تحليل تريساكتشاريديس الحليب فوكوسيلاتيد الإنسان في سياق التكنولوجيا الأحيائية باستخدام جينياً ترميز أجهزة استشعار العوامل البيولوجية

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

يصف لنا هنا كشف الفائق والتقدير الكمي فوكوسيلاتيد لبن oligosaccharides (إهمال) استخدام بيوسينسور كامل الخلية. كما نبدي هنا، تكييف هذا البرنامج نحو تحليل لسلالات إنتاج مؤمن، مع التركيز على تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Oligosaccharides اللبن البشري (إهمال) عناصر الكربوهيدرات المعقدة في لبن الثدي البشري الذي يحمل فوائد وفيرة على صحة الرضع. ومع ذلك، يقتصر التحسين على التوليف التكنولوجيا الحيوية الإنتاجية منخفضة نسبيا من الكشف والتحديد الكمي لأحادي والروابط. وتشمل التقنيات التقليدية لتحليل جليكان طرق الكروماتوغرافي/الجماهيري-والمطيافيه مع الإنتاجية بناء على أمر من مئات العينات يوميا دون التنفيذ التلقائي. نظهر هنا، بيوسينسور بكتيرية مرمزة وراثيا لكشف الفائق، والخاصة بالربط والتقدير الكمي لهياكل فوكوسيلاتيد مؤمن و 2-فوكوسيلاكتوسي 3-فوكوسيلاكتوسي، الذي يمكننا تحقيقه عن طريق مغايرة التعبير عن فوكوسيداسيس. كما يمكن أن يؤدي وجود اللاكتوز في الحليب أو في العمليات الحيوية لايجابيات كاذبة، علينا أن نبرهن أيضا الحد الإشارات من اللاكتوز استخدام استراتيجيات مختلفة. نظراً للإنتاجية العالية لهذه التقنية، يمكن جزيئي العديد من شروط رد فعل أو معلمات مفاعل حيوي في نفس الوقت في بضع ساعات، مما يسمح للاستفادة المثلى التصنيع مؤمن.

Introduction

Oligosaccharides اللبن البشري (إهمال) هي مشتقة من اللاكتوز-oligosaccharides، عادة ما تتألف من ثلاث إلى ثماني السكر مونومرات. لديهم اللاكتوز (غال-β1، 4-جنة الضوء الأخضر) الحد من نهاية وهي ممدود المزيد من الروابط glycosidic (بيتا-1، 3-أو β-1، 6-) الجلوكوز (الأخضر)، واللبن (Gal)، أو ن-أسيتيلجلوكوساميني (جلكناك). وباﻹضافة إلى ذلك، فوكوسي (الجبهة، α-1، 2--أو α-1، 3-) أو حمض اللعابي (سيا أو نيواك، α-2 و 3-أو α-2، 6-) المخلفات غالباً ما يتم إضافة1.

التحليل الحالي أوليجوساكتشاريديس والكربوهيدرات الأخرى محدودة في الإنتاجية والنطاق بالحاجة إلى والمطيافيه الكروماتوغرافي/الكتلة (MS) التكنولوجيا2،3،،من45، 6 , 7، والذي يمكن أن يستغرق حوالي ساعة كل عينة، ناهيك عن الضرورة لمعدات غالية الثمن والأعمدة المتخصصة ووكلاء ديريفاتيزينج والخبرة في تشغيل هذه المعدات8. الروابط oligosaccharide تتسم بصعوبة خاصة لتحديد، تتطلب متقدمة MS9،10 أو تقنيات الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي)11. التحسين السريع لتوليف لهذه أوليجوساكتشاريديس وبالتالي يحد من الإنتاجية من هذه الخطوة التحليلية بطيئة.

في هذه الدراسة، ونظهر الكشف الخاصة بالربط من تريساكتشاريدي فوكوسيلاتيد إهمال يستند اللاكتوز، مع التركيز على 2 '--فوكوسيلاكتوسي (2-فلوريدا) هو مؤمن الأكثر وفرة في اللبن البشري، وراثيا تم ترميزه باستخدام خلية كله الإشريكيّة القولونية بيوسينسور حدا للكشف على 4 مغ/لتر. من السمات هامة لهذا بيوسينسور هو قدرته على التفريق بين تريساكتشاريديس متجازئه. يستند مبدأ التصميم إلى التعبير عن فوكوسيداسيس محددة في كولاي أن تحرير اللاكتوز من إهمال، هو الكشف عن وجود التي بها مشغل أمريكا اللاتينية والكاريبي ، الذي يولد بدوره إشارة فلورسنت. يمكننا تحقيق ذلك من خلال بناء نظام بلازميد اثنين، واحد إيواء فوكوسيداسي الخاصة بالربط والآخر بروتين مراسل فلورسنت. منصة بيوسينسور هذا مناسبة للفرز الفائق بالتدفق الخلوي أو قارئ لوحة صغيرة. كما نبدي الاستفادة بيوسينسور في التحديد الكمي 2 '--فلوريدا التي تنتجها سلالة المهندسة12. ضمن هذه الدراسة، كما نقدم ثلاث استراتيجيات في إزالة انتقائية من اللاكتوز التي يمكن أن تسفر عن إشارة إيجابية كاذبة من بيوسينسور، نظراً لأن يزرع سلالة منتج هندسيا على اللاكتوز.

أخذت معا، هذه الأجهزة المشفرة جينياً يسمح لنا بكشف وتحديد إهمال في طريقة الربط على حدة، وصعبة حتى مع الكروماتوغرافي، مرض التصلب العصبي المتعدد، أو الرنين المغناطيسي تقنيات. ينبغي أن يكون هذا الأسلوب نظراً للإنتاجية العالية وسهولة الاستخدام، تطبيقات على نطاق واسع في الهندسة الأيضية وتوليف من إهمال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-خلية ظروف الثقافة والتوجيه

ملاحظة: في التجارب التالية، ثلاث سلالات المستخدمة: BL21 كولاي (DE3) مع موجه فارغ، BL21 كولاي (DE3) مع البلازميدات بأفكا14 و pET28:green نيون البروتين (التجارة والنقل)، و BL21 كولاي (DE3) مع البلازميدات بافكب14 و pET28:GFP. وتزرع جميع سلالات في مرق لوريا بيرتاني (رطل) أو الحد الأدنى من وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية المناسبة. إعداد حلول الأسهم 1,000 x كاناميسين (50 ملغم/مل) وكاربينيسيلين (100 مغ/مل) في منزوع (DI) المياه.

  1. إعداد الوسائط
    1. تحضير الوسائط رطل بإضافة ز 25 رطل مسحوق المخزون إلى 1 لتر مياه دي. اﻷوتوكﻻف الحل في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتعقيم. الانتظار حتى يتم تعقيم رطل وسائل الإعلام درجة الحرارة أقل من 60 درجة مئوية قبل إضافة 1 ميليلتر من مخزون المضادات الحيوية لكل 1 مل من وسائل الإعلام رطل.
    2. لإعداد لوحات رطل، إضافة أجار ز 15 إلى وسائل الإعلام رطل قبل التعقيم. الانتظار حتى يتم تعقيم رطل أجار درجة الحرارة أقل من 60 درجة مئوية قبل إضافة المضادات الحيوية.
    3. 1.1.3 للخلايا بيوسينسينج، وإعداد وسائل الإعلام أو لوحات مع المضادات الحيوية المزدوج، كاناميسين، وكاربينيسيلين.
  2. مستحثات الكربوهيدرات
    1. إعداد حلول الأسهم من مستحثات الكربوهيدرات في معادلات المولى إلى 20 غرام/لتر لاكتوز: 29 غ/لتر 2 '--فلوريدا و 3-فلوريدا.
      ملاحظة: يتطلب كل ميليلتر 200 من الخلايا 20 ميليلتر 2 '--فلوريدا أو 3-فلوريدا.
    2. حمل 200 ميليلتر من الخلايا مع 2.0 غرام/لتر التركيز النهائي للتركيز النهائي اللاكتوز أو 2.9 غرام/لتر من إينكوباتي 2 '--FL/3-سائلة في 37 درجة مئوية مع الرج المستمر والسماح للثقافات التي تنمو بين عشية وضحاها.
  3. خلية ثقافة
    1. البذور قبل التجربة اليوم 5 مل من رطل المتوسطة وتستكمل مع كاناميسين وكاربينيسيلين من مستعمرة بكتيرية جديدة، باستخدام تقنية تعقيم.
    2. احتضان جميع الثقافات في 37 درجة مئوية مع إثارة وتنمو الثقافات بين عشية وضحاها.
    3. نقل 50 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها إلى 5 مل الإعلام رطل/M9 الطازجة مع كاناميسين وكاربينيسيلين. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج المستمر والنمو حتى وصلت الثقافة الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) من 0.5 – 0.7. في هذه المرحلة سجل منتصف، يمكن أن يتسبب الخلايا.

2-قياس الأسفار وحدود الكشف

  1. إعداد الخلايا للتدفق الخلوي
    1. نقل الثقافات بين عشية وضحاها إلى 1.5 مل أنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 12,500 س ز لمدة 1 دقيقة.
    2. تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 500 ميليلتر من س 1 الملحية مخزنة الفوسفات (برنامج تلفزيوني؛ 6 مم نا2هبو4مم 1.8 نة2بو4، 145 مم كلوريد الصوديوم في مياه DI، الرقم الهيدروجيني 7.2) بإعداد تعليق خلية مفردة ونقل خلية مفردة تعليق لمل 5 التدفق الخلوي أنابيب.
    3. تبقى الخلايا في الظلام في 4 درجات مئوية حتى تشغيل العينات على سيتوميتير تدفق. للحصول على أفضل النتائج، قم بتحليل الخلايا أسرع.
    4. حدد 488 نانومتر الليزر تثير التجارة والنقل. جمع fluorescein isothiocyanate (فيتك) الأسفار مستويات (أحداث 20,000 – 40,000، بوابات مبعثر إلى الأمام والجانب لتجنب الخلايا المجمعة والحطام) مع عامل تصفية ممر الموجه nm 525/50.
  2. معايرة بيوسينسور
    1. لجعل منحنى معايرة، جعل تخفيف 8 – 10 من معيار 2 '--فلوريدا بملغ النطاق 0-2,500/l.
    2. الثقافة الخلايا بيوسينسينج 2 '--فلوريدا (تحتوي على بأفكا و pET28:GFP) وحملها بتخفيف الموحدة، كما هو موضح سابقا في الفرع 1-3. القيام بثلاثة البيولوجية وإنشاء نسخ متماثلة لتمييع كل.

3-الكشف والتحديد الكمي ل 2 '--فلوريدا في سلالة منتج

  1. زراعة سلالة منتج
    1. لتقديم الحد الأدنى من وسائل الإعلام، وإعداد حلول منفصلة من 1 م ك2مكتب البراءات الهنغاري4، فيسو4·7H2س وسترات الصوديوم والثيامين م 1-HCl. تعقيم الحلول باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. مزيج من وسائل الإعلام M9 مسحوق مرق مع 1 لتر مياه دي. اﻷوتوكﻻف الحل M9 في 121 درجة مئوية للحد الأدنى 15 بارد الحل وصولاً إلى 50 درجة مئوية. إضافة مجسو4كاكل2، ك2هبو4، فيسو4·7H2س، وسترات الصوديوم، والثيامين التركيزات النهائية من 2 مم، 0.1 ملم، 12 غرام/لتر، 11 مغ/لتر، 75 مغ/لتر و 7.5 ميكروغرام/لتر، على التوالي.
    2. بدء ثقافة 2 '--فلوريدا إنتاج سلالة، مثلاً، JM109 جوبك-F2، في 5 مل الإعلام رطل وتركها تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، كما هو موضح في بومغارتنر et al.12.
    3. ثقافة فرعية في 1% كما هو موضح في وقت سابق في خطوة 1.3.3 في 250 مل من وسائل الإعلام الحد الأدنى إعدادها في الخطوة 3.1.1. إضافة الجلسرين إلى نهائي تركيز 10 غرام/لتر، واحتضان ثقافة عند 37 درجة مئوية.
    4. عندما يصل الثقافة التطوير التنظيمي600 من 0.5 – 0.7، إضافة الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) بتركيز نهائي من 0.5 مم واللاكتوز بتركيز نهائي 2 غ/ل.
    5. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج المستمر والسماح للثقافات التي تنمو على ح 24.
  2. استخراج 2 '--فلوريدا
    1. نقل الثقافات بين عشية وضحاها إلى أنابيب معقمة 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 900 x ز لمدة 15 دقيقة.
    2. 3.2.2 تجاهل المادة طافية وتعليق إعادة بيليه في المياه دي. كرر الخطوة يغسل ثلاث مرات لإزالة اللاكتوز المتبقية، وأخيراً إعادة تعليق في 5 مل مياه دي.
    3. لتعليق خلية، استخدم سونيكاتور في السلطة 30 ٪، في 30 ثانية البقول. تبقى الخلايا على الجليد في جميع الأوقات.
    4. الطرد المركزي الخلايا ليسيد لمدة 25 دقيقة في 2,000 س ز. إزالة المادة طافية، يمر عليه عقيمة (مثلاً، 0.22 ميكرومتر) تصفية وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى التحليل.
  3. القياس الكمي مع بيوسينسور
    1. تلقيح ثقافة الخلايا بيوسينسينج 2 '--فلوريدا وفي سجل منتصف المرحلة، حمل مع خلية ما يعادل ليستي المقدرة بتركيزات من 2'--فلوريدا تستخدم لجعل منحنى المعايرة كما هو موضح في القسم 2-2. إجراء المعايرة في الوسط نفسه كنموذج لتحليل (على سبيل المثال، الخلية ليستي) عن طريق إضافة تخفيف 2 '--فلوريدا لمراقبة (أي غير المنتجة) خلية المصفاة قبل حمل الخلايا بيوسينسور.
    2. تشغيل العينات على سيتوميتير تدفق. إنشاء منحنى استجابة لجرعة بالتآمر الإخراج fluorescence ضد تركيز oligosaccharide. مقارنة استجابة للمعايير للخلية ليستي.

4-انتقائية إزالة اللاكتوز

ملاحظة: الخلايا بيوسينسينج حساسة اللاكتوز، ومن المرغوب فيه أن بيوسينسور للكشف عن إهمال بشكل انتقائي على اللاكتوز. وستشمل استراتيجية واحدة الغسيل للخلايا كما هو موضح في المقطع 3.2. ويرد أدناه ثلاث استراتيجيات أخرى.

  1. المعاملة مع التجاري المنقي β-جالاكتوسيداسي
    1. حل جالاكتوسيداسي β المجففة بالتبريد للوحدات (لجنة الاتصالات الفدرالية اللاكتاز) 1,000/mL, 1 مم مجكل2 أو استخدام تجاري β-جالاكتوسيداسي في الحل.
    2. لتحديد تركيز المثلى للانزيم اللازم، تنمو العدوى خلايا بيوسينسينج 2 '--فلوريدا وحمل مع اللاكتوز 2 غرام/لتر و 2.9 غ/ل 2'--فلوريدا في منتصف المرحلة سجل.
    3. 100 ميليلتر الثقافات، إضافة كميات متغيرة من β-جالاكتوسيداسي، يصل إلى 12 وحدة، والسماح للثقافات تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الرج المستمر.
    4. قياس الأسفار النحو المبين في الفرع 2-1 وحساب وحدات الإنزيم اللازمة بتحديد تركيز إنزيم الحد الأدنى لتحقيق التوهين المرجوة من الإشارات الأمثل.
    5. 2-فلوريدا إنتاج الخلايا نمت عن ح 24، إضافة وحدات الأمثل من β-جالاكتوسيداسي واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. المضي قدما في البروتوكول المتعلق بتحديد عيار 2 '--فلوريدا كما هو موضح في القسم 3.3.
  2. ما قبل المعالجة مع لاكز + سلالة
    1. تبدأ ثقافة 25 مل من سلالة 2 '--فلوريدا المنتجة ومجرد فعل في سجل منتصف المرحلة، واحتضان الثقافة في 37 درجة مئوية ح 24.
    2. تطعيم BL21 كولاي الثقافة (DE3) في رطل، أنها تنمو إلى سجل منتصف المرحلة عند 37 درجة مئوية وإضافة 50 مل الثقافة (2:1) لثقافة ح 24.
    3. احتضان في 37 درجة مئوية حاء 3 المضي قدما مع البروتوكول لتحديد عيار 2 '--فلوريدا كما هو موضح في القسم 3.3.
  3. هطول الأمطار اللاكتوز مع الإيثانول
    ملاحظة: هذا القسم هو مقتبس من وماتسوكى et al.12.
    1. تبدأ ثقافة 25 مل من سلالة 2 '--فلوريدا المنتجة ومجرد فعل في سجل منتصف المرحلة، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 24.
    2. إضافة مجلدين من الإيثانول 100% للثقافة، يهز جيدا، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 4.
    3. الطرد المركزي من التعليق في 900 x ز 15 دقيقة جمع المادة طافية واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، ورواسب اللاكتوز.
    4. إزالة اللاكتوز سرع بتمرير الحل عن طريق ورقة تصفية (11 ميكرومتر). جمع فيلتراتي التي هي الخلية الذي يحتوي على 2 '-فلوريدا، التي يمكن قياسها كمياً بالمقطع التالي 3.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لقد قمنا بتصميم بيوسينسور خلية كله معينة إلى 2 '--فلوريدا التي يمكن استخدامها بالاقتران مع إنتاج التكنولوجيا الأحيائية oligosaccharide. وهذا يعتمد على الانقسام الانزيمية محددة لتعديل السكريات محطة توليد اللاكتوز وبالتالي تفعيل مشغل أمريكا اللاتينية والكاريبي ، تؤدي إلى التعبير عن البروتين الفلورسنت مراسل تحت مروج إيندوسيبلي لاكتوز، نسبة إلى كمية 2 '--فلوريدا. كما تم اختبار لإثبات خصوصيته الربط، 3-فوكوسيلاكتوسي (3-فلوريدا)، أيسومر،. الدائرة الوراثية يحتوي على قسمين: استنساخ جين فوكوسيداسي، أو أفكا أو أفكب، يقودها أحد المروجين تأسيسي أسفر عن التعبير التأسيسي إلى ناقل مع تسلسل إشارة بيلب ترميز المنبع الجين فوكوسيداسي إلى تسهيل تصدير بيريبلاسميك، فضلا عن نظام مراسل فلورسنت التي تحتوي على مروج T7 يقود التعبير عن التجارة والنقل. يتم التعبير عن الجزء الأول على بأفكا بلازميد ونظام المراسل الثاني على بلازميد pET28:GFP. وتحولت في بناء النهائي إلى BL21 كولاي (DE3)، سلالة متاحة على نطاق واسع قد بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 دمج الجينوم تحت سيطرة المروج المراعية اللاكتوز pLacUV5. ويبين الشكل 1A التصميم التخطيطي حيث أن القارئ يمكن أن تتبع مبدأ العمل بيوسينسور. يوضح الشكل 1B إشارة الفلورسنت تحت ظروف مختلفة للتعريف كما حلل في سيتوميتير تدفق. واتساقا مع لدينا فرضية، على زيادة بنسبة 100-fold في الأسفار لوحظ بيوسينسور 2 '--فلوريدا مقارنة بمكافحة ناقلات الأمراض فقط أو مع بيوسينسور ل 3-فلوريدا. ويبين هذا الربط-خصوصية عالية بيوسينسور. لضمان أن الإشارة في الواقع بسبب ديفوكوسيليشن، ركضنا عنصر تحكم عن طريق إضافة التجارية α-1 و 2-فوكوسيداسي للثقافة خلال التعريفي، والذي يؤكد كما هو موضح بأشرطة على الحق. يمكن تحديد حساسية الفحص عن طريق توليد منحنى استجابة لجرعة مع اختلاف مستويات الكربوهيدرات (الشكل 2A). من المؤامرة، والنطاق الديناميكي الخطي لكشف 2 '--فلوريدا ما بين 40 و 400 مغ/لتر، والحد من الكشف 4 مغ/لتر. هذا التحليل يمكن أن تنفذ خلال يوم العمل، كما هو موضح بقياسات اللقطة لديناميات مراسل التعبير (الشكل 2).

وأخيراً، نقدم كيف يمكن استخدام الخلايا بيوسينسينج لكشف وتحديد 2 '--فلوريدا من عبئا منتج المهندسة 2'--فلوريدا. حيث تستخدم هذه السلالة اللاكتوز كركيزة، قمنا بتطوير استراتيجيات لتقليل الإشارات من اللاكتوز خارجية حيث مباشرة تتوافق قراءات إشارة إلى تركيز 2 '--فلوريدا (الشكل 3A). هو استراتيجية واحدة للحط من انزيماتيكالي اللاكتوز استخدام β-جالاكتوسيداسي التي لا تعمل على تعديل اللاكتوز. وهذا يمكن تحقيقه باستخدام جالاكتوسيداسي β التجارية التي ترتبط بشكل تفضيلي الأفعال على اللاكتوز، الحد من إشارة اللاكتوز بنسبة 20% من النص الأصلي (الشكل 3B) أو عن طريق الحضانة مع لاكز + سلالة، BL21 البرية من نوع (DE3)، في ثلاث ساعات قطرات اللاكتوز إشارة إلى مستويات الخلفية (الشكل 3). الماضي استراتيجية يستخدم الإيثانول، الذي ليس فقط بشكل انتقائي رواسب اللاكتوز ولكن lyses أيضا إنتاج الخلايا، وتحلل الخلية يجري خطوة ضرورية المصب (الشكل 3D). هذا عملية استخراج بسيطة، ولكن ينبغي توخي الحذر بسبب الانتعاش أقل من 2 '--فلوريدا مقارنة مع أساليب أخرى، ربما من خسائر بسبب بعض بلورة 2'--فلوريدا. على الرغم من إضافة الإيثانول، نحن لم يلاحظ كبيرة تثبيط نمو الخلايا بيوسينسينج، ويحتمل أن الإيثانول النهائي التركيزات منخفضة (< % 2، v/v) في الثقافات. أخيرا، هو الأسلوب الأكثر فعالية لكن مضيعة للوقت نظهر بيليه وتغسل الخلايا قبل تحلل الخلية لإطلاق سراح داخل الخلية 2 '--فلوريدا (3E الشكل). أننا ننصح القارئ إلى استخدام السلطة التقديرية لتحديد الطريقة المناسبة لإزالة اللاكتوز على أساس الكفاءة وتوافر الوقت والمواد الكاشفة.

كما يوضح الشكل 3 أي قدرتنا على تقدير موثوق 2 '--فلوريدا في سياق التكنولوجيا الأحيائية. نحن مثقف أما هندستها 2 '--فلوريدا-إنتاج سلالة11 أو فوكوسيلترانسفيراسي السلبية المسخ (مراقبة سلبية) مع اللاكتوز لرصد إنتاج 2'--فلوريدا في الخلية ليستي. بعد استزراع الخلايا، قمنا بقياس تركيز استخدام كلا من بيوسينسور وعالية الأداء اللوني السائل ([هبلك]) للتحقق من صحة (تكميلية الشكل 1). منحنيات استجابة الجرعة لمنتج ليساتي ومراقبة ليساتي ارتفعت مع 2 '--فلوريدا متشابهة جداً، مما يوضح القياس الكمي من 2'--فلوريدا في إطار الخلية ليساتي.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي بيانات التصميم والممثل بيوسينسور 2 '--فلوريدا- (أ) 2-فوكوسيلاكتوسي (2-فلوريدا) يدخل بيريبلاسم البكتيرية ويتم تحويلها إلى اللاكتوز التي أعربت عن هيتيرولوجوسلي فوكوسيداسي. اللاكتوز هو نقل إلى السيتوبلازم وتحويلها إلى اللولكتس. يقوم هذا بتنشيط مروج LacUV5 الأصلية في BL21 كولاي (DE3)، إنتاج رناب T7, الذي المحاضر بروتينات فلورية خضراء تحت المروج T7، مما يؤدي إلى تعبير البروتينات الفلورية. (ب) الكشف عن 2 '--فلوريدا وفلوريدا. 3 الخلايا التي تحتوي على pET28:GFP وأما بأفكا (الأخضر)، بافكب (أرجواني)، أو ناقلات فارغة (أزرق) كانت المستحث بين عشية وضحاها مع لا السكر، 2-فلوريدا، 2'--فلوريدا مع مناشئ وأضاف α-1، 2-فوكوسيداسي، 3-فلوريدا، أو اللاكتوز. جميع البيانات يتم في متوسط ثلاثة replicates البيولوجية كل تحليله في ثلاث نسخ، حيث تمثل أشرطة الخطأ المعياري من الوسط. دلالة إحصائية يتحدد متعددة مقارنة اختبار في توكي و * * يدل ف < 0.01.  أولاً هذا الرقم أمام القضاء ومانسل14 ويتم استخدامها مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: وصف بيوسينسور للكشف عن 2 '--فلوريدا- (أ) حدود الكشف، ونقل الوظائف من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية. منحنيات استجابة fluorescence يعني تصف بأفكا/2 'فلوريدا (دائرة خضراء) أو ناقل التحكم فارغة (الماس الأزرق) على كميات مختلفة من 2'--فلوريدا مثقف. (ب) دورة الوقت التعبير مراسل. كان المحتضنة سلالة بأفكا مع 2 '--فلوريدا (الساحة الخضراء) والأسفار تم رصد ما يزيد على 8 ح التعريفي. سلالة بأفكا المحتضنة مع اللاكتوز يتم إدراجها كعنصر تحكم. جميع البيانات يتم في متوسط ثلاثة replicates البيولوجية كل تحليله في ثلاث نسخ، حيث تمثل أشرطة الخطأ المعياري من الوسط. أولاً هذا الرقم أمام القضاء ومانسل14 ويتم استخدامها مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الكشف والتحديد الكمي ل 2 '--فلوريدا من سلالة منتج. (أ) سير العمل مما يدل على استخدام بيوسينسور في بروتوكول بسيط مع التركيز الرئيسي على إزالة الضجيج من اللاكتوز المتبقية. (ب) إزالة اللاكتوز بالهضم الأنزيمي β-جالاكتوسيداسي. كانت المحتضنة الثقافات الذي يحتوي على 0.3% 2 '--فلوريدا (الساحة الخضراء) أو اللاكتوز (دائرة زرقاء) من 0.2% مع الثقافات biosensor كانت جزيئي تحتوي على كميات مختلفة من β-جالاكتوسيداسي خارجية في وقت التعريفي للأسفار بعد الحضانة بين عشية وضحاها. (ج) إزالة اللاكتوز بالحضانة مع البرية من نوع لاكز + سلالة. كان المحتضنة يبره يحتوي على 0.3% 2 '--فلوريدا (الدائرة الخضراء)، واللاكتوز 0.2% (المربع الأزرق)، أو خليط 1:1 (0.2% لاكتوز مكافئ، أي 0.1% لاكتوز + 0.15% 2'-فلوريدا، المثلث الأرجواني) لعدة مرات مع BL21 الخلايا (DE3)، ثم إضافتها إلى الثقافات biosensor ل قياس الأسفار بعد الحضانة بين عشية وضحاها. (د) هطول الأمطار من تحلل اللاكتوز وخلية بالمعالجة المسبقة الإيثانول. تخمير JM109 جوبك-F2 (دائرة أرجواني) أو الخلايا جوبك (المثلث الأزرق) JM109 المحتضنة مع وحدات التخزين 2 من الإيثانول وتصفيتها قبل الحضانة مع خلايا biosensor الفلورسنت ومقارنة بالأسفار غير المعالجة JM109 جوبك-F2 (الثقافة الساحة الخضراء). () التحديد الكمي ل 2 '--فلوريدا في الخلية ليستي. تم تقييم بيوسينسور لقدرتها على اكتشاف 2 '--فلوريدا من سلالة منتج أيضي هندسيا. قياسات fluorescence إنشاؤها بواسطة إضافة أما الخام JM109 جوبك-F2 (دائرة أرجواني، 2 '--فلوريدا كمياً بمرض التصلب العصبي المتعدد-LC) أو 2-فلوريدا بمبالغ محددة لسلالة نونبرودوسير JM109 جوبك خلية ليستي (الساحة الخضراء) أو الخام JM109 جوبك السلالة (أزرق الماس). تم التحقق من صحة النتائج بتقدير [هبلك] 2-فلوريدا في سلالة منتج. جميع البيانات يتم في متوسط ثلاثة replicates البيولوجية كل تحليله في ثلاث نسخ، حيث تمثل أشرطة الخطأ العمودي الانحراف المعياري من الأسفار يعني وأشرطة الخطأ الأفقي تمثل الانحراف المعياري في 2 '--فلوريدا يقاس [هبلك] في تريبليكاتيس. أولاً هذا الرقم أمام القضاء ومانسل14 ويتم استخدامها مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الشكل 1: تحليل [هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد 2 '--فلوريدا. (أ) استخراج أيون تشروماتوجرامس من 2 '--فلوريدا (m/z 511). ويرد chromatogram معيار التجارية في الجزء العلوي. تشروماتوجرام 2 '--فلوريدا من سلالة JM109gwBC-F2 (تمييع الوقت) يظهر في الجزء السفلي. الذروة في 511 m/z أدوكت الصوديوم. (ب) يرد توسيع طيف كتلة m/z من 300−800، حيث تركزت على الإشارات الأكثر وفرة للمعيار التجاري (أعلى) و 2 '--فلوريدا من سلالة منتج (أسفل). المنحنى المعياري (ج) تم إنشاؤه بتحليل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد بدرجات متفاوتة من التجارية 2-فلوريدا. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية من ثلاث قياسات. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقدم استراتيجية الفائق لكشف الروابط الخاصة فوكوسيلاتيد أوليجوساكتشاريديس اللبن البشري. كان ذلك عن طريق بناء خلية كله أجهزة استشعار العوامل البيولوجية عن طريق الهندسة وراثيا كولاي التي تستجيب مع إشارة فلورسنت عند الاستقراء مع جليكانس محددة. تفاصيل البروتوكول أيضا على كيف يمكن استخدامها في بيوسينسور لكشف وتحديد إهمال في سلالة بكتيرية أيضي هندسيا.

لدينا بروتوكول يوفر مزايا أكثر من الأساليب البديلة بسبب إنتاجية عالية بالإضافة إلى الربط خصوصيته بالمقارنة مع طرق الكروماتوغرافي/MS. يسمح انخفاض الحد من الكشف وواسعة النطاق الديناميكي للقياس المباشر لإهمال.

تحدث خطوات حاسمة في هذا البروتوكول في إعداد الخلية السلالات المنتجة. لضمان عيار الحد الأقصى من 2 '-فلوريدا، من الأهمية بمكان توفير الظروف المثلى. قد تنشأ التقلبات على دفعات بسبب المعلمات sonication أو إضعاف التعريفي. ينبغي الحرص أثناء وصف بيوسينسور. من المستحسن أيضا لتشغيل الضوابط المناسبة لجميع الخطوات في التجربة ضمان الحصول على نتائج متسقة.

واحد الحد من لدينا بروتوكول هو اعتمادها على اللاكتوز للاستقراء، الذي يصبح عنق زجاجة عند تقديم اللاكتوز بطبيعة الحال، كما هو الحال في حليب الثدي، أو استخدامها كالركيزة في إنتاج التكنولوجيا الأحيائية من إهمال. وقد تناولنا هذا مع أربع استراتيجيات متميزة إزالة إشارة إلى نسبة الضوضاء بحيث بيوسينسور بشكل انتقائي يمكن الكشف عن إهمال على اللاكتوز.

بيوسينسور كامل الخلية المشفرة جينياً المعروضة هنا سيسمح الأمثل للصنع من إهمال، كما يمكن جزيئي العديد من شروط رد فعل أو معلمات مفاعل حيوي في نفس الوقت في غضون ساعات. عند إجراء عملية في لوحات 96-أو 384 جيدا، يظهر الأسلوب القدرة على الشاشة الآلاف من عينات يوميا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل "أموال بدء التشغيل جامعة الدولة آيوا". جزئيا في تمويله هو زمالة ترينيكت جبهة الخلاص الوطني والاستاذية هوبة مانلي. T.J.M. أيده جزئيا كارين وزمالة كلية فوغن ديني. يشكر المؤلفون آيوا جامعة الدولة تدفق مرفق الخلوي ومختبر أبحاث جميع كيك للمساعدة مع الأسفار ودراسات LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86, (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78, (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300, (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67, (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303, (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442, (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8, (1), 5562 (2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411, (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434, (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12, (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25, (10), 1292-1303 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics