Analyse af Fucosylated Human mælk trisaccharider i bioteknologiske sammenhæng ved hjælp af genetisk kodet biosensorer

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi beskriver her høj overførselshastighed påvisning og kvantificering af fucosylated modermælk oligosaccharider (HMOs) ved hjælp af en helhed-celle biosensor. Vi viser også her, en tilpasning af denne platform til analyse af HMO produktionsstammer, fokuserer på at forbedre signal-støj-forholdet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Modermælk oligosaccharider (HMOs) er komplekse kulhydrater komponenter i modermælk, der udviser rigelige fordele infant sundhed. Men, optimering af deres bioteknologiske syntese er begrænset af den relativt lave dataoverførselshastighed i påvisning og kvantificering af monosakkarid og forbindelser. Konventionelle teknikker af glycan analyse omfatter kromatografiske/massespektrometrisk metoder med overførselshastighed på rækkefølgen af hundredvis af prøver pr. dag uden automatisering. Vi viser her, en genetisk kodet bakteriel biosensor for høj overførselshastighed, kobling-specifik påvisning og kvantificering af fucosylated HMO strukturer, 2'-fucosyllactose og 3-fucosyllactose, som vi opnåede via heterolog udtryk for fucosidases. Da tilstedeværelsen af laktose i mælk eller i bioteknologiske processer kan føre til falske positiver, vise vi også reduktion af signal fra laktose ved hjælp af forskellige strategier. På grund af den høje overførselshastighed på denne teknik, kunne mange reaktionsbetingelser eller bioreaktor parametre analyseres parallelt i løbet af få timer, giver mulighed for optimering af HMO fremstilling.

Introduction

Modermælk oligosaccharider (HMOs) er laktose-afledte oligosaccharider, normalt bestående af tre til otte sukker monomerer. De har en laktose (Gal-B1, 4-Glc) reducere ende og er yderligere aflange af glycosidic links (β-1,3 - eller β-1,6-) til glukose (Mona), galaktose (Gal) eller N-acetylglukosamin (GlcNAc). Derudover fucose (Fuc, α-1,2 - eller α-1,3-) eller sialic syre (Sia eller NeuAc, α-2,3 - eller α-2,6-) restkoncentrationer er ofte tilsat1.

Aktuelle analyse af oligosaccharider og andre kulhydrater er begrænset i overførselshastighed og omfang af behovet for gaskromatografisk/masse spektrometrisk (MS) teknologi2,3,4,5, 6 , 7, som kan tage omkring en time pr. prøve, for ikke at nævne nødvendigheden af dyrt udstyr, specialiserede kolonner og afledende agenter og ekspertise på driften af dette udstyr8. Oligosaccharid forbindelser er særdeles vanskeligt at fastslå, der kræver avanceret MS9,10 eller Kernemagnetisk resonans (NMR) teknikker11. Hurtig optimering af syntesen af disse oligosaccharider er således begrænset af gennemløb af denne langsomme analytiske trin.

I denne undersøgelse, vi påvise kobling-specifik påvisning af fucosylated trisaccharide laktose-baserede HMOs, med fokus på 2'-fucosyllactose (2'-FL), er den mest rigelige HMO i modermælk, ved hjælp af en genetisk kodet Escherichia coli hele cellen biosensor med en grænse på opdagelse på 4 mg/L. Et vigtigt element i denne biosensor er dens evne til at skelne mellem isomer trisaccharider. Designprincip er baseret på udtryk for bestemt fucosidases i E. coli , at befri laktose fra HMOs, som registreres af lac operonen, som gengæld genererer en fluorescerende signal. Dette opnås ved at bygge en to-plasmid system, en husly kobling-specifikke fucosidase og den anden en fluorescerende reporter protein. Denne biosensor platform er velegnet til høj overførselshastighed screening ved flowcytometri eller mikro-Pladelæser. Vi viser også udnyttelsen af biosensor i kvantificere 2'-FL produceret af en manipuleret stamme12. Inden for denne undersøgelse præsentere vi også tre strategier på selektiv fjernelse af laktose, som kan resultere i falske positive signal fra biosensor, eftersom manipuleret producent stamme er vokset på lactose.

Tilsammen, de genetisk kodet biosensorer gør det muligt at detektere og kvantificere HMOs i en kobling-specifik måde, som er svære selv med kromatografiske, MS eller NMR teknikker. På grund af sin høje overførselshastighed og brugervenlighed, bør denne metode har udbredt programmer i metaboliske engineering og syntese af HMOs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur og induktion betingelser

Bemærk: I de følgende eksperimenter, bruges tre stammer: E. coli BL21 (DE3) med en tom vektor, E. coli BL21 (DE3) med plasmider pAfcA14 og pET28:green fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis), og E. coli BL21 (DE3) med plasmider pAfcB14 og pET28:GFP. Alle stammer, der er dyrket i Luria-Bertani bouillon (LB) eller minimal medier med passende antibiotika. Forberede stamopløsninger af 1.000 x kanamycin (50 mg/mL) og carbenicillin (100 mg/mL) i ionbyttet (DI) vand.

  1. Media forberedelse
    1. Forbered LB medier ved at tilføje 25 g LB pulver materiel til 1 L DI vand. Autoklave løsning ved 121 ° C i 20 min. til at sterilisere. Vent indtil steriliseret LB media temperaturen er under 60 ° C inden tilsætning af 1 µL af antibiotika stock for hver 1 mL af LB medier.
    2. For at forberede LB plader, tilsættes 15 g agar til LB medierne før sterilisation. Vent indtil den steriliserede LB agar temperatur er under 60 ° C inden tilsætning af antibiotika.
    3. 1.1.3 for biosensing celler, forberede medier eller plader med dobbelt antibiotika, kanamycin og carbenicillin.
  2. Kulhydrat induktorer
    1. Forberede stamopløsninger af kulhydrat induktorer på kindtand ækvivalenter til 20 g/L af laktose: 29 g/L, 2'-FL og 3-FL.
      Bemærk: Hver 200 µL af celler vil kræve 20 µL af 2'-FL eller 3-FL.
    2. Fremkalde 200 µL af celler med 2,0 g/L endelige koncentration af laktose eller 2,9 g/L slutkoncentration på 2'-FL/3-FL. Incubate ved 37 ° C med kontinuerlig ryster og lade kulturer vokse natten over.
  3. Cellekultur
    1. Dagen før eksperimentet frø 5 mL af LB medium suppleret med kanamycin og carbenicillin fra en frisk bakteriel koloni, ved hjælp af steril teknik.
    2. Inkuber alle kulturer ved 37 ° C med agitation og vokse kulturer natten over.
    3. Overføre 50 µL af overnight kultur til 5 mL frisk LB/M9 medier med kanamycin og carbenicillin. Der inkuberes ved 37 ° C med kontinuerlig ryster og vokse indtil kultur har nået optisk tæthed på 600 nm (OD600) på 0,5-0,7. På denne midten log fase, kan cellerne fremkaldes.

2. måling af fluorescens og påvisningsgrænser

  1. Forberedelse af celler til flowcytometri
    1. Overføre de overnattende kulturer til 1,5 mL rør og centrifugeres ved 12.500 x g i 1 min.
    2. Kassér supernatanten og genopslæmmes pellet i 500 µL 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl i DI vand, pH 7,2) for at forberede en enkelt cellesuspension og overføre en enkelt celle suspension til 5 mL flow flowcytometri rør.
    3. Holde cellerne i mørke ved 4 ° C indtil kører prøverne på en flow Flowcytometret. For de bedste resultater, analysere cellerne så hurtigt som muligt.
    4. Vælg 488 nm laser til at ophidse normal god landbrugspraksis. Indsamle fluorescein isothiocyanat (FITC) Fluorescens niveauer (20.000 – 40.000 events, gated for frem og side scatter at undgå aggregerede celler og små klippestykker) med en 525/50 nm bandpass filter.
  2. Kalibrering af biosensor
    1. For at gøre en kalibreringskurve, gør 8-10 Fortyndingerne af standard 2'-FL i området 0-2.500 mg/L.
    2. Kultur 2'-FL biosensing celler (som indeholder pAfcA og pET28:GFP) og fremkalde dem med de standard fortyndinger, som tidligere beskrevet i afsnit 1.3. Foretage tre biologiske flergangsbestemmelser for hver fortynding.

3. påvisningen og kvantificeringen af 2'-FL i en producent stamme

  1. Dyrkning af producent stamme
    1. For at gøre minimal medier, forberede separate løsninger af 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, natriumcitrat og 1 M thiamin-HCl. sterilisere løsninger ved hjælp af et 0,22 µm filter. Bland M9 media bouillon pulver med 1 L DI vand. Autoklave M9 løsning ved 121 ° C i 15 min. afkøles løsning ned til 50 ° C. Tilføj MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, natriumcitrat, og thiamin til endelige koncentrationer af 2 mM, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L og 7,5 µg/L, henholdsvis.
    2. Starte en kultur af 2'-FL producerer stamme, fx, JM109 gwBC-F2, i 5 mL af LB medier og lad det vokse natten over ved 37 ° C, som beskrevet i Baumgartner et al.12.
    3. Subkultur på 1% som beskrevet tidligere i trin 1.3.3 i 250 mL af minimal medierne forberedt i trin 3.1.1. Tilføje glycerol til en endelig koncentration på 10 g/L, og der inkuberes kultur ved 37 ° C.
    4. Når kulturen når en OD600 på 0,5-0,7, tilføje isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til en endelig koncentration på 0,5 mM og laktose til en slutkoncentration på 2 g/L.
    5. Der inkuberes ved 37 ° C med kontinuerlig ryster og lade kulturer vokse i 24 timer.
  2. Ekstraktion af 2'-FL
    1. Overføre de overnattende kulturer til sterile 50 mL rør og centrifugeres ved 900 x g i 15 min.
    2. 3.2.2 kassere supernatanten og genopslæmmes pellet i osmosevand. Gentag trinnet vask tre gange at fjerne resterende laktose og endelig genopslæmmes i 5 mL Deioniseret vand.
    3. For at lyse cellesuspension, skal du bruge en sonikator på 30% strøm i 30 s pulser. Holde celler på is på alle tidspunkter.
    4. Der centrifugeres de lysed celler i 25 min. på 2.000 x g. Fjern supernatanten, passerer det gennem en steril (fx 0,22 µm) filter og opbevares ved 4 ° C indtil analyse.
  3. Kvantificering med biosensor
    1. Podes en kultur af 2'-FL biosensing celler og ved midten log fase, fremkalde med celle lysate svarende til anslåede koncentrationer af 2'-FL bruges til at lave en kalibreringskurve som beskrevet i afsnit 2.2. Udfør kalibrering i det samme miljø som prøven analyseres (f.eks. celle lysate) ved at tilføje fortyndinger af 2'-FL kontrol (dvs. ikke-producerende) filtreret celle lysate før inducerende biosensor celler.
    2. Køre prøverne på en flow Flowcytometret. Generere en dosis-respons kurve ved at plotte fluorescens output mod oligosaccharid koncentration. Sammenligne svar af standarder til cellen lysate.

4. selektiv fjernelse af laktose

Bemærk: Biosensing cellerne er følsomme over for laktose og det er ønskeligt for biosensor til selektivt opdage HMOs over laktose. Én strategi ville omfatte vask af celler, som beskrevet i afsnit 3.2. Tre andre strategier er beskrevet nedenfor.

  1. Behandling med kommercielle renset β-galactosidase
    1. Opløse frysetørrede β-galactosidase til 1.000 (FCC laktase) enheder/mL, i 1 mM MgCl2 eller bruge kommercielle β-galactosidase i løsning.
    2. For at bestemme den optimale koncentration af enzymet behov, vokse et inokulum 2'-FL biosensing celler og inducerer med 2 g/L laktose og 2,9 g / L 2'-FL på midten af log fase.
    3. 100 µL kulturer, tilføje varierende mængder af β-galactosidase, op til 12 enheder, og lad kulturerne vokse natten over ved 37 ° C med kontinuerlig ryster.
    4. Måle fluorescens, som beskrevet i punkt 2.1 og beregne de optimale enheder af enzymet behov ved at bestemme den minimale enzym koncentration at opnå ønskede dæmpning af signalet.
    5. 2'-FL producerer cellerne vokset til 24 h, tilføje optimal enheder af β-galactosidase og inkuberes natten over ved 37 ° C. Fortsætte med protokol til bestemmelse af 2'-FL titer som beskrevet i afsnit 3.3.
  2. Forbehandling med LacZ + stamme
    1. Start en 25 mL kultur af 2'-FL producerer stamme, og når induceret på midten log fase, inkuberes kultur ved 37 ° C i 24 timer.
    2. Podes en E. coli BL21 (DE3) kultur i LB, vokser det til midten log fase ved 37 ° C og tilsættes 50 mL kultur (2:1) til kulturen, 24 h.
    3. Der inkuberes ved 37 ° C i 3 h. Fortsæt med protokol til bestemmelse af 2'-FL titer som beskrevet i afsnit 3.3.
  3. Laktose nedbør med ethanol
    Bemærk: Denne sektion er tilpasset fra Matsuki et al.12.
    1. Start en 25 mL kultur af 2'-FL producerer stamme, og når induceret på midten log fase, inkuberes ved 37 ° C i 24 timer.
    2. Tilføje to bind af 100% ethanol til kultur, ryst godt, og der inkuberes ved 37 ° C i 4 timer.
    3. Der centrifugeres suspension ved 900 x g i 15 min. indsamle supernatanten og inkuberes natten over ved 4 ° C, der udfælder laktose.
    4. Fjerne de udfældede laktose ved at passere gennem et filtrerpapir (11 µm). Saml filtratet, som er cellen lysate indeholdende 2'-FL, som kan kvantificeres ved følgende afsnit 3.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har designet en hel celle biosensor specifikke for 2'-FL der kan bruges i forbindelse med den bioteknologiske produktion af oligosaccharid. Dette er baseret på specifikke enzymatisk kløvningen af modificerer terminal sukker skaber laktose og dermed aktivering af lac operonen, fører til udtryk af en reporter fluorescerende protein en laktose inducerbar promotor, i forhold til den mængden af 2'-FL. For at demonstrere sin kobling specificitet, 3-fucosyllactose (3-FL), en isomer, blev også testet. Den genetiske kredsløb indeholder to dele: en fucosidase gen, afcA eller afcB, drevet af en konstitutive promoter resulterer i konstitutiv udtryk klonet på en vektor med et signal sekvensen af pelB kodet opstrøms af fucosidase for at lette periplasmic udførsel, samt en fluorescerende reporter system der indeholder T7 initiativtageren kørsel udtryk for normal god landbrugspraksis. Den første del er udtrykt på plasmidet pAfcA og den anden reporter system på plasmidet pET28:GFP. Den endelige konstruktion blev omdannet til E. coli BL21 (DE3), et bredt tilgængelige stamme, der har T7 RNA polymerase integreret i genomet under kontrol af laktose-responderende pLacUV5 promotor. Figur 1A viser skematisk design, så læseren kan følge Funktionsprincip af biosensor. Figur 1B illustrerer den fluorescerende signal under forskellige betingelser for induktion, som analyseres på et flow Flowcytometret. Konsekvent med vores hypotese, over en 100-fold stigning i fluorescens blev observeret med 2'-FL biosensor sammenlignet med kontrolelementet vektor-only eller biosensor for 3-FL. Dette viser biosensor høj kobling-specificitet. For at sikre, at signalet er faktisk på grund af defucosylation, kørte vi et kontrolelement ved at tilføje kommercielle α-1,2-fucosidase til kultur under induktion, som er blevet bekræftet som det fremgår af barerne til højre. Følsomheden af analysen kan bestemmes ved at generere en dosis-respons kurve med varierende kulhydrat niveauer (figur 2A). Fra plottet, 2'-FL påvisning dynamiske lineære område er mellem 40 og 400 mg/L og detektionsgrænsen er 4 mg/L. Denne analyse kan gennemføres i løbet af en arbejdsdag, som det fremgår af snapshot målinger af dynamikken i reporter udtryk (figur 2B).

Endelig præsenterer vi, hvordan biosensing cellerne kan bruges til at detektere og kvantificere 2'-FL fra en manipuleret 2'-FL producent stamme. Da denne stamme bruger laktose som substrat, udviklet vi strategier til at reducere signal fra eksogene laktose, så signalet udlæsning direkte svarer til 2'-FL koncentrationen (figur 3A). Én strategi er at enzymatisk nedbryde laktose ved hjælp af en β-galactosidase, der ikke reagerer på modificerede laktose. Dette kan opnås ved hjælp af kommercielle β-galactosidase, der fortrinsvis fungerer på lactose, reducere laktose signal til 20% af oprindelige (figur 3B) eller via inkubering med en LacZ + stamme, wild-type BL21 (DE3), som i tre timer dråber laktose signal til baggrundsværdier (figur 3 c). Den sidste strategi benytter ethanol, som ikke kun selektivt udfældes laktose men også lyses producent celler, celle lysis er et nødvendigt skridt downstream (figur 3D). Dette er en enkel adskillelse proces, men bør udvises forsigtighed på grund af lavere inddrivelse af 2'-FL sammenlignet med andre metoder, muligvis fra tab som følge af nogle krystallisering af 2'-FL. På trods af tilføjelsen af ethanol, vi ikke har overholdt betydelig hæmning af væksten i de biosensing celler, sandsynligvis fordi de endelige ethanol koncentrationen er lav (< 2%, v/v) i kulturer. Endelig er den mest effektiv men tidskrævende metode vi demonstrere pellet og vaske cellerne inden cellen lysis at frigive den intracellulære 2'-FL (figur 3). Vi anbefaler læseren til at bruge skoen for at vælge den relevante metode for laktose fjernelse baseret på effektivitet og tilgængelighed af tid og reagenser.

Figur 3E viser også vores evne til pålideligt kvantificere 2'-FL i bioteknologiske sammenhæng. Vi kulturperler enten en manipuleret 2'-FL-producerende stamme11 eller en fucosyltransferase negative mutant (negativ kontrol) med laktose at overvåge produktionen af 2'-FL i celle lysate. Efter dyrkning af celler, målte vi koncentration ved hjælp af både biosensor og højtydende væskekromatografi (HPLC) til validering (tillægs figur 1). Dosis/respons-kurver for producent lysate og kontrol lysate tilsat 2'-FL er meget ens, som demonstrerer kvantitativ måling af 2'-FL i forbindelse med celle lysate.

Figure 1
Figur 1: skematisk af 2'-FL biosensor design og repræsentative data. (A) 2'-Fucosyllactose (2'-FL) træder den bakterielle periplasm og omdannes til laktose af heterologously udtrykte fucosidase. Laktose er transporteres til cytoplasma og konverteret til allolactose. Dette aktiverer den indfødte LacUV5 promotor i E. coli BL21 (DE3), producerer T7 RNAP, som transcribes normal god landbrugspraksis T7 promotor, fører til fluorescerende proteiner udtryk. (B) påvisning af 2'-FL og 3-FL. celler, der indeholder pET28:GFP og pAfcA (grøn), pAfcB (magenta), eller en tom vektor kontrol (blå) blev induceret natten over med noget sukker, 2'-FL, 2'-FL med eksogent tilføjet α-1,2-fucosidase, 3-FL eller laktose. Alle data er et gennemsnit af tre biologiske replikater hver analyseres i tre eksemplarer, hvor fejllinjer repræsenterer standardafvigelse fra middelværdien. Statistisk signifikans, blev fastsat ved Tukeys flere sammenligning test og ** er vejledende p < 0,01.  Dette tal først dukkede op i Enam og Mansell14 og er genbrugt med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: karakterisering af biosensor for 2'-FL påvisning. (A) grænseværdier for påvisning og overførsel funktion af biosensorer. Respons kurver skildrer gennemsnitlige fluorescens for pAfcA/2 ' FL (grøn cirkel) eller tomme kontrol vektor (blå diamant) på varierende mængder af 2'-FL kulturperler. (B) tidsforløb reporter udtryk. Stamme pAfcA blev inkuberet med 2'-FL (grøn firkant) og fluorescens blev overvåget over 8 h af induktion. Stamme pAfcA inkuberes med laktose er inkluderet som en kontrol. Alle data er et gennemsnit af tre biologiske replikater hver analyseres i tre eksemplarer, hvor fejllinjer repræsenterer standardafvigelse fra middelværdien. Dette tal først dukkede op i Enam og Mansell14 og er genbrugt med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: påvisningen og kvantificeringen af 2'-FL fra en producent stamme. (A) arbejdsproces demonstrerer brugen af biosensor i en enkel protokol med fokus på at fjerne støj fra resterende laktose. (B) fjernelse af laktose af β-galactosidase Enzymatisk nedbrydning. Kulturer som indeholder 0.3% 2'-FL (grøn firkant) eller 0,2% lactose (blå cirkel) blev inkuberet med biosensor kulturer med varierende mængder af eksogene β-galactosidase induktion dengang blev analyseret for fluorescens efter inkubering natten over. (C) fjernelse af laktose ved inkubering med vildtype LacZ + stamme. LB som indeholder 0.3% 2'-FL (grøn cirkel), 0,2% lactose (blå firkant) eller en 1:1 blanding (0,2% lactose tilsvarende, dvs, 0,1% lactose + 0,15% 2'-FL, magenta trekant) blev udruget i forskellige gange med BL21 (DE3) celler, og derefter tilføjes biosensor kulturer for Fluorescens målingen efter inkubering natten over. (D) udfældning af lactose og celle lysering af ethanol forbehandling. Forgæring af JM109 gwBC-F2 (magenta cirkel) eller JM109 gwBC (blå trekant) celler blev inkuberet med 2 bind af ethanol og filtreret før inkubation med fluorescerende biosensor celler og sammenlignet med fluorescens fra ubehandlet JM109 gwBC-F2 kultur ( grøn firkant). (E) kvantificering af 2'-FL i celle lysate. Biosensor blev evalueret for sin evne til at opdage 2'-FL fra en metabolisk manipuleret producent stamme. Fluorescens målinger genereret ved tilsætning af enten rå lysate af JM109 gwBC-F2 (magenta cirkel, 2'-FL som kvantificerede af LC-MS), 2'-FL i definerede beløber sig til nonproducer stamme JM109 gwBC celle lysate (grøn firkant) eller rå lysate af JM109 gwBC stamme (blå diamant). Resultaterne blev valideret af HPLC kvantificering af 2'-FL i producer stamme. Alle data er et gennemsnit af tre biologiske replikater hver analyseres i tre eksemplarer, hvor lodret fejllinjer repræsenterer standardafvigelse fra den gennemsnitlige fluorescens og horisontale fejllinjer repræsenterer standardafvigelse i 2'-FL målt ved HPLC i den tre. Dette tal først dukkede op i Enam og Mansell14 og er genbrugt med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: HPLC-MS analyse af 2'-FL. (A) udvundet ion kromatogrammer af 2'-FL (m/z 511). Kromatogrammet af kommercielle standard er vist på toppen. Kromatogrammet af 2'-FL fra JM109gwBC-F2 stamme (10-fold fortynding) er vist i bunden. Peak på 511 m/z er natrium addukt. (B) en udvidelse af masse spektrum m/z fra 300−800, hvor de mest rigelige signaler var koncentreret er vist for de kommercielle standard (øverst) og 2'-FL fra producent stamme (nederst). (C) en standardkurve var lavet af LC-MS analyse med varierende niveauer af kommercielle 2'-FL. Fejllinjer udgør standardafvigelser fra tredobbelt målinger. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer en høj overførselshastighed strategi for kobling-specifik påvisning af fucosylated modermælk oligosaccharider. Dette blev opnået ved at bygge hele cellen biosensorer af genetisk engineering E. coli som på induktion med specifikke glycans reagerer med en fluorescerende signal. Protokollen også detaljer om hvordan biosensor kan bruges til at detektere og kvantificere HMOs i en metabolisk manipuleret bakteriel stamme.

Vores protokol tilbyder fordele over alternative metoder på grund af sin høje overførselshastighed ud over sin kobling-specificitet i forhold til kromatografiske/MS-analysemetoder. Den lave grænse for påvisning og bredt dynamikområde giver mulighed for direkte måling af HMOs.

Kritiske trin i denne protokol forekommer i forberedelsen af cellen lysate af producent stammer. For at sikre maksimal titer på 2'-FL, er det afgørende at give de optimale betingelser. Variabilitet i partier kan opstå på grund af sonikering parametre eller induktion gange. Bør sikres under karakterisering af biosensor. Det anbefales også at køre ordentlig kontrol for alle trin i eksperimentet at sikre ensartede resultater.

En begrænsning af vores protokol er dens afhængighed af laktose til induktion, som bliver en flaskehals, når laktose naturligvis præsentere, som i modermælken, eller bruges som underlag i bioteknologiske produktion af HMOs. Vi har behandlet dette med fire forskellige strategier til at fjerne signal-støj-forhold, så biosensor kan selektivt registrere HMOs over laktose.

Den genetisk kodet hele-celle biosensor præsenteres her tillader optimering til fremstilling af HMOs, som mange reaktionsbetingelser eller bioreaktor parametre kan analyseres parallelt i løbet af få timer. Når der udføres i 96 - eller 384-godt plader, viser metoden potentiale til at skærmen tusindvis af prøver pr. dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Iowa State University start midler. F.E. var delvist finansieret af NSF Trinect Fellowship og Manley Hoppe professorat. T.J.M. blev delvist støttet af Karen og Denny Vaughn fakultet stipendium. Forfatterne takke Iowa State University Flow flowcytometri facilitet og WM Keck Metabolomics Research Laboratory for bistand med fluorescens og LC-MS undersøgelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86, (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78, (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300, (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67, (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303, (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442, (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8, (1), 5562 (2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411, (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434, (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12, (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25, (10), 1292-1303 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics