Analys av Fucosylated mänskliga mjölk trisackarider i biotekniska sammanhang med genetiskt kodade biosensorer

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi beskriver här hög genomströmning detektering och kvantifiering av fucosylated bröstmjölk oligosackarider (HMOs) använder en hela-cell biosensor. Vi visar även här, anpassning av denna plattform mot analys av HMO produktion stammar, med fokus på att förbättra signal-brusförhållande.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bröstmjölk oligosackarider (HMOs) är komplexa kolhydrater, komponenter av bröstmjölk som uppvisar rikliga fördelar på spädbarns hälsa. Optimering av deras bioteknologiska syntes begränsas emellertid av relativt låg genomströmning av detektering och kvantifiering av monosackarid och kopplingar. Konventionella tekniker av glykananalys inkluderar kromatografiska/massa-spektrometriska metoder med genomströmning storleksordningen hundratals prover per dag utan automatisering. Vi visar här, en genetiskt kodade bakteriell biosensor för hög genomströmning, koppling-specifika detektering och kvantifiering av fucosylated HMO strukturer, 2'-fucosyllactose och 3-fucosyllactose, som vi uppnått via heterologa uttryck för fucosidases. Eftersom förekomsten av laktos i mjölk eller i biotekniska processer kan leda till falsklarm, Visa vi också minskning av signalen från laktos med hjälp av olika strategier. På grund av hög genomströmning av denna teknik, kunde många reaktion villkor eller bioreaktor parametrar analyseras parallellt i några timmar, vilket möjliggör optimering av HMO tillverkning.

Introduction

Bröstmjölk oligosackarider (HMOs) är laktos-derived oligosackarider, som oftast består av tre till åtta socker monomerer. De har en laktos (Gal-β1, 4-Glc) att minska slut och är ytterligare avlånga av glycosidic länkar (β-1,3 - eller β-1,6-) till glukos (Glc), galaktos (Gal) eller N-acetylglukosamin (GlcNAc). Dessutom fukos (Fuc, α-1,2 - eller α-1,3-) eller sialic acid (Sia eller NeuAc, α-2,3 - eller α-2,6-) rester läggs ofta1.

Aktuell analys av oligosackarider och andra kolhydrater är begränsad i genomströmning och omfattningen av behovet av kromatografiska/massa spektrometriska (MS) teknik2,3,4,5, 6 , 7, vilket kan ta ungefär en timme per prov, att inte nämna behovet av dyrbar utrustning, specialiserade kolumner och derivatizing agenter och expertis på driften av denna utrustning8. Oligosackarid kopplingar är särskilt svår att fastställa, kräver avancerad MS9,10 eller kärnmagnetisk resonans (NMR) teknik11. Snabb optimering av syntes av dessa oligosackarider begränsas således av genomströmning av detta långsam analytiska steg.

I denna studie visar vi kopplingen-detektering av fucosylated trisaccharide laktos-baserade HMOs, med fokus på 2'-fucosyllactose (2'-FL) som är den vanligast förekommande HMO i bröstmjölk, använder en genetiskt kodade Escherichia coli hela cellen Biosensor med en detektionsgräns på 4 mg/L. Ett viktigt inslag i denna biosensor är dess förmåga att skilja mellan isomera trisackarider. Designprincipen är baserad på uttrycket av specifika fucosidases i E. coli som befria laktos från HMOs, vars förekomst upptäcks av den lac operon, som i sin tur genererar en fluorescerande signal. Detta uppnår vi genom att bygga en två-plasmid systemet, en härbärgerat den koppling-specifika fucosidase och den andra ett fluorescerande reporter protein. Denna biosensor plattform är lämplig för high-throughput screening av flödescytometri eller mikro-plate reader. Vi visar också utnyttjandet av biosensor kvantifiera 2'-FL produceras av en konstruerad stam12. Inom denna studie presenterar vi också tre strategier på selektiv borttagning av laktos som kan resultera i falskt positiv signal från biosensor, med tanke på att den bakåtkompilerade producent stammen odlas på laktos.

Sammantaget de genetiskt kodade biosensorer tillåter oss att upptäcka och kvantifiera HMOs i ett länkage-specifika sätt, vilket är svårt även med HPLC, MS, eller NMR tekniker. På grund av dess hög genomströmning och användarvänlighet, bör denna metod har omfattande program inom metabola verkstads- och syntes av HMOs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cell kultur och induktion villkor

Obs: I följande experiment, tre stammar används: E. coli BL21 (DE3) med en tom vektor, E. coli BL21 (DE3) med plasmider pAfcA14 och pET28:green fluorescerande protein (GFP), och E. coli BL21 (DE3) med plasmider pAfcB14 och pET28:GFP. Alla stammar odlas i Luria-Bertani buljong (LB) eller minimal media med lämplig antibiotika. Förbereda stamlösningar av 1000 x kanamycin (50 mg/mL) och carbenicillin (100 mg/mL) i avjoniserat vatten (DI) vatten.

  1. Media förberedelse
    1. Förbered LB genom att lägga till 25 g LB pulver lager 1 L DI vatten. Autoklav lösningen vid 121 ° C i 20 min att sterilisera. Vänta tills steriliserad LB media temperaturen är under 60 ° C före tillsats av 1 µL antibiotika lager för varje 1 mL LB media.
    2. För att förbereda LB tallrikar, tillsätt 15 g agar till LB media före sterilisering. Vänta tills steriliserad LB agar temperaturen är under 60 ° C före tillsats av antibiotika.
    3. 1.1.3 för biosensing cellerna, förbereda media eller plattor med dubbla antibiotika, kanamycin och carbenicillin.
  2. Kolhydrat-inducerare
    1. Förbereda stamlösningar av de kolhydrat-inducerare på molar motsvarigheter till 20 g/L laktos: 29 g/L 2'-FL och 3-FL.
      Obs: Varje 200 µL av celler kommer att kräva 20 µL av 2'-FL eller 3-FL.
    2. Inducera 200 µL av celler med 2,0 g/L slutliga koncentration av laktos eller 2.9 HB slutlig koncentration på 2'-FL/3-FL. Inkubera vid 37 ° C under ständig skakning och låt kulturer växa över natten.
  3. Cellkultur
    1. Dagen innan experimentet utsäde 5 mL LB medium kompletteras med kanamycin och carbenicillin från en färsk bakteriell koloni, med steril teknik.
    2. Inkubera alla kulturer vid 37 ° C med agitation och växa kulturer över natten.
    3. Över 50 µL av övernattning kultur till 5 mL färsk LB/M9 medier med kanamycin och carbenicillin. Inkubera vid 37 ° C under ständig skakning och växa tills kultur har nått optisk densitet vid 600 nm (OD600) av 0,5 – 0,7. På denna halva log fas, kan cellerna induceras.

2. mätning av fluorescens och detektionsgränser

  1. Beredning av celler för flödescytometri
    1. Överföra de övernattande kulturerna till 1,5 mL rör och centrifugera vid 12500 x g i 1 min.
    2. Avlägsna supernatanten och slamma pelleten i 500 µL 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl i DI vatten, pH 7,2) för att förbereda en enda cellsuspension och överföra den enda cellen upphängning till 5 mL flöde flödescytometri rör.
    3. Hålla cellerna i mörker vid 4 ° C tills körs proverna på en flödescytometer. För bästa resultat, analysera cellerna så snart som möjligt.
    4. Välj 488 nm laser att excitera GFP. Samla in fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) fluorescens nivåer (20 000 – 40 000 spelningar, gated för framåt och side scatter att undvika aggregerade celler och skräp) med ett 525/50 nm bandpassfilter.
  2. Kalibrera biosensor
    1. För att göra en kalibreringskurva, gör 8 – 10 utspädningar av standard 2'-FL i intervallet 0 – 2 500 mg/L.
    2. Kultur 2'-FL biosensing cellerna (innehållande pAfcA och pET28:GFP) och framkalla dem med de standard utspädningarna, som tidigare beskrivits i avsnitt 1.3. Genomföra tre biologiska replikat för varje spädning.

3. identifiering och kvantifiering av 2'-FL i en producent stam

  1. Odling av producenten stam
    1. För att göra minimala media, förbereda separata lösningar av 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, natriumcitrat och 1 M tiamin-HCl. sterilisera de lösningar som använder ett 0,22 µm filter. Blanda M9 media buljong pulver med 1 L DI vatten. Autoklav M9 lösningen vid 121 ° C i 15 min. Cool lösningen ned till 50 ° C. Lägg till MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, natriumcitrat, och tiamin till slutliga koncentrationer av 2 mM, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L och 7,5 µg/L, respektive.
    2. Starta en kultur av 2'-FL producerar stam, t.ex., JM109 SHK-F2, i 5 mL LB media och låt den växa över natten vid 37 ° C, som beskrivs i Baumgartner et al.12.
    3. Subkultur på 1% som beskrivs tidigare i steg 1.3.3 i 250 mL minimal media bereddes i steg 3.1.1. Lägg till glycerol till en slutlig koncentration på 10 g/L och inkubera kulturen vid 37 ° C.
    4. När kulturen når en OD600 av 0,5 – 0,7, lägga isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) till en slutlig koncentration av 0,5 mM och laktos till en slutkoncentration av 2 g/L.
    5. Inkubera vid 37 ° C under ständig skakning och låt kulturer växa för 24 h.
  2. Utvinning av 2'-FL
    1. Överföra de övernattande kulturerna till sterila 50 mL rör och centrifugera vid 900 x g i 15 min.
    2. 3.2.2 avlägsna supernatanten och slamma pelleten i DI-vatten. Upprepa tvättningen tre gånger för att ta bort kvarvarande laktos och slutligen återsuspendering i 5 mL DI vatten.
    3. För att lysera cellsuspension, Använd en någon sonikator på 30% effekt, i 30 s pulser. Hela tiden hålla cellerna på is.
    4. Centrifugera lyserat cellerna i 25 minuter vid 2000 x g. Ta bort supernatanten, passera den genom en steril (t.ex. 0,22 µm) filter och lagra den på 4 ° C fram till analys.
  3. Kvantifiering med biosensor
    1. Inokulera en kultur av 2'-FL biosensing celler och på mitten av stocken fas, framkalla med cell lysate motsvarar uppskattade koncentrationer av 2'-FL används för att göra upp kalibreringskurvan som beskrivs i avsnitt 2.2. Utför kalibreringen i samma miljö som provet som skall analyseras (t.ex. cell lysate) genom att tillsätta utspädningar av 2'-FL till kontroll (dvs. icke-producerande) filtrerade cell lysate innan inducerande biosensor celler.
    2. Kör exemplen på en flödescytometer. Generera en dos-respons kurva genom att plotta fluorescens utdata mot oligosackarid koncentrationen. Jämför svaret av standarder till cell lysate.

4. selektiv borttagning av laktos

Obs: Biosensing cellerna är känsliga för laktos och det är önskvärt för biosensor selektivt identifiera HMOs över laktos. En strategi skulle inkludera tvättning av celler som beskrivs i avsnitt 3.2. Tre andra strategier beskrivs nedan.

  1. Behandling med kommersiella renat β-galaktosidas
    1. Lös upp frystorkat β-galaktosidas till 1000 (FCC laktas) enheter/mL i 1 mM MgCl2 eller använda kommersiella β-galaktosidas i lösning.
    2. För att avgöra den optimala koncentrationen av enzym som behövs, växa ett inokulum av 2'-FL biosensing celler och framkalla med 2 g/L laktos och 2.9 g / L 2'-FL på mitten av stocken fas.
    3. Till 100 µL kulturer, lägga till varierande mängder av β-galaktosidas, upp till 12 enheter, och låt kulturerna som växer över natten vid 37 ° C under ständig skakning.
    4. Mäta fluorescensen som beskrivs i avsnitt 2.1 och beräkna de optimala förband av enzym som behövs genom att bestämma den minsta enzym koncentrationen för att uppnå önskad dämpning av signalen.
    5. 2'-FL producerar celler odlas för 24 h, lägga till optimala förband av β-galaktosidas och inkubera över natten vid 37 ° C. Fortsätt med protokollet för att fastställa antikroppnivåns 2'-FL som beskrivs i avsnitt 3.3.
  2. Förbehandling med Lindholm + stam
    1. Starta en 25 mL kultur 2'-FL producerar stam och när inducerad på mitten av stocken fas, Inkubera kulturen vid 37 ° C under 24 h.
    2. Inokulera en E. coli BL21 (DE3) kultur i LB, växa till mitten av log fas vid 37 ° C och tillsätt 50 mL av kulturen (2:1) till 24 h kultur.
    3. Inkubera vid 37 ° C i 3 h. Fortsätt med protokollet för att fastställa antikroppnivåns 2'-FL som beskrivs i avsnitt 3.3.
  3. Laktos nederbörd med etanol
    Obs: Detta avsnitt är anpassad från Matsuki et al.12.
    1. Starta en 25 mL kultur 2'-FL producerar stam och när inducerad på mitten av stocken fas, inkubera vid 37 ° C under 24 h.
    2. Lägg två volymer av 100% etanol till kultur, skaka väl och inkubera vid 37 ° C i 4 h.
    3. Centrifugera suspensionen vid 900 x g i 15 min. samla supernatanten och inkubera över natten vid 4 ° C, vilket påskyndar laktos.
    4. Ta bort den utfällda laktos genom passerar lösningen genom ett filterpapper (11 µm). Samla upp filtratet som är cellen lysate innehållande 2'-FL, som kan kvantifieras genom följande avsnitt 3.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har utformat en hel cell biosensor specifika för 2'-FL som kan användas i samband med bioteknisk produktion av oligosaccharide. Detta är beroende av specifik enzymatisk klyvning av ändra terminal sockerarter genererar laktos och därmed aktivering av de lac operon, leder till uttryck för en reporter fluorescerande protein under laktos inducerbara främjare, i proportion till den kvantitet av 2'-FL. För att demonstrera dess koppling särart, 3-fucosyllactose (3-FL), en isomer, testades också. Den genetiska kretsen innehåller två delar: en fucosidase gen, afcA eller afcB, driven av en konstitutiva Promotorn resulterar i konstitutiv uttryck klonade vidare till en vektor med en signal sekvens av pelB kodade uppströms den fucosidase genen till underlätta periplasmic export, liksom ett fluorescerande reporter system som innehåller T7 Promotorn körning uttrycket av GFP. Den första delen uttrycks på plasmiden pAfcA och andra reporter systemet på plasmiden pET28:GFP. Den slutliga konstruktionen förvandlades till E. coli BL21 (DE3), en allmänt tillgänglig stam som har den T7 RNA-polymeras som integreras i genomet under laktos-lyhörda pLacUV5 arrangörens kontroll. Figur 1A visar schematiska utformningen så att läsaren kan följa den arbetande principen av biosensor. Figur 1B illustrerar fluorescerande signalen under olika förhållanden av induktion som analyseras på en flödescytometer. I enlighet med vår hypotes, över en 100-faldig ökning av fluorescens observerades med de 2'-FL biosensor jämfört med kontrollen endast vektor- eller med biosensor för 3-FL. Detta visar biosensor hög koppling-specificitet. För att säkerställa att signalen faktiskt beror på defucosylation, körde vi en kontroll genom att lägga till kommersiella α-1,2-fucosidase kulturen under induktion, vilket bekräftas av staplarna till höger. Analysens känslighet kan bestämmas genom att generera ett DOS-respons kurva med varierande kolhydrater (figur 2A). Från tomten, 2'-FL upptäckt linjär dynamiska omfång är mellan 40 och 400 mg/L och detektionsgränsen är 4 mg/L. Denna analys kan utföras under loppet av en arbetsdag, vilket framgår av ögonblicksbild mätningar av dynamiken i reporter uttryck (figur 2B).

Slutligen presenterar vi hur biosensing cellerna kan användas för att påvisa och kvantifiera 2'-FL från en konstruerad 2'-FL producent stam. Eftersom denna stam använder laktos som substrat, utvecklat vi strategier för att minska signal från exogena laktos så att signalen utslaget skulle direkt motsvarar 2'-FL koncentrationen (figur 3A). En strategi är att enzymatiskt försämra laktos med en β-galaktosidas som inte agerar på modifierade laktos. Detta kan uppnås med kommersiella β-galaktosidas som prioriterat fungerar på laktos, minska laktos signalen till 20% av ursprungliga (figur 3B) eller via inkubation med en Lindholm + stam, vild typ BL21 (DE3), som i tre timmar sjunker laktos signal till bakgrundsnivåerna (figur 3 c). Den sista strategin använder tredjeparts etanol, som inte bara selektivt påskyndar laktos men också lyserar de producent celler, cellys är ett nödvändigt steg nedströms (figur 3D). Detta är en enkel extraheringen, men försiktighet bör iakttas på grund av lägre återhämtning av 2'-FL jämfört med andra metoder, möjligen från förluster på grund av vissa kristallisering av 2'-FL. Trots tillägg av etanol, vi inte iakttog signifikant hämning av tillväxt av biosensing cellerna, sannolikt eftersom de slutliga etanol koncentrationerna är låga (< 2%, v/v) i kulturer. Slutligen är den mest effektiva men tidskrävande metod vi demonstrera pellet och tvätta cellerna före cellys att släppa den intracellulära 2'-FL (figur 3E). Vi rekommenderar läsaren att använda diskretion för att välja lämplig metod för laktos borttagning baserat på effektivitet och tillgänglighet i tid och reagenser.

Figur 3E visar också vår förmåga att på ett tillförlitligt sätt kvantifiera 2'-FL i biotekniska sammanhang. Vi odlade antingen en konstruerad 2'-FL-producerande stam11 eller en fucosyltransferase negativa mutant (negativ kontroll) med laktos att övervaka produktionen av 2'-FL i cell lysate. Efter odling cellerna, mätte vi koncentrationen med både biosensor och högpresterande vätskekromatografi (HPLC) för validering (kompletterande figur1). DOS-responskurvorna för producenten lysate och kontroll lysate spetsade med 2'-FL är mycket lika, vilket visar kvantitativ mätning av 2'-FL i samband med cell lysate.

Figure 1
Figur 1: Schematisk 2'-FL biosensor design och representativa uppgifter. (A) 2'-Fucosyllactose (2'-FL) träder den bakteriella periplasm och konverteras till laktos med heterologously uttryckt fucosidase. Laktos är transporteras till cytoplasman och konverteras till allolactose. Detta aktiverar infödda LacUV5 arrangören i E. coli BL21 (DE3), producerar T7 RNAP, som transcribes GFP under T7 Promotorn, leder till fluorescerande proteinuttryck. (B) identifiering av 2'-FL och 3-FL. celler som innehåller pET28:GFP och pAfcA (grön), pAfcB (magenta), eller en tom vector kontroll (blå) förmåddes över natten med ingen socker, 2'-FL, 2'-FL med exogent extra α-1,2-fucosidase, 3-FL eller laktos. Alla data är ett genomsnitt av tre biologiska replikat varje analyseras i tre exemplar, där felstaplar representera standardavvikelsen från medelvärdet. Statistisk signifikans bestämdes av Tukeys flera jämförande test och ** är vägledande p < 0,01.  Denna siffra först dök upp i Enam och Mansell14 och återanvänds med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: karakterisering av biosensor för 2'-FL upptäckt. (A) gränserna för upptäckt och överföring funktioner av biosensorer. Svar kurvor föreställande genomsnittlig fluorescens för pAfcA/2 ' FL (grön cirkel) eller tom kontroll vektor (blue diamond) vid varierande mängder av 2'-FL odlade. (B) tidsförloppet för reporter uttryck. Stam pAfcA var inkuberas med 2'-FL (grön fyrkant) och fluorescens övervakades över 8 h av induktion. Stam pAfcA inkuberas med laktos ingår som en kontroll. Alla data är ett genomsnitt av tre biologiska replikat varje analyseras i tre exemplar, där felstaplar representera standardavvikelsen från medelvärdet. Denna siffra först dök upp i Enam och Mansell14 och återanvänds med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: identifiering och kvantifiering av 2'-FL från en producent stam. (A) arbetsflöde demonstrera användningen av biosensor i ett enkelt protokoll med huvudfokus på att ta bort brus från resterande laktos. (B) avlägsnande av laktos av β-galaktosidas enzymatisk nedbrytning. Kulturer som innehåller 0,3% 2'-FL (grön fyrkant) eller 0,2% laktos (blå cirkel) inkuberades med biosensor kulturer som innehåller varierande mängder exogena β-galaktosidas på induktionstiden analyserades för fluorescens efter inkubation under natten. (C) borttagande av laktos genom inkubation med vildtyp Lindholm + stam. LB som innehåller 0,3% 2'-FL (grön cirkel), 0,2% laktos (blå fyrkantig) eller en 1:1 blandning (0,2% laktos motsvarande, dvs 0,1% laktos + 0,15% 2'-FL, magenta triangel) var ruvas under olika tider av BL21 (DE3) celler, och läggs sedan till biosensor kulturer för fluorescens mätning efter inkubation under natten. (D) utfällning av laktos och cell lysis av etanol förbehandling. Fermentering av JM109 SHK-F2 (magenta cirkel) eller JM109 SHK (blå triangel) celler var inkuberas med 2 volymer av etanol och filtreras före inkubation med fluorescerande biosensor celler och jämfört med fluorescens från obehandlade JM109 SHK-F2 kultur ( grön fyrkant). (E) kvantifiering av 2'-FL i cell lysate. Biosensor utvärderades för sin förmåga att upptäcka 2'-FL från en metaboliskt bakåtkompilerade producent stam. Fluorescens mätningar genereras genom tillsats av antingen råolja lysate JM109 SHK-F2 (magenta cirkel, 2'-FL som kvantifierade av LC-MS), 2'-FL i definierade uppgår till nonproducer stam JM109 SHK cell lysate (grön fyrkant) eller råolja lysate JM109 SHK stam (blå diamant). Resultat validerades av HPLC kvantifiering av 2'-FL i producent stam. Alla data är ett genomsnitt av tre biologiska replikat varje analyseras i tre exemplar, där vertikala felstaplar representera standardavvikelsen från medelvärdet fluorescensen och horisontella felstaplar representera standardavvikelsen i 2'-FL mätt genom HPLC i den tripletter. Denna siffra först dök upp i Enam och Mansell14 och återanvänds med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur1: HPLC-MS analys av 2'-FL. (A) utvinns ion kromatogram av 2'-FL (m/z 511). Kromatogram av kommersiell standard visas på toppen. Kromatogrammet för 2'-FL från JM109gwBC-F2 stammen (10-faldig utspädning) visas längst ned. Toppen vid 511 m/z är natrium addukt. (B) en utvidgning av masspektrum m/z från 300−800, där de vanligast förekommande signalerna var koncentrerade visas för den kommersiella standarden (överst) och 2'-FL från producenten stammen (nederst). (C) en standardkurva skapades av LC-MS analys med varierande nivåer av kommersiella 2'-FL. Felstaplar representera standardavvikelser från tre exemplar mätningar. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterar en hög genomströmning strategi för koppling-specifik detektion av fucosylated bröstmjölk oligosackarider. Detta uppnåddes genom att bygga hela cellen biosensorer genom att genetiskt konstruera E. coli som vid induktion med specifika glycans svara med en fluorescerande signal. Protokollet är också Detaljer om hur biosensor kan användas för att påvisa och kvantifiera HMOs i en metaboliskt bakåtkompilerade bakteriestam.

Våra protokoll erbjuder fördelar jämfört med alternativa metoder på grund av dess hög genomströmning utöver dess koppling-specificitet jämfört med kromatografiska/MS-metoder. Den låga gränsen för upptäckt och brett dynamiskt omfång tillåter direkt mätning av HMOs.

Kritiska steg i detta protokoll uppstå i utarbetandet av cellen lysate producent stammar. För att säkerställa högsta titer för 2'-FL, är det viktigt att ge de optimala förutsättningarna. Variabilitet i omgångar kan uppstå på grund av ultraljudsbehandling parametrar eller induktion gånger. Försiktighet bör iakttas under karakterisering av biosensor. Det rekommenderas också att köra ordentliga kontroller för alla steg i experimentet att säkerställa konsekventa resultat.

En begränsning av våra protokoll är beroendet av laktos för induktion, som blir en flaskhals när laktos förekommer naturligt, som i bröstmjölk, eller användas som substrat i bioteknisk produktion av HMOs. Vi har tagit upp detta med fyra olika strategier för att ta bort signal-brusförhållande så att biosensor kan selektivt detektera HMOs över laktos.

Den genetiskt kodade hela-cell biosensor presenteras här kommer tillåta optimering för tillverkning av HMOs, som många reaktion villkor eller bioreaktor parametrar kan analyseras parallellt i några timmar. När utförs i 96 - eller 384 brunnar, visar metoden potential att skärmen tusental av prover per dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av Iowa State University Startup medel. F.E. finansierades delvis av NSF Trinect gemenskap och Manley Hoppe professur. T.J.M. var delvis stöds av Karen och Denny Vaughn fakulteten Fellowship. Författarna tackar Iowa State University Flow flödescytometri anläggningen och W.M. Keck metabolomik forskningslaboratorium för hjälp med fluorescens och LC-MS studier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86, (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78, (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300, (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67, (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303, (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442, (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8, (1), 5562 (2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411, (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434, (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12, (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25, (10), 1292-1303 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics