ניתוח של האדם Fucosylated Trisaccharides חלב בהקשר ביוטכנולוגי באמצעות גנטית מקודד ביולוגיים

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

נתאר כאן את כימות של fucosylated חלב oligosaccharides (קופות החולים) באמצעות ביוסנסור תאים שלמים וזיהוי תפוקה גבוהה. גם נדגים כאן, את העיבוד של פלטפורמה זו לקראת ניתוח זנים לייצור קופות החולים, תוך התמקדות בשיפור את האות לרעש יחס.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Oligosaccharides בחלב (קופות החולים) הם פחמימות מורכבות מרכיבים של חלב אם אנושי כי התערוכה בשפע הטבות על בריאות התינוק. עם זאת, אופטימיזציה של סינתזה ביוטכנולוגי שלהם מוגבל על ידי את התפוקה נמוכה יחסית של זיהוי, כימות של חד-סוכר למוטות וחיבורים. טכניקות שגרתיות של ניתוח glycan כוללות שיטות כרומטוגרפי/מסה-spectrometric עם תפוקה של הסדר מאות דוגמאות ליום ללא אוטומציה. נדגים כאן, של ביוסנסור חיידקי מקודדים גנטית תפוקה גבוהה, הצמדה ספציפי זיהוי, כימות של מבנים fucosylated קופות החולים, 2'-fucosyllactose 3-fucosyllactose, אשר השגנו ויה heterologous ביטוי של fucosidases. משום הנוכחות של לקטוז בחלב או בתהליכים הביו-טכנולוגיה עלול לגרום תוצאות חיוביות שגויות, אנחנו גם להוכיח ההפחתה של האות מ לקטוז באמצעות אסטרטגיות שונות. בשל התפוקה הגבוהה של טכניקה זו, תנאי ריאקציה או ביוריאקטור פרמטרים רבים יכול להיות לבדיקה במקביל תוך מספר שעות, המאפשרות אופטימיזציה של קופות החולים הייצור.

Introduction

Oligosaccharides בחלב (קופות החולים) הם לקטוז, נגזר oligosaccharides, הכוללת בדרך כלל 3 עד 8 סוכר מונומרים. הם יש לקטוז (גל-β1, 4-Glc) הפחתת בסוף, הם עוד יותר מאורך על-ידי קישורים glycosidic (β-1, 3 - או β-1, 6-) (Glc) גלוקוז, גלקטוז (Gal) או N-acetylglucosamine (GlcNAc). בנוסף, fucose (Fuc, α-1, 2 - או α-1, 3-) או חומצה sialic (Sia או NeuAc, α-2, 3 - או α-2, 6-) שאריות לעיתים קרובות נוספות1.

הניתוח הנוכחי של oligosaccharides ופחמימות אחרות מוגבל התפוקה ואת היקף על ידי הצורך כרומטוגרפי/מסה spectrometric (MS) טכנולוגיה2,3,4,5, 6 , 7, אשר יכול לקחת בערך שעה עבור דגימה, שלא לדבר על הצורך של ציוד יקר, עמודות מיוחדים סוכנים derivatizing, ואת המומחיות על המבצע של ציוד זה8. פחמימה # מיון הפחמימות קישורים קשים במיוחד לקבוע, הדורשים MS מתקדם9,10 או טכניקות תהודה מגנטית גרעינית (NMR)11. אופטימיזציה מהירה של סינתזה של אלה oligosaccharides ובכך מוגבל על ידי התפוקה של שלב זה אנליטי איטי.

במחקר זה, נדגים זיהוי ספציפי הצמדה של fucosylated trisaccharide קופות מבוססות-לקטוז, התמקדות 2'-fucosyllactose (2'-פל) הנמצא שקמתי הנפוץ ביותר בחלב, באמצעות מקודדים גנטית Escherichia coli כל התא ביוסנסור עם מגבלה של זיהוי-4 מ ג/ל' תכונה חשובה של ביוסנסור זו, היא יכולתה להבחין בין isomeric trisaccharides. עקרון העיצוב מבוסס על הביטוי של fucosidases ספציפי ב e. coli זה לשחרר לקטוז של קופות חולים, הנוכחות של אשר הוא זוהה על ידי הלקטוז, אשר בתורו מפיק אות ניאון . נוכל להשיג זאת על ידי בניית מערכת דו-פלסמיד, אחד מסתיר את fucosidase ספציפיים הצמדה והשני חלבון כתב פלורסנט. הפלטפורמה ביוסנסור מתאימה להקרנה תפוקה גבוהה על-ידי cytometry זרימה או מיקרו-plate הקורא. אנחנו גם להוכיח את הניצול של החיישן ב לכימות 2'-FL המיוצר על ידי זן מהונדסים12. במסגרת מחקר זה, אנו מציגים גם שלוש אסטרטגיות על הסרה סלקטיבית של לקטוז שיכול לגרום אות חיובי כוזב החיישן, בהתחשב בכך המתח מפיק מהונדסים התרגלתי לקטוז.

יחדיו ביולוגיים מקודדים גנטית מאפשרים לנו לזהות ולכמת קופות החולים באופן ספציפי הצמדה, אשר קשה אפילו עם כרומטוגרפי, MS, או NMR טכניקות. בשל תפוקה גבוהה שלה קלות שימוש, שיטה זו צריך יישומים נפוצים הנדסה מטבולית, סינתזה של קופות החולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות התא ותנאי אינדוקציה

הערה: בניסויים הבאים, שלושה זנים משמשים: e. coli BL21 (DE3) עם וקטור ריק, e. coli BL21 (DE3) עם פלסמידים pAfcA14 ו- pET28:green חלבון פלואורסצנטי (GFP), e. coli BL21 (DE3) עם פלסמידים pAfcB14 ו- pET28:GFP. כל הזנים גדלים מרק לוריא-Bertani (LB) או תקשורתי מזערי באנטיביוטיקה מתאימה. להכין מלאי פתרונות של 1,000 x kanamycin (50 מ"ג/מ"ל), carbenicillin (100 מ"ג/מ"ל) ביונים (DI) מים.

  1. הכנה מדיה
    1. להכין LB מדיה על-ידי הוספת 25 אלף מניות אבקת LB 1 ליטר של מים DI. אוטוקלב הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לחטא. לחכות עד הטמפרטורה מדיה LB סטיריליים מתחת 60 ° C לפני תוספת של 1 µL אנטיביוטי במניה כל 1 מ"ל של מדיה ליברות.
    2. כדי להכין צלחות ליברות, להוסיף 15 גרם אגר התקשורת LB שלפני החיטוי. לחכות עד הטמפרטורה אגר LB סטיריליים מתחת 60 ° C לפני חיבור של אנטיביוטיקה.
    3. 1.1.3 עבור התאים biosensing, להכין מדיה או צלחות עם אנטיביוטיקה כפול, kanamycin, carbenicillin.
  2. פחמימות inducers
    1. להכין מלאי פתרונות של inducers פחמימות-המקבילה טוחנת 20 g/L של לקטוז: 29 g/L 2'-FL, קומה 3
      הערה: כל µL 200 של תאים ידרוש µL 20 2'-FL או קומה 3
    2. זירוז µL 200 של תאים עם 2.0 g/L הריכוז הסופי של לקטוז או 2.9 g/L הריכוז הסופי של Incubate 2'-פל/3-קומה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות רציפה ותנו תרבויות לגדול בין לילה.
  3. תרבית תאים
    1. יום לפני הניסוי זרע מ ל LB בינוני בתוספת kanamycin, carbenicillin של מושבת חיידקים טריים, בטכניקה סטרילי.
    2. דגירה בכל התרבויות ב 37 ° C עם עצבנות ולגדול התרבויות בין לילה.
    3. להעביר 50 µL של תרבות לילה 5 מ של מדיה ליברות/M9 טריים עם kanamycin, carbenicillin. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות רציפה וגדל עד התרבות הגיעה צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של 0.5-0.7. בשלב זה יומן אמצע, התאים יכולה להיגרם.

2. מדידת קרינה פלואורסצנטית ומגבלות של זיהוי

  1. הכנה של תאים עבור cytometry זרימה
    1. להעביר את התרבויות לילה 1.5 mL צינורות, צנטריפוגה ב 12,500 x g עבור 1 דקות.
    2. למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשהות בגדר ב 500 µL של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS; 6 מ מ נה2HPO4, 1.8 מ"מ NaH2PO4, 145 מ"מ NaCl במים DI, pH 7.2) להכין השעיה תא בודד ולהעביר התא הבודד ההשעיה ל מ ל צינורות cytometry זרימה.
    3. להשאיר את התאים באפלה ב 4 ° C עד פועל הדגימות cytometer זרימה. לקבלת תוצאות מיטביות, לנתח את התאים בהקדם האפשרי.
    4. בחר 488 ננומטר לייזר כדי לרגש GFP. איסוף fluorescein isothiocyanate (FITC) רמות קרינה פלואורסצנטית (20,000 – 40,000 אירועים, פיקוח על פיזור קדימה ואת הצד להימנע מצטברים תאים ופסולת) עם מסנן bandpass 525/50 ננומטר.
  2. . מכיילת את החיישן
    1. כדי לבצע עקומת כיול, בצע 8-10 דילולים של תקן 2'-הרצ ב הרוסים בטווח 0 – 2,500/ל'
    2. התרבות התאים biosensing 2'-פל (המכילים pAfcA ו- pET28:GFP), זירוז אותם עם דילולים רגיל, כפי שתואר לעיל בסעיף 1.3. משכפל ביולוגי שלושה עבור כל דילול לבצע.

3. זיהוי, כימות של 2'-FL בזן מפיק

  1. טיפוח של מפיק זן
    1. להכנת תקשורתי מזערי, להכין פתרונות נפרדים של 1 מ' K-2-HPO-4, מכל4·7H2O, סודיום ציטרט, תיאמין 1 מ'-HCl. לחטא את הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. מיקס מדיה M9 אבקת מרק עם 1 ליטר מים DI. אוטוקלב הפתרון M9 ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות מגניב הפתרון עד 50 מעלות צלזיוס. הוסף MgSO4, CaCl2, K2HPO4, מכל4·7H2O, סודיום ציטרט, ו תיאמין ריכוזי הסופי של 2 מ מ, 0.1 מ מ, 12 g/L, 11 מ ג/ליטר, 75 מ ג/ליטר ו- 7.5 µg/L, בהתאמה.
    2. התחל תרבות של 2'-FL בהפקת זן, למשל, JM109 gwBC-F2, ב 5 מ ל LB מדיה ולתת לו לגדול בין לילה ב 37 ° C, כפי שמתואר באומגרטנר et al.12.
    3. תת-תרבות ב 1% כפי שמתואר בתחילת שלב 1.3.3 ב 250 מל של התקשורת מינימלי מוכן בשלב 3.1.1. להוסיף גליצרול ריכוז סופי של 10 גרם/ליטר, דגירה התרבות ב 37 º C.
    4. התרבות מגיעה עם יתר600 של 0.5-0.7, להוסיף איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ריכוז סופי של 0.5 מ מ, לקטוז כדי ריכוז סופי של 2 גר'/ל'
    5. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות רציפה ותנו תרבויות לגדול במשך 24 שעות ביממה.
  2. מיצוי של 2'-פל
    1. להעביר את התרבויות לילה צינורות סטרילי 50 מ ל, צנטריפוגה ב x 900 גרם למשך 15 דקות.
    2. 3.2.2 למחוק את תגובת שיקוע והשהה מחדש בגדר במים DI. חזור על השלב שטיפת שלוש פעמים כדי להסיר שאריות לקטוז, סוף סוף מחדש להשהות ב 5 מ ל מים DI.
    3. כדי lyse התליה תא, להשתמש sonicator של 30% כוח ב-30 פעימות s. שמור את התאים על קרח בכל עת.
    4. Centrifuge את התאים lysed עבור 25 דקות ב 2,000 x g. להסיר את תגובת שיקוע, להעביר את זה דרך סטרילי (למשל, 0.22 מיקרומטר) לסנן ואחסן אותו ב 4 ° C עד הניתוח.
  3. כימות עם ביוסנסור
    1. לחסן תרבות של תאים biosensing 2'-FL, בשלב אמצע יומן, זירוז עם תא lysate מקביל משוער ריכוזי 2'-FL נהגה להכין את עקומת כיול כמתואר בסעיף 2.2. לבצע את הכיול חצרו אותו כמו הדגימה כדי להיות מנותח (למשל, תא lysate) על-ידי הוספת דילולים של 2'-פל בקרה (קרי, המפיק-שאינם) מסוננים תא lysate לפני גרימת ביוסנסור תאים.
    2. להפעיל את הדוגמאות על cytometer זרימה. יוצרות עקומת מנה-תגובה מאת התוויית פלט קרינה פלואורסצנטית נגד הריכוז פחמימה # מיון הפחמימות. להשוות את התגובה של הסטנדרטים אל התא lysate.

4. סלקטיבי הסרה של לקטוז

הערה: התאים biosensing רגישים ללקטוז וזה רצוי עבור החיישן לזיהוי קופות החולים באופן סלקטיבי על לקטוז. אסטרטגיה אחת יכלול כביסה של תאים כמתואר בסעיף 3.2. שלוש אסטרטגיות אחרות שיפורטו להלן.

  1. טיפול עם מסחרי מטוהרים β-galactosidase
    1. להמיס lyophilized β-galactosidase על יחידות (ה-FCC לקטאז) 1,000/mL, ב- 1 מ מ MgCl2 או שימוש מסחרי β-galactosidase בפתרון.
    2. כדי לקבוע ריכוז אופטימלי של האנזים הדרוש, לגדול על inoculum של תאים biosensing 2'-FL, זירוז עם לקטוז 2 g/L ו- 2.9 g / L 2'-פל בשלב יומן באמצע.
    3. לתרבויות µL 100, הוסף משתנה של β-galactosidase, עד 12 יחידות, ותנו התרבויות לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות רציפה.
    4. למדוד את קרינה פלואורסצנטית כמתואר בסעיף 2.1 ולחשב היחידות האופטימלי של אנזימים הדרושים על-ידי קביעת ריכוז האנזים מינימום על מנת להגיע הרצוי הנחתה של אות.
    5. לתאים 2'-FL בהפקת גדל במשך 24 שעות ביממה, להוסיף יחידות האופטימלי של β-galactosidase, דגירה בין לילה ב 37 º C. להמשיך עם הפרוטוקול לקביעת כייל את 2'-FL כמתואר בסעיף 3.3.
  2. טיפול קדם עם LacZ + מתח
    1. תחילת תרבות 25 מ של 2'-FL בהפקת זן ופעם המושרה בשלב אמצע יומן, דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    2. לחסן e. coli BL21 התרבות (DE3) ב- LB, לגדל את זה לשלב באמצע יומן ב 37 מעלות צלזיוס ולהוסיף 50 מ של התרבות (2:1) התרבות 24 שעות ביממה.
    3. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ח' להמשיך עם הפרוטוקול לקביעת כייל את 2'-FL כמתואר בסעיף 3.3.
  3. לקטוז משקעים עם אתנול
    הערה: סעיף זה מותאמת Matsuki et al.12.
    1. תחילת תרבות 25 מ של 2'-FL בהפקת זן ופעם המושרה בשלב אמצע יומן, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    2. להוסיף שני כרכים של 100% אתנול לתרבות, לנער היטב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
    3. Centrifuge המתלים ב x 900 גרם במשך 15 דקות לאסוף את תגובת שיקוע, דגירה בין לילה ב 4 ° C, אשר ארגונייט שוקע של לקטוז.
    4. הסר את לקטוז precipitated על-ידי העברת הפתרון דרך נייר פילטר (11 מיקרומטר). לאסוף את פילטרט של זה הוא lysate המכיל את 2'-פל, אשר ניתן לכמת על-ידי המקטע הבא 3.3 התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תיכננו ביוסנסור התא כולו ספיציפית 2'-FL שיכול לשמש בשילוב עם ייצור ביוטכנולוגי פחמימה # מיון הפחמימות. זה מסתמך על המחשוף אנזימטי ספציפי של שינוי מסוף סוכרים ליצירת לקטוז וע י הפעלת אופרון הלקטוז, המוביל לביטוי של חלבון פלואורסצנטי כתב תחת מקדם inducible לקטוז, ב proportion כמות של 2'-קומה כדי להדגים ירידה לפרטים שלה הצמדה, 3-fucosyllactose (3-FL), איזומר של, גם נבדקה. המעגל גנטית מכיל שני חלקים: ג'ין fucosidase, afcA או afcB, מונע על ידי יזם מכוננת והתוצאה היא ביטוי המכונן של משובטים על וקטור עם רצף אות של pelB מקודד הזרם של הגן fucosidase להקל על ייצוא periplasmic, כמו גם מערכת הכתב פלורסנט המכיל את המקדם T7 נהיגה ביטוי של ה-GFP. החלק הראשון מבוטא על פלסמיד pAfcA ומערכת כתב השני על פלסמיד pET28:GFP. הבונה הסופית הפכה e. coli BL21 (DE3), זן הנפוצה כי יש את T7 RNA פולימראז משולב לתוך הגנום תחת שליטה של האמרגן pLacUV5 מגיב לקטוז. איור 1A מציג עיצוב סכמטי כך שהקורא יכול לעקוב אחר עקרון הפעולה של החיישן. איור 1B ממחיש את האות פלורסנט בתנאים שונים האינדוקציה כפי שנותחו על cytometer זרימה. מסתדר עם ההשערה שלנו, על עלייה 100-fold קרינה פלואורסצנטית נצפתה עם החיישן 2'-FL בהשוואה הפקד וקטור בלבד או את החיישן עבור 3-קומה זה מראה הצמדה-יחודיות גבוהה של החיישן. כדי להבטיח כי האות הוא אכן בשל defucosylation, רצנו פקד על-ידי הוספת מסחרי α-1, 2-fucosidase לתרבות במהלך אינדוקציה, אשר אושר כפי שמוצג בסורגים בצד הימין. הרגישות של וזמינותו יכול להיקבע על ידי יצירת עקומת מנה-תגובה עם משתנה רמות פחמימות (איור 2 א). מן העלילה, הטווח הדינמי ליניארי של זיהוי 2'-FL הוא בין 40 ו 400 מ"ג/L וכן מהמגבלה של זיהוי הוא 4 מ ג/ל' Assay זה יכול להתבצע במהלך יום העבודה, כפי שהראה את המידות תצלום בזק של הדינמיקה של הכתב ביטוי (איור 2B).

לבסוף, אנו מציגים כיצד ניתן להשתמש כדי לזהות ולכמת 2'-FL מ זן מפיק מהונדסים-2' FL התאים biosensing. מאז זה זן משתמשת לקטוז כמו מצע, פיתחנו אסטרטגיות כדי להפחית את האות של לקטוז אקסוגני כך המדידה האות מתכתב ישירות לריכוז 2'-פל (איור 3 א). אסטרטגיה אחת היא enzymatically לבזות את לקטוז באמצעות β-galactosidase שאינה לפעול על לקטוז ששונה. זו יכולה להיות מושגת באמצעות β-galactosidase מסחרי מעדיפים הפועל על לקטוז, הפחתת האות לקטוז ל-20% המקורי (איור 3B) או באמצעות דגירה עם LacZ + זן, פראי-סוג BL21 (DE3), אשר תוך 3 שעות טיפות של חלב (לקטוז) אות לרמות רקע (איור 3C). אסטרטגיה האחרונה מנצל אתנול, אשר לא רק באופן סלקטיבי ארגונייט שוקע לקטוז אלא גם lyses את התאים מפיק, פירוק התא להיות הכרחי צעד במורד הזרם (איור תלת-ממד). זהו תהליך החילוץ פשוטות, אך להקפיד בשל התאוששות נמוך של 2'-FL לעומת שיטות אחרות, ואולי מפני הפסדים בשל כמה התגבשות של 2'-קומה למרות התוספת של אתנול, לא נתבונן עיכוב משמעותי של צמיחה של תאי biosensing, סביר להניח כי ריכוזי אתנול הסופי נמוכים (< % 2, וי/v) בתרבויות. לבסוף, השיטה יעילה ביותר, אך גוזלת זמן שנדגים היא גלולה. ולשטוף את התאים לפני פירוק התא כדי לשחרר את תאיים 2'-פל (איור 3E). אנו מייעצים הקורא לנהוג בחשאיות על בחירת השיטה המתאימה להסרת לקטוז בהתבסס על יעילות וזמינות של ריאגנטים וזמן.

איור 3E גם מדגים את היכולת שלנו בצורה אמינה לכמת 2'-FL בהקשר הביו-טכנולוגיה. אנחנו תרבותי או מהונדסים 2'-פל-בהפקת זן11 או של fucosyltransferase שליליות מוטציה (בקרה שלילית) עם לקטוז כדי לפקח על הייצור של 2'-FL תא lysate. לאחר culturing התאים, מדדנו את הריכוז באמצעות ביוסנסור והן ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) עבור אימות (משלים איור 1). עקומות תגובת המינון מפיק lysate ובקרה lysate עם 2'-FL דומים מאוד, אשר מדגים מדידה כמותית של 2'-FL בהקשר של התא lysate.

Figure 1
איור 1: סכימטי של 2'-FL ביוסנסור עיצוב, נציג נתונים. (א) 2'-Fucosyllactose (2'-פל) מזין את periplasm חיידקי, מומר על-ידי fucosidase heterologously ביטוי לקטוז. לקטוז הוא מועבר אל הציטופלסמה, המרה allolactose. פעולה זו מפעילה את מקדם LacUV5 מקורי ב- e. coli BL21 (DE3), בהפקת T7 RNAP, אשר transcribes GFP תחת מקדם T7, המוביל אל ביטוי חלבון פלואורסצנטי. (B) זיהוי של 2'-פל ו 3-קומה תאים המכילים pET28:GFP, pAfcA (ירוק), pAfcB (מגנטה) או פקד וקטור ריק (כחול) היו המושרה למשך הלילה עם לא סוכר, 2'-FL, 2'-חליל הוסיף exogenously α-1, 2-fucosidase, 3-FL או לקטוז. כל הנתונים נמצאים בממוצע שלוש משכפל ביולוגי שאחד ניתח דולר, כאשר קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן מן הממוצע. מובהקות סטטיסטית נקבע ע י מבחן השוואה מרובים של Tukey, * * מעידה על p < 0.01.  דמות זו תחילה הופיע Enam, מנסל14 , שימוש חוזר עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: אפיון ביוסנסור לגילוי 2'-FL- (א) גבולות של פונקציות איתור והעברה של ביולוגיים. תגובת ' עקומות ' המתאר פלורסצנטיות רשע pAfcA/2 ' פל (עיגול ירוק) או בקרה הריק וקטור (היהלום הכחול)-כמויות משתנות של 2'-FL תרבותי. (B) מסלול הזמן הביטוי העיתונאי. זן pAfcA, נדגרה עם 2'-פל (ריבוע ירוק), קרינה פלואורסצנטית נוטרו מעל 8 שעות האינדוקציה. PAfcA זן מתפשט עם לקטוז נכלל בתור פקד. כל הנתונים נמצאים בממוצע שלוש משכפל ביולוגי שאחד ניתח דולר, כאשר קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן מן הממוצע. דמות זו תחילה הופיע Enam, מנסל14 , שימוש חוזר עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: זיהוי, כימות של 2'-FL מ זן מפיק. זרימת עבודה (A) הממחיש את השימוש החיישן ב פרוטוקול פשוט עם התמקדות מפתח הסרת רעש שיורי לקטוז. (B) הסרה של לקטוז על ידי β-galactosidase עיכול אנזימטי. תרבויות המכיל 0.3% 2'-פל (ריבוע ירוק) או 0.2% לקטוז (העיגול הכחול) היו מודגרות עם תרבויות ביוסנסור המכיל כמויות משתנות של β-galactosidase אקסוגני בזמן אינדוקציה היו לבדיקה עבור קרינה פלואורסצנטית לאחר דגירה בין לילה. (ג) הסרה של לקטוז על ידי דגירה עם פראי-סוג LacZ + זן. LB המכיל 0.3% 2'-פל (עיגול ירוק), 0.2% לקטוז (רבוע כחול) או תערובת 1:1 (0.2% לקטוז המקביל, קרי, לקטוז 0.1% + 0.15% 2'-FL, מגנטה משולש), נדגרה על במועדים שונים עם BL21 תאים (DE3), ולאחר מכן נוסף תרבויות ביוסנסור פלורסצנטיות מדידה לאחר דגירה בין לילה. (ד) משקעים של פירוק לקטוז ותא על ידי רעלני אתנול. Fermentations של JM109 gwBC-F2 (עיגול בצבע ארגמן) או תאים gwBC (משולש כחול) JM109 היו מודגרות עם 2 כרכים של אתנול, סינון לפני הדגירה עם תאים ביוסנסור פלורסנט, לעומת זריחה של לא מטופל JM109 gwBC-F2 תרבות ( ריבוע ירוק). (E) כימות של 2'-FL תא lysate. החיישן הוערך ביכולתה לזהות 2'-FL מ זן מפיק סמויה מהונדסים. מדידות קרינה פלואורסצנטית שנוצר על ידי תוספת של הגולמי lysate של JM109 gwBC-F2 (עיגול בצבע ארגמן, 2'-FL כמו כימות מאת LC-MS), 2'-FL בסכומים המוגדרים לאמץ nonproducer JM109 gwBC תא lysate (ריבוע ירוק) או גולמי lysate של JM109 gwBC זן (כחול יהלום). התוצאות היו אומת על-ידי HPLC כימות של 2'-FL במפיק זן. כל הנתונים נמצאים בממוצע שלוש משכפל ביולוגי אחד ניתח שהפקידים, קווי שגיאה אנכי לייצג סטיית תקן בין ידי קרינה פלואורסצנטית רשע ואיפה קווי שגיאה אופקי לייצג סטיית התקן של 2'-פלורידה נמדדת ב- hplc, קורס triplicates. דמות זו תחילה הופיע Enam, מנסל14 , שימוש חוזר עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה איור 1: HPLC-MS ניתוח של 2'-קומה (א) לחלץ יון chromatograms של 2'-פל (מ/z 511). Chromatogram ברמה מסחרית מוצג על גבי. Chromatogram של 2'-FL בגלל הלחץ JM109gwBC-F2 (דילול 10-fold) מוצג בתחתית. הפסגה ב מ 511/z הוא הנתרן adduct. (B) – הגדלה של ספקטרום מסה m/z מן 300−800, איפה האותות הנפוץ ביותר היו מרוכזים מוצג עבור תקן מסחרי (למעלה) ו- 2'-הרצ מן המתח מפיק (למטה). עיקול רגיל (ג) A נוצר על ידי ניתוח LC-MS עם רמות משתנות של מסחרי-2' קומה קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן מן המידות triplicate. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מציגים אסטרטגיה תפוקה גבוהה לאיתור ספציפי הצמדה fucosylated בחלב oligosaccharides. דבר זה הושג על ידי בניית התא כולו ביולוגיים באמצעות הנדסה גנטית e. coli אשר על אינדוקציה עם glycans מסוימים מגיבים אות ניאון. הפרוטוקול מפרט גם על איך החיישן יכול לשמש כדי לזהות ולכמת קופות החולים בזן חיידקי סמויה מהונדסים.

פרוטוקול שלנו מציע יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות בשל תפוקה גבוהה שלה בנוסף שלה הצמדה-ירידה לפרטים בהשוואה לשיטות כרומטוגרפי/MS. המגבלה נמוכה של זיהוי, טווח דינאמי רחב מאפשר מדידה ישירה של קופות החולים.

השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה להתרחש בהכנה של התא lysate של מפיק זנים. להבטחת כייל מקסימלית של 2'-FL, זה הכרחי לספק את התנאים האופטימליים. Variabilities בקבוצות שעלולים להתעורר עקב sonication פרמטרים או אינדוקציה פעמים. צריך לקחת במהלך אפיון החיישן. מומלץ גם להפעיל פקדי נכונה עבור כל השלבים בניסוי כדי להבטיח תוצאות עקביות.

מגבלה אחת של פרוטוקול שלנו הוא הסתמכותו על לקטוז על אינדוקציה, אשר הופך צוואר בקבוק כאשר לקטוז באופן טבעי להציג, כמו חלב אם, או משמש המצע ייצור ביוטכנולוגי של קופות החולים. . פתרנו את זה עם ארבע אסטרטגיות שונות כדי להסיר את האות לרעש יחס כך החיישן ניתן לזהות באופן סלקטיבי קופות החולים על לקטוז

החיישן כולה תאים מקודדים גנטית המובאת כאן יאפשר אופטימיזציה עבור הייצור של קופות חולים, כמו תנאי ריאקציה או ביוריאקטור פרמטרים רבים יכולים להיות לבדיקה במקביל תוך מספר שעות. כאשר מבוצעת ב- 96 - או 384-ובכן צלחות, השיטה מראה פוטנציאל מסך אלפי דוגמאות לכל יום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי איווה המדינה אוניברסיטת הפעלה כספים. הקיבולות נשמר מומן בחלקו על ידי ה-NSF Trinect אחוות מנלי Hoppe פרופסורה. T.J.M. מומן בחלקו על ידי קרן דני מלגת הפקולטה ווהן. המחברים תודה איווה המדינה אוניברסיטת Flow Cytometry המתקן את מעבדת המחקר גליקומיקס קק W.M. לקבלת סיוע עם פלורסצנטיות ולימודי LC-MS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86, (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78, (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300, (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67, (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303, (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442, (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8, (1), 5562 (2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411, (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434, (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12, (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25, (10), 1292-1303 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics