منهاج متجه لينتيفيرال الكفاءة في تقديم أدوات تحرير ابيجينومي إلى الإنسان الناجمة عن نماذج المرض المستمدة من الخلايا الجذعية Pluripotent

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

واستهدفت epigenome الحمض النووي يمثل تحرير نهج علاجية قوية. يصف هذا البروتوكول إنتاج وتنقية، وتركيز ناقلات لينتيفيرال الكل في واحد إيواء التحوير كريسبر-dCas9-DNMT3A لتطبيقات تحرير ابيجينومي في الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسك)-المستمدة من الخلايا العصبية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tagliafierro, L., Ilich, E., Moncalvo, M., Gu, J., Sriskanda, A., Grenier, C., Murphy, S. K., Chiba-Falek, O., Kantor, B. Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models. J. Vis. Exp. (145), e59241, doi:10.3791/59241 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ويمثل استخدام الخلايا المشتقة من هيبسك نهجاً قيماً لدراسة أمراض الأعصاب البشرية. وهنا، يمكننا وصف بروتوكولا أمثل للتفريق بين هيبسكس المستمدة من مريض مع تريبليكاتيون موضع الجينات (سنكا) ألفا سينوكلين في مرض باركنسون (PD)-السكان العصبية تتميز ذات الصلة. تتراكم الأدلة أظهرت أن مستويات عالية من سنكا المسببة لتطوير النادي واعترافاً بالحاجة غير المستوفاة إنشاء نهج علاجية جديدة لشعبة المشتريات، وبخاصة تلك التي تستهدف تنظيم التعبير سنكا ، ونحن وضعت مؤخرا كريسبر/dCas9 الحمض النووي-مثلايشن-نظام يستند ابيجينيتيكالي تعدل النسخ سنكا بإثراء مستويات مثلايشن في المنطقة التنظيمية إنترون 1 سنكا . لتسليم النظام، تتألف من القتلى الإصدار (المعطلة) من Cas9 (dCas9) تنصهر مع المجال الحفاز من 3A الإنزيم ميثيلترانسفيراسي الحمض النووي (DNMT3A)، يستخدم ناقل لينتيفيرال. هذا النظام يطبق على الخلايا التي تحتوي تريبليكيشن محور سنكا ويقلل من سنكا-مرناً ومستويات البروتين بحوالي 30% من خلال مثلايشن الحمض النووي المستهدف من سنكا إنترون 1. Downregulation صقل مستويات سنكا تنقذ تعمل الخلوية المتعلقة بالمرض. في البروتوكول الحالي، ونحن نهدف إلى وصف إجراء خطوة بخطوة للتفرقة بين هيبسكس في الخلايا العصبية السلف (الشخصيات)، وإنشاء والتحقق من صحة من فحوصات بيروسيكوينسينج لتقييم الشخصية مثلايشن في سنكا إنترون 1. لإنشاء مخطط تفصيلي بمزيد من التفصيل في منظومة lentivirus-كريسبر/dCas9 المستخدمة في هذه التجارب، يصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج وتنقية وتركيز ناقلات لينتيفيرال وتسليط الضوء على ملاءمتها لاستخدام تطبيقات تحرير ابيجينومي والجينوم هيبسكس والشخصيات. البروتوكول قابل للتكيف بسهولة ويمكن استخدامها لإنتاج لينتيفيروسيس عيار عالية لتطبيقات في المختبر والمجراه.

Introduction

تم وضع منصات متعددة تحرير epigenome مؤخرا لاستهداف أي تسلسل الحمض النووي في المناطق التي تتحكم في الجينات التعبير1،2. صممت أدوات تحرير epigenome الذي تم إنشاؤه ل (ط) تنظيم النسخ و (ثانيا) تغيير التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال، (ثالثا) تعديل مثلايشن الحمض النووي و (رابعا) تعدل التفاعلات العنصر التنظيمي. النهج لربط معدلات النسخ/الكروماتين إلى Cas9 (ميتا) المعطلة (dCas9) التي أثيرت من قبل منصات التحرير epigenome المتقدمة، مثل الزنك الإصبع البروتينات (زفبس) والنسخ الشبيهة بالمنشط المستجيبة (حكايات)، إيواء مجال المستجيب النسخي قوية تنصهر (ED) إلى مجال الحمض النووي ملزم المصممة (DBD)3. ويعرف نتائج النمط الظاهري المطلوب مثل التنشيط أو القمع الجزيء المستجيب ترتكز المكاني الذاتية (الشكل 1). لإنشاء وسائل تفعيل الترانسكربتي القابلة للبرمجة، ترتبط وحدات dCas9/جرنا VP164،،من56 (الشكل 1A)، مجال تنشيط فيروسية المجندين "بول الثاني" وآلات النسخ العام. وشمل تعديل هذا النظام VP64، تيترامير VP16 المجالات، توفير إطار حتى أكثر قوة تفعيل5،معدل6. وقد استخدمت بنجاح النظام لتنشيط مناطق الترميز وفضله باستهداف العناصر التنظيمية والمروجين. الأهم من ذلك، على الرغم من أن الجزيئات VP64 مباشرة لا تقم بتعديل هيكل الكروماتين في المنطقة المستهدفة، من المجندين المعدلات الكروماتين الذي ربط النتائج في ترسب علامات النشطة (يوتشروماتين)، بما في ذلك ك acetylation H3/H4 و H3-K4 دي/ مثلايشن ثلاثي5،6. بالإضافة إلى VP64، وقد تم المربوطة الوحيدات p65 المجمع NF-κB البشرية إلى الوحدة النمطية dCas9/جرنة7. من المثير للاهتمام، يؤدي الربط هذه المستجيبة لمناطق المنبع لمواقع بدء النسخ (تحديد) وداخلها المروجين تحريض جينات قوية. ومع ذلك، يمكن أيضا ممارسة المستجيبة VP64 و p65 آثار أكتيفاتوري حين ارتباطها بالمناطق الواقعة أسفل النهر لتحديد وفي معززات القاصي7،8. للحصول على رد النسخي أكثر قوة، اندماج dCas9-VP64 أو dCas9-p65 متعددة بحاجة إلى تجنيد لهدف واحد موضع9،10. على هذا النحو، أدت التطورات الأخيرة في تفعيل الجيل القادم، التي تقوم بتجنيد العديد من المجالات المستجيب بمجمع جرنة dCas9 واحد، مثل سونتاج، أقوى تنشيط القدرة مقارنة ب نظرائهم الانصهار dCas9-VP6411 , 12-تم الحصول على تنشيط النسخي محسنة من خلال الدمج بين VP64، p65، و "هيئة الطرق والمواصلات" (VPR)، مجال transactivation من أشعة غاما-هيربيسفيروسيس، إلى ج-المحطة dCas913 (الشكل 1A). وقد وضعت نظم كريسبر/dCas9 مماثلة للقمع محددة الهدف (الشكل 1B).

يمكن تحقيق القمع الجينات الذاتية مع اندماج قامع هندسيا من خلال مجموعة متنوعة من الآليات (الشكل 1B). وقد ثبت أن نظم كريسبر/dCas9، مرتبطة قامع دبد (حتى بدون مجال المستجيب/s)، يمكن إسكات كفاءة التعبير الجيني في حين المربوطة إلى مروج أو المنبع/المتلقين للمعلومات-خدمات الدعم التقني مناطق3،6 ،14. آثار على النسخ بسبب تدخل الفراغية النسخ عامل ربط وتجهيز بوليميريز الحمض النووي الريبي. على الرغم من ذلك، يلزم اتباع نهج أكثر شمولاً، كما القمع الجينات بعائق الفراغية وحدها في كثير من الأحيان لا تكفي لإسكات صوت قوي. تطوير الجيل القادم من كواتم الصوت الأخيرة استناداً إلى نظم كريسبر/dCas9 تقل معدلات هيستون قامع النسخي المجالات (تردس)، (دي H3-K9-/مثلايشن ثلاثي، H3-K27 دي--/ثلاثي-مثلايشن؛ H3-K36 دي--/ثلاثي-مثلايشن، ديسيتيلاتيون H3/H4)، والحمض النووي (البد) مثلايشن أدت إلى بناء أدوات جينية السماح أكثر قوة إسكات آثار4،5،،من1516، 17،18،،من1920. وقد ثبت أن توظيف هذه المعدلات جينية للحمض النووي قد يؤدي إلى تشكيل أكثر الكروماتين المغلقة والمكثفة، التي عادة ما تولد من أقوى إسكات نتائج21،22. هو المجال الأكثر شيوعاً إسكات المستخدمة مع دبدس4،مربع المرتبطة كربل (KRAB)5. وقد ثبت توظيف عامل لتتوافق مع التغييرات الكروماتين؛ ومع ذلك، آليات هذه التعديلات بعد أن أوضحت16،،من1718. في الآونة الأخيرة، فقد ثبت أن إضفاء الطابع المحلي على KRAB للحمض النووي يمكن أن تعزز الجمعية methyltransferase هيستون SETDB1 والمجمعات نورد هيستون ديسيتيليشن (هداك)، مما يوحي بإمكانية أن هذه التفاعلات التوسط من أجل تشكيل التكثيف الكروماتين وإسكات النسخي3،13. كنهج بديل، يمكن أن تنصهر فيها المجالات المستجيب دبدس لخلق بروتين إسكات جينية مخصصة. مباشرة يحفز هذا النظام القمعي علامات الحمض النووي أو تعديلات هيستون.

في الآونة الأخيرة، قد تم أغراض أخرى استخدام نظم كريسبر/dCas9 الاصطناعية المربوطة للانزيم DNMT3A للتعطيل النسخي. DNMT3A يحفز مثلايشن الحمض النووي التي تمارس القمع النسخي في جميع أرجاء تشكيل heterochromatin على مروجي الجينات الذاتية والأخرى18،المناطق التنظيمية (الشكل 1B)20. وكانت ماكدونالد et al.18 وفويتا et al.20 الكتاب الأول التقرير أن مثلايشن الحمض النووي يمكن أن تستخدم لإسكات الجينات epigenome أو القمع، مما يدل على أن النظام الانصهار تسليم بلازميد dCas9-DNMT3A يمكن أن يعزز حقاً مثلايشن السيتوزين حول خدمات الدعم التقني من18،20. ماكدونالد وزملاء العمل أظهرت أن توظيف الاستراتيجية قد يؤدي انخفاض كبير (حوالي 40%) في جين ورم القامع، مستويات مرناً CDKN2A 18. وبالمثل، يظهر استهداف منطقة المروج أونميثيلاتيد الجينات باخ أو IL6ST مثلايشن البد المتزايدة التي قد تم يرتبط بانخفاض مزدوج في التعبير الجيني20. لدينا مختبر قد مؤخرا إعادة توجيه الغرض منه استخدام مثلايشن الحمض النووي لتخفيف النتائج المرضية من سنكا أوفيريكسبريشن (الشكل 2)23. ترتكز الاستراتيجية على تعزيز انتقائية في مثلايشن الحمض النووي داخل منطقة إنترون 1 سنكا ، كما أفيد سابقا أن يكون هيبوميثيلاتيد في شعبة المشتريات والخرف مع ليفي الهيئات (دلب) العقول24،25، 26. ارتبط هذا هيبوميثيليشن overexpression سنكا ، وهكذا تقدم هدفا جذاباً للتدخل العلاجي24،،من2728. نحن مؤخرا قد أظهرت انخفاض مستوى الحمض النووي مثلايشن في إنترون سنكا 1 المنطقة في الشخصيات تتميز المستمدة من هيبسك التي تم الحصول عليها من مريض PD مع تريبليكيشن سنكا 23. وميزة هذا النموذج التجريبي هو أن الشخصيات يمكن نشر قوة في الثقافة أو زيادة متباينة في الخلايا العصبية الناضجة، مما يتيح فحص كفاءة تحديد العوامل الوراثية التي تتوسط تعمل الخلوية، بما في ذلك عنصر مؤكسد الإجهاد والمبرمج29. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا النظام النموذجي العلماء تلخيص الأحداث التنموية التي حدثت قبل ظهور الأعراض في المرضى. وبالإضافة إلى ذلك، تمثل الشخصيات المستمدة من هيبسك أداة عظيمة لاختبار مسارات الخلوية والجزيئية المرتبطة بالتعبير الجيني. الأهم من ذلك، الشخصيات المستمدة من هيبسك جنبا إلى جنب مع الدولة من أحدث التكنولوجيا كريسبر/Cas9-ابيجينومي يمكن أن يسهل وضع "المخدرات الجيل القادم" للعديد من أمراض الأعصاب.

لتقليل مستويات مرضية للتعبير سنكا، وضعنا مؤخرا نظام قائم على لينتيفيروس تحمل البروتين الانصهار dCas9-DNMT3A، وجرنة بالتحديد الهدف البد مثلايشن داخل إنترون سنكا 1 (الشكل 2A)23. وسيصف هذا البروتوكول متجه لينتيفيرال (LV) التصميم والإنتاج بالتفصيل. LVs تمثل وسيلة فعالة لتوصيل المكونات كريسبر/dCas9 لعدة أسباب، إلا وهي إدراج (ط) قدرتها على تحمل الحمض النووي الضخمة، (الثاني) كفاءة عالية لمجموعة واسعة نطاق من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الفاصل سواء نونديفيدينج30 ترانسدوسينج ، (ثالثا) وقدرتها على حمل ردود السامة للخلايا ومكسبه الحد الأدنى. في الآونة الأخيرة، ونحن تطبيق النظام LV تتميز هيبسك المستمدة من الخلايا العصبية من مريض مع تريبليكيشن محور سنكا وأظهر إمكانات LVs العلاجية لتقديم ابيجينومي--تحرير أدوات مثلايشن23 ( الشكل 2B). في الواقع، يؤدي نظام LV-جرنة/dCas9-DNMT3A زيادة كبيرة في مثلايشن الحمض النووي في منطقة إنترون 1 سنكا . يقابل هذه الزيادة مع انخفاض مستويات سنكا مرناً والبروتين23. وعلاوة على ذلك، تنقذ downregulation سنكا المتعلقة بالمشتريات تعمل في سنكا تريبليكيشن/هيبسك-مشتقة تتميز الخلايا العصبية (مثل المتقدرية روس إنتاج الخلية من الناحيتين)23. الأهم من ذلك، أثبتنا أن التخفيض في التعبير سنكا بالنظام LV-جرنة-dCas9-DMNT3A قادر على عكس تعمل التي هي سمة مميزة للخلايا العصبية تتميز هيبسك المستمدة من مريض PD قاموا سنكا تريبليكيشن، مثل روس المتقدرية الإنتاج وخلية بقاء23. والهدف من هذا البروتوكول هو 1) لتحديد البروتوكول للإنتاج وتركيز منصة LV الأمثل لتوليد الأعمال التحضيرية الفيروسية تيتيريد عالية و 2) لوصف التفريق بين هيبسكس إلى الشخصيات منقوشة لتصبح ناضجة تتميز 31،الخلايا العصبية32 وتوصيف مستويات مثلايشن المنطقة المستهدفة داخل سنكا إنترون 1.

منصات لينتيفيرال لها ميزة كبيرة على منصة ناقلات الأكثر شعبية، إلا وهي المرتبطة بالغدد ناقلات (آفس)، الذي هو في السابق القدرة على استيعاب أكبر إدراج الوراثية33،34. آفس يمكن أن تتولد في غلات أعلى بكثير ولكن تملك قدرة تغليف منخفضة (< 4.8 كيلو بايت)، المساس باستخدامها لإيصال نظم كريسبر/Cas9 الكل في واحد. وهكذا، يبدو أن LVs المنصة الاختيار في التطبيقات المشتركة في تقديم أدوات كريسبر/dCas9. ولذلك، سوف يكون البروتوكول الواردة هنا أداة قيمة للباحثين ورغبة منها في فعالية تسليم المكونات ابيجينومي--تحرير الخلايا والأجهزة. ويحدد البروتوكول كذلك الاستراتيجية الرامية إلى زيادة قدرات الإنتاج والتعبير لناقلات المرض عن طريق تعديل في رابطة الدول المستقلة من العناصر داخل ناقلات التعبير كاسيت30،35. وتقوم الاستراتيجية على الرواية النظام المتقدمة ودراستها في المختبر لدينا ويسلط الضوء على قدرته على إنتاج الجزيئات الفيروسية في نطاق/mL الوحدات الفيروسية (فو)10 1030،35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-نظام تصميم وإنتاج فيروس

  1. بلازميد التصميم والبناء
    ملاحظة: يتم تنفيذ بناء متجه LV-جرنة-dCas9-DNMT3A-الكل في واحد باستخدام إنتاج-والتعبير التعبير الأمثل كاسيت نشرتها أورتينسكي et al.30. كاسيت ناقلات تحمل تكرار الموقع التعرف على عامل النسخ حزمة الخدمة Sp1 وحذف الدولة من الفن داخل غير مترجمة (U3 ') المنطقة من طرفية 3' دام تكرار (لاتينية) (الشكل 2A)30،36. ناقلات العمود الفقري قد وجد أن تكون فعالة في إيصال والإعراب عن30،Cas9 كريسبر/35.
    1. الحصول على إصدار التنشيط (الميت) SpCas9 (dCas9) عن طريق موقع الموجه الطفرات (البيانات لا تظهر). يستعاض عن استنساخ إيواء الطفرات D10A و H840A في مجالات الحفاز HNH وروفك إنزيم، على التوالي، مع Cas9 النشطة في pBK30129 من تبادل بين الأجزاء يجئ-بامهي (الشكل 3).
    2. تستمد المجال الحفاز DNMT3A pdCas9-DNMT3A-اجفب (انظر الجدول للمواد) بتضخيم DNMT3A في الجزء 5 بامهي-429/R '-جاجكجاتكككككتكككج-3' 5 بامهي-429/L '-كتكتككاكتجككجاتككج-3' (الشكل 3). لتوسيع المنطقة التي تحتوي على DNMT3A، استخدام الشروط التالية: (1) 95 درجة مئوية مقابل 60 s، (2) 95 درجة مئوية لمدة 10 ق، (3) 60 درجة مئوية 20 s، (4) 68 درجة مئوية ل 60 س. كرر الشروط 2 إلى 4 30 x. للتمديد النهائي، استخدام 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وعقد 4 درجات مئوية.
    3. استنساخ جزء DNMT3A، يهضم إنزيم تقييد بامهي، في موقع بامهي pBK301 تعديل مكافحة ناقلات تحمل dCas9. التحقق من الاستنساخ قبل مباشرة سانغر التسلسل. علما أن بلازميد وادي إلى المرافئ التحوير dCas9-DNMT3A-p2a-بوروميسين. بلازميد تعرب عن سقالة جرنا من مروج U6 البشري (الشكل 3).
    4. استبدال الجينات مراسل بوروميسين بالبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) لإنشاء dCas9-DNMT3A-p2a-التجارة والنقل. هضم dCas9-DNMT3A-p2a-بورو بلازميد مع فسيي. تنقية جزء متجه على استخدام أسلوب تنقية هلام. إعداد الإدراج بهضم pBK201a (بلينتي-التجارة والنقل) مع فسيي. استنساخ جزء فسيي داخل المتجهة. PBK539 بلازميد وادي إلى المرافئ التحوير dCas9-DNMT3A-p2a-التجارة والنقل (الشكل 3).
  2. استزراع خلايا HEK-293T وطلاء الخلايا تعداء
    ملاحظة: الكلي الجنينية البشرية 293T تستزرع خلايا (HEK-293T) في الجلوكوز عالية كاملة تعديل دولبيكو المتوسطة النسر (دميم؛ 10% مصل العجل البقري، 1 x مضاد حيوي فطري، بيروفات صوديوم x 1، 1 x غير الأساسية من الأحماض الأمينية، 2 مم L-الجلوتامين) عند 37 درجة مئوية مع 5% أول أكسيد الكربون 2. من المستحسن لإمكانية تكرار نتائج البروتوكول، لاختبار مصل العجل عند التبديل إلى الكثير/مجموعة مختلفة. ما يصل إلى ستة 15 سم تحتاج لوحات لإنتاج لينتيفيرال.
    1. استخدام خلايا المرور منخفضة لبدء ثقافة جديدة (أقل من مرور 20). حالما تصل الخلايا إلى التقاء 90%-95%، نضح وسائط الإعلام وغسله برفق مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
    2. إضافة 2 مل التربسين-يدتا (0.05%) واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. لإلغاء تنشيط الكاشف الانفصال، إضافة 8 مل كاملة عالية-الجلوكوز دميم، وماصة 10 x x-15 مع ماصة 10 مل مصلية لإنشاء تعليق خلية واحدة من 4 × 106 خلايا/مل.
    3. ترانسفيكشنز، معطف لوحات 15 سم مع الجيلاتين 0.2%. إضافة 22.5 مل من الجلوكوز عالية متوسطة والبذور الخلايا عن طريق إضافة 2.5 مل تعليق خلية (مجموع ~ 1 × 107 خلايا/اللوحة). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 حتى يتم التوصل إلى التقاء 70% – 80%.
  3. تعداء الخلايا HEK-293T
    1. إعداد 2 × الحل مخزنة بس بب س و كاكل 1 م2، وفقا فيجايراغافان وكانتور35. تصفية الحلول بتمريرها من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية. مزيج تعداء يجب أن تكون واضحة قبل به، بالإضافة إلى الخلايا. إذا كان هذا المزيج يصبح غائم أثناء الحضانة، إعداد x BBS 2 جديدة (الرقم الهيدروجيني = 6.95).
    2. لإعداد مزيج بلازميد، استخدم والبلازميدات أربعة كما هو موضح (المزيج التالي غير كافية للوح واحد 15 سم): 37.5 ميكروغرام ناقل كريسبر/dCas9-نقل (pBK492 [DNMT3A-بورو-لا-جرنة] أو pBK539 [DNMT3A-التجارة والنقل-لا-جرنة])؛ 25 ميكروغرام من pBK240 (psPAX2)؛ 12.5 ميكروغرام من pMD2.G؛ 6.25 ميكروغرام من برسف-رؤيا (الشكل 4 أ). حساب حجم والبلازميدات استناداً إلى التركيزات وإضافة الكميات المطلوبة في أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة ميليلتر 312.5 م 1 كاكل2 وإحضار وحدة التخزين النهائي إلى 1.25 مل، عقيمة ح دد2"سين بلطف" باستخدام إضافة 1.25 مل 2 حل x BBS حين فورتيكسينج هذا المزيج. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أصبحت جاهزة تعداء الخلايا مرة واحدة هم روافد 70% – 80%.
    3. نضح وسائط الإعلام واستبدله 22.5 مل دميم عالية-الجلوكوز الطازجة دون المصل. إضافة 2.5 مل المخلوط تعداء dropwise لكل لوحة 15 سم. دوامة اللوحات واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 2 – 3.
    4. بعد ح 3، إضافة 2.5 مل (10%) من المصل للوحة الواحدة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    5. في اليوم الأول بعد تعداء، مراقبة الخلايا للتأكد من أنه لا يوجد أي أو موت الخلية الحد الأدنى وأن الخلايا تشكل ثقافة المتلاقية (100%).
      1. تغيير وسائط الإعلام عن طريق إضافة 25 مل من الطازجة عالية-الجلوكوز دميم و 10% مصل لكل لوحة.
    6. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 48.
  4. حصاد الفيروس
    1. جمع المادة طافية من كافة الخلايا ترانسفيكتيد وتجمع لهم في أنابيب مخروطية 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 400-450 x ز للحد الأدنى 10 تصفية المادة طافية من خلال وحدة تصفية فراغ 0.45 ميكرومتر. وبعد الترشيح، ويمكن الاحتفاظ بالمادة طافية في 4 درجات مئوية للتخزين القصير الأجل (تصل إلى 4 أيام). للتخزين على المدى الطويل، إعداد مختبرين وتخزينها في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: الاستعدادات الفيروسي نونكونسينتراتيد من المتوقع أن تكون ~ 2 × 107 إلى 3 × 107 فو/مليلتر (راجع المقطع 1.5 لتحديد عيار). ينصح بتحضير مختبرين تستخدم مرة واحدة، منذ عدة دورات تجميد أذاب سوف يؤدي إلى فقدان 10% – 20% في التتر الوظيفية.
  5. تركيز الجزيئات الفيروسية
    ملاحظة: للتنقية، يقوم الأسلوب المزدوج-السكروز خطوتين تشمل سكروز تدرج خطوة وخطوة وسادة سكروز (الشكل 4 باء).
    1. لإنشاء تدرج سكروز، تعد هذه الأنابيب المخروطية تنبيذ فائق بالترتيب التالي: 0.5 مل من محلول السكروز 70% في برنامج تلفزيوني 1 x، 0.5 مل من محلول السكروز 60% في 1 مل من محلول السكروز 30% في دميم دميم و 2 مل من محلول السكروز 20% في برنامج تلفزيوني 1 x.
    2. إضافة المادة طافية، التي تم جمعها ووفقا للفرع 1-4، بعناية، للتدرج. نظراً لحجم إجمالي التي تم جمعها من أربع لوحات 15 سم 100 مل، استخدم ستة تنبيذ فائق أنابيب لمعالجة المادة طافية الفيروسية.
    3. توزيع متساو المادة طافية الفيروسية بين كل أنبوبة تنبيذ فائق. لتجنب الكسر الأنبوبة أثناء الطرد المركزي، ملء أنابيب تنبيذ فائق إلى مالا يقل عن ثلاثة-الرابعة وقدرتها في الحجم الإجمالي. تحقيق التوازن بين الأنابيب مع برنامج تلفزيوني 1 x. الطرد المركزي هذه العينات في 70,000 س ز 2 ح في 17 درجة مئوية.
      ملاحظة: للحفاظ على طبقة السكروز أثناء خطوات التسارع والتباطؤ، تسمح ultracentrifuge التعجيل ببطء ويتباطأ الدوار من 0 إلى 200 × ز ومن 200 إلى 0 x ز خلال أول وآخر 3 دقائق من الدوران، على التوالي.
    4. بلطف بجمع الكسور السكروز 30%-60% في أنابيب نظيفة (الشكل 4 باء). إضافة 1 × برنامج تلفزيوني (الباردة) يصل إلى 100 مل حجم الإجمالي. مزيج من بيبيتينج عدة مرات.
    5. بعناية، التجهيزة إعداد الفيروسية على وسادة سكروز بإضافة 4 مل من محلول السكروز 20% (في 1 x PBS) إلى الأنبوبة. مواصلة طريق بيبيتينج ~ 20 – 25 مل من محلول الفيروسية لكل أنبوبة. ملء الأنابيب مع برنامج تلفزيوني 1 x إذا كان حجم محتوياتها أقل من الرابعة وثلاثة كل أنبوب. موازنة الأنابيب بعناية. أجهزة الطرد المركزي في 70,000 س ز ح 2 في 17 درجة مئوية. إفراغ المادة طافية وعكس الأنابيب على مناشف ورقية للسماح بباقي السائل إلى استنزاف.
    6. إزالة جميع السائل بحذر يسفط السائل المتبقية. لاحظ أنه، في هذه الخطوة، والكريات المحتوية على الفيروس مرئية بالكاد كبقع صغيرة شفافة. إضافة 70 ميليلتر من 1 x برنامج تلفزيوني للأنبوب الأول ريسوسبيند بيليه. دقة "الماصة؛" التعليق ونقله إلى الأنبوب القادم حتى يتم حراكه جميع الكريات.
    7. غسل الأنابيب مع ميليلتر 50 إضافية 1 × برنامج تلفزيوني ومزيج قبل. علما بأن حجم تعليق نهائي في هذه الخطوة، هو ميليلتر ~ 120 ويظهر قليلاً من درب التبانة. للحصول على تعليق واضح، المضي قدما في استخدام الطرد المركزي s 60 في 10,000 س ز. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وجعل 5 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: الاستعدادات متجه لينتيفيرال حساسة بدورات متكررة للتجميد والذوبان. وباﻹضافة إلى ذلك، اقترح أن الخطوات المتبقية يتم القيام به في احتواء زراعة الأنسجة أو في مكان مخصص للمناطق المؤهلة من حيث كونها في مستويات كافية من معايير السلامة البيولوجية (الشكل 4 باء).
  6. التحديد الكمي التتر الفيروسية
    ملاحظة: تقدير التتر الفيروسية تتم باستخدام الأسلوب الإنزيم (إليزا) المرتبط بالانزيم الممتز p24 (p24اسكت أليسا) ووفقا "برنامج لقاح الإيدز المعاهد الوطنية للصحة" (NIH) البروتوكول لفيروس نقص المناعة البشرية-1 p24 "مستضد التقاط المقايسة" مع تعديلات طفيفة.
    1. استخدم 200 ميليلتر من 0.05% توين 20 x 1 الباردة في برنامج تلفزيوني (برنامج تلفزيوني-T) لغسل آبار صفيحة 96-جيدا 3 x.
    2. لمعطف اللوحة، استخدم 100 ميليلتر من جسم [مونوكلونل] مكافحة-p24 المخفف في 1:1,500 في برنامج تلفزيوني 1 x. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    3. إعداد كاشف الحظر (1% البقري الزلال [جيش صرب البوسنة] في برنامج تلفزيوني 1 x) وإضافة 200 ميليلتر لكل بئر لتجنب الربط غير محدد. استخدم 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-T لغسل x 3 جيد لح 1 على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    4. المضي قدما في إعداد عينة. عند العمل مع ناقل تتركز الأعمال التحضيرية، تضعف الموجه في 1: 100 باستخدام 1 ميليلتر من العينة وميليلتر 89 ح دد20 10 ميليلتر من Triton X-100 (بتركيز نهائي 10%). للتحضير نونكونسينتراتيد، يؤدي إلى تمييع العينات في 01:10.
    5. الحصول على فيروس نقص المناعة البشرية-1 المعايير باستخدام إضعاف مسلسل ذات شقين (تركيز انطلاق 5 نانوغرام/مل).
    6. تمييع العينات مركزة (أعد الخطوة 1.6.4) في 1640 RPMI تستكمل مع 0.2% 20 توين و 1% جيش صرب البوسنة للحصول على 01:10، 000، 01:50، 000، وتخفيف 1:250,000. وبالمثل، تمييع العينات نونكونسينتراتيد (أعد الخطوة 1.6.4) في 1640 RPMI تستكمل مع 0.2% 20 توين و 1% جيش صرب البوسنة إقامة 1: 500، 1:2، 500، وتخفيف 1:12,500.
    7. إضافة إلى عينات والمعايير على اللوحة في تريبليكاتيس. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    8. وفي اليوم التالي يغسل الآبار 6 x.
    9. إضافة 100 ميليلتر من جسم p24 مكافحة أرنب [بولكلونل]، تضعف في 1:1,000 في RPMI 1640، 10% مصل بقرى الجنين (FBS) وجيش صرب البوسنة 0.25% والمصل الماوس العادية 2% (المتحف)، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 4.
    10. غسل الآبار 6 x. إضافة الماعز الأرنب المضادة الفجل البيروكسيديز مفتش المخفف في المضيفين في 1640 RPMI تستكمل مع مصل الماعز العادي 5% و 2% NMS، جيش صرب البوسنة 0.25% و 0.01 ٪ 20 توين. احتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
    11. غسل الآبار 6 x. إضافة الركازة البيروكسيديز TMB واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    12. للتوقف عن رد فعل، بإضافة 100 ميليلتر من 1 N HCl. في قارئ ميكروسكوبية، قياس امتصاص 450 نانومتر.
  7. قياس كثافة مراسل نيون
    1. استخدام تعليق الفيروسية للحصول على إضعاف مسلسل إذ (من 10-1 إلى 10-5) في برنامج تلفزيوني 1 x.
    2. لوحة 5 × 105 HEK-293T الخلايا في كل من لوحة 6-جيدا جيدا. تطبيق 10 ميليلتر من كل تمييع الفيروسي على الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 48.
    3. الانتقال إلى الخلية تفعيلها fluorescence الفرز التحليل (نظام مراقبة الأصول الميدانية) على النحو التالي: فصل الخلايا عن طريق إضافة 200 ميليلتر لحل يدتا التربسين 0.05%. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وريسوسبيند لهم في 2 مل متوسطة دميم (بالمصل). جمع العينات في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ز في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة x 1.
    4. إصلاح الخلايا بإضافة 500 ميليلتر من 4% بارافورمالدهيد (PFA) واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. الطرد المركزي في 400 x ز عند 4 درجة مئوية وريسوسبيند بيليه في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. تحليل التعبير التجارة والنقل باستخدام أداة نظام مراقبة الأصول الميدانية، كما هو موضح في أورتينسكي et al.30. لتحديد عيار الوظيفية الفيروسات، استخدم الصيغة التالية.
      Equation 1
      هنا،
      تيراغرام = عدد الخلايا الحاملات للتجارة والنقل؛
      Tn = العدد الكلي للخلايا؛
      N = عدد الخلايا ترانسدوسيد؛
      V = حجم المستخدمة لتوصيل (في ميكروليتيرس).
  8. عد الخلايا الحاملات للتجارة والنقل
    ملاحظة: تحديد تعدد العدوى (وزارة الداخلية) التي يتم استخدامها لتوصيل. اختبار مجموعة واسعة من أشهر (من وزارة الداخلية = 1 إلى وزارة الداخلية = 10).
    1. البذور 3 × 105 إلى 4 × 105 HEK-293T الخلايا في كل من لوحة 6-جيدا جيدا.
    2. عندما تصل إلى الخلايا > التقاء 80%، ترانسدوسي لهم مع الموجه في وزارة الداخلية للفائدة.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2، ورصد إشارة بروتينات فلورية خضراء في الخلايا 1 – 7 أيام.
    4. حساب عدد الخلايا الحاملات للتجارة والنقل. استخدام مجهر فلوري (الهدف 4 x الخطة، 0.1 N.A.، 40 x التكبير) باستخدام عامل تصفية بروتينات فلورية خضراء (الطول الموجي الإثارة = 470 شمال البحر الأبيض المتوسط، والطول الموجي الانبعاثات = 525 نانومتر). استخدام خلايا أونترانسدوسيد إلى مجموعة السكان مراقبة الخلايا السلبية التجارة والنقل.
    5. تستخدم الصيغة التالية لتحديد عيار الوظيفية للفيروس.
      Equation 2
      هنا،
      N = عدد الخلايا الحاملات للتجارة والنقل؛
      D = عامل التخفيف؛
      M = عامل التكبير؛
      V = حجم الفيروس المستخدمة لتوصيل.
      ملاحظة: حساب النتائج بعد هذا المثال: لعد في إضعاف (د) 10-4 (01:10، 000) في 20 x التكبير (M) في عينة 10 ميليلتر (V) خلايا الحاملات للتجارة والنقل 10 (ن)، ستكون تو في المليلتر (10 × 104) × (20) س (10) × (100) = 2 × 108 فو/مل.

2-التفريق بين الخلايا العصبية السلف تتميز

  1. استزراع هيبسكس
    ملاحظة: هيبسكس من مريض مع تريبليكيشن محور سنكا، ND34391، تم الحصول عليها من "المعهد الوطني للاضطرابات العصبية" و "السكتة الدماغية" (NINDS) الكتالوج (انظر الجدول للمواد).
    1. الثقافة هيبسكس تحت ظروف مستقلة عن التغذية في مستنبت ESC-اللجنة التوجيهية خالية من علبة التغذية بالورق (انظر الجدول للمواد) على غشاء المصفوفة الأساسية مؤهل هيس (بم)-مغلفة بلوحات (انظر الجدول للمواد). أغسل المستعمرات المتلاقية مع 1 مل من DMEM/F12، إضافة 1 مل كاشف الانفصال (انظر الجدول للمواد)، واحتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. نضح الكاشف الانفصال وإضافة 1 مل مستنبت ESC-اللجنة التوجيهية خالية من علبة التغذية بالورق.
    3. كشط لوحة باستخدام رافعة خلايا وريسوسبيند المستعمرات في 11 مل مستنبت ESC-اللجنة التوجيهية خالية من علبة التغذية بواسطة بيبيتينج x-5 4 x باستخدام الماصات البورسليكات.
    4. لوحة 2 مل تعليق مستعمرة على لوحات بم المغلفة ووضع اللوحة عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. قم بتغيير متوسط يومي وتقسيم الخلايا كل 5 – 7 أيام.
  2. التمايز في الخلايا العصبية السلف تتميز
    ملاحظة: التفريق بين هيبسكس داخل الخلايا العصبية السلف تتميز (MD الشخصيات) تتم باستخدام بروتوكول متوسطة التعريفي العصبية متاحة تجارياً كل تعليمات الشركات المصنعة، مع تعديلات طفيفة (32 31، انظر الجدول للمواد). ويعتبر اليوم الأول من التفريق بين اليوم 0. هيبسكس عالية الجودة مطلوبة من أجل كفاءة تمايز العصبية. تحريض من الشخصيات MD بيرفورميدوسينج هيئة امبريويد (المجلس التنفيذي)-على أساس البروتوكول.
    1. قبل البدء بالتفريق بين هيبسكس، إعداد لوحة ثقافة ميكروويل (انظر الجدول للمواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لها.
    2. وبعد إعداد لوحة الثقافة ميكروويل، أضف 1 مل متوسطة التعريفي العصبية (نيم؛ انظر الجدول للمواد) تستكمل مع 10 ميكرون Y-27632.
    3. تعيين اللوحة جانبا حتى جاهزة للاستخدام.
    4. أغسل هيبسكس مع DMEM/F12، أضف 1 مل من محلول مفرزة الخلية (انظر الجدول للمواد)، واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    5. ريسوسبيند الخلايا المفردة في DMEM/F12 والطرد المركزي لهم في 300 x غ لمدة 5 دقائق.
    6. نضح المادة طافية بعناية وريسوسبيند الخلايا في نيم + 10 ميكرون Y-27632 للحصول على تركيز نهائي من 3 × 106 خلايا/مل.
    7. أضف 1 مل تعليق خلية واحدة إلى بئر واحدة للوحة الثقافة ميكروويل والطرد المركزي اللوحة في 100 x ز لمدة 3 دقائق.
    8. فحص لوحة تحت المجهر لضمان توزيع حتى الخلايا بين ميكروويل، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2.
    9. 1 – 4 أيام، إجراء تغيير جزئي متوسط يومي.
    10. استخدام 1 مل ميكروبيبيتي، إزالة 1.5 مل الوسط وتجاهل. ببطء، بإضافة 1.5 مل نيم جديدة دون Y-27632.
    11. كرر الخطوة 2.2.10 حتى يوم 4.
    12. وفي اليوم الخامس، معطف بئر واحدة من صفيحة 6-جيدا مع بم.
    13. ضع مصفاة عكسها 37 ميكرون (انظر الجدول للمواد) على رأس أنبوب مخروطي 50 مل (النفايات). نقطة السهم من مصفاة عكسها نحو الأعلى.
    14. إزالة المتوسطة من لوحة الثقافة ميكروويل دون إزعاج الحديدية المشكلة.
    15. أضف 1 مل من DMEM/F12 وعلى الفور جمع الحديدية مع ماصة البورسليكات وتصفية لهم من خلال المصفاة.
    16. كرر الخطوة 2.2.15 حتى تتم إزالة جميع الحديدية من لوحة الثقافة ميكروويل.
    17. عكس في المصفاة عبر أنبوب مخروطي 50 مل جديدة وإضافة 2 مل نيم جمع جميع الحديدية.
    18. لوحة 2 مل تعليق اجتماع المجلس التنفيذي في بئر واحدة لصفيحة بم المغلفة باستخدام ماصة البورسليكات. احتضان الحديدية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    19. في يوم 6، إعداد 2 مل نيم + 200 نانوغرام/مليلتر SHH (انظر الجدول للمواد)، وإجراء تغيير متوسط يومي.
    20. وفي يوم 8النظر في النسبة المئوية لتحريض الخلايا العصبية.
    21. عد الحديدية المرفقة كلها، وعلى وجه التحديد، تحديد عدد كل EB الفردية مليء بمأخذ العصبية. التحديد الكمي لاستحثاث روزيت العصبية باستخدام الصيغة التالية.
      Equation 3
      ملاحظة: إذا كان الاستقراء العصبية < 75%، التحديد روزيت العصبية قد تكون غير فعالة.
    22. وفي يوم 12، إعداد 250 مل متوسطة N2B27 مع مل 119 المتوسطة نيوروباسال، ومل 119 من DMEM/F12 المتوسطة، 2.5 مل جلوتاماكس، 2.5 مل نيا، 2.5 مل ملحق N2، 5 مل B27 دون فيتامين (أ)، 250 ميكروليتر من الجنتاميسين (50 ملغم/مل) ، و 19. 66 ميكروليتر من جيش صرب البوسنة (7 مغ/مل).
    23. لإعداد 50 مل من إكمال N2B27 المتوسطة، إضافة 3 ميكرومتر 2 ميكرومتر، CHIR99021 SB431542، 20 نانوغرام/مل بفجف و 20 نانوغرام/مليلتر لو 200 نانوغرام/مليلتر SHH.
      ملاحظة: من المهم إعداد المكتملة متوسطة الحق قبل الاستخدام.
    24. نضح المتوسطة من الآبار التي تحتوي على مأخذ العصبية وتغسل مع 1 مل من DMEM/F12.
    25. الإعلانية 1 مل كاشف التحديد روزيت العصبية (انظر الجدول للمواد)، واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 1.
    26. إزالة التحديد الكاشف، واستخدام بيبيتور 1 مل، تهدف مباشرة إلى مجموعات روزيت.
    27. إضافة التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل وكرر الخطوات 2.2.25 و 2.2.26 حتى غالبية المجموعات روزيت العصبية التي تم جمعها.
      ملاحظة: لتجنب التلوث بأنواع الخلايا نونيورونال، لا أوفيرسيليكت.
    28. الطرد المركزي من تعليق روزيت في 350 x ز لأدنى 5 Aspirate المادة طافية وريسوسبيند مأخذ العصبية في N2B27 + 200 نانوغرام/مليلتر SHH. إضافة تعليق روزيت العصبية إلى بئر بم المغلفة واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    29. أيام 13 – 17، إجراء تغيير متوسط يومي استخدام المكتملة N2B27 المتوسطة. مرور الخلايا عند الثقافات روافد 80%-90%.
    30. لتقسيم الخلايا، تعد لوحة بم المغلفة.
    31. تغسل الخلايا مع 1 مل من DMEM/F12 ونضح المتوسطة، وإضافة 1 مل كاشف الانفصال (انظر الجدول للمواد).
    32. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية وإضافة 1 مل من DMEM/F12، وإزاحة الخلايا المرفقة بها بيبيتينج صعودا وهبوطاً. جمع تعليق المجلس الوطني في أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
    33. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل N2B27 كاملة + 200 نانوغرام/مليلتر SHH.
    34. عد الخلايا ولوحة لهم في كثافة 1.25 × 105 خلايا/سم2، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    35. تغيير من المتوسط كل يوم، باستخدام N2B27 كاملة + 200 نانوغرام/مليلتر SHH.
      ملاحظة: في هذا المقطع، والشخصيات تعتبر مرور (ف) 0. يمكن سحب SHH من متوسطة N2B27 في P2.
    36. مرور الخلايا بمجرد وصولها إلى التقاء 80%-90%.
    37. وفي هذه المرحلة، تؤكد أن الخلايا التعبير عن علامات نيستين و FoxA2 باستخدام إيمونوسيتوتشيميستري وقبكر. هذا البروتوكول يؤدي إلى توليد خلايا إيجابية مزدوجة 85% لعلامات نيستين و FoxA2.
    38. بالنسبة باساجينج الخلايا، كرر الخطوات 2.2.31–2.2.36.
    39. تجميد الخلايا، بدءاً من مرور P2. لتجميد الخلايا، كرر الخطوات 2.2.31–2.2.36 وريسوسبيند بيليه الخلية على 2 × 106 إلى 4 × 106 خلايا/مل باستخدام السلف العصبية الباردة تجميد المتوسطة (انظر الجدول للمواد).
    40. نقل 1 مل تعليق خلية في كل كريوفيال وتجميد الخلايا باستخدام نظام تبريد قياسية بطء معدل يسيطر عليها. للتخزين على المدى الطويل، إبقاء الخلايا في نيتروجين سائل.
  3. ذوبان الجليد الشخصيات MD
    1. إعداد لوحة بم المغلفة والحارة N2B27 كاملة. إضافة 10 مل من DMEM/F12 الحارة إلى أنبوب مخروطي 15 مل. مكان كريوفيال في كتلة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
      1. نقل الخلايا من كريوفيال أن الأنبوب الذي يحتوي على DMEM/F12. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
      2. نضح المادة طافية، ريسوسبيند الخلايا في 2 مل N2B27، وإضافة تعليق خلية إلى واحد من لوحة بم المغلفة جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.

3-توصيل MD الشخصيات وتحليل التغيرات مثلايشن

  1. توصيل الشخصيات MD
    1. ترانسدوسي "الشخصيات العضو المنتدب" في التقاء 70% مع ناقلات LV-جرنة/dCas9-DNMT3A في وزارة الداخلية = 2. استبدال بوستترانسدوكشن ح 16 متوسطة N2B27.
    2. إضافة N2B27 مع 5 ميكروغرام/مل بوروميسين، ح 48 بعد توصيل. ثقافة الخلايا لمدة 3 أسابيع في N2B27 بالإضافة إلى بوروميسين للحصول على خطوط "نواب العضو المنتدب" مستقرة. الخلايا على استعداد لتطبيقات المصب (الحمض النووي، الجيش الملكي النيبالي، ويحلل البروتين، توصيف المظهرية23، تجميد وباساجينج).
  2. وصف الشخصية مثلايشن من سنكا إنترون 1
    1. استخراج الحمض النووي من كل خلية ستابلي ترانسدوسيد كيت خط تستخدم استخراج الحمض النووي (انظر الجدول للمواد).
    2. استخدام 800 نانوغرام من الحمض النووي لإجراء تحويل بيكبريتيت، استخدام المتاحة تجارياً كيت (انظر الجدول للمواد). بعد التحويل، وبيكبريتيت الوت الحمض النووي بيكبريتيت تحويلها إلى 20 نانوغرام/ميليلتر.
  3. بكر لتحليل بيروسيكوينسينج
    1. إعداد مزيج PCR الرئيسي في أنبوب نوكلاس مجاناً. لكل رد فعل، استخدم ميليلتر 0.4 من عكس التمهيدي (10 ميكرومتر)، 0.4 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر)، 1.6 ميليلتر مجكل2 (25 مم)، 2 ميليلتر من 10 × "التركيز كورالواد"، 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي x PCR 2، 4 ميليلتر من 5 س س-الحل، 1 ميليلتر من الحمض النووي ، و 0.6 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس.
    2. نقل لوحة الرد على ثيرموسيكلير وإجراء PCR استخدام الشروط التالية: 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، 50 دورة 94 درجة مئوية لمدة 30 ق، 56 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، مع خطوة تمديد نهائي 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية. يتم سرد أجهزة الإشعال المستخدمة بيروسيكوينسينج من سنكا إنترون 1 في الجدول 1و الشكل 7 ألف التكميلي الرقم 1.
    3. وبعد التضخيم، تصور أمبليكونس استخدام 2 ميليلتر من منتج PCR مع اثيديوم بروميد تلطيخ، التالية [اغروس] هلام التفريد.
    4. فحوصات بيروسيكوينسينج يتم التحقق من صحة باستخدام خليط من أونميثيلاتيد (U) وميثليته (M) تحويل بيكبريتيت السلطات الوطنية المعينة في النسب التالية، إلا وهي 100U:0M، 75U:25M، 50U:50M، 25U:75M، و 0U:100M (انظر الجدول للمواد).
    5. إجراء بيروسيكوينسينج باستخدام الكواشف بيروسيكوينسينج (انظر الجدول للمواد)، وحساب القيم مثلايشن لكل موقع البد استخدام البرمجيات بيروسيكوينسينج. لبروتوكول بيروسيكوينسينج مفصلة، راجع اسيل et al.37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التحقق من صحة التتر الإنتاج موجهات LV-dCas9-DNMT3A-بروتينات فلورية خضراء/بورو مقارنة بنظيره بروتينات فلورية خضراء ساذجة

أجرينا p24اسكت أليسا لمقارنة بين التتر المادية من LV-dCas9-DNMT3A-بروتينات فلورية خضراء/بورو مع نظرائهم بروتينات فلورية خضراء/بورو ساذجة. وتبين النتائج الممثل، المعروضة في الشكل 5A، أن غلة المادية لناقلات المرض، التي تم إنشاؤها باستخدام بروتوكول المبينة هنا، قابلة للمقارنة. وهذا يوحي بأن الأداة المساعدة للعمود الفقري ناقلات الأمثل، جنبا إلى جنب مع بروتوكول الإنتاج الأمثل، يؤدي إلى عيار عالية الغلة من ناقلات كريسبر/dCas9. لتقييم كفاءة التعبئة وتغليف التحوير dCas9-DNMT3A إلى جزيئات فيروسية، أجرينا توصيل ناقل تتركز في الخلايا HEK-293T (الشكل 5 (ب)). على الرغم من ذلك، أظهرت النتائج المبلغ عنها في الشكل 5A أن معدلات توصيل ناقل LV-dCas9-DNMT3A-التجارة والنقل كان أقل بكثير من أن ناقل بروتينات فلورية خضراء السذاجة (الشكل 5 (ب)). في الواقع، كان أقل أربع مرات من نظيره ساذج، مما يوحي بأن يتم خفض كفاءة التعبئة والتغليف من الجيش الملكي النيبالي كريسبر/dCas9 عيار الوظيفية ناقل LV-dCas9-DNMT3A-التجارة والنقل. وعلاوة على ذلك، شكلت ناقلات LV-dCas9-DNMT3A-بورو المستعمرات بوروميسين المقاوم بمعدل كان خمسة إضعاف أقل مقارنة مع نظيرتها السذاجة-بورو. ونحن أيضا اختبار كفاءة توصيل موجهات LV-dCas9-DNMT3A-بورو في الشخصيات MD. وتحقيقا لهذه الغاية، تم ترانسدوسيد الخلايا مع ناقل السذاجة LV-التجارة والنقل والجهد المنخفض-dCas9-DNMT3A-بورو في وزارة الداخلية = 1. كما هو موضح في الشكل 5، كانت معدلات توصيل ناقل التحكم بورو خمسة إضعاف أعلى بالمقارنة مع ناقل dCas9-DNMT3A. وتأكدت هذه النتائج باستخدام إصدارات بروتينات فلورية خضراء من الناقلات (الشكل 5). كما اقترح في قسم المناقشة، مع خصائص التعبئة والتغليف/التعبير أقل نظام LV-ابيجينومي-التحرير الوارد هنا، المستويات كافية لحفز مثلايشن الحمض النووي المستدامة في تسلسل الهدف. وعلاوة على ذلك، يمكن تحسين هذه الخصائص بالارتقاء بعملية الإنتاج.

التفريق بين الشخصيات MD

ويسمح البروتوكول على أساس EB الموصوفة هنا التفريق بين الشخصيات MD (الشكل 6A). قمنا بتقييم عملية التمايز باستخدام علامات محددة في مراحل مختلفة. أعرب هيبسكس بلوريبوتينسي ماركر OCT4، بينما أعربت الشخصيات MD نيستين و FOXA2 (الشكل 6B، ج). نحن ذكرت سابقا أن هذا البروتوكول التمايز تنتج 83.3% خلايا التي إيجابية مزدوجة نيستين و FOXA2 علامات31، يؤكد نجاح التفريق بين هذه الخلايا. على الأقل 75%-80% الخلايا بحاجة إلى إظهار علامات خلية على حدة. عائد أقل (< 50%) الخلايا إيجابية للعلامات سوف يتطلب بروتوكول تمايز آخر.

فحوصات التحقق من الصحة بيروسيكوينسينج إنترون سنكا 1 مثلايشن الشخصية

صممت سبع بيروسيكوينسينج فحوصات (الجدول 1، تكميلية الشكل 1، الشكل 7A) والتحقق من صحتها للتحديد الكمي لحالة مثلايشن في إنترون سنكا 1. Chr4: 89,836,150-89,836,593 (GRCh38/hg38) المنطقة تحتوي على 23 المعبأة. فحوصات تصميم تم التحقق من صحتها للخطى باستخدام خليط مختلف من أونميثيلاتيد (U) وميثليته (M) تحويل بيكبريتيت السلطات الوطنية المعينة كمعايير. واستخدمت الخلائط في النسب التالية، إلا وهي 100U:0M، 75U:25M، 50U:50M، 25U:75M، و 0U:100M. جميع الاختبارات السبعة تم التحقق من صحتها (الشكل 7)، وأظهرت العلاقة الخطية ص2 > 0.93. وجرت إعادة تصميم فحوصات عدم التحقق من صحتها. استخدام فحوصات المصادق عليه، كان من الممكن لتحديد مستويات مثلايشن في المعبأة 23 في إنترون سنكا 1 (الشكل 7).

Figure 1
رقم 1: أدوات تحرير ابيجينومي لتنشيط الجينات والقمع. المطابقة مغلقة (A) من الحمض النووي يبين المنظمة هيتيروتشروماتين. يمكن تعيين الجزيئات المستجيب، بما في ذلك VP64، P65 وهيئة الطرق والمواصلات، والانزيم demethylation DNA وتيت-1 المناطق التنظيمية (المروجين، إينترونس، إلخ) عن طريق الاقتران مع نظام dCas9-جرنة. نتائج توظيف النظام في الكروماتين يعيد البناء الذي يؤدي إلى إنشاء منظمة فتح الكروماتين (يوتشروماتين) المرتبطة بالتنشيط الجيني. (ب) على أساس Epigenome إسكات يمكن بتجنيد مجمعات ريبريسوري dCas9، بما في ذلك الإنزيم مثلايشن KRAB، هداكس، والحمض النووي، DNMT3A في المناطق التنظيمية (المروجين، إينترونس، إلخ) عن طريق الربط مع المكون جرنة. توظيف نتائج النظام في التعطيل الجيني (إسكات)، المرتبطة الحمض النووي الكروماتين يعيد البناء، وصعوبة الوصول إلى آلات النسخ العام لهيكل الكروماتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تصميم ناقلات مثلايشن الحمض النووي المستهدف داخل سنكا لينتيفيرال تريبليكاتيد المكاني- (أ) الإنتاج والتعبير-محسن لناقلات العمود الفقري هو وصف بالتفصيل كانتور et al.23،30من أورتينسكي et al.، و فيجايراغافان وكانتور35. شروح لعناصر رابطة الدول المستقلة في مكافحة ناقلات هي عنصر تعبئة ناقل (ψ، psi) وعنصر الاستجابة Rev (رر) ومواقع ملزمة Sp1 (Sp1)، البشرية U6 المروج (hU6)، ومروج 1α عامل استطالة أساسية (EFS-NC) وفيروس التهاب الكبد الوبائي وودكوك بوسترانسكريبشونال العنصر التنظيمي (وبر). (ب) التمثيل التخطيطي من سنكا تريبليكاتيد المكان. مثلايشن الحمض النووي هو إليه مهمة تنظيم النسخي مباشرة أو غير مباشرة يحد من إمكانية الوصول إلى الحمض الخلوي الصبغي21. ولوحظ زيادة سنكا التعبير من قبيل الصدفة أن البد مثلايشن مستويات منخفضة في إنترون سنكا 1 (الأسهم الخضراء تسمية الدولة تعبير الجين المنشط لمحور سنكا تريبليكاتيد). تعيين ناقلات LV-جرنة/dCas9-DNMT3A تترنح الإنزيم ميثيلترانسفيراسي إلى منطقة إنترون 1 سنكا . هذه النتائج في جمعية الكروماتين مغلقة مما يؤدي downregulation النسخي من سنكا (الأسهم الحمراء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: اء كاسيت التعبير لينتيفيرال ناقلات تحمل التحوير dCas9-DNMT3A- يرد وصف المتجهات الأبوية، pBK301، أورتينسكي et al.30. تم استنساخ الموجه مع dCas9-DNMT3A-بورو (pBK492) أو dCas9-DNMT3A-التجارة والنقل (pBK539) (يمكن العثور تدفق الاستنساخ في البروتوكول وفي كانتور et al.23). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تعبئة ناقلات لينتيفيرال والإنتاج وتنقية- (أ) بروتوكول تعداء عابر المستخدمة لإنتاج LV-جرنة/dCas9-DNMT3A. لتوليد نواقل، تم transfected الخلايا HEK-293T بفيروس التهاب الفم الحويصلي ز-البروتين (منظمة-ز)، التعبئة والتغليف، والتعبير والبلازميدات23. وجمعت من supernatants ثقافة الجسيمات الفيروسية. واستخدمت الجيل الثاني من نظام التعبئة والتغليف لاستكمال شرائط التعبير. أن النظام كان يؤوي تأت والبروتينات Rev. بلازميد القس، برسف-القس، واستكملت بشكل منفصل. المختصرات: بكمف = مروج الفيروس المضخم للخلايا؛ لتر = يكرر المحطة منذ فترة طويلة؛ منظمة-G = فيروس التهاب الفم الحويصلي ز-البروتين؛ رر = عنصر الاستجابة القس؛ حزمة الخدمة Sp1 = مواقع Sp1--ربط عامل النسخ؛ Ψ = عنصر ناقل التعبئة والتغليف (psi)؛ وبر = وودكوك الالتهاب الكبدي فيروس بوسترانسكريبشونال التنظيمية عنصر؛ EFS-NC = مروج 1α عامل استطالة أساسية؛ hU6 = البشرية U6 المروج. (ب) الناقل تنقية والتركيز قد نفذت على النحو التالي: تم استخدام البروتوكول التدرج السكروز مزدوجة لتنقية وتركيز الجسيمات الفيروسية عقب تعداء عابرة (انظر أعلاه). بإيجاز، ثقافة المادة طافية (SN) التي تم جمعها وتحميلها على تدرج سكروز. لإنشاء التدرج، 70%، 60%، 30%، و 20 ٪ من حلول السكروز المذاب في x 1 استخدمت برنامج تلفزيوني. وشملت الخطوة الثانية لتنقية تنبيذ فائق ضد وسادة سكروز 20%. وكان حراكه بيليه المشكلة في برنامج تلفزيوني 1 x. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تقييم التتر الفيروسية. (أ) p24 أليسا المقايسة. يتم تنفيذ إجراء تيتيرينج كما وصفها كانتور et al.23. يتم تمييز ناقلات السذاجة (التجارة والنقل) في شريط أسود. كما سلط الضوء على ناقلات LV-dCas9-DNMT3A-بورو (شريط أزرق فاتح) وناقلات LV-dCas9-DNMT3A-التجارة والنقل (شريط أخضر). وقد تم تقييم إنتاج الجسيمات المادية لناقلات المرض. وتسجل النتائج في إعداد نسخة في المليلتر، حيث 1 نانوغرام من p24اسكت = 1 × 104 الجسيمات الفيروسية. وتمثل البيانات شريطي ± يعني SD من ثلاث تجارب مستقلة. (ب) تقييم التتر الوظيفية بعد توصيل داخل الخلايا HEK-293T. كانت ترانسدوسيد LVs المحتوية على بورو في خلايا HEK-293T كما هو موضح في نتائج تمثيلية. وقيست التتر الوظيفية لإنتاج الفيروسية بإحصاء عدد المستعمرات بعد التحديد بوروميسين. وقد حسبت النتائج كنسبة عدد المستعمرات التي تم الحصول عليها من لينتيفيرال ناقل-بورو (مراقبة ناقلات) مقارنة بنظيره dCas9-DNMT3A-بورو. ويمثل الرسم البياني الشريطي ± يعني SD من ثلاث تجارب مستقلة. (ج) تقييم كفاءة توصيل والتعبير عن الناقلات في الخلايا HEK-293T (اللوحة العلوية) والشخصيات (أسفل اللوحة). تمثل اللوحات الأيسر ترانسدوكشنز ناقل السذاجة (التجارة والنقل). وتمثل اللوحات حق ترانسدوكشنز dCas9-DNMT3A-التجارة والنقل المتجهة. ثلاثة أيام بوستترانسدوكشن، تم جمع الصور عن استخدام مجهر الأسفار (40 x). (د) تقييم التتر الوظيفية بعد توصيل في اللجان التحضيرية الوطنية. كانت ترانسدوسيد LVs المحتوية على بورو في الشخصيات كما هو موضح في الممثل النتائج والنتائج حسبت كما هو الحال في الفريق ب. يمثل الرسم البياني الشريطي ± يعني البيولوجية الثلاثة ووزارة شؤون المرأة وإنشاء نسخ متماثلة. المختصرات: HEK-293T = الكلي الجنينية البشرية 293T؛ الشخصيات = الخلايا العصبية السلف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: التمايز وتوصيف الشخصيات MD المستمدة من هيبسك- (أ) جدول زمني يظهر التفريق بين علامات MD الشخصيات. "القياس الكمي للعضو المنتدب لمجلس الشعب" المستمدة من هيبسك باستخدام إيمونوسيتوتشيميستري (ب وج) و (د وه) في الوقت الحقيقي (RT) PCR. وحسبت مستويات كل مرناً بالنسبة للوسط الهندسي جابده-مرناً وضوابط مرجعية بيا-مرناً باستخدام الأسلوب 2-ΔΔCT . يمثل كل عمود متوسط اثنان replicates البيولوجية والتقنية. أشرطة الخطأ تمثل sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7: التحقق من صحة الكمية بيروسيكوينسينج assays استهداف سنكا إنترون 1- (أ) نظرة عامة على فحوصات بيروسيكوينسينج في إنترون سنكا 1. (ب) تصميم الاختبارات تم التحقق من صحتها باستخدام نسب مختلفة من أونميثيلاتيد (U) وميثليته (M) تحويل بيكبريتيت الحمض النووي، وهي: 100U:0M، 75U:25M، 50U:50M، 25U:75M، و 0U:100M. (ج) واستخدمت Validated فحوصات لقياس النسبة المئوية مثلايشن المعبأة 23 في إنترون سنكا 1 في الشخصيات MD هيبسك المستمدة من مريض مع تريبليكيشن محور سنكا . الأشرطة تمثل متوسط النسبة المئوية ميثليته المعبأة في تجربتين مستقلة، وإظهار أشرطة الخطأ sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الاعتداء # التمهيدي إلى الأمام (5 '-3') عكس التمهيدي (5 '-3') التسلسل التمهيدي (5 '-3') البد المشمولة
1 تتتتتجججاجتتاجااجا آككتككتاكاكتككاتتكات * جججاجتتاجااجا 1
2 تجججاجتتاجااجاجاتت أككتككتاكاكتككاتتكات * جتجاجاجاتاجتجت 2,3,4,5,6,7
3 تتجججاجتتاجااجاجات أككتككتاكاكتككاتتكات * أجاجاجاتجتتتاتج 7، 8
4 تتتتتجججاجتتاجااجا * ككتككتاكاكتككاتتكات كتاكاكتككاتتكاتات 9.8
5 تجججاجتتاجااجاجاتت كككتكاكتاتكتاكككتااكا * جاجتتجتااتاتجا 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17
6 جتجتاجاجتاجتاتاج أكاكااكككااتاتاتاتكتات * أجتاجتاتاجتجتا 17، 18، 19، 20، 21، 22
7 تتتتتجججاجتتاجااجا * كتكااكااكاكااكككاات كتكااكااكاكااكككاات 23, 22, 21, 20
* يشير إلى كبسولة تفجير بيوتينيلياتيد

الجدول 1: بيروسيكوينسينج فحوصات لتقييم مستويات مثلايشن البد إنترون 1 سنكا.

التكميلية الرقم 1: نظرة عامة بيروسيكوينسينج فحوصات في إنترون سنكا 1- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LVs قد بدأت في الظهور كالوسيلة للاختيار لتحرير ابيجينومي، لا سيما في سياق الأمراض الوراثية، ويرجع ذلك أساسا إلى قدرتها على (ط) استيعاب حمولات كبيرة من الحمض النووي و (ii) ترانسدوسي كفاءة مجموعة واسعة من تقسيم والخلايا نونديفيدينج. فعالية العبوة الكبيرة LVs مفيد بوجه خاص للتطبيقات التي تنطوي على التعبئة وتغليف نظم كريسبر/dCas9 التي هي كبيرة الحجم. ومن هذا المنظور، تمثل LVs المنصة الاختيار لإيصال نظم كريسبر/Cas9 الكل في واحد. في الواقع، منصة إف، الذي يستخدم عادة لتطبيقات العلاج الجيني السريري والسريري، ليست قادرة تماما ﻻستيعاب أحجام العبوة الكبيرة من أنظمة dCas9 المستجيب. وفي الواقع، متطلبات التغليف الدقيق لناقلات إف هي حظر استخدامها لتوصيل المكونات كريسبر/dCas9. وقد وضعت الأنظمة الأساسية المستندة إلى إف رواية عدة لتحسين القدرة على التعبئة والتغليف إف،. على سبيل المثال، نهج تقسيم انتئين فصل Cas9 النظام في اثنين من أشرطة الكاسيت إف قد تم مؤخرا بناء38. وزاد النهج الشامل التغليف القدرات؛ ومع ذلك، أنها تحتاج إلى الإنتاج وكوترانسدوكشن من اثنين من ناقلات إف38. اكتشاف SaCas9، المستمدة من المكوّرات العنقودية الذهبية، يسمح بتطوير نظام SaCas9/دليل الحمض النووي الريبي39،40. SaCas9 أقصر، لكن الإنزيم Cas9 قوية على قدم المساواة، في ناقلات إف وتعبئتها بسهولة. وقد أظهرت التجارب المجراة في أن هذا النظام يستهدف كفاءة الجينات التنظيمية الكوليسترول PCSK940. ومع ذلك، كفاءة التعبئة والتغليف من ناقلات إف الكل في واحد يحتاج إلى مزيد من التحسين. نظراً للمزايا الواضحة لنظام التسليم LV، نحن مؤخرا نمواً والمستخدمة التحوير كان يؤوي العمود الفقري dCas9 لينتيفيرال-DNMT3A، فضلا عن سقالة جرنة. لاختبار إمكانات هذا النظام رواية العلاجية، طبقنا PD المستمدة من هيبسك الخلايا العصبية التي تقوم سنكا المكاني تريبليكيشن23. علينا التحقق من كفاءة هذا النظام الذي أدى إلى صقل downregulation سنكا-مرناً والبروتين مستويات23. الأهم من ذلك، أظهر النظام القدرة على الإنقاذ تعمل الخلوية المتعلقة بالمرض، مما يوحي بإمكانية كبيرة للنهج لأن العلاجات المستندة إلى ابيجينومي23.

لزيادة إنتاج الناقلات، قدمنا مؤخرا عدة تعديلات في كاسيت التعبير ناقلات الأمراض، بما في ذلك دمج Sp1 مواقع والحذف في 3 ' لتر، وتقليص حجم للتعبير بلازميد (انظر الفقرة التالية)30 .

إدخال تعديلات على الأنظمة القائمة

أسلوب الإنتاج المقدمة هنا يمكن توليد نواقل LV-كريسبر/dCas9 في التتر في النطاق من 1 × 1010 فو/مليلتر (الشكل 5). كما ورد أعلاه، تحقيق أعلى إنتاج التتر، ونحن إضافة تكرار الموقع Sp1--ربط عامل النسخ كاسيت ناقلات تعبير كريسبر/Cas9 كل في واحد وأدخلت حذف الدولة للفنون في منطقة U3 للتر 3 '. هذه التعديلات أدت إلى أوبريجولاتيون كبيرة في كفاءة ناقل التعبئة والتغليف (~2.5x) فضلا عن تعبير التحوير (حوالي سبع مرات)30،35. هذه التحسينات في الاتفاق مع البيانات التي تم إنشاؤها مسبقاً41،42،،من4344.

الخطوات الحاسمة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

كاسيت ناقلات الأمثل، وتعبئتها في الجزيئات الفيروسية، يولد التتر نحو 1 × 1010 فو/مل كل ~ 5 × 107 منتج للخلايا. وفي حالة إنتاج الناقلات في التتر السفلي، ينبغي النظر في التحسينات التالية. 1) استخدام الخلايا HEK-293T في عدد مرور منخفضة. استبدال الخلايا بانتظام بعد الممرات إيه تو زيرو. أيضا، استبدال الخلايا عندما تظهر بمعدل نمو بطيء. 2) بصورة روتينية فحص مكونات المتوسطة نظراً لأنها قد تسهم في التغيرات التي حدثت في عيار الفيروس. استبدل المصل الجنيني بمصل العجل الكونية فعالة من حيث التكلفة. 3) خطوط الخلية المختلفة المستخدمة لتوليد متجه تثبت اللياقة البدنية إنتاج متميزة. على سبيل المثال، خلايا HEK 293T قادرة على توليد ناقلات على المستويات التي أعلى من الخلايا HEK-293 مترا بثلاثة إضعاف (البيانات لا تظهر). 4) تعداء الأمثل يتحقق عندما تكون الخلايا في التقاء 70% – 80%. سيؤدي إلى انخفاض كثافة موت الخلايا المبكرة كعامل سمية الفيروسية. ومع ذلك، سيؤدي كثافات أعلى انخفاض كبير في كفاءة الإنتاج. وكقاعدة عامة، ينبغي أن تسمح كثافة الخلية قبل تعداء الخلايا لتقسيم مرة واحدة قبل إنشاء ثقافة المتلاقية تماما. 5) تعداء التتر تعتمد أيضا على درجة الحموضة للكاشف BBS. وكقاعدة عامة، فإننا نقترح اختبار دفعة جديدة من BBS في أجواء تعداء تجريبية قبل استخدامه. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني x BBS 2 6.95.

إنتاج الغلال مقابل كفاءة توصيل/تعبير

ينبغي أن يكون أشار إلى أنه حتى على الرغم من حزمة الخدمة Sp1--LVs تحمل كريسبر/dCas9 المتسلسلات قادرة على توليد التتر محيط 1 × 1010 فو/مل في ~ 5 × 107 إنتاج الخلايا، وقابلة للمقارنة مع ناقل السذاجة (الشكل 5A)، للخطر كفاءة التعبئة والتغليف من الجيش الملكي النيبالي الفيروس إلى حد كبير مع التحوير dCas9-DNMT3A. والواقع أن نظهر حوالي خمسة إضعاف الحد في التتر الفنية وقدرات التعبير من ناقلات LV-dCas9-DNMT3A-بورو/التجارة والنقل (الشكل 5B). قد يكون الانخفاض في كفاءة التعبئة والتغليف، والتعبير عن الناقلات نتيجة أوفيريكسبريشن DNMT3A. وفي هذا الصدد، وقد ثبت أن مثلايشن الحمض النووي قد تلعب دوراً مهما في السيطرة على فيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها والتعبير الجيني. ولذلك، سيكون من الضروري لتحديد ما إذا كان LVs تخضع للائحة مماثلة، وإذا كان هذا هو الحال، على وضع استراتيجيات للنشاط DNMT3A إيندوسيبلي الصمت خلال مرحلة الإنتاج الموجه. وعلى الرغم من انخفاض إنتاج عائد، تثبت الناقلات التتر وظيفي لائق (بانخفاض 109 النطاق، الذي ينبغي أن يكون كافياً في العديد من التطبيقات، بما فيها تلك التي تتطلب تقديم المجراة في). تجدر الإشارة إلى أن إجراءات الإنتاج يمكن أن تكون بسهولة النهوض بها، كما تمت مناقشته في هذا الاستعراض، الذي ينبغي أن يسمح مطابقة التتر التي تم الحصول عليها مع النظم الأخرى للتعبير.

التعامل مع المتجهات والسلامة

لإنشاء LVs، ينبغي النظر في النقاط التالية السلامة. أولاً، يتطلب LVs كونتاينمينتس مستوى 2 السلامة الأحيائية. على الرغم من سلامة النسبي LVs (الذي ينبع من طبيعتها الخطيئة)، كان النشاط النسخي المتبقية أظهرت22. وعلاوة على ذلك، يمكن إنقاذهم LV الجينومات بفيروس نقص المناعة البشرية-122. ونتيجة لكل هذا، نحن نوصي بشدة إجراء فحوصات كفاءة النسخ المتماثل (لا سيما في الأعمال التحضيرية مركزة). لإجراءات السلامة فيما يتعلق بالتعامل مع لينتيفيروسيس، ونشير هنا للسلامة الأحيائية في المجهرية و "المختبرات الطبية الحيوية"، الطبعة الرابعة، التي نشرتها المراكز مراقبة الأمراض (مركز السيطرة على الأمراض؛ والمتاحة على شبكة الإنترنت). للتطبيقات السريرية، استخدام الجيل الثالث من منظومة التعبئة والتغليف. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن استخدام الجيل الثالث من أنظمة التغليف يربط مع التتر أقل مقارنة مع أنظمة التغليف من الجيل الثاني.

أهمية والاتجاهات المستقبلية

ويعزز منهاج الرواية المبينة هنا الأدوات الاتساع لتسليم عناصر التحرير ابيجينومي والأخرى الشحنات الجزيئية للخلايا والأجهزة. وعلى الرغم من التقدم المحرز مؤخرا في تطوير نظم لفيروس نقص المناعة البشرية-1-تعتمد، تثبت فقط بضع منصات الغلة المستدامة من إنتاج الفيروسية. الاستفادة المثلى من ناقلات العمود الفقري ذكرت هنا جعل من الممكن لمعالجة بعض القضايا المرتبطة بكفاءة الإنتاج المنخفضة نسبيا لناقلات المرض. لمواصلة تحسين خصائص إنتاج ناقلات الأمراض، أنه سيكون قيماً لاختبار ما إذا كانت غلة الموجه والتعبير يمكن أن تتحسن عن طريق إضافة تكرار نسخ متعددة من فكرة ربط نفسه أو عن طريق مضاعفة الحافز Sp1 مع الاعتراف بالمواقع لعوامل أخرى. وفي هذا الصدد، قد توفر النتائج المعروضة هنا وضع استراتيجية عامة لتحسين المروجين الخاصة بالانسجة ضعيفة نسبيا، مثل الإنسان سينابسين (حسين) وكامكييا.

نحن مؤخرا أظهرت أن التعبير الطويل الأجل لتسليم LV Cas9/دليل الحمض النووي الريبي قد يؤدي إلى آثار غير مرغوب فيها خارج الهدف30. على الرغم من أن تطبيق هذه الفكرة أساسا لتقسيم الخلايا، سيكون مفيداً للغاية لتطوير نظم مكافحة ناقلات ابيسومال قادرة على تسليم الشحنات العلاجية عابر. كما ذكر أعلاه، ناقلات إف قيمة للغاية، عابر تسليم المركبات؛ ومع ذلك، قدرة التعبئة منخفضة تؤثر بشكل كبير استخدامها، خاصة بالنسبة لتطبيقات تحرير ابيجينومي. ولهذا السبب، سيتيح ناقلات تفتقر إلى إينتيجراسي لينتيفيرال (إيدلفس) وسيلة جذابة للتسليم والتعبير عن أدوات تحرير epigenome استناداً إلى كريسبر/dCas9. الخصائص التالية للنظام الأساسي إيدلف جاذبية خاصة: (ط) القدرة على إيصال الشحنات الوراثية لمجموعة واسعة نطاق من الخلايا والأجهزة؛ (ثانيا) سعة عبوة متفوقة – الذي هو ميزة كبيرة على ناقلات إف؛ (ثالثا) طبيعة عابرة للتسليم (والذي ميزة كبيرة بالمقارنة مع LVs integrase المختصة)45،30. طبيعة الجينوم إيدلف ابيسومال ويسلط الضوء على معدلات منخفضة جداً من التكامل، وعلى هذا النحو، تكون مفيدة إلى حد كبير للحد من خطر الطفرات إينسيرشونال. ونحن مؤخرا الأمثل إيدلف خصائص الإنتاج والتعبير، إنشاء المنصة التي آمنة وفعالة لتوصيل المكونات كريسبر/Cas930. وفي الواقع، كانت إيدلفس تحسين قادرة على استحثاث الجينوم السريع والمطرد التحرير في HEK-293T الخلايا والخلايا العصبية في الدماغ بوستميتوتيك. النظام يتسم بتعبير عابر، وتم العثور على أن تكون أكثر أماناً من LVs integrase المختصة المقابلة. تكييف ناقلات إيدلف للتطبيقات التي تنطوي على تحرير epigenome التلاعب سيكون مفيد جداً لحقل العلاج بالجينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جامعة ديوك قدم طلب براءة المؤقت ذات الصلة بهذه الدراسة.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل جزئيا بجائزة التنمية الأعصاب خان (لقائد) والوطنية معاهد للصحة الوطنية المعهد من الاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (المعاهد الوطنية للصحة/NINDS) (NS085011 R01 إلى قائد).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
0.22 μM filter unit, 1 L Corning 430513
0.45-μm filter unit, 500 mL Corning 430773
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
50 mL conical centrifuge tubes Corning 430291
6-well plates Corning 3516
Aggrewell 800 StemCell Technologies 34811
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
BD FACS Becton Dickinson 338960
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
Eppendorf Cell Imaging Slides Eppendorf 30742060
High-binding 96-well plates Corning 3366
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Reversible Strainer StemCell Technologies 27215
SW32Ti rotor Beckman Coulter 369650
VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic VWR 93000-694
VWR® Vacuum Filtration Systems VWR 89220-694
xMark™ Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
Accutase StemCell Technologies 7920
Anti-Adherence Rinsing Solution StemCell Technologies 7010
Anti-FOXA2 Antibody Abcam Ab60721
Anti-Nestin Antibody Abcam Ab18102
Antibiotic-antimycotic solution, 100x Sigma Aldrich A5955-100ML
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587010
BES Sigma Aldrich B9879 - BES
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260037
CHIR99021 StemCell Technologies 72052
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning 08-774-552
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
DMEM-F12 Lonza 12-719
DMEM, high glucose media Gibco 11965
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EpiTect PCR Control DNA Set Qiagen 596945
EZ DNA Methylation Kit Zymo Research D5001
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15750078
Gentle Cell Dissociation Reagent stemCell Technologies 7174
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Human Recombinant bFGF StemCell Technologies 78003
Human Recombinant EGF StemCell Technologies 78006
Human Recombinant Shh (C24II) StemCell Technologies 78065
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140050
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
N-2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502001
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
PyroMark PCR Kit Qiagen 978703
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
SB431542 StemCell Technologies 72232
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
STEMdiff Neural Induction Medium StemCell Technologies 5835
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium StemCell Technologies 5838
TaqMan Assay FOXA2 Thermo Fisher Scientific Hs00232764
TaqMan Assay GAPDH Thermo Fisher Scientific Hs99999905
TaqMan Assay Nestin Thermo Fisher Scientific Hs04187831
TaqMan Assay OCT4 Thermo Fisher Scientific Hs04260367
TaqMan Assay PPIA Thermo Fisher Scientific Hs99999904
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
Y27632 StemCell Technologies 72302
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Goat serum, Sterile, 10 mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Normal mouse serum, Sterile, 500 mL Equitech-Bio SM30-0500
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pMD2.G Addgene 12253
pRSV-Rev Addgene 52961
psPAX2 Addgene 12259
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsmBI New England Biolabs R0580S
BsrGI New England Biolabs R0575S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31, (7), 397-405 (2013).
  3. Thakore, P. I., Black, J. B., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation. Nature Methods. 13, (2), 127-137 (2016).
  4. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, (2), 442-451 (2013).
  5. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159, (3), 647-661 (2014).
  6. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10, (10), 973-976 (2013).
  7. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12, (4), 326-328 (2015).
  8. Horlbeck, M. A., et al. Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro. eLife. 5, (2016).
  9. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13, (7), 563-567 (2016).
  10. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, (3), 440-446 (2018).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159, (3), 635-646 (2014).
  12. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517, (7536), 583-588 (2015).
  13. Holtzman, L., Gersbach, C. A. Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape. Annual Review of Genomics and Human Genetics. (2018).
  14. Perez-Pinera, P., et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature Methods. 10, (3), 239-242 (2013).
  15. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nature Methods. 12, (12), 1143-1149 (2015).
  16. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167, (1), 219-232 (2016).
  17. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167, (1), 233-247 (2016).
  18. McDonald, J. I., et al. Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation. Biology Open. 5, (6), 866-874 (2016).
  19. Huang, Y. H., et al. DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A. Genome Biology. 18, (1), 176 (2017).
  20. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Research. 44, (12), 5615-5628 (2016).
  21. Razin, A., Kantor, B. DNA methylation in epigenetic control of gene expression. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 38, 151-167 (2005).
  22. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (44), 18786-18791 (2009).
  23. Kantor, B., et al. Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD. Molecular Therapy. (2018).
  24. Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. Journal of Neuroscience. 30, (18), 6355-6359 (2010).
  25. Wang, Y., et al. A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2'-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson's disease-related genes in dopaminergic neurons. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19, (3), 183-190 (2013).
  26. Matsumoto, L., et al. CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson's disease. PLOS One. 5, (11), e15522 (2010).
  27. Desplats, P., et al. Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases. Journal of Biological Chemistry. 286, (11), 9031-9037 (2011).
  28. Ai, S. X., et al. Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson's disease. Journal of the Neurological Sciences. 337, (1-2), 123-128 (2014).
  29. Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies. Neurogenetics. 17, (3), 145-157 (2016).
  30. Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).
  31. Tagliafierro, L., et al. Genetic analysis of alpha-synuclein 3' untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson's disease compared to dementia with Lewy bodies. Alzheimer’s & Dementia. 13, (11), 1237-1250 (2017).
  32. Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging. Human Molecular Genetics. (2018).
  33. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical applications involving CNS gene transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  34. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  35. Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56915 (2017).
  36. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 16, (12), 1968-1976 (2008).
  37. Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. Bisulfite pyrosequencing. Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).
  38. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Research. 43, (13), 6450-6458 (2015).
  39. Nishimasu, H., et al. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162, (5), 1113-1126 (2015).
  40. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520, (7546), 186-191 (2015).
  41. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology. 68, (4), 2632-2648 (1994).
  42. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. Journal of Virology. 71, (8), 6113-6127 (1997).
  43. Goffin, V., et al. Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity. Nucleic Acids Research. 33, (13), 4285-4310 (2005).
  44. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. Journal of Biological Chemistry. 280, (22), 21545-21552 (2005).
  45. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 19, (3), 547-556 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics