم (٪) ورم الرئة/الكبد (٪) معدل الوفيات (بالنسبة المئوية)
UCC, n= 30 83.3 33.3 صفر
CRC, n=32 96.9 53.1 صفر

الجدول 1: ملخص تكوين الورم، وورم خبيث، والوفيات في نماذج البكالوريا الدولية والأشعة تحت الحمراء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المرض النقيلي هو المسؤول عن معظم وفيات مرضى السرطان. في الاختبارات العلاجية قبل السريرية، من المهم جداً إنشاء نماذج الماوس التي تحاكي نمو الورم البشري بشكل وثيق مع الانبثاث الجهاز البعيد التلقائي. استخدام نماذج المورين مع زرع الخلايا السرطانية المشتقة من ورم المريض (xenografts) يسمح لفهم أفضل لبيولوجيا الورم والمؤشرات الحيوية التنبؤية وكذلك اختبار والتنبؤ بالآثار المضادة للأورام من العلاجات الجديدة18. وقد استخدمت العديد من النماذج لإظهار الانبثاث UCC وCRC في تجارب المورين، مثل حقن الوريد الذيل الوريد تظهر القدرة على إنتاج أمراض الرئة19 أو زرع تحت الجلد من الخلايا السرطانية أو شظايا الورم في الجناح ل نمو الورم المترجم20,21. أحد المختبرات ذكرت سابقا نموذج سرطان المثانة مورين باستخدام علاجات حمض الهيدروكلوريك لتعزيز بنجاح تناول الورم22. في حين أن هذه الأساليب تنتج نموا محليا موثوقا به، وقد تظهر بعض الأنشطة النقيلية، فإنها لا تشبه على وجه التحديد المسار الطبيعي للسرطان وضعت في البشر ولا تستخدم آلية النقيلي ينظر في المرضى18، 23. تم الإبلاغ عن نماذج أخرى من المورين لتقليد نمو الورم عن طريق حقن الخلايا السرطانية مباشرة في أجهزة مثل الكبد أو mesentery، لكنها تحمل مخاطر تسرب الخلايا السرطانية ولم تنتج الانبثاث كبيرة.

لقد أثبتنا سابقا العلاقة بين محتوى الخلايا السرطانية في الورم الأساسي ومشاركة LN24 ودور الخلايا السرطانية / LN التفاعل سترومال في سياق تطور الورم الأساسي إلى مرض النقيلي10 , 12 , 17.دمج عملنا السابق على تأثير البيئة الصغرى السترومال LN في التقدم النقيلي، أنشأنا نماذج تقويم العظام (وخاصة نماذج PDOX) التي تحاكي المسار الطبيعي للنشر النقيلي، هي استنساخ من الناحية الفنية، والحفاظ على عدم تجانس أورام المريض الأصلي، وتوليد الورم الأساسي متسقة والنتائج النقيلية12،13،17. باستخدام آثار تعزيز الورم من البيئة الدقيقة سترومال LN مهم لأنه يوفر بيئة صغيرة ورم مماثلة في UCC الإنسان وCRC، يطور جميع الخطوات في شلال النقيلي، ويقلل من عدد الخلايا السرطانية المطلوبة في نموذج الماوس الذي يقلل من عدد الممرات xenograft، ويؤدي إلى نموذج موثوق به الذي يحاكي عن كثب نمو الورم والانبثاث في الإنسان.

لقد أنشأنا طريقة فريدة من نوعها من IB الكهربائية التحفيز باستخدام الغرس المشترك للخلايا هونج كونج التي تنتج نموذجا موثوقا لتطوير MIUCC. نموذجنا يحاكي المسار الطبيعي للتقدم UCC عن طريق زرع الورم بدءا من الغشاء المخاطي ، مما يؤدي إلى العضلات ، ثم ينتقل إلى الرئتين13.

تظهر نتائجنا أيضًا أن نموذج الأشعة تحت الحمراء آمن وقابل للتكرار وناجح. يتميز نموذج الماوس CRC تقويم العظام نمو الورم الأولي والانبثاث البعيد التلقائي12,17. إجراء الأشعة تحت الحمراء سريعة وسهلة التعلم، وسهلة من الناحية الفنية لأداء، وليس مرهقة جدا على الحيوانات. ولم يكن لدى مجموعتي البكالوريا الدولية والأشعة تحت الحمراء أي معدل وفيات (الجدول1)في فترة ما بعد الجراحة قبل القياس النهائي لـ BLI. ومع ذلك، تتطلب هذه التقنية ممارسة. إذا كان الحقن داخل المستقيم ناجحاً، يجب أن يكون هناك "فقاعة" مرئية تتشكل مع إدخال السائل في الغشاء المخاطي المستقيمي وسيؤدي إلى نمو الورم الأولي الذي سيصبح في نهاية المطاف ملموساً كما هو موضح في الشكل 1. إذا تم حقن الورم في عمق تجويف الحوض، فإنه سيكون غير مرتبط بالجهاز المستقيمي وينمو كبير ًا جدًا لملء الحوض، مما يسبب أحيانًا انسدادًا. إذا كانت الحقنة ضحلة جداً أو لا تدخل الطبقة تحت المخاطية المستقيمية على الإطلاق، فإنه سيتم تسرب مما يؤدي إلى انخفاض أو غياب عبء الورم الأساسي.

لقد أنشأنا فريدة من نوعها، نماذج PDOX قابلة للاستنساخ لالإنسان HG-UCC وCRC. تسمح هذه النماذج لتكوين الورم ودراسات الانبثاث. يمكننا الآن استخدام هذه النماذج كطريقة أساسية لمواصلة دراسة البيئة الدقيقة سترومال LN وتفاعلها مع الأورام الأولية المريض. هذه النماذج سوف تسمح لنا أيضا للتحقيق في العلاجات التي تتداخل مع الآثار المؤيدة للورم من LNSC على الورم الأولي. مع هذه النماذج، يمكن إجراء اختبار الأدوية العلاجية الجديدة بكفاءة وفي السلوكيات المحاكاة السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وقد تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل منحة مبادرة أبحاث الطب الترجمة Ochsner 2014. ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويشكر المؤلفون برايان رويتر، ودانييل بيرتوني، وبيتر ميلر، وشانون ماتشيسني الذين ساعدوا في بدء هذه الدراسات على دعمهم التقني الممتاز. كما يشكر المؤلفون هيذر غرين ماترانا ومارغريت فاريانو وسونيل تالوار وماريا لاتسي على مساعدتهم في مساعدة المرضى على الموافقة وتوفير عينات الورم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avidin-biotin-peroxidase Vector Labs Inc PK-6100
Biotinylated secondary antibody Vector Labs Inc BA-1000
Collagenase IV (1.5 mg/mL) Worthington Biochemical Corporation LS004189
Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) Sigma D4263
D-Luciferin (150 mg/kg) Perkin Elmer 122796
Formalin (10% neutral buffered) Leica 46129
glutamine (2 nM) Fisher Scientific 35050061
Hair Removal Cream Church & Dwight Co., Inc 1 (800) 248-8820
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific SH30016.02
Hyaluronidase (20 mg/mL) Sigma H3884
Isoflurane Henry Schein Animal Health 108333
Luc/RFP-lentivirus From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018).
McCoy’s medium Life Technologies 110862
penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) Fisher Scientific 15140-122
RPMI-1640 Medium American Type Culture Collection 110636
Trypan Blue Sigma T6146
Trypsin/EDTA Life Technologies 15400-054
Name Company Catalog Number Comments
Gas
100% Oxygen Airgas Inc OX USP200
100% CO2 Airgas Inc CD USPE
Name Company Catalog Number Comments
Mice
6-8 week old NOD/SCID Mice (male) Jackson Lab 001303
6-8 week old NOD/SCID Mice (female) Jackson Lab 001303
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Hematoxylin Sigma GHS232
Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody Thermo Scientific RM-9106-S
Name Company Catalog Number Comments
Tools
40 µm cell strainer Fisher Scientific 08-771-1
100 µm cell strainer Fisher Scientific 08-771-19
15 mL Conical Tube Sarstedt 11799
50 mL Conical tube Sarstedt 15762
150 mm Tissue Culture Dish USA Scientific Inc CC7682-3614
96 Well plate USA Scientific Inc CC7682-7596
Forceps Symmetry Surgical Inc 06-0011
Surgical scissors Symmetry Surgical Inc 02-2011
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
5% CO2 humidified incubator Thermo Scientific 3110
Bioluminescent (BLI) Imaging Machine Perkin Elmer CLS136334
BLI Imaging Machine Software Perkin Elmer CLS136334
Centrifuge Beckman 366830
Deconvoluting Microscope Intelligent Imaging Innovations Marianas
Deconvoluting Microscope Imaging Software Intelligent Imaging Innovations +1 (303) 607-9429 x1
Digital caliper Fowler Tools and Instruments 54-115-330
Dissecting microscope Precision Instruments LLC (504) 228-0076
Electrosurgical generator ValleyLab FORCE1C20
Isoflurane Induction Chamber Perkin Elmer 119038
Microtome American Optical Corporation 829
Pipet Aid Fisher Healthcare 13-681-15E
Serological pipet (10 mL) Sarstedt 86.1254.001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer--prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
  2. Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
  3. National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Bladder Cancer. Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/urinb.html (2018).
  4. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
  5. Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
  6. Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
  7. Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, discussion 764-755 758-764 (1993).
  8. Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
  9. National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2017).
  10. Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
  11. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
  12. Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
  13. Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
  14. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
  15. Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
  16. Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
  17. Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
  18. Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
  19. Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
  20. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
  21. Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
  22. Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
  23. Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
  24. Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics