आसीबिंग सर्किट वयस्क हिप्पोकैम्पस तंत्रिका precursor कोशिकाओं के विशिष्ट विनियमन

Neuroscience

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Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक विशिष्ट स्थानीय तंत्रिका सर्किट के chemogenetic हेरफेर के जवाब में वयस्क तंत्रिका स्टेम / जनक कोशिकाओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन है.

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Quintanilla, L. J., Yeh, C. Y., Bao, H., Catavero, C., Song, J. Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells. J. Vis. Exp. (149), e59237, doi:10.3791/59237 (2019).

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Abstract

वयस्क neurogenesis एक गतिशील प्रक्रिया है जिसके द्वारा नव सक्रिय तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) दंत चिकित्सा gyrus के subgranular क्षेत्र (एसजीजेड) में (DG) नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करते हैं, जो एक मौजूदा तंत्रिका सर्किट में एकीकृत और विशिष्ट हिप्पोकैम्पस कार्यों के लिए योगदान . महत्वपूर्ण बात, वयस्क neurogenesis अत्यधिक पर्यावरण उत्तेजनाओं के लिए अतिसंवेदनशील है, जो विभिन्न संज्ञानात्मक कार्यों की गतिविधि पर निर्भर विनियमन के लिए अनुमति देता है. विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से तंत्रिका सर्किट की एक विशाल रेंज इन जटिल संज्ञानात्मक कार्यों आर्केस्ट्रा. इसलिए यह समझने के लिए कैसे विशिष्ट तंत्रिका सर्किट वयस्क neurogenesis को विनियमित महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम विशेष रूप से डिजाइनर दवाओं द्वारा सक्रिय डिजाइनर रिसेप्टर का उपयोग कर तंत्रिका सर्किट गतिविधि में हेरफेर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन (DREADDs) प्रौद्योगिकी है कि NSCs और कृन्तकों में नवजात संतान को नियंत्रित करता है. इस व्यापक प्रोटोकॉल वायरल कणों के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन, विशिष्ट तंत्रिका सर्किट के chemogenetic उत्तेजना, थाइमिडीन अनुरूप प्रशासन, ऊतक प्रसंस्करण, इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग, confocal इमेजिंग, और इमेजिंग भी शामिल है तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं के विभिन्न चरणों का विश्लेषण. इस प्रोटोकॉल एंटीजन पुनर्प्राप्ति की तकनीक पर विस्तृत निर्देश प्रदान करता है NSCs और उनकी संतान कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया और एक सरल, अभी तक प्रभावी तरीका clozapine एन-ऑक्साइड (CNO) या CNO युक्त पीने के पानी का उपयोग कर मस्तिष्क सर्किट modulate करने के लिए और DREADDs-अतिश: वायरस. इस प्रोटोकॉल की ताकत तंत्रिका सर्किट की एक विविध रेंज है कि एनएससी से व्युत्पन्न वयस्क neurogenesis को प्रभावित अध्ययन करने के लिए अपनी अनुकूलन क्षमता में निहित है.

Introduction

प्रौढ़ तंत्रिकाजनन एक जैविक प्रक्रिया है जिसके द्वारा नए न्यूरॉन्स का जन्म वयस्क में होता है और मौजूदा तंत्रिका नेटवर्क1में एकीकृत होता है . मनुष्यों में, यह प्रक्रिया हिप्पोकैम्पस के डेन्टीट gyrus (डीजी) में होती है, जहां प्रत्येक दिन लगभग 1,400 नई कोशिकाएं पैदा होती हैं2। ये कोशिकाएं डीजी के भीतरी भाग में रहती हैं, जो न्यूरोजेनिक आला को आश्रय देती है, जिसे उपकणीय क्षेत्र (एसजीजेड) कहा जाता है। यहाँ, हिप्पोकैम्पस वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल (NSCs) एक जटिल विकास प्रक्रिया से गुजरना पूरी तरह कार्यात्मक न्यूरॉन्स कि विशिष्ट मस्तिष्क कार्यों के विनियमन में योगदान बनने के लिए, सीखने और स्मृति सहित, मूड विनियमन, और तनाव प्रतिक्रिया3 ,4,5,6. व्यवहार को प्रभावित करने के लिए, वयस्क एनएससी अत्यधिक स्थानीय और दूरस्थ रासायनिक संकेतों की एक सरणी का जवाब देकर एक गतिविधि निर्भर तरीके से विभिन्न बाहरी उत्तेजनाओं द्वारा विनियमित कर रहे हैं. इन रासायनिक संकेतों न्यूरोट्रांसमीटर और neuromodulators शामिल हैं और विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से एक सर्किट विशिष्ट तरीके से कार्य. महत्वपूर्ण बात, NSCs पर इन रासायनिक संकेतों के सर्किट व्यापक अभिसरण स्टेम सेल सक्रियण, भेदभाव, और भाग्य निर्णय के अद्वितीय और सटीक विनियमन के लिए अनुमति देता है.

विवो में वयस्क एनएससी के सर्किट विनियमन से पूछताछ करने के लिए सबसे प्रभावी तरीकों में से एक सर्किट व्यापक जोड़तोड़ के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण जोड़ना है। वयस्क एनएससी का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण एक सामान्य रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है, जहां वयस्क एनएससी के विकासात्मक चरण को इंगित करने के लिए विशिष्ट आणविक मार्करों के विरुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। इन मार्करों में शामिल हैं: एक रेडियल ग्लिया सेल और जल्दी तंत्रिका जनक मार्कर के रूप में नेस्टिंग, एक मध्यवर्ती संतति मार्कर के रूप में Tbr2, और एक neuroblast और अपरिपक्व न्यूरॉन मार्कर के रूप में dcx7. इसके अतिरिक्त, BrdU, CidU, Idu, और Edu जैसे थाइमिडीन एनालॉगका प्रबंध करके, एस चरण से गुजर ने सेल की आबादी को व्यक्तिगत रूप से लेबल किया जा सकता है और8,9,10की कल्पना की जा सकती है। इन दो दृष्टिकोणों के संयोजन से, सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला कैसे प्रसार विशिष्ट विकासात्मक चरणों में विनियमित है से लेकर जांच की जा सकती है, कैसे विभिन्न संकेतों एनएससी भेदभाव और neurogenesis को प्रभावित करने के लिए.

कई विकल्प प्रभावी ढंग से विद्युत उत्तेजना सहित तंत्रिका सर्किट में हेरफेर करने के लिए मौजूद, optogenetics, और chemogenetics, अपने स्वयं के फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक. विद्युत उत्तेजना एक व्यापक सर्जरी जहां इलेक्ट्रोड बाद में एक लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र को मॉड्युलेट करने के लिए विद्युत संकेतों संचारित करने के लिए उपयोग किया जाता है जो एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र के लिए प्रत्यारोपित कर रहे हैं शामिल है. हालांकि, इस दृष्टिकोण दोनों सेलुलर और सर्किट विशिष्टता का अभाव है. Optogenetics वायरल कणों कि एक प्रकाश सक्रिय रिसेप्टर कि एक प्रत्यारोपित ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से उत्सर्जित एक लेजर द्वारा प्रेरित है सांकेतिक प्रेमीकरण की डिलीवरी शामिल है, लेकिन व्यापक जोड़तोड़ की आवश्यकता है, बड़ी लागत, और जटिल सर्जरी11. Chemogenetics वायरल कणों है कि एक डिजाइनर रिसेप्टर विशेष रूप से डिजाइनर दवाओं या DREADDs द्वारा सक्रिय सांकेतिक संबंधों की डिलीवरी शामिल है, जो बाद में एक विशिष्ट और जैविक रूप से निष्क्रिय ligand द्वारा सक्रिय कर रहे हैं clozapine एन-ऑक्साइड (CNO)12 के रूप में जाना जाता है . वयस्क NSCs को विनियमित है कि स्थानीय तंत्रिका सर्किट में हेरफेर करने के लिए DREADDs का उपयोग का लाभ आसानी और CNO प्रशासन के विभिन्न मार्गों में निहित है. यह कम पशु हैंडलिंग के साथ एक कम समय लेने वाली दृष्टिकोण के लिए अनुमति देता है, जो आसानी से तंत्रिका सर्किट को मॉड्युलेट करने के लिए दीर्घकालिक अध्ययन के लिए अनुकूलनीय है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण विभिन्न प्रोटोकॉल का एक व्यापक संग्रह है जो वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस के सर्किट विनियमन को सफलतापूर्वक पूछताछ करने के लिए आवश्यक है जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक और सर्किट जोड़-तोड़ दोनों को जोड़ती है रसोजेनेटिक्स का उपयोग करना। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में वर्णित विधि उत्तेजक या एक या एकाधिक सर्किट एक साथ vivo में बाधा वयस्क neurogenesis पर अपने नियामक समारोह निर्धारित करने के लिए के लिए उपयुक्त है. इस दृष्टिकोण सबसे अच्छा प्रयोग किया जाता है अगर सवाल लौकिक संकल्प के एक उच्च डिग्री की जरूरत नहीं है. एक निश्चित आवृत्ति पर उत्तेजना/अवरोध के सटीक अस्थायी नियंत्रण की आवश्यकता वाले प्रश्नों को ऑप्टोजेनेटिक्स13,14का उपयोग करके बेहतर ढंग से संबोधित किया जा सकता है । यहाँ वर्णित दृष्टिकोण आसानी से कम से कम पशु से निपटने के साथ दीर्घकालिक अध्ययन के लिए अनुकूलित है, खासकर जहां तनाव एक प्रमुख चिंता का विषय है.

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Protocol

पशु विषयों सहित सभी प्रक्रियाओं उत्तरी कैरोलिना चैपल हिल विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. वायरल कणों के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन

  1. प्रश्न में तंत्रिका परिपथों का निर्धारण की। यह वायरस और माउस लाइन निम्न प्रक्रिया के लिए उपयोग निर्धारित करेगा.
    नोट: इस उदाहरण के लिए, contralateral काई सेल अनुमानों वयस्क neurogenesis पर इसके प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं. वायरल कणों एन्कोडिंग AAV5-hSyn-DIO-hM3DQ-mChery 5ht2A-Cre चूहों15के डीजी को दिया जाता है।
  2. प्रशासन meloxicam (5 mg/kg, subcutaneously) कम से कम 30 मिनट पूर्व ऑपरेटिव एक 8 सप्ताह पुराने पुरुष heterozygus 5ht2A-Cre माउस के लिए पूर्व खाली analgesia प्रदान करने के लिए.
  3. माउस का उपयोग कर एक 4% isoflurane ऑक्सीजन मिश्रण का उपयोग कर एनेस्थेटाइज जब तक अपनी सांस धीमा हो जाता है और माउस एक isoflurane कक्ष का उपयोग बेहोश है. यह उत्तरदायी नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए माउस चुटकी टो.
  4. थर्मल विनियमन के लिए एक छोटे से पशु हीटिंग पैड पर स्टीरियोटैक्स में माउस प्लेस और प्रत्येक आंख के लिए आंख स्नेहक लागू होते हैं। पशु स्टीरियोटैक्स के अंदर है एक बार 1.5% करने के लिए isoflurane कम करें।
    नोट: इस चरण के दौरान कान बार प्लेसमेंट महत्वपूर्ण है. सुनिश्चित करें कि सिर कान बार प्लेसमेंट के बाद स्तर है. अधिक विस्तृत निर्देश Geiger एट अल16में पाया जा सकता है.
  5. सिर पर बालों को हटाने के उत्पाद प्लेस और यह अप करने के लिए बैठने के लिए 1 न्यूनतम अधिकतम. इथेनॉल पोंछे के साथ सिर पोंछते द्वारा बालों को निकालें. यदि बाल पूरी तरह से नहीं हटाया जाता है, सिर के शीर्ष बाल हीन है जब तक इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
  6. कम से कम 3 बार एक povidone-आयोडीन समाधान के साथ hairless क्षेत्र को संक्रमित.
  7. सिर के बालहीन त्वचा पर सामयिक lidocaine समाधान प्लेस और 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. सिर से सामयिक lidocaine निकालें और आंखों की शुरुआत से सिर पर एक छोटा सा चीरा बनाने के बारे में कान की शुरुआत करने के लिए 2 मिमी एक शल्य खोपड़ी का उपयोग कर.
    नोट: टो माउस चुटकी सुनिश्चित करने के लिए कि यह पूरी तरह से किसी भी चीरा बनाने से पहले बेहोश हो गया है.
  8. खोपड़ी को वापस लें और बंध्याकरण कपास swabs का उपयोग करके सिर के शीर्ष पर संयोजी ऊतक को साफ जब तक bregma आसानी से पहचाने जाने योग्य है.
  9. ब्रीग्मा का पता लगाएँ और सिर को समायोजित करें ताकि ब्रीग्मा और लैम्ब्डा दोनों निर्देशांकों पर ड्रिल रखकर एक ही तल पर हों और उन्हें संरेखित होने का आश्वासन देकर। इसके अतिरिक्त, ब्रीग्मा और लैम्ब्डा के बीच किसी क्षेत्र के बाएँ/दाएँ पर ड्रिल रखकर बाएँ और दाएँ गोलार्द्ध को संरेखित करें.
    नोट: यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है; अनुचित रूप से संरेखित सिर प्लेसमेंट स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक को बाधित करेगा।
  10. एक 0.5 मिमी ड्रिल बिट का उपयोग कर bregma से निम्नलिखित निर्देशांक पर ड्रिल: पूर्वकाल पीछे अक्ष (एपी) -2.00 मिमी, मध्य पार्श्व अक्ष (एमएल) +1.50 मिमी. एक 0.5 मिमी करने के लिए 1 मिमी व्यास ड्रिल छेद में बनाओ।
    नोट: प्रश्न में परिपथ के लिए विशिष्ट निर्देशांक के साथ इस चरण को संशोधित करें. यह उदाहरण काई कोशिकाओं युक्त एकपक्षीय दंते तत्व gyrus को लक्षित करता है और contralateral पक्ष पर वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं पर उनके प्रभाव को निर्धारित करता है.
  11. ड्रिल को 5 डिग्री सेल्सियस सिरिंज और 26 डिग्री 33 जी सुई पर स्विच करें। ब्रीग्मा पर शून्य और फिर पूर्वकाल अक्ष -2.00 मिमी, मध्य पार्श्व अक्ष -1.50 मिमी, पृष्ठीय अधर अक्ष -2.3 मिमी पर ड्रिल होल में सुई रखकर निम्न निर्देशांकों पर इंजेक्ट करें।
  12. एक वायरल कोर या वाणिज्यिक स्रोत से उपयुक्त गोलार्द्ध के लिए एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के 500 एनएल को एक जलसेक पंप (सामग्रीकीतालिका) का उपयोग करके 50 डिग्री एन एल/मिन पर डाल दें। धीरे धीरे मस्तिष्क से सुई को हटाने से पहले कम से कम 5 मिनट पोस्ट इंजेक्शन प्रतीक्षा करें.
    नोट: इन निर्देशांकों को माउस की आयु और आकार के आधार पर समायोजन की आवश्यकता हो सकती है. कुछ वायरल serotypes अलग प्रसार पैटर्न है, यह एक पूरा प्रयोग से पहले वायरल प्रसार का परीक्षण करने के लिए पायलट प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए सबसे अच्छा है।
  13. नमकीन का उपयोग कर चीरा के आसपास स्वच्छ खोपड़ी और त्वचा, तो ऊतक चिपकने वाला (सामग्री कीतालिका) का उपयोग कर चीरा सील, जबकि चिमटी के साथ एक साथ त्वचा पकड़े. माउस सक्रिय है जब तक एक हीटिंग पैड पर वसूली के दौरान निगरानी के रूप में सभी पोस्ट ऑपरेटिव प्रक्रियाओं प्रदर्शन, घाव पर एनाल्जेसिक लागू करने, और दो दिनों के लिए दर्द निवारक प्रशासन.
    नोट: कई प्रयोगों उचित वायरल अभिव्यक्ति के लिए वायरल जलसेक के बाद 2 "4 सप्ताह प्रतीक्षा समय की आवश्यकता है.

2. क्लोज़ापिन एन-ऑक्साइड प्रशासन

  1. डाइमेथिल सल्फोक्साइड (DMSO) और भंवर िंग के 100 डिग्री एल में CNO की 10 मिलीग्राम CNO भंग करके एक स्टॉक CNO समाधान तैयार करें।
    नोट: यदि समाधान पूरी तरह से भंग नहीं होता है, तो DMSO की मात्रा में वृद्धि, लेकिन बहुत अधिक DMSO पानी कड़वा कर सकते हैं. CNO पानी के समाधान में 0.1% DMSO से अधिक या एक 200 एमएल समाधान के लिए DMSO के 200 से अधिक $ L से अधिक नहीं है। CNO स्टॉक समाधान को दो सप्ताह तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. 1 0 मिलीग्राम/100 एल सी एन ओ स्टॉक समाधान के 10$50 डिग्री एल के अंतिम सांद्रता के लिए प्रत्येक 200 एमएल जल के लिए 10 डिग्री 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। CNO पानी मिश्रण ताजा हर दिन तैयार करें.
    नोट: कुछ समूहों को पानी में 1% saccharin पूरक है कड़वाहट मुखौटा अगर चूहों पीने से परहेज कर रहे हैं. परिपथ की जाँच सक्रियण की सीमा के आधार पर एक अलग प्रतिक्रिया से पता चला. सामान्य में, 1 मिलीग्राम CNO/200 एमएल सबसे सर्किट को उत्तेजित करने के लिए पर्याप्त है17.
  3. 4 दिनों की अवधि में चरण 1.13 से स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन से वसूली के दो सप्ताह बाद चूहों को प्रशासित करते समय एक पन्नी कवर या प्रकाश संरक्षित कंटेनर में CNO समाधान रखें।
    नोट: CNO प्रकाश संवेदनशील है; पूरी प्रक्रिया के दौरान प्रकाश के संपर्क को कम करना।
  4. उपाय और रिकॉर्ड भस्म CNO पानी समाधान हर दिन जब ताजा CNO समाधान की तैयारी. औसत पर, एक वयस्क माउस CNO पानी के मिश्रण के बारे में 4 एमएल भस्म हो जाएगा. इसके अतिरिक्त, रिकॉर्ड माउस वजन दैनिक सुनिश्चित करने के लिए वे पी रहे हैं.
  5. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक प्रयोग के लिए उचित नियंत्रण का उपयोग किया जाता है. CNO और DREADD नियंत्रण दोनों शामिल करें. एक प्रयोगात्मक सेटअप का एक उदाहरण शामिल होंगे: (1) वाहन + स्वायत्त उभयचर वाहन (एएवी) वायरल रिपोर्टर के साथ कोई DREADD, (2) CNO + वायरल रिपोर्टर के साथ एएवी कोई DREADD, और (3) CNO + AAV DREADD.
    नोट: समाधान में सभी समूहों में DMSO शामिल हैं। DMSO नियंत्रण शामिल नहीं हैं क्योंकि जानवरों से कम प्राप्त कर रहे हैं 0.1% DMSO, जो चूहों में वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं दिखाया गया है. यदि पीने के पानी में DMSO उपयोग के बारे में चिंता कर रहे हैं, एक अतिरिक्त कोई DMSO और नमकीन नियंत्रण जोड़ें.

3. थाइमदीन एनालॉग लेबलिंग

  1. ऊतक संग्रह दिन पर, CNO प्रशासन के बाद 4 दिन, थाइमिडीन एनालॉग की एक श्रृंखला प्रदर्शन करके लेबल proliferating कोशिकाओं, 5-एथनिल-2'-deoxyuridine (Edu) intraperitoneal इंजेक्शन.
    नोट:
    इस प्रोटोकॉल Edu का इस्तेमाल करता है. हालांकि, वहाँ कई थाइमिडीन एनालॉग है कि कुशलता से Brdu, Idu, और Cidu8सहित कोशिका आबादी proliferating लेबल कर सकते हैं.
    1. वजन Edu और पशु चिकित्सा ग्रेड में भंग 0.9% सोडियम क्लोराइड इंजेक्शन समाधान पर 4 mg/mL भंवर द्वारा और 15 मिनट के लिए एक रोटर पर रखकर.
      नोट: थाइमिडीन एनालॉग विषाक्त और हल्के संवेदनशील होते हैं। एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश जोखिम से निपटने और कवर समाधान जब सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (MSDS) का पालन करें।
    2. 4 मिलीग्राम/एमएल एडू समाधान के शरीर के वजन के 4 मिलीग्राम/10 ग्राम पर एडू इंट्रापेरिटोनली को 4 बार हर 2 ज।
      नोट: 50 मिलीग्राम/किलोग्राम से ऊपर की खुराक संतृप्ति स्तर के पास पहुंच जाती है और लेबल की बढ़ती कोशिकाओं की मात्रा में काफी वृद्धि नहीं होगी18. यह महत्वपूर्ण है कि सभी चूहों Edu इंजेक्शन की एक ही राशि प्राप्त के बाद से अनुचित लेबलिंग परिणाम तिरछा कर सकते हैं.

4. ऊतक तैयारी और प्रसंस्करण

  1. पिछले Edu इंजेक्शन के बाद दो घंटे, एक isoflurane कक्ष का उपयोग कर माउस anesthetize जब तक साँस लेने में काफी कम है और यह पूरी तरह से बेहोश है यह सुनिश्चित करने के लिए चुटकी.
  2. सुइयों का उपयोग करके सतह पर माउस को सुरक्षित करें और दिल को उजागर करने वाला एक छोटा सा चीरा बनाएं। बाएं ओरटा में 25 जी सुई डालें और यकृत ऊतक को मंजूरी मिलने तक 1 डिग्री 4 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर फॉस्फेट बफर ेड नमकीन (पीबीएस) समाधान के साथ ट्रांसकार्डियल पर्साइसन के लिए दाएं वेंट्रिकल को काट दें।
  3. मस्तिष्क के ऊतकों को ठीक करने के लिए परफ्यूजन समाधान को 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) पर स्विच करें और लगभग 15 डिग्री 20 एमएल पर डाल दें।
    नोट: परफ्यूजन प्रक्रिया पर अधिक विस्तृत निर्देश पण एट अल19में पाया जा सकता है. जब ठीक से किया जाता है तो पशु झटके देखे जाएंगे।
  4. बड़ी कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर सिर निकालें और फिर खोपड़ी से मस्तिष्क को मुक्त करने के लिए सावधान चीरों की एक श्रृंखला प्रदर्शन करते हैं। फिक्सिंग जारी रखने के लिए रात भर 4% पीएफए में 4 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क के ऊतकों को स्टोर करें।
  5. 4% पीएफए समाधान से मस्तिष्क के ऊतकों को निकालें और पीबीएस में 10% सुक्रोज समाधान में जगह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए ऊतक cryoprotect. फिर अनुभागिंग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर एक और 24 एच के लिए एक 30% sucrose पीबीएस समाधान के लिए ऊतक हस्तांतरण।
    नोट: माइक्रोटोम सेक्शनिंग के लिए तैयार होने पर मस्तिष्क के ऊतक सुक्रोज में डूब जाएंगे। मस्तिष्क ऊतक 30% sucrose में लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है.
  6. एक माइक्रोटोम का उपयोग करते हुए 40 डिग्री मीटर वर्गों में मस्तिष्क ऊतक कोकोनली धारा। dentate gyrus के शुरू में शुरू वर्गों लीजिए, के बारे में -1.20 मिमी bregma से, और समाप्त होने के बाद थाली पहले खंड सबसे पूर्वकाल जा रहा है और पिछले अनुभाग के साथ पूरा हो गया है सबसे पीछे जा रहा है. सही डीजी और शुरू ऊतक संग्रह निर्देशांक की पहचान करने के लिए एक माउस मस्तिष्क एटलस से परामर्श करें।
  7. प्रत्येक अनुभाग को 6 की पंक्तियों में एंटीफ्रीज़ समाधान से भरी 48 अच्छी प्लेट में संग्रहीत करें (तालिका 1)।
एंटीफ्रीज समाधान एथिलीन-ग्लाइकोल 150 एमएल + सुक्रोज 150 ग्राम + 500 एमएल 0.1 एमएल पीबी के लिए 500 एमएल के लिए भरें
साइट्रेट बफर साइट्रिक एसिड स्टॉक के 9 एमएल + 41 एमएल त्रि-सोडियम साइट्रेट बफर + 450 एमएल डीडीएच2हे
साइट्रिक एसिड स्टॉक [0.1 एम] साइट्रिक एसिड 21 g/1 L ddH2हे
त्रि-सोडियम साइट्रेट स्टॉक [0.1 एम] त्रि-सोडियम साइटेट 29.4 ग्राम/1 एल डी डी एच2हे
Tris बफर्ड Saline -Triton (टीबीएस -Triton) 0.05% 100-x Triton टीबीएस में
Permeabilization बफर 0.5% 100-x Triton टीबीएस में
बफ़र ब्लॉक कर रहा है 10 एमएल टीबीएस-ट्रिटन में 0.33 एमएल गधा सीरम
एडू रिएक्शन समाधान [0.1 M] त्रिस पीएच 8.5 के 4 एमएल समाधान में CuSO4[5H2O) की 1 मिलीग्राम जोड़कर एक CuSO4[5H2O) बनाइए। फिर ऊतक पर आवेदन करने से पहले 600 डिग्री सेल्सियस एलेक्सा488-अजीदे समाधान के 1:40और एल-ना+ एसकोरबेट के 10 मिलीग्राम/एमएल को शामिल करें।

तालिका 1: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए उपयोग किए गए समाधान।

5. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. बुनियादी चल प्रोटोकॉल
    नोट: यदि दाग नेस्टिंग, अनुभाग 5.1 को छोड़ दें और अनुभाग 5.2 पर जाएँ. बुनियादी अस्थायी प्रोटोकॉल Tbr2 या doublecortin (DCX) के लिए ही थाइमिडीन अनुरूप Edu धुंधला बिना है.
    1. एक 48 अच्छी तरह से थाली में सीरियल क्रम में Tris-buffered नमकीन (टीबीएस) के लिए antifreeze समाधान से अनुभागों स्थानांतरण।
    2. टीबीएस-ट्रिटन (0.05% टीबीएस-ट्रिटन, टेबल 1) में दो बार वर्गों को धोएं, जबकि धीमी गति से या रॉकर पर हर बार समाधान को बढ़ाकर 5 मिनट के लिए।
    3. धीमी गति से हिलते समय 20 डिग्री 30 मिनट के लिए permebilization बफर (0.5% टीबीएस-ट्रिटन, तालिका 1) का उपयोग कर वर्गों permeabilize।
    4. टीबीएस-ट्रिटन के 10 एमएल में 0.33 डिग्री सेल्सियस गधे के सीरम को जोड़कर अवरुद्ध बफर बनाएं। ताजा बनाने के लिए और 3 दिनों के भीतर का उपयोग करें।
    5. Aspirate permeabilization बफर और कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट से 1 एच के लिए बफर अवरुद्ध में इनक्यूबेट वर्गों।
    6. बफर अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान बनाओ और प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ने के लिए. सभी ऊतक खंडों के लिए 500 डिग्री सेल्सियस/अच्छी तरह से पूरी तरह से जलमग्न होने के लिए पर्याप्त है। एक रॉकर या शेकर पर आरटी में रात भर इनक्यूबेट करें।
    7. Aspirate समाधान और प्राथमिक एंटीबॉडी के निशान को दूर करने के लिए प्रत्येक 10 मिनट के लिए टीबीएस-ट्रिटन 3x में वर्गों कुल्ला।
    8. एक रॉकर पर आरटी में 2 एच के लिए बफर समाधान को अवरुद्ध करने में तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी के खिलाफ फ्लोरोफोर संयुग्मी माध्यमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट।
    9. टीबीएस-ट्रिटन में प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x को धोएं और फिर 4$,6-diamidino-2-फेनिलिनो(DAPI) समाधान (300 डिग्री सेल्सियस पर समाधान) पीबीएस में 15 मिनट के लिए पतला में वर्गों को इनक्यूबेट करें।
    10. पीबीएस में वर्गों 3x धोने और एक सकारात्मक आरोप लगाया स्लाइड पर पूर्वकाल से पीछे करने के लिए सीरियल आदेश बनाए रखने वर्गों माउंट। आरटी में ऊतक को तब तक सूखने दें जब तक नमी दिखाई न दे, आमतौर पर लगभग 2-5 मिनट, बढ़ते मीडिया के साथ कवर करने से पहले।
  2. एंटीजन पुनः प्राप्ति
    नोट: यह अनुभाग केवल नेस्टिंग के लिए आवश्यक है. यदि धुंधला नेस्टिंग, थाइमिडीन एनालॉग धुंधला (अनुभाग 5.3) से पहले इस अनुभाग को निष्पादित करें। Edu के साथ Tbr2 या DCX धुंधला के लिए छोड़ें.
    1. पीबीएस में ऊतक वर्गों प्लेस और एक सकारात्मक आरोप स्लाइड पर 5 "8 वर्गों माउंट पूर्वकाल से पीछे करने के लिए सीरियल आदेश को बनाए रखने. आरटी में ऊतक वर्गों को पूरी तरह से स्लाइड का पालन करने के लिए सूखा दें, जिसमें लगभग 2 डिग्री 5 मिनट का समय लगता है। ऊतक को नमी के अभाव में स्पष्ट रूप से अनुपस्थित होना चाहिए।
    2. एक कंटेनर में साइट्रेट बफर (सारणी 1) तैयार करें, आमतौर पर 1,000 एल पिपेट टिप बॉक्स।
    3. एक माइक्रोवेव ओवन में गर्मी साइट्रेट बफर (1,000 डब्ल्यू) 5 मिनट के लिए जब तक समाधान उबल रहा है. जबकि समाधान हीटिंग है, एक 20-स्लाइड ग्लास स्लाइड धारक में घुड़सवार वर्गों जगह है। 5 मिनट के बाद, ध्यान से पिपेट बॉक्स में वर्गों के साथ स्लाइड धारक जगह है।
    4. 50% के लिए माइक्रोवेव ओवन शक्ति सेट और 7 मिनट के लिए समय पकाना. 7 मिनट के लिए एक टाइमर शुरू और माइक्रोवेव देखो. इन 7 मिनट के दौरान, माइक्रोवेव बंद करो जब समाधान उबाल शुरू होता है और उबलते बंद हो जाता है के बाद माइक्रोवेव जारी है.
      नोट: इस चरण का लक्ष्य पानी के तापमान को उबलते तापमान के ठीक नीचे 7 मिनट तक रखना है। टाइमर समाप्त होने के बाद भी बंद करें, भले ही माइक्रोवेव पर कुक का समय समाप्त न हो। अधिक विस्तृत निर्देश हुसैनी एट अल20में पाया जा सकता है.
    5. साइट्रेट बफर और ऊतक स्लाइड के साथ गर्म बॉक्स बाहर ले लो और शांत करने के लिए एक बर्फ बाल्टी में जगह है। बर्फ या अन्य सामग्री समाधान में प्रवेश करने से रोकने के लिए कवर. के बारे में 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें या जब तक समाधान को छूने के लिए शांत है.
    6. थाइमिडीन एनालॉग का उपयोग करते हुए 5.3.2 यदि थाइमिडीन एनालॉग का उपयोग करते हैं, तो थाइमिडीन एनालॉग दाग करने के लिए आगे बढ़ें।
  3. थायमिडीन अनुरूप धुंधला
    नोट: यहाँ शुरू अगर धुंधला Edu और Tbr2 या Edu और DCX.
    1. पीबीएस में ऊतक वर्गों प्लेस और एक सकारात्मक आरोप स्लाइड पर 5 "8 वर्गों माउंट पूर्वकाल से पीछे और एक ही अभिविन्यास के लिए सीरियल आदेश को बनाए रखने. ऊतक वर्गों सूखी पूरी तरह से स्लाइड का पालन करें और फिर एक हाइड्रोफोबिक कलम या पीएपी कलम का उपयोग कर एक सीमा आकर्षित करने के लिए करते हैं।
    2. permeabilize वर्गों permeabilization बफर के साथ (0.5% टीबीएस-ट्रिटन) के लिए 20 $30 मिनट. फिर 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस-ट्रिटन का उपयोग कर वर्गों 2x धोने।
      नोट: Permeabilization एड्स intracellular एंटीबॉडी प्रवेश. Permeabilization समय ऊतक मोटाई और एंटीबॉडी दक्षता के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक permebilization शक्ति को बढ़ाने के लिए डिटर्जेंट एकाग्रता में वृद्धि कर सकते हैं. हालांकि, देखभाल भी लंबे समय के लिए permeabilize नहीं करने के लिए लिया जाना चाहिए के बाद से ऊतक कमजोरी लंबे समय तक permeabilization समय के साथ बढ़ जाती है.
    3. तालिका 1के अनुसार ईदु अभिक्रिया समाधान तैयार की। Alexa488-azide के अंतिम एकाग्रता Edu प्रतिक्रिया समाधान के 1 एमएल में 15 डिग्री सेल्सियस है.
    4. 30 मिनट से 1 एच के लिए ईदु प्रतिक्रिया समाधान में इनक्यूबेट अनुभागों और फिर 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस-ट्रिटन में 3x धोएं। इस कदम के बाद प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में स्लाइड को कवर करें। इस स्तर पर जांच अगर Edu प्रतिक्रिया एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके काम करता है. एडू लेबल कोशिकाओं एक एपिफ्लोरेसी माइक्रोस्कोप के तहत फ्लोरेसेस होगा।
  4. माउंटेड ऊतक अनुभाग प्रोटोकॉल
    1. ब्लॉक ऊतक वर्गों चरण 5.3.4 से एक स्लाइड पर घुड़सवार माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही जानवरों में उठाया बफर अवरुद्ध का उपयोग कर, उदाहरण के लिए, गधा सीरम, 30 मिनट से 1 एच के लिए और फिर टीबीएस-ट्रिटन में 2x धोने के लिए प्रत्येक 5 मिनट.
    2. 1:200 पर बफर समाधान को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण द्वारा अवरुद्ध कदम के दौरान प्राथमिक एंटीबॉडी (यानी, चिकन विरोधी nestin) समाधान तैयार करें। 250 डिग्री प्रति स्लाइड यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है कि ऊतक समाधान में पूरी तरह से जलमग्न हो जाए।
    3. एक प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में एक प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में रात भर में इनक्यूबेट ऊतक वर्गों आरटी में अवरुद्ध washes के बाद. उपयोग किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी के आधार पर इस चरण को संशोधित करें.
      नोट: यदि एंटीबॉडी में उच्च पृष्ठभूमि या गैर-विशिष्ट बाइंडिंग है, तो आरटी के बजाय 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग परिणामों में सुधार कर सकती है। गरीब ऊतक प्रवेश के साथ एंटीबॉडी 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ दिया जा सकता है अगर जरूरत है.
    4. अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए टीबीएस-ट्रिटन में 3x इनक्यूबेट ऊतक वर्गों। फिर फ्लोरोफोर संयुग्मी माध्यमिक एंटीबॉडी में ऊतक वर्गों को इनक्यूबेट करें (यानी, एलेक्सा 647 एंटी-चिकन 1:00 पर) आरटी में 2 एच के लिए बफर समाधान को अवरुद्ध करने में तैयार किया गया।
    5. अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी को हटाने और आरटी में 15 मिनट के लिए पीबीएस में 1:100 पर 300 डिग्री एम DAPI समाधान लागू करने के लिए 5 मिनट के लिए टीबीएस-ट्रिटन में 3x इनक्यूबेट ऊतक वर्गों।
    6. अतिरिक्त DAPI को हटाने और एक कपास झाड़ू या एक नाजुक कार्य पोंछे का उपयोग कर ऊतक के आसपास से पैप पेन सर्कल को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए पीबीएस में ऊतक वर्गों 3x इनक्यूबेट ऊतक। वर्गों सूखी और फिर बढ़ते मीडिया और कवर पर्ची लागू करते हैं. इमेजिंग स्लाइड से पहले बढ़ते मीडिया को सूखने दें।

6. छवि संग्रह

  1. स्लाइड लेबलों और छवि को कवर करके नियंत्रण समूहों से अंधा प्रयोगात्मक समूहों एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर डीजी के एक ही पक्ष (सामग्री की तालिका) 40x तेल आवर्धन ऑप्टिकल लेंस के साथ 1 डिग्री मीटर कदम आकार या एक 20x 2x ज़ूम पर 1 डिग्री मीटर.
    नोट: 40x तेल आवर्धन वृद्धि संकल्प दे देंगे, लेकिन 20x 2x ज़ूम से अधिक समय ले.
  2. 40x करने के लिए उद्देश्य लेंस सेट और फिर confocal सॉफ्टवेयर में ऊपरी बाएँ कोने पर पता लगाने टैब पर क्लिक करें ( सामग्रीकीतालिका) और देखने के क्षेत्र के बीच में वांछित डीजी अनुभाग सेट.
  3. डीजी का पता लगाएँ, ऊपरी बाएँ कोने में अधिग्रहण टैब पर स्विच करें, और निम्न बॉक्स की जाँच करें: $-स्टैक, टाइलस्कैन, और स्थिति।
  4. चैनल सेटिंग्स 600 के बीच सेट करें 750 लाभ, 1% $15% लेज़र तीव्रता, और 1 "10 ऑफ़सेट. चैनलों में से किसी के लिए 20% लेजर तीव्रता से अधिक नहीं है। लाभ और तीव्रता सेट करते समय सुनिश्चित करें कि कोई पिक्सेल अधिक संतृप्त नहीं होता है।
    नोट: इन श्रेणियों का उपयोग किया और धुंधला दक्षता उपकरणों की दक्षता के आधार पर अलग अलग होंगे.
  5. टाइल स्कैन विंडो में 3 ऊर्ध्वाधर द्वारा 7 क्षैतिज करने के लिए टाइल सेट और वर्तमान में इस्तेमाल किया जा रहा लोगों के रूप में एक ही सेटिंग्स का उपयोग कर स्कैन अवलोकन छवि दबाएँ। उदाहरण के लिए, 3 ऊर्ध्वाधर और 2x ज़ूम के साथ 20x उद्देश्य द्वारा 7 क्षैतिज का उपयोग करें।
  6. अवलोकन स्कैन के बाद डीजी पूरी तरह से अपेक्षित छवि के भीतर है कि सुनिश्चित करें। यदि नहीं, तो डीजी के दृश्य को समायोजित जब तक यह अवलोकन छवि में पूरी तरह से है क्योंकि यह एक प्रतिनिधि छवि है कि एक प्राप्त हो जाएगा.
  7. ठीक ध्यान घुंडी का उपयोग कर अलग -स्टैक के माध्यम से स्क्रॉल करके इमेजिंग गहराई सेट करें। सुनिश्चित करें कि पूरे डीजी शुरू और अंत बिंदुओं के भीतर है। 1 डिग्री मीटर के चरण आकार को मानते हुए, प्रत्येक छवि लगभग 40 चरण होनी चाहिए.
  8. द्वि-दिशात्मक स्कैनिंग और अधिग्रहण मोड विंडो में कोई औसत के साथ 9 करने के लिए स्कैनिंग गति सेट करें। फिर स्थिति विंडो में स्थिति जोड़ें.
    नोट: एक बार में कई DGs छवि के लिए चरण 6.3 $6.8 दोहराएँ. स्कैन की गति में वृद्धि छवि गुणवत्ता को कम करती है, लेकिन समग्र इमेजिंग समय कम कर देता है. छवि गुणवत्ता बहुत कम है, तो स्कैन की गति को कम करने या औसत वृद्धि।
  9. तैयार होने पर प्रयोग प्रारंभ करें बटन क्लिक करें. पूर्वकाल से पश् च अक्ष के साथ प्रति माउस DG के 5 खंडों को स्कैन करें। उदाहरण के लिए, यदि बाएँ DG अनुभाग एक के लिए छवि है, छवि अगले सबसे पीछे छोड़ दिया डीजी अनुभाग दो के लिए.
  10. confocal सॉफ्टवेयर में प्रक्रिया टैब के तहत सिलाई सुविधा का उपयोग कर dentate gyrus की एक पूरी छवि बनाने के लिए एक साथ अलग छवियों सिलाई. वैकल्पिक रूप से, एक पूर्ण दंते gyrus बनाने के लिए छवियों को एक साथ सिलाई करने के लिए FIJI (ImageJ) का उपयोग करें।
  11. परिमाणीकरण के लिए सिले हुए चित्र सहेजें.

7. छवि विश्लेषण

  1. एक अधिकतम प्रक्षेपण के रूप में और चैनलों के साथ एक समग्र छवि के रूप में एक समग्र छवि का उपयोग कर प्रत्येक दंतेत gyrus अनुभाग के प्रत्येक छवि खोलें आसानी से colocalization कल्पना करने के लिए अलग अलग रंग में विलय कर दिया।
  2. बहुभुज चयन उपकरण (बाएं से तीसरा बॉक्स) का उपयोग कर अधिकतम प्रक्षेपण छवि के प्रत्येक अनुभाग के लिए डीजी के क्षेत्र को मापने और प्रत्येक माउस के प्रत्येक अनुभाग के लिए रिकॉर्ड. यह घनत्व की गणना करने के लिए प्रयुक्त डीजी का क्षेत्र होगा।
  3. समग्र छवि है कि colocalizing प्राथमिक एंटीबॉडी (यानी, नेटिन) और थाइमिडीन अनुरूप Edu, plugins के तहत पाया FIJI प्लगइन सेल काउंटर का उपयोग करके से डीजी में कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड ] विश्लेषण [ सेल काउंटर ] सेल काउंटर| इसके अतिरिक्त, एक रेडियल प्रक्रिया के साथ Edu धनात्मक और नेस्तनाबूद सकारात्मक कोशिकाओं की कुल संख्या रिकॉर्ड.
    नोट: नेटिन के मामले में, आकृति विज्ञान पर ध्यान देना बहुत महत्वपूर्ण है। यदि तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित, सुनिश्चित करें कि केवल एक रेडियल प्रक्रिया के साथ कोशिकाओं मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. जब डेंटेट gyrus वर्गों की मात्रा निर्धारित, सभी के लिए एक ही मापदंड लागू होते हैं, खासकर जब एक फोकल विमान के बाहर कोशिकाओं visualizing. यदि कोशिकाओं फोकल विमान के भीतर नहीं हैं, उन्हें गिनती नहीं है. स्टीरियोलॉजिकल परिमाणीकरण पर अधिक विस्तृत निर्देशों के लिए कृपया पश्चिम एट अल21 देखें।
  4. बाद में विश्लेषण के लिए डेटा के सभी टुकड़ों को संकलित करने के लिए स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में कक्ष गणना एँ दर्ज करें.
  5. प्रत्येक अनुभाग में प्रत्येक अनुभाग के लिए कुल मात्रा से colocalized कोशिकाओं की कुल संख्या विभाजित करके प्रत्येक अनुभाग के लिए colocalized कोशिकाओं के घनत्व की गणना. उदाहरण के लिए, एक जानवर में डीजी आयतन के योग से नेस्तनाबूद+/edu+ कोशिकाओं के योग को विभाजित करके स्टेम सेल घनत्व प्राप्त कीजिए। यह मानते हुए कि प्रत्येक चरण 1 $m है, कुल $-चरण वृद्धि के साथ क्षेत्र को गुणा करके प्रत्येक अनुभाग की मात्रा की गणना करें.
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, कुल चरण 40 के करीब होने चाहिए, क्योंकि ऊतक को 40 डिग्री मीटर पर काट दिया गया है। यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक जानवर एक डेटा बिंदु है क्योंकि इस दृष्टिकोण का लक्ष्य एक हिप्पोकैम्पस के एक गोलार्द्ध में सहस्थानीयीकृत कोशिकाओं की कुल मात्रा का अनुमान लगाना है।
  6. प्रश्न के लिए अतिरिक्त आवश्यक परिकलन निष्पादित करें जो पता करने का प्रयास कर रहा है. इस उदाहरण में, proliferating कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना, कुल स्टेम सेल जनसंख्या, और contralateral काई कोशिकाओं उत्तेजक के बाद स्टेम कोशिकाओं proliferating के प्रतिशत.

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के बाद (चित्र 1A,बी), हम हिप्पोकैम्पस के भीतर neurogenic आला पर contralateral मॉजी सेल अनुमानों उत्तेजक के प्रभाव का निर्धारण करने में सक्षम थे. 5-HT2A क्रे-लाइन लेबलिंग एक काई सेल लेबलिंग के साथ युग्मित एक क्रे-निर्भर जीक्यू-युग्मित उत्तेजक DREADD वायरस का उपयोग करके, हम चुनिंदा contralateral डीजी पर काई कोशिकाओं से उत्तेजक अनुमानों को सक्रिय करने में सक्षम थे और निर्धारित किया है कि मजबूत काई सेल उद्दीषं प्रर्षं स्टेम सेल ंसिंहं (चित्र १च) हमने ऊतक के विश्लेषण से पहले सटीक वायरल डिलीवरी की पुष्टि की (चित्र 2क, बी)। इसके अतिरिक्त, हमने सी-फॉस इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रयोगों (डेटा नहीं दिखाया गया) के माध्यम से काई कोशिकाओं के सक्रियण की पुष्टि की। अनुचित वायरल इंजेक्शन के मामले में, आगे के विश्लेषण से पशु को बाहर। एक अनुचित इंजेक्शन एक है कि वांछित निर्देशांक को लक्षित करने में विफल रहता है, वांछित क्षेत्र के बाहर अभिव्यक्ति के सबसे अधिक है, या कोई वायरल वितरण के लिए थोड़ा है. इस प्रयोग के लिए, डीजी की पहाड़ी में काई कोशिकाओं का इरादा लक्ष्य थे, और अगर इंजेक्शन hilus के बाहर थे, वे बाहर रखा गया. 5.2 और 5.3 अनुभागों में उल्लिखित नेस्तनाबूद दाग के लिए एक थाइमिडीन एनालॉग, एडू, और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति का उपयोग करके, हम सफलतापूर्वक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को बढ़ा-प्रसार करने के लेबल करने में सक्षम थे (चित्र 3क)। इसके अतिरिक्त, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति कदम omitting द्वारा, अनुभाग 5.2, हम Tbr2 सकारात्मक तंत्रिका जनक और neuroblast लेबल करने में सक्षम थे, और DCX सकारात्मक neuroblast और अपरिपक्व न्यूरॉन्स (चित्र 3A). हम परिमाणित क्षेत्र का एक उदाहरण प्रदर्शित करते हैं और घनत्व की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है और किसी स्लाइड पर माउंटेड ऊतक का एक उदाहरण प्रदान करते हैं (चित्र3ठ और चित्र 4क)। इसके अतिरिक्त, प्रायोगिक अनुगमों के संदर्भ केरूप में सफल तथा उप-पार दोनों प्रयोग प्रदान किए जाते हैं (चित्र 4ठ)। अंत में, वहाँ कई अलग अलग परिमाणीकरण है कि एक सफल प्रयोग से प्राप्त किया जा सकता है (चित्र 5A-D)15. परिमाणीकरण में तंत्रिका स्टेम सेल (नेस्टिन+/Edu+/volume), बढ़ते तंत्रिका स्टेम सेल (Nestin+/Edu+/total nestin), कुल प्रसारित कोशिकाओं (Edu+/volume) और कुल स्टेम सेल पूल (Nestin+/volume) का घनत्व शामिल है। ). एक काई कोशिकाओं के contralateral उत्तेजना पर, तंत्रिका स्टेम सेल प्रसार में कमी देखी गई थी. इसी तरह के परिमाणों उचित एंटीबॉडी का उपयोग करके तंत्रिका संतति और अपरिपक्व न्यूरॉन्स के लिए प्राप्त किया जा सकता है.

Figure 1
चित्र 1: वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के परख सर्किट विनियमन के लिए प्रायोगिक दृष्टिकोण. (क) प्रोटोकॉल में उल्लिखित विभिन्न चरणों का प्रतिनिधित्व करते हुए Schematic. (बी) कृन्तकों में काई कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किए जाने वाले प्रायोगिक अभिगमका समयरेखा। (ग) उत्तेजना के लिए इंजेक्शन योजनाबद्ध लक्ष्यcontralateral काई कोशिकाओं. (घ) उपकणीय क्षेत्र (एसजीजेड), कणिका सेल परत (जीसीएल) में वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के विकासात्मक वंश की योजना, और आण्विक परत (एमएल) जिसमें विभिन्न विकासात्मक चरणों में प्रयुक्त संगत एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। विभिन्न विकासात्मक चरणों में या तो शांत या सक्रिय रेडियल न्यूरल स्टेम सेल (एनएससी), तंत्रिका संतति (एनपी), न्यूरोब्लास्ट (एनबी), अपरिपक्व ग्रेन्युल सेल (जीसी), और परिपक्व जीसी शामिल हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रभावी वायरल वितरण का प्रदर्शन. (ए) सटीक वायरल डिलीवरी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों। वायरल कण एक मची फ्लोरोसेंट लेबल व्यक्त करते हैं जो हिलस (सफेद बॉक्स्ड क्षेत्र) में काई कोशिकाओं को लक्षित करते हैं। डीएपीआई सेल नाभिक को लेबल करता है। सटीक वायरल वितरण की छवि पक्ष contralateral इंजेक्शन पक्ष से स्पष्ट काई फाइबर अनुमानों को दर्शाता है. (बी) लक्ष्य वायरल इंजेक्शन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों। ध्यान दें कि इस मामले में contralateral काई फाइबर छवि पक्ष में अनुपस्थित रहे हैं. स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और संतति का प्रसार का विश्लेषण. (ए) थाइमिडीन एनालॉग एडू की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवियों को विशिष्ट सेल चरण मार्कर नेस्टिंग (न्यूरल स्टेम सेल और संतति), Tbr2 (न्यूरल स्टेम सेल, न्यूरल संतति), और डीसीएक्स (न्यूरोब्लास्ट, अपरिपक्व न्यूरॉन्स) के साथ कोलोलोफिलिंग सफेद तीर सिर. स्केल बार - 10 डिग्री उ. () घनत्व की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेन्टेट gyrus के भीतर क्षेत्र का प्रतिनिधि माप। स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: इम्यूनोफ्लोरेसेंस तैयारी का प्रदर्शन। (क) पूर्वकाल से पश् चपश्य अक्ष तक माउंटेड ऊतक खंडों के त्रिविमीय पृथक्करण का प्रदर्शन करता है। लाल बॉक्स पक्ष छवि को दर्शाता है. (ख) न्यूरोनल वंश मार्करों के लिए सफल और उप-परिरक्षण प्रयोगों का प्रदर्शन। स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: काई कोशिकाओं के विपरीत पक्षसक्रियण तंत्रिका स्टेम सेल प्रसार कम हो जाती है. (क) दंतिका जिरस में नेस्टिन+/ईदु + कोशिकाओं के इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री परिमाणीकरण contralateral मॉसी कोशिकाओं की उत्तेजना के बाद प्रसार में कमी प्रदर्शित करते हैं। (बी) सक्रिय contralateral काई कोशिकाओं के साथ समूह में बढ़ते तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के प्रतिशत में कमी. (ग) किसी भी समूह में तंत्रिका स्टेम सेल घनत्व में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ था। (घ) दंतेतर जाइरस में कोशिकाओं के उत्पादक स्तरों में कोई परिवर्तन नहीं हुआ है. मानों का प्रतिनिधित्व करने का अर्थ है - माप की मानक त्रुटि। p ;lt; 0.05 (n $ 3 नियंत्रण के लिए, n $ 5 hM3D समूह के लिए). यह आंकड़ा ये एट अल15से अनुकूलित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य का आकलन कैसे विशिष्ट तंत्रिका सर्किट जोड़ तोड़ इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री तकनीकों की एक श्रृंखला का उपयोग कर विवो में वयस्क हिप्पोकैम्पस neurogenesis को नियंत्रित करता है. विशिष्ट तंत्रिका सर्किट द्वारा मध्यस्थता वयस्क neurogenesis के गतिविधि पर निर्भर विनियमन गतिविधि पर निर्भर तंत्रिका सर्किट की एक विविध रेंज का अध्ययन करने के लिए संशोधनों के लिए महान क्षमता के साथ एक मूल्यवान तकनीक है. प्रयोगों के इन प्रकार की सफलता सटीक वायरल वितरण, वांछित हेरफेर के लिए उचित वायरल चयन, एक थाइमिडीन एनालॉग के उचित वितरण, पशु उम्र, इम्यूनोस्टेनिंग दक्षता, सफल सहित कई कारकों पर निर्भर करता है ट्रांसकार्डियल perfusions, और छवियों की निष्पक्ष परिमाणीकरण. उदाहरण के लिए, गलत वायरल वितरण लक्ष्य प्रभाव है कि एक phenotype प्रश्न में सर्किट से असंबंधित में परिणाम बंद हो सकता है. इसके अतिरिक्त, कम गुणवत्ता इम्यूनोफ्लोरेसी तकनीक वर्तमान कोशिकाओं की सही संख्या को छुपा सकती है और इसलिए एक फीनोटाइप का उत्पादन कर सकती है जो जैविक रूप से प्रासंगिक नहीं है। एक और बहुत ही महत्वपूर्ण कारक को नियंत्रित करने के लिए चूहों की उम्र है जब प्रयोगों प्रदर्शन, विचार है कि वयस्क neurogenesis उम्र निर्भर22है . अंत में, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक वर्ग निष्पक्ष रूप से रन बनाए हैं। पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, एक व्यवस्थित दृष्टिकोण लें और यह सुनिश्चित करें कि स्कोरिंग करने वाला व्यक्ति रूपात्मक जानकारी का उपयोग करके वयस्क एनएससी विकास के चरणों की पहचान करने में कुशल है। इसके अतिरिक्त, अंधा दोनों नियंत्रण और उपचार समूहों और छवि परिमाणीकरण के बाद अपनी पहचान प्रकट करते हैं. पूर्वाग्रह को कम करने के लिए एक अतिरिक्त उपाय के रूप में, दो अलग अलग व्यक्तियों मनाया परिणामों को मान्य करने के लिए एक ही डेटा सेट मात्रा निर्धारित कर सकते हैं.

वयस्क एनएससी और नवजात संतान के सर्किट गतिविधि निर्भर विनियमन का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण के साथ जुड़े कई सीमाएं हैं। पहली सीमा यह है कि इस दृष्टिकोण एक सर्किट है कि प्रश्न में सर्किट जोड़ तोड़ से एनएससी पर समग्र प्रभाव मध्यस्थता के भीतर विशिष्ट सेल प्रकार के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है. इसका मतलब यह है कि हालांकि वयस्क NSCs पर एक phenotypic प्रभाव हो सकता है, प्रभाव एक या कई मध्यवर्ती सेल प्रकार के माध्यम से अभिनय किया जा सकता है. इस चिंता को संबोधित करने के लिए एक कारगर तरीका बिचौलियों नीचे पिन करने के लिए electrophysiology के साथ इन अध्ययनों जोड़ी है. इस प्रोटोकॉल का एक अतिरिक्त सीमा या तो एक विशिष्ट Cre माउस (5-HTR2A) लाइन या एक वायरल निर्माण (AAV5-camKII-hM3d-mcherry) है कि वांछित सर्किट को लक्षित कर सकते हैं की आवश्यकता है. यदि एक प्रभावी सेल विशिष्ट Cre माउस लाइन ब्याज के एक सवाल के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं है, इस सर्किट का अध्ययन करने की क्षमता तेजी से मुश्किल हो जाता है. हालांकि, मस्तिष्क में कई सेल प्रकार Cre विशिष्ट माउस लाइनों है. इस प्रोटोकॉल का एक कम सीमा एक प्रभावी निष्क्रिय ligand के रूप में CNO से संबंधित है. हाल ही में, अध्ययनों से पता चला है कि CNO, निष्क्रिय रासायनिक DREADDs को सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया, clozapine को metabolizes, जो व्यवहार phenotypes23पैदा कर सकता है. हालांकि, पता करने के लिए एक कुशल तरीका प्रत्येक प्रयोग में उचित नियंत्रण शामिल करने के लिए है। उचित नियंत्रण का एक उदाहरण दोनों एक CNO और DREADD नियंत्रण, जहां CNO एक नियंत्रण रिपोर्टर वायरस (AAV5-DIO-mCherry) के साथ संयोजन में प्रशासित किया जाता है, और एक लवण केवल नियंत्रण जहां कोई CNO एक रिपोर्टर वायरस समूह के लिए प्रशासित है शामिल हैं. इन नियंत्रणों को शामिल करके, केवल CNO के प्रभाव अलग किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक माध्यमिक निष्क्रिय ligand C21 के रूप में जाना जाता है, हाल ही में कोई प्रदर्शन व्यवहार प्रभाव24के साथ इसी तरह की प्रभावकारिता और शक्ति है प्रदर्शन किया गया है. अंत में, इस प्रोटोकॉल की अंतिम सीमा CNO की मात्रा को नियंत्रित कर रही है जो प्रत्येक जानवर प्रयोग के दौरान उपभोग करता है. विभिन्न जानवरों अलग डिग्री पर CNO युक्त पानी पीते हैं और इसलिए वयस्क neurogenesis पर प्रभाव की एक श्रृंखला हो सकती है. सामान्य तौर पर, एक माउस एक 24 ज अवधि में CNO पानी के बारे में 4 एमएल पीने के लिए जाता है. इसका मतलब यह है कि की एकाग्रता में 1 mg/200 एमएल जानवरों की कुल प्राप्त 0.02 प्रति दिन CNO की मिलीग्राम जो एक एकल CNO खुराक की मात्रा के बराबर है intraperitoneally इंजेक्शन. यदि समय पर CNO के युग्मित प्रशासन एक चिंता का विषय है, intraperitoneal इंजेक्शन के लिए स्विचन एक बेहतर विकल्प हो सकता है.

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने का लाभ वयस्क neurogenesis नियमन जब हासिल की विशिष्टता की डिग्री है. पिछले neurogenesis अध्ययन व्यवस्थित प्रशासित औषधीय agonist या विरोधी सर्किट घटकों को मॉड्युलेट करने के लिए उपयोग किया है. इन गैर विशिष्ट जोड़तोड़ phenotypic मतभेद का उत्पादन लेकिन वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल विनियमन में शामिल तंत्र के बारे में थोड़ा अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल आसानी से वयस्क neurogenesis पर विभिन्न सर्किट व्यापक प्रभाव की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक निरोधात्मक DREADD करने के लिए स्विच करके, या एक बार में एक या एक से अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करके, एक वयस्क neurogenesis के सर्किट विशिष्ट विनियमन को समझने के लिए सवालों की एक सरणी पूछ सकते हैं. पिछले दृष्टिकोण पर इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने का एक और लाभ यह है कि, एक nestin एंटीबॉडी का उपयोग फ्लोरोसेंट इनकोडिंग तंत्रिका स्टेम सेल पत्रकारों जैसे नेस्टिंग:GFP के रूप में transgenic पशु प्रजनन समाप्त, दक्षता में वृद्धि और प्रति समय को कम करने प्रयोग8| इसके अलावा, इस तकनीक को सीमित कृंतक हैंडलिंग जब CNO प्रशासन, जो प्रयोगों के दौरान कृंतक तनाव कम कर देता है. तनाव-संवेदी प्रक्रियाओं का अध्ययन करते समय तनाव को कम करना महत्वपूर्ण है। अंत में, इस दृष्टिकोण को आसानी से एक व्यवहार परख शामिल करने के लिए संशोधन है, उदाहरण के लिए, अगर एक पूछ अगर contralateral मॉसी सेल सर्किट है कि NSCs modulates भी स्थानिक सीखने या तनाव लचीलापन में एक भूमिका निभाता है में रुचि रखते थे.

मुख्य तकनीकी कठिनाई जब इस दृष्टिकोण का उपयोग कर सटीक वायरल वितरण है. एक कुशल कृंतक सर्जन बनने अभ्यास लेता है और महत्वपूर्ण समस्या निवारण ले जा सकते हैं. इसलिए वायरल टिटर, लेबलिंग दक्षता, और वायरल प्रसार का परीक्षण करने के लिए पायलट प्रयोगों की एक श्रृंखला करने की सलाह दी जाती है। हमने पाया है कि कुछ serotypes अलग फैल पैटर्न है और यह कि AAV2 serotype AAV5 या AAV8 से कम फैलता है. इसके अतिरिक्त, यह इन प्रयोगों में से प्रत्येक के लिए एक विश्वसनीय वायरल पैकेजिंग प्रदाता के लिए सबसे अच्छा है. पायलट सर्जरी प्रदर्शन करके, इन चिंताओं के कई संबोधित किया जा सकता है और एक समय बचा सकता है. यह भी सिफारिश की है कि एक परीक्षण अलग CNO सांद्रता को प्रोत्साहित या वांछित सर्किट को बाधित करने के लिए. सामान्य में, 1 मिलीग्राम/kg पर्याप्त रूप से परीक्षण किया सर्किट सक्रिय होगा, लेकिन कुछ सेल प्रकार के अधिक या कम CNO की आवश्यकता हो सकती है. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि CNO प्रशासन की खुराक कुछ सर्किटों को विशेष रूप से प्रभावित कर सकती है जब कुछ को देखते हुए जैसे काई कोशिकाओं15.

इस प्रोटोकॉल के वैकल्पिक अनुप्रयोगों एक साथ व्यवहार परीक्षण, वैकल्पिक सर्किट के मॉडुलन, और neurogenesis सुविधाओं के अतिरिक्त विश्लेषण शामिल हैं. व्यवहार परीक्षण करने के लिए, एक वर्णित प्रोटोकॉल का पालन कर सकता है और CNO प्रशासन के बाद, एक विशिष्ट व्यवहार कार्य, इस तरह के एक उपन्यास स्थान परख, या एक स्थानिक नेविगेशन कार्य के रूप में प्रदर्शन. इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि एक भी प्रयोग दोनों व्यवहार और सर्किट विशिष्ट जानकारी है कि एक सर्किट विशिष्ट व्यवहार phenotype के लिए नेतृत्व कर सकता उपज होगा. वैकल्पिक सर्किट को मॉड्युलेट करने के लिए, एक अलग क्रे लाइनों और वायरल सदिशों के संयोजन का उपयोग कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, यदि एक अधर tegmental क्षेत्र से डोपामाइनर्जिक न्यूरॉन्स बाधा को समझने में रुचि रखते थे (VTA) या VTA वयस्क neurogenesis modulates, एक एक tyrosine hydroxylase Cre माउस लाइन का उपयोग करें और एक क्रे निर्भर hM4D (निवारक) इंजेक्ट कर सकते हैं वयस्क neurogenesis के डोपामाइनर्जिक विशिष्ट विनियमन निर्धारित करने के लिए VTA में खूंखार वायरस. इस दृष्टिकोण का उपयोग वैकल्पिक मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए संभावनाएं विशाल हैं और रणनीतिक सम्मोहक तंत्रिका सर्किट पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, इस दृष्टिकोण एक वयस्क neurogenesis के अतिरिक्त चरणों की जांच करने की अनुमति देता है. उदाहरण के लिए एक कैसे उत्तेजक काई कोशिकाओं arborization या अपरिपक्व न्यूरॉन्स के डेन्ड्रिटिक लंबाई को प्रभावित करता है समझने के लिए चाहता था, एक एक समान प्रोटोकॉल का पालन करेंगे, लेकिन इस तरह के शोल विश्लेषण के रूप में वैकल्पिक विश्लेषण प्रदर्शन.

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल एक विस्तृत कदम दर कदम प्रक्रिया प्रदान करता है परख सर्किट गतिविधि वयस्क NSCs और neurogenesis के विषय में निर्भर विनियमन के माध्यम से DREADD प्रौद्योगिकी. इस प्रोटोकॉल की ताकत आसानी से सर्किट विशिष्ट वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल विनियमन के बारे में सवालों की एक विशाल रेंज को संबोधित करने के लिए संशोधित किया जा करने की क्षमता में निहित है. संकुल नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता है (CRISPR) प्रौद्योगिकी की प्रगति के साथ, यह अब सेल विशिष्ट Cre माउस लाइनों उत्पन्न करने के लिए परिष्कृत वायरल निर्माण के साथ जोड़ी के लिए तेजी से जटिल सवालों का समाधान आसान है इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता का विस्तार.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

L.J.Q. विविधता अनुपूरक R01MH111773 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक T32 प्रशिक्षण अनुदान T32NS007431-20. इस परियोजना NIH (MH111773, AG058160, और NS104530) से जे एस को दिए गए अनुदान से समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 Well Plate Thermo Fisher Scientific 07-200-84
48 Well Plate Denville Scientific T1049
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) Carbosynth NE08701
Alcohol 70% Isopropyl Thermo Fisher Scientific 64-17-5
Alcohol Prep Pads Thermo Fisher Scientific 13-680-63
Alexa-488 Azide Thermo Fisher Scientific A10266
Anti-Chicken Nestin Aves NES; RRID: AB_2314882
Anti-Goat DCX Santa Cruz Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494
Anti-Mouse Tbr2 Thermo Fisher Scientific 14-4875-82; RRID: AB_11042577
Betadine Solution (povidone-iodine) Amazon
Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) Sigma-Aldrich 251275
Clozapine N- Oxide Sigma-Aldrich C08352-5MG
Confocal Software (Zen Black) Zeiss Microscopy Zen 2.3 SP1 FP1 (black)
Copper (II) Sulfate Pentahydrate Thermo Fisher Scientific AC197722500
Cotton Swabs Amazon
Coverslip Denville Scientific M1100-02
Delicate Task Wipe Kimwipes Kimtech Science 7557
Drill Bit 0.5 mm Fine Science Tools 19007-05
Ethylene Glycol Thermo Fisher Scientific E178-1
Hamilton Needle 2 inch Hmailton Company 7803-05
Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN Hmailton Company Ref: 87931
High Speed Drill Foredom 1474
Infusion Pump Harvard Apparatus 70-4511
Injectable Saline Solution Mountainside Health Care NDC 0409-4888-20
Insulin Syringe BD Ultra-Fine Insulin Syringes
Isoflurane Henry Schein 29405
Stereotax For Small Animal KOPF Instruments Model 942
Leica M80 Leica
Leica Microtome Leica SM2010 R
LSM 780 Zeiss Microscopy
Nair (Hair Removal Product) Nair
Paraformaldahyde 4% Sigma-Aldrich 158127
Plus Charged Slide Denville Scientific M1021
Phosphate Buffered Solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010031
Puralube Vet Ointment Puralube
Slide Rack 20 slide unit Electron Microscopy Science 70312-24
Slide Rack holder Electron Microscopy Science 70312-25
Small Animal Heating Pad K&H
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Super PAP Pen 4 mm tip PolySciences 24230
Surgical Scalpel MedPride 47121
Tris Buffered Solution (TBS) Sigma-Aldrich T5912
Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) Sigma-Aldrich C8532
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Tweezers Amazon
Vet Bond Tissue Adhesive 3M 1469SB

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References

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