Анализ Трисахариды молока Fucosylated человека в биотехнологических контексте с использованием генетически закодированный биосенсоров

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Мы опишем здесь высок объём обнаружения и количественного определения fucosylated олигосахаридов грудного молока (ОУМ) с помощью биосенсора поклеточного. Мы также демонстрируют здесь, адаптация этой платформы к анализу HMO производства штаммов, уделяя особое внимание улучшению соотношение сигнал-шум.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Олигосахаридов грудного молока (ОУМ) являются компонентами сложный углевод человеческого грудного молока, которые демонстрируют обильные преимущества детского здоровья. Однако оптимизации их биотехнологического синтеза ограничивается относительно низкую пропускную способность обнаружения и количественного определения моносахаридов и связей. Обычные методы анализа glycan включают хроматографии/масс спектрометрического методов с пропускной способностью порядка сотни образцов в день без автоматизации. Мы показываем здесь, генетически закодированный бактериальных биосенсора для высокой пропускной способности, связь конкретных обнаружения и количественного определения структур fucosylated HMO, 2'-fucosyllactose и 3-fucosyllactose, которого мы достигли через гетерологичных выражение fucosidases. Как присутствие лактозы в молоке или в биотехнологических процессов может привести к ложным положительным результатам, мы также демонстрируют сокращение сигнала от лактозы, используя различные стратегии. Благодаря высокой пропускной способности этой техники много условий реакции или биореактор параметров может assayed параллельно в течение нескольких часов, что обеспечивает возможность оптимизации производства HMO.

Introduction

Олигосахаридов грудного молока (ОУМ) являются лактоза производные олигосахариды, обычно состоит из трех до восьми сахара мономеров. Они имеют лактозы (Гал β1, 4-Glc) уменьшение конец и далее вытянутые гликозидные связи (β-1,3 - или β-1,6-) глюкозы (КЗС), галактозу (Gal) или N-acetylglucosamine (GlcNAc). Кроме того Фукоза (ОФП, α-1,2 - или α-1,3-) или сиаловая кислота (Sia или NeuAc, α-2,3 - или α-2,6-) остатки часто добавляется1.

Текущий анализ олигосахаридов и других углеводов в пропускную способность и объем ограничен потребность хроматографии/масс-спектрометрии (МС) технология2,3,4,5, 6 , 7, который может занять примерно час образец, не говоря уже о необходимости дорогостоящего оборудования, специализированных столбцов и derivatizing агентов и специалистов по эксплуатации этого оборудования8. Олигосахариды связей особенно трудно определить, требующих передовых MS9,10 или методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР)11. Быстрая оптимизация синтеза этих олигосахариды ограничивается таким образом пропускная способность этой медленной аналитической шаг.

В этом исследовании, мы продемонстрировать связь конкретного выявления fucosylated Трисахариды лактозы основе поликлиниками, сосредоточив внимание на 2'-fucosyllactose (2'-FL), является наиболее распространенным HMO в человеческом молоке, с использованием генетически закодированный Escherichia coli клеточных Биосенсор с пределом обнаружения на 4 мг/л. Важной особенностью этой биодатчик является его способность различать изомерных Трисахариды. Принцип конструкции на основе выражения конкретных fucosidases в E. coli , освободить лактозы с поликлиниками, присутствие которых обнаруживается lac -оперона, который в свою очередь генерирует сигнал флуоресцентные. Мы добиться этого путем создания системы двух плазмиды, один укрывательство связь конкретных fucosidase и другой белок флуоресцентные репортер. Этот биодатчик платформа подходит для высокопроизводительного скрининга проточной цитометрии или микро плита читателя. Мы также демонстрируют использование биосенсор в количественном определении 2'-FL, производимые инженерии штамм12. В рамках этого исследования мы также представляем три стратегии на селективного удаления лактозы, что может привести к ложным положительный сигнал от биосенсор, учитывая, что штамм инженерии продюсер выращивается на лактозу.

Вместе взятые, генетически закодированный биодатчики позволяют нам выявлять и количественно HMOs связь конкретным образом, что трудно даже с хроматографического, MS, или ЯМР методами. Благодаря своей высокой пропускной способности и простоты использования этот метод должен иметь широкое применение в метаболический инжиниринг и синтез HMOs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. клетки культуры и индукции условия

Примечание: В следующих экспериментах, используются три штамма: E. coli BL21 (DE3) с пустой вектор, E. coli BL21 (DE3) с плазмид pAfcA14 и pET28:green флуоресцентный белок (КГВ) и E. coli BL21 (DE3) с плазмиды pAfcB14 и pET28:GFP. Все штаммы выращиваются в бульоне Лурия Бертани (LB) или минимальной СМИ с соответствующие антибиотики. Подготовка запасов решения 1000 x канамицин (50 мг/мл) и carbenicillin (100 мг/мл) в дейонизированной (DI) воды.

  1. Подготовка средств массовой информации
    1. Подготовьте LB СМИ, добавив 25 g акций LB порошка на 1 Л воды ди. Автоклав раствор при температуре 121 ° C за 20 мин до стерилизации. Подождите, пока стерилизованные LB СМИ Температура не ниже 60 ° C до сложения 1 мкл антибиотик запасов для каждого 1 мл LB СМИ.
    2. Подготовить LB тарелки, добавьте 15 g агар LB СМИ до стерилизации. Подождите, пока стерилизованные LB агар Температура не ниже 60 ° C до введения антибиотика.
    3. 1.1.3 для biosensing клеток Подготовьте СМИ или тарелки с двойной антибиотики, канамицин и carbenicillin.
  2. Углеводный индукторов
    1. Подготовка запасов растворы углеводов индукторов в молярной эквиваленты до 20 г/Л лактозы: 29 г/Л 2'-FL и 3-эт.
      Примечание: Каждый 200 мкл клеток потребует 20 мкл 2'-FL или 3-эт.
    2. Побудить 200 мкл клеток с 2,0 г/Л конечная концентрация лактозы или 2,9 г/Л конечная концентрация 2'-FL/3-эт инкубировать при 37 ° C с непрерывной тряски и пусть культуры растут на ночь.
  3. Культура клеток
    1. За день до эксперимента семян 5 мл среды LB, дополненная канамицин и carbenicillin из свежего бактериальные колонии, используя стерильную методику.
    2. Инкубировать всех культур при 37 ° C с перемешиванием и расти культур на ночь.
    3. Передача 50 мкл ночь культуры в 5 мл свежего LB/M9 СМИ с канамицин и carbenicillin. Инкубировать при 37 ° C с непрерывной тряски и расти до тех пор, пока культура достигла оптическая плотность 600 Нм (600OD) 0,5 – 0,7. На этом этапе середины журнала может быть наведено клетки.

2. Измерение флуоресценции и пределы обнаружения

  1. Подготовка клетки для проточной цитометрии
    1. Передачи на ночь культур для 1.5 мл пробирок и центрифуги на 12 500 x g за 1 мин.
    2. Отменить супернатант и вновь приостановить гранулы в 500 мкл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS; 6 мм Na2HPO4, 1.8 мм NaH2PO4, 145 мм NaCl в DI воды, рН 7,2) подготовить одну ячейку подвеска и передавать одну ячейку подвеска в 5 мл цитометрии расходомерных трубок.
    3. Держите клетки в темноте при температуре 4 ° C до запуска примеров на проточный цитометр. Для достижения наилучших результатов анализ клетки как можно скорее.
    4. Выберите 488 нм лазер для возбуждения GFP. Соберите флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) флуоресценции уровней (20 000 – 40 000 мероприятий, закрытом для передней и боковых разброс во избежание агрегированных клеток и мусора) с 525/50 Нм полосовой фильтр.
  2. Калибровка биосенсор
    1. Чтобы сделать калибровочной кривой, сделать 8 – 10 разведений Стандартный 2'-FL в диапазоне 0 – 2500 мг/л
    2. Культура клетки biosensing 2'-FL (содержащий pAfcA и pET28:GFP) и побудить их с стандартных растворов, как описано ранее в разделе 1.3. Проводят три биологических репликация для каждого разведения.

3. выявление и количественная оценка 2'-ФЛ в продюсер штамм

  1. Выращивание штамма продюсер
    1. Для изготовления минимальные средства массовой информации, подготовить отдельные решения 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, натрия цитрата и тиамин 1 M-HCl. стерилизовать решения, с помощью фильтра 0.22 мкм. Смешайте бульон порошок M9 СМИ с 1 Л воды ди. Автоклав M9 раствор при температуре 121 ° C на 15 мин охлаждения решение до 50 ° C. Добавьте в MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, цитрат натрия и тиамина окончательного концентрации 2 мм, 0,1 мм, 12 г/Л, 11 мг/Л, 75 мг/Л и 7.5 мкг/Л, соответственно.
    2. Начало культуры 2'-FL производства штамм, например, JM109 gwBC-F2, 5 мл LB СМИ и пусть растут на ночь при 37 ° C, как описано в Баумгартнер et al.12.
    3. Субкультура в 1%, как описано выше в шаге 1.3.3 в 250 мл минимальной СМИ, подготовленную на этапе 3.1.1. Добавить глицерин в конечной концентрации 10 г/Л и инкубировать культуры при 37 ° C.
    4. Когда культура достигает ОД600 0,5 – 0,7, добавьте изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0,5 мм и лактозы до конечной концентрации 2 г/л
    5. Инкубировать при 37 ° C с непрерывной тряски и пусть культуры растут на 24 часа.
  2. Экстракция 2'-FL
    1. Передать ночи культур стерильные 50 мл трубки и центрифуги на 900 x g за 15 мин.
    2. 3.2.2 удалить супернатант и вновь приостановить Пелле в воде ди. Повторите шаг мыть три раза для удаления остатков лактозы и наконец вновь приостановить в 5 мл воды ди.
    3. Чтобы лизировать клетки подвеска, используйте sonicator на 30% мощности, в 30 s импульсов. Держите клетки на льду во все времена.
    4. Центрифуга лизированных клетках для 25 мин на 2000 x g. Удалить супернатант, передать его через стерильную (например, 0,22 мкм) фильтра и хранить его на 4 ° C до анализа.
  3. Количественная оценка с биосенсор
    1. Прививать культуру 2'-FL biosensing клеток, а также на этапе среднего журнала, побудить с lysate клетки эквивалент к оценкам концентрации 2'-FL, используемый для сделать градуировочного графика, как описано в разделе 2.2. Калибровки в том же обстановке как образец для анализа (например, ячейка lysate) путем добавления разведений 2'-FL управления (т.е.-продюсер) отфильтрованные клеток lysate до вызывая биосенсор клетки.
    2. Выполнение примеров на проточный цитометр. Создание кривой доза реакция путем построения выход флуоресценции против концентрации олигосахариды. Сравните ответ стандартов lysate клетки.

4. селективное удаление лактозы

Примечание: Biosensing клетки чувствительны к лактозы и желательно для биосенсора избирательно обнаруживать HMOs над лактозы. Одна из стратегий будет включать Стиральная клеток, как описано в разделе 3.2. Ниже описаны три другие стратегии.

  1. Лечение с коммерческой очищенный β-галактозидазы
    1. Распустить лиофилизированные β-галактозидазы в 1000 единиц (FCC лактаза) / мл, 1 мм MgCl2 или использовать коммерческие β-галактозидазы в растворе.
    2. Для определения оптимальной концентрации фермента необходимо, растут посевным материалом 2'-FL biosensing клеток и побудить с 2 г/Л лактозы и 2,9 г / Л 2'-FL в середине фазы журнала.
    3. 100 мкл культур добавьте переменную количества β-галактозидазы, до 12 единиц и пусть растут на ночь при 37 ° C с непрерывной тряски культур.
    4. Измерения флуоресценции, как описано в разделе 2.1 и рассчитать оптимальное единиц фермент необходимые определения концентрации минимальный фермента для достижения желаемого затухания сигнала.
    5. 2'-FL производства клетки выросли за 24 ч добавить оптимального единиц β-галактозидазы и Инкубируйте на ночь на 37 ° C. Продолжите с протоколом для определения титра 2'-FL, как описано в разделе 3.3.
  2. Предварительная обработка с LacZ + штамм
    1. Начало 25 мл культуры штамма 2'-FL производства и после индуцированного на этапе среднего журнала, инкубировать культуры при 37 ° C в течение 24 ч.
    2. Прививать E. coli BL21 (DE3) культура в LB, растут в середине журнала фазы при 37 ° C и добавить 50 мл (2:1) культуры к культуре 24 h.
    3. Инкубируйте при 37 ° C для 3 h. продолжить с протоколом для определения титра 2'-FL, как описано в разделе 3.3.
  3. Лактоза осадков с этанолом
    Примечание: Этот раздел заимствован из Мацуки et al.12.
    1. Начало 25 мл культуры штамма 2'-FL производства и после индуцированного на этапе среднего журнала, инкубации при 37 ° C в течение 24 ч.
    2. Добавьте два тома 100% этанола к культуре, встряхнуть и инкубировать при 37 ° C в течение 4 ч.
    3. Центрифуга подвеска на 900 x g для 15 минут собрать супернатант и инкубировать на ночь при 4 ° C, который осаждает лактозы.
    4. Удаления осажденного лактозы, передав решение через фильтровальную бумагу (11 мкм). Сбор фильтрата, что ячейка lysate, содержащий 2'-FL, которые могут быть количественно следующим раздел 3.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы разработали клеточных биосенсора для 2' FL, который может использоваться в сочетании с биотехнологического производства олигосахариды. Это зависит от конкретных ферментативного расщепления изменения терминалов сахара генерации лактозы и тем самым активации lac -оперона, ведущих к выражению репортер флуоресцентный белок под индуцибельной промоутер лактозы, пропорционально Количество 2'-ФЗ. Чтобы продемонстрировать свою специфику связь, 3-fucosyllactose (3-FL), изомер, также был испытан. Генетической цепи состоит из двух частей: fucosidase ген, afcA или afcB, движимый учредительный промоутер результате учредительными экспрессии клонирован на вектор с последовательность сигнала кодируются pelB вверх по течению от fucosidase гена для облегчить периплазматическое экспорта, а также флуоресцентных репортер системы, содержащей T7 промоутер вождения выражение гена GFP. Первая часть выражается на плазмида pAfcA и второй системы репортер на pET28:GFP плазмиды. Окончательной конструкции был преобразован в E. coli BL21 (DE3), широко доступны штамм, который имеет T7 РНК-полимеразы, интегрированы в геном под контролем промотора лактозы отзывчивым pLacUV5. Рисунок 1A показывает эскизного проектирования, так что читатель может следовать принцип работы биодатчик. Рисунок 1B иллюстрирует флуоресцентного сигнала при различных условиях индукции, как анализируется на проточный цитометр. В соответствии с нашей гипотезы, над 100-кратного увеличения в флуоресцировании было отмечено с биосенсор 2'-FL, по сравнению с только для векторного управления или биосенсора для 3-эт. Это показывает высокий связь специфика биодатчик. Чтобы убедиться, что сигнал действительно благодаря defucosylation, мы побежали элемент управления путем добавления коммерческих α-1,2-fucosidase культуры во время индукции, что подтверждается как показано на панели справа. Чувствительность assay может определяться путем создания кривой доза ответ с различными уровнями углеводов (рис. 2A). С участка линейный динамический диапазон обнаружения 2'-FL между 40 и 400 мг/Л и предел обнаружения 4 мг/л. Этот assay может осуществляться в течение рабочего дня, как показано на снимок измерения динамики репортер выражения (рис. 2B).

Наконец мы представляем, как biosensing клетки могут использоваться для выявления и количественной оценки 2'-FL, от штамма продюсер инженерии 2'-FL. Так как этот штамм использует лактозы как субстрат, мы разработали стратегии сокращения сигнал от экзогенных лактозы, так что индикация сигнала будет непосредственно соответствуют 2'-FL концентрации (рис. 3A). Одна из стратегий заключается в ферментативно деградации с помощью β-галактозидазы, которая действует не на изменение лактоза лактоза. Это может быть достигнуто с помощью коммерческих β-галактозидазы, выполняющий преференциально на лактозы, уменьшение лактозы сигнала до 20% оригинала (Рисунок 3В) или через инкубации с LacZ + штамм, одичал тип BL21 (DE3), которая в три часа падает лактозы сигнал для фоновых уровней (рис. 3 c). Последний стратегия использует этанола, который не только выборочно осаждает лактозы, но также лизирует продюсер клетки, лизис клеток является необходимым шагом, вниз по течению (Рисунок 3D). Это простой добычи процесс, но следует проявлять осторожность из-за нижней восстановления 2'-FL, по сравнению с другими методами, возможно от потерь из-за некоторых кристаллизации 2'-ФЗ. Несмотря на добавление этанола, мы не наблюдали значительное торможение роста клеток biosensing, вероятно, потому что окончательный этанола концентрации низки (< 2%, v/v) в культурах. Наконец наиболее эффективным, но трудоемкий метод, которую мы демонстрируем это окатышей и вымыть клетки до лизис клеток выпустить внутриклеточных 2'-FL (Рисунок 3E). Мы рекомендуем читателю использовать усмотрению для выбора соответствующего метода для удаления лактозы, основанный на эффективности и наличия времени и реагенты.

Рисунок 3E также демонстрирует нашу способность надежно количественную оценку 2'-ФЛ в биотехнологических контексте. Мы культивировали либо инженерии 2'-FL-производство штамма11 или fucosyltransferase отрицательные с лактозы для мониторинга производства 2'-FL в lysate клетки мутанта (отрицательный контроль). После культивирования клеток, мы измерили концентрации с использованием высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), так и для биосенсора для проверки (дополнительный рис. 1). Доза ответ кривые для продюсер lysate и управления lysate шипами с 2'-FL очень похожи, который демонстрирует количественного измерения 2'-FL в контексте lysate клетки.

Figure 1
Рисунок 1: схема 2'-FL биосенсор дизайн и представитель данных. (A) 2'-Fucosyllactose (2'-FL) входит бактериальный periplasm и преобразуется лактозы с участием выраженной fucosidase. Лактоза перевезены в цитоплазме и преобразованы в аллолактозы. Это активирует родной LacUV5 промоутер в E. coli BL21 (DE3), производство T7 РНК-Полимераза, которая транскрибирует GFP под T7 промоутер, ведущих к флуоресцентных белков. (B) выявления 2'-FL и 3-эт клетки, содержащие pET28:GFP и pAfcA (зеленый), pAfcB (пурпурный) или пустой переносчиками (синий) были индуцированной ночь с без сахара, 2'-FL, 2'-FL с экзогенно добавлен α-1,2-fucosidase, 3-FL или лактозы. Все данные являются в среднем три биологических реплицирует, которую каждый проанализированы в трех экземплярах, где погрешностей представляют собой стандартное отклонение от среднего значения. Статистическая значимость определяется Тьюки множественные сравнения теста и ** свидетельствует о p < 0.01.  Эта цифра впервые появился в НШАМ и Манселл14 и повторно используется с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: характеристика биосенсора для обнаружения 2'-FL. (A) пределы обнаружения и передачи функций биодатчиков. Ответ кривых с изображением среднее флуоресценции для pAfcA/2 ' FL (зеленый кружок) или пустой элемент управления вектор (синий алмаз) на различное количество 2'-FL культивировали. (B) время курс репортер выражения. Штамм pAfcA был инкубировали с 2'-FL (зеленый квадрат) и флуоресценции контролируется более 8 h индукции. Штамм pAfcA инкубировали с лактозы включается в качестве элемента управления. Все данные являются в среднем три биологических реплицирует, которую каждый проанализированы в трех экземплярах, где погрешностей представляют собой стандартное отклонение от среднего значения. Эта цифра впервые появился в НШАМ и Манселл14 и повторно используется с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: определение и количественная оценка 2'-FL, от производителя штамм. (A) рабочий процесс демонстрации использования биосенсор в простой протокол с упором на устранение шума от остатков лактозы. (B) удаления лактозы, β-галактозидазы ферментативного пищеварения. Культур, содержащие 0,3% 2'-FL (зеленый квадрат) или 0,2% лактозы (синий круг) инкубировали с биосенсор культур, содержащих различное количество внешних β-галактозидазы в индукции время дубликатах для флуоресценции после инкубации на ночь. (C) удаления лактозы по инкубации с одичал тип LacZ + штамма. Фунтов, содержащие 0,3% 2'-FL (зеленый кружок), 0,2% лактозы (голубой квадратный) или смесь 1:1 (0,2% лактозы эквивалент, т.е., 0,1% лактозы + 0,15% 2'-FL, пурпурный треугольник) был инкубированы для различных раз с BL21 (DE3) клетки и затем добавляется биосенсор культур для измерения флуоресценции после инкубации на ночь. (D) осадков лактозы и клеток лизиса на этанол предварительной обработки. Брожения JM109 gwBC-F2 (пурпурный кружок) или JM109 gwBC (синий треугольник) клетки были инкубировали с 2 тома этанола и фильтруются до инкубации с флуоресцентные биосенсор клеток и по сравнению с флуоресценцией от необработанных (культура) JM109 gwBC-F2 зеленый квадрат). (E) количественная оценка 2'-ФЛ в lysate клетки. Биосенсор оценивалась для его способности обнаруживать 2'-FL, от штамма метаболически инженерии продюсер. Измерения флуоресценции, порожденных добавлением либо сырой lysate JM109 gwBC-F2 (пурпурный круг, 2'-FL как количественных, LC-MS), 2'-FL в определенных количествах nonproducer штамм JM109 gwBC клеток lysate (зеленый квадрат) или сырой lysate штамма JM109 gwBC (синий алмаз). Результаты были подтверждены ВЭЖХ количественная оценка 2'-ФЛ в продюсер деформации. Все данные являются в среднем три биологических реплицирует каждый проанализированы в трех экземплярах, где вертикальные планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от среднего флуоресценции и горизонтальные планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение в 2'-FL измеряется ВЭЖХ в triplicates. Эта цифра впервые появился в НШАМ и Манселл14 и повторно используется с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные рисунок 1: анализ ВЭЖХ-МС 2'-эт (A) извлечено хроматограммы Ион 2'-FL (m/z 511). Хроматограмма коммерческого стандарта показано на верхней части. Хроматограмма 2'-FL, от напряжения JM109gwBC-F2 (десятикратного разрежения) отображается в нижней части. Пик на 511 m/z-аддукт натрия. (Б) увеличение массовых спектр m/z от 300−800, где были сосредоточены наиболее распространенных сигналов показан для коммерческого стандарта (вверху) и 2'-ФЗ от производителя штамм (внизу). (C) A калибровочной кривой был создан LC-MS анализ с различными уровнями коммерческих 2'-ФЗ. Планки погрешностей представляют стандартных отклонений от трех экземплярах измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы представляем высок объём стратегию для выявления конкретных связей fucosylated олигосахаридов грудного молока. Это было достигнуто путем построения клеточных биодатчики, генетически инженерных E. coli , который после индукции с конкретными гликанов реагировать с флуоресцентного сигнала. Протокол также подробную информацию о как биосенсор может использоваться для выявления и количественной оценки поликлиниками в метаболически инженерии бактериальный штамм.

Наш протокол предлагает преимущества по сравнению с альтернативными методами из-за его высокой пропускной способности в дополнение к его связь специфика по сравнению с методами хроматографии/MS. Низкий предел обнаружения и широкий динамический диапазон позволяет для прямого измерения поликлиниками.

Важные шаги в этом протоколе происходят в подготовке ячейки lysate продюсер штаммов. Для обеспечения максимального титра 2'-FL, крайне важно для обеспечения оптимальных условий. Вариативности в пакетах могут возникнуть из-за sonication параметров или индукции раз. Следует позаботиться при характеристике биодатчик. Также рекомендуется запускать надлежащего контроля для всех шагов в эксперименте, чтобы гарантировать согласованность результатов.

Одно ограничение нашего протокола является его зависимость от лактозы для индукции, который становится узким местом, когда лактозы естественно, как и в грудное молоко, или использоваться в качестве субстрата в биотехнологического производства HMOs. Мы обратились это с четырех различных стратегий для удаления соотношение сигнал-шум, так что биосенсор выборочно можно обнаружить HMOs над лактозы.

Генетически закодированный поклеточного биосенсор, представленные здесь позволит оптимизации для изготовления поликлиниками, как много условий реакции или биореактор параметров может быть assayed параллельно в течение нескольких часов. При выполнении в 96 - или 384-ну пластины, метод показывает потенциал экран тысячи образцов в день.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана средств запуска Айова государственного университета. Отвязка частично финансировалась NSF Trinect стипендий и Мэнли Hoppe профессора. T.J.M. был частично поддерживается Карен и Денни вон факультета стипендий. Авторы благодарят Айова государственного университета потока цитометрии фонда и W.M. Keck метаболомики научно-исследовательская лаборатория для помощи с флуоресценции и LC-MS исследования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86, (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78, (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300, (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67, (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303, (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442, (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8, (1), 5562 (2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411, (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434, (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12, (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25, (10), 1292-1303 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics