Analyse van de Fucosylated mens melk trisacharide in biotechnologische Context, waarbij het genetisch gecodeerd biosensoren

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Hier beschrijven we de high-throughput detectie en kwantificering van fucosylated menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) met behulp van een geheel-cel biosensor. We ook laten zien hier, de aanpassing van dit platform naar analyse van HMO productie stammen, gericht op het verbeteren van de signaal / ruisverhouding.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) zijn onderdelen van de complexe koolhydraten van menselijke moedermelk die overvloedig voordelen op de gezondheid van de baby vertonen. Optimalisatie van hun biotechnologische synthese wordt echter beperkt door de relatief lage doorvoer van detectie en kwantificering van monosaccharide en verbanden. Conventionele technieken van glycan analyse omvatten chromatografische/Massaspectrometrische methoden met doorvoer over de volgorde van honderden monsters per dag zonder automatisering. Wij tonen hier, een genetisch gecodeerde bacteriële biosensor voor de high-throughput, koppelings-specifieke detectie en kwantificering van de fucosylated HMO structuren, 2'-fucosyllactose en 3-fucosyllactose, die we via heterologe bereikt expressie van fucosidases. Als de aanwezigheid van lactose in melk of in biotechnologische processen tot valse positieven leiden kan, tonen we ook de vermindering van signaal uit lactose met behulp van verschillende strategieën. Vanwege de hoge doorvoer van deze techniek, kunnen veel reactie voorwaarden of bioreactor parameters vehiculumcontrolegroep worden parallel in een kwestie van uren, waardoor voor de optimalisatie van de HMO verwerkende industrie.

Introduction

Menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) zijn lactose-afgeleide oligosacharide, meestal bestaande uit drie tot acht suiker monomeren. Ze hebben een lactose (Gal-β1, 4-Glc) verminderen beëindigen en verder door glycosidic links zijn langwerpig (β-1,3 - of β-1,6-) glucose (Glc), galactose (Gal) of N-acetylglucosamine (GlcNAc). Daarnaast fucose (Fuc, α-1,2 - of α-1,3-) of sialic zuur (Sia of NeuAc, α-2,3 - of α-2,6-) residuen worden vaak toegevoegd1.

Huidige analyse van de oligosacchariden en andere koolhydraten in doorvoer en reikwijdte begrensd door de behoefte aan spectrometrische chromatografische/massa (MS) technologie2,3,4,5, 6 , 7, dat ongeveer duren kan een uur per monster, niet te vergeten de noodzaak voor dure apparatuur, gespecialiseerde kolommen en Derivatiserings agenten en expertise over de werking van deze apparatuur8. Oligosaccharide verbanden zijn bijzonder moeilijk te bepalen, waarvoor geavanceerde MS9,10 of11technieken nucleaire magnetische resonantie (NMR). Snelle optimalisatie van synthese van deze oligosachariden is dus beperkt door de doorvoer van deze trage analytische stap.

In deze studie, tonen we koppeling-specifieke detectie van fucosylated trisaccharide lactose gebaseerde zorgorganisaties, gericht op 2'-fucosyllactose (2'-FL) thats de overvloedigste HMO in menselijke melk, met behulp van een genetisch gecodeerde Escherichia coli hele cel biosensor met een limiet van detectie op 4 mg/L. Een belangrijk kenmerk van deze biosensor is haar vermogen om te onderscheiden tussen isomere trisacharide. De ontwerpprincipe is gebaseerd op de expressie van specifieke fucosidases in E. coli die bevrijden lactose van zorgorganisaties, waarvan de aanwezigheid wordt gedetecteerd door het lac -operon, die op zijn beurt een fluorescent signaal genereert. Dit bereiken we door het bouwen van een twee-plasmide-systeem, een herbergen de koppelings-specifieke fucosidase en anderzijds een fluorescerende verslaggever eiwit. Dit platform biosensor is geschikt voor high-throughput screening door stroom cytometry of micro-afleesapparaat. We tonen ook het gebruik van de biosensor in 2'-FL geproduceerd door een gemanipuleerde stam12te kwantificeren. Binnen deze studie presenteren we ook drie strategieën op selectieve verwijdering van lactose die leiden valse positieve signaal van de biosensor tot kan, gezien het feit dat de gemanipuleerde producent stam wordt verbouwd op lactose.

Samen genomen, de genetisch gecodeerde biosensoren laten detecteren en kwantificeren van zorgorganisaties in een koppeling-specifieke wijze, die moeilijk zelfs met is chromatografische, MS of NMR technieken. Vanwege de hoge doorvoer en gebruiksgemak moet deze methode wijdverbreide toepassingen in de metabole engineering en synthese van zorgorganisaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cel cultuur en inductie voorwaarden

Opmerking: De volgende experimenten, drie stammen worden gebruikt: E. coli BL21 (DE3) met een lege vector, E. coli BL21 (DE3) met plasmiden pAfcA14 en pET28:green fluorescente proteïne (GFP) en E. coli BL21 (DE3) met plasmiden pAfcB14 en pET28:GFP. Alle stammen worden gekweekt in Luria Bertani broth (LB) of minimale media met de juiste antibiotica. Bereiden van stamoplossingen van 1.000 x kanamycine (50 mg/mL) en carbenicillin (100 mg/mL) in gedeïoniseerd (DI) water.

  1. Voorbereiding van de media
    1. Bereiden van LB-media door 25 g van LB poeder voorraad aan 1 L DI water toe te voegen. Autoclaaf de oplossing bij 121 ° C gedurende 20 min te steriliseren. Wacht totdat de gesteriliseerde LB media temperatuur lager dan 60 ° C vóór toevoeging van 1 µL van antibiotica materieel voor elk 1 mL van LB-media is.
    2. Toevoegen om te bereiden LB platen, 15 g agar tot de LB-media voor sterilisatie. Wacht totdat de gesteriliseerde LB agar temperatuur lager dan 60 ° C vóór toevoeging van de antibiotica is.
    3. 1.1.3 de biosensing cellen, opstellen media of platen met dubbele antibiotica, kanamycine en carbenicillin.
  2. Koolhydraten inductoren
    1. Bereiden van stamoplossingen van de koolhydraten inductoren op molaire equivalent van 20 g/L lactose: 29 g/L 2'-FL en 3-FL.
      Opmerking: Elke 200 µL van cellen vergt 20 µL van 2'-FL of 3-FL.
    2. Induceren van 200 µL van cellen met 2,0 g/L eindconcentratie van lactose of 2.9 g/L eindconcentratie van 2'-FL/3-FL. Incubate bij 37 ° C met continue schudden en culturen groeien 's nachts laat.
  3. Celcultuur
    1. De dag voordat het experiment zaad 5 mL van LB medium aangevuld met kanamycine en carbenicillin uit een vers bacteriële kolonie, met behulp van steriele techniek.
    2. Incubeer alle culturen bij 37 ° C met agitatie en groeien de culturen 's nachts.
    3. Breng 50 µL van overnachting cultuur in 5 mL verse LB/M9 media met kanamycine en carbenicillin. Incubeer bij 37 ° C met continue schudden en groeien tot cultuur heeft bereikt optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,5 – 0,7. In deze fase halverwege log, kunnen de cellen worden opgewekt.

2. meting van fluorescentie en detectiegrenzen

  1. Voorbereiding van cellen voor stroom cytometry
    1. De overnachting culturen overbrengen in 1,5 mL tubes en centrifuge op 12.500 x g voor 1 min.
    2. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 500 µL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 6 mM nb2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl in DI water, pH 7,2) voor te bereiden van een eencellige schorsing en overbrengen van een enkele cel schorsing 5 mL stroom cytometry buizen.
    3. Houd de cellen in het donker bij 4 ° C tot de voorbeelden op een stroom cytometer uitvoeren. Voor het beste resultaat door de cellen zo spoedig mogelijk te analyseren.
    4. Selecteer 488 nm laser te prikkelen GFP. Verzamelen fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) fluorescentie niveaus (20.000-40.000 evenementen, gated voor voorwaartse en zijdelingse scatter om te voorkomen dat de samengevoegde cellen en puin) met een 525/50 nm bandfilter filter.
  2. Kalibreren van de biosensor
    1. Om een ijklijn, 8 – 10 verdunningen van het standaard 2'-FL te maken in het bereik 0-2.500 mg/L.
    2. Cultuur van de 2'-FL biosensing cellen (met pAfcA en pET28:GFP) en veroorzaken ze met de standaard verdunningen, zoals eerder is beschreven in punt 1.3. Uitvoeren van drie biologische herhaling voor elke verdunning.

3. opsporing en kwantificering van 2'-FL bij een producent stam

  1. Teelt van producent stam
    1. Voor het maken van minimale media, bereiden aparte oplossingen van 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, Natriumcitraat en 1 M thiamine-HCl. Steriliseer de oplossingen met behulp van een 0,22 µm filter. M9 media Bouillon poeder mengen met 1 L DI water. Autoclaaf de M9 oplossing bij 121 ° C gedurende 15 min. koel de oplossing tot 50 ° C. Voeg MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, Natriumcitraat, en thiamine aan de eindconcentraties van 2 mM, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L en 7,5 µg/L, respectievelijk.
    2. Een cultuur van 2'-FL stam, bijvoorbeeld, JM109 gwBC-F2, 5 ml van LB-media produceren en laten groeien 's nachts bij 37 ° C, zoals beschreven in Baumgartner et al.12starten
    3. Subcultuur op 1% zoals eerder in stap 1.3.3 in 250 mL van de minimale media bereid in stap 3.1.1 beschreven. Glycerol toevoegen om een eindconcentratie van 10 g/L en Incubeer de cultuur bij 37 ° C.
    4. Wanneer de cultuur een OD600 van 0,5 – 0,7 bereikt, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toevoegen om een eindconcentratie van 0.5 mM en lactose aan een definitieve concentratie van 2 g/L.
    5. Incubeer bij 37 ° C met continue schudden en laat culturen groeien gedurende 24 uur.
  2. Extractie van 2'-FL
    1. De overnachting culturen overbrengen in steriele 50 mL tubes en centrifuge op 900 x g gedurende 15 minuten.
    2. 3.2.2 Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in DI water. Herhaal de stap van wassen drie keer te verwijderen van de resterende lactose en ten slotte resuspendeer in 5 mL DI water.
    3. Gebruik een ultrasoonapparaat op kracht van 30%, in 30 s pulsen om de celsuspensie lyse. Houd de cellen op het ijs te allen tijde.
    4. De lysed cellen voor 25 min op 2.000 x gcentrifugeren. Verwijder het supernatant, passeren het een steriele (b.v. 0,22 µm) filteren en op te slaan bij 4 ° C tot analyse.
  3. Kwantificering met biosensor
    1. Enten van een cultuur van 2'-FL biosensing cellen en op mid log fase, induceren met cel lysate gelijkwaardig zijn aan de geschatte concentraties van 2'-FL gebruikt om de kalibratiecurve zoals beschreven in paragraaf 2.2. De kalibratie uit te voeren in de zelfde omgeving als het monster te worden geanalyseerd (bijvoorbeeld cel lysate) door toevoeging van verdunningen van 2'-FL aan controle (dat wil zeggen, niet-producerende) gefilterde cel lysate voordat inducerende biosensor cellen.
    2. De monsters worden uitgevoerd op een cytometer van de stroom. Een dosis-responscurve genereren door het uitzetten van de fluorescentie output tegen de oligosaccharide concentratie. Vergelijk de reactie van de normen op de cel lysate.

4. selectieve verwijdering van lactose

Opmerking: De biosensing cellen zijn gevoelig voor lactose en het is wenselijk dat de biosensor selectief detecteren zorgorganisaties over lactose. Een strategie zou wassen van cellen bevatten, zoals beschreven in paragraaf 3.2. Drie andere strategieën worden hieronder beschreven.

  1. Behandeling met commerciële gezuiverde β-galactosidase
    1. Ontbinden gelyofiliseerd β-galactosidase tot 1000 (FCC lactase) eenheden/mL, in 1 mM MgCl2 of gebruik commerciële β-galactosidase in oplossing.
    2. Om te bepalen van de optimale concentratie van enzym nodig, een entmateriaal van 2'-FL biosensing cellen groeien en veroorzaken met 2 g/L lactose en 2.9 g / L 2'-FL in mid log fase.
    3. 100 µL culturen, voeg van variërende hoeveelheden β-galactosidase, maximaal 12 eenheden, en laat de culturen groeien 's nachts bij 37 ° C met continue schudden.
    4. Meten van de fluorescentie, zoals beschreven in paragraaf 2.1 en bereken de optimale eenheden van enzym die nodig zijn door de bepaling van de concentratie van de minimale enzym om gewenste demping van signaal.
    5. Naar 2'-FL producerende cellen gekweekt voor 24u, optimale units van β-galactosidase toevoegen en na een nacht bebroeden bij 37 ° C. Ga verder met het protocol voor het bepalen van de titer van de 2'-FL zoals beschreven in punt 3.3.
  2. Voorbehandeling met LacZ + stam
    1. Start een 25 mL cultuur van 2'-FL produceren stam en zodra geïnduceerde in Mid log fase, Incubeer de cultuur bij 37 ° C gedurende 24 uur.
    2. Enten van een BL21 E. coli (DE3) cultuur in LB, het groeien tot halverwege log fase bij 37 ° C en voeg 50 mL van de cultuur (2:1) aan de cultuur van de 24 h.
    3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 h. doorgaan met het protocol voor het bepalen van de titer van de 2'-FL zoals beschreven in punt 3.3.
  3. Lactose precipitatie met ethanol
    Opmerking: Deze sectie is aangepast van Matsuki et al.12.
    1. Start een 25 mL cultuur van 2'-FL produceren stam en zodra geïnduceerde in Mid log fase, Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur.
    2. Voeg twee volumes van 100% ethanol tot de cultuur, goed schudden en Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur.
    3. Centrifugeer de schorsing bij 900 x g gedurende 15 min. verzamelen het supernatant en na een nacht bebroeden bij 4 ° C, die de lactose precipitaten.
    4. Verwijder de geprecipiteerde lactose door het passeren van de oplossing door een filtreerpapier (11 µm). Vang het filtraat op die de cel lysate met de 2'-FL, die kan worden gekwantificeerd door volgende punt 3.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We ontwierpen een hele cel biosensor specifiek voor 2'-FL die kan worden gebruikt in combinatie met de biotechnologische productie van de oligosaccharide. Dit is gebaseerd op de specifieke enzymatische splitsing van wijzigen terminal suikers genereren van lactose en daarmee activering van het lac -operon, leidt tot expressie van een verslaggever fluorescent proteïne onder een lactose afleidbare promotor, in verhouding staan tot de hoeveelheid 2'-FL. Om aan te tonen van de specificiteit van de koppeling, 3-fucosyllactose (3-FL), een isomeer, werd ook getest. Het genetische circuit bestaat uit twee delen: een fucosidase gen, afcA of afcB, gedreven door een constitutief promotor resulterend in constituerende expressie gekloond naar een vector met een reeks pelB gecodeerd signaal stroomopwaarts van de fucosidase-gen aan vergemakkelijken periplasmische export, evenals een fluorescerende verslaggever-systeem met de promotor van de T7 uitdrukking van GFP rijden. Het eerste deel wordt uitgedrukt op plasmide pAfcA en de tweede verslaggever systeem op plasmide pET28:GFP. De uiteindelijke constructie werd omgevormd tot de BL21 E. coli (DE3), een algemeen beschikbare spanning die de T7 RNA-polymerase geïntegreerd in het genoom onder controle van de promoter lactose-responsieve pLacUV5 heeft. Figuur 1A blijkt het schematische ontwerp, zodat de lezer het werkingsprincipe van de biosensor kan volgen. Figuur 1B illustreert het fluorescent signaal onder verschillende omstandigheden van inductie zoals geanalyseerd op een stroom cytometer. Consistent met onze hypothese, over een 100-fold verhoging van fluorescentie werd waargenomen met de 2'-FL biosensor in vergelijking met het kenmerk alleen-vector besturingselement of met de biosensor voor 3-FL. Dit toont de hoge koppeling-specificiteit van de biosensor. Om ervoor te zorgen dat het signaal inderdaad te wijten aan de defucosylation is, liepen we een besturingselement door commerciële α-1,2-fucosidase aan de cultuur tijdens inductie, die wordt bevestigd, zoals blijkt uit de bars op het recht toe te voegen. De gevoeligheid van de test kan worden bepaald door het genereren van een dosis-responscurve met verschillende niveaus van de koolhydraten (figuur 2A). Van het perceel, de dynamische lineaire reeks 2'-FL detectie is tussen 40 en 400 mg/L en de limiet van detectie is 4 mg/L. Deze bepaling kan worden uitgevoerd in de loop van een werkdag, zoals blijkt uit de metingen van de momentopname van de dynamiek van verslaggever expressie (figuur 2B).

Tot slot presenteren we hoe de biosensing cellen kunnen worden gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van 2'-FL van een gemanipuleerde 2'-FL producent-stam. Aangezien deze spanning gebruik lactose als substraat, ontwikkeld wij strategieën ter vermindering van signaal van exogene lactose, zodat de uitlezing signaal direct met de concentratie van 2'-FL (figuur 3A overeen zou). Een strategie is om de lactose met behulp van een β-galactosidase die niet handelt op gewijzigde lactose enzymatisch te degraderen. Dit kan worden bereikt met behulp van commerciële β-galactosidase die bij voorkeur fungeert op lactose, vermindering van het signaal van de lactose tot 20% van het origineel (figuur 3B) of via incubatie met een LacZ + stam, wild-type BL21 (DE3), die in drie uur daalt de lactose signaal aan achtergrondniveaus (Figuur 3 c). De laatste strategie maakt gebruik van ethanol, die niet alleen selectief lactose precipitaten maar ook lyses de producent cellen, lysis van de cel wordt een noodzakelijke stap stroomafwaarts (figuur 3D). Dit is een eenvoudige extractieproces, maar zorg moet worden genomen als gevolg van lagere herstel van 2'-FL vergeleken met andere methoden, misschien van verliezen als gevolg van sommige kristallisatie van 2'-FL. Ondanks de toevoeging van ethanol, we deden niet waarnemen significante remming van de groei van de biosensing cellen, waarschijnlijk omdat de definitieve ethanol concentraties laag (< 2%, v/v) in de culturen. Tenslotte is de meest effectieve, maar tijdrovende methode die wij tonen pellet en wassen van de cellen vóór lysis van de cel om de intracellulaire 2'-FL (figuur 3E) vrij te geven. Wij adviseren de lezer om discretie te gebruiken voor het selecteren van de juiste methode voor het verwijderen van de lactose gebaseerd op efficiëntie en beschikbaarheid van tijd en reagentia.

Figuur 3E toont ook aan ons vermogen om op betrouwbare wijze kwantificeren 2'-FL in biotechnologische kader. We ofwel een gemanipuleerde 2'-FL-producerende stam gekweekte11 of een mutant (negatieve controle) met lactose te controleren van de productie van 2'-FL in cel lysate negatieve fucosyltransferase. Na het kweken van de cellen, we de concentratie met behulp van zowel de biosensor en de krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) voor validatie (aanvullende figuur 1) gemeten. De dosis respons-curven voor producent lysate en controle lysate verrijkt met 2'-FL zijn zeer vergelijkbaar, die toont kwantitatieve meting van 2'-FL in het kader van cel lysate.

Figure 1
Figuur 1: schematische vangegevens 2'-FL biosensor ontwerp en vertegenwoordiger. (A) 2'-Fucosyllactose (2'-FL) voert de bacteriële periplasma en wordt geconverteerd naar lactose door geïnfecteerd uitgesproken fucosidase. Lactose is vervoerd naar het cytoplasma en geconverteerd naar allolactose. Hiermee activeert u de inheemse LacUV5 promotor in E. coli BL21 (DE3), T7 RNAP, die GFP onder de T7 promotor transcribeert, leidt tot fluorescerende eiwituitdrukking te produceren. (B) detectie van 2'-FL- en 3-FL. cellen met pET28:GFP en pAfcA (groen), pAfcB (magenta), of een lege vectorbestrijding (blauw) werden 's nachts geïnduceerde met geen suiker, 2'-FL, 2'-FL met exogenously toegevoegde α-1,2-fucosidase, 3-FL of lactose. Alle gegevens zijn een gemiddelde van drie biologische replicatieonderzoeken die elk geanalyseerd in drievoud, waarbij foutbalken standaarddeviatie van het gemiddelde vertegenwoordigen. Statistische significantie werd bepaald door Tukey van meerdere vergelijkingstest en ** is een indicatie van p < 0,01.  Dit cijfer in Enam en Mansell14 en maakte zijn debuut met toestemming wordt hergebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: karakterisering van biosensor voor 2'-FL detectie. (A) grenzen van de detectie- en overdracht functies van biosensoren. Reactie buigt met gemiddelde fluorescentie voor pAfcA/2 ' FL (groen cirkeltje) of lege controle vector (blauwe diamant) op wisselende hoeveelheden van 2'-FL gekweekt. (B) tijdsverloop van verslaggever expressie. Stam pAfcA was geïncubeerd met 2'-FL (groene vierkantje) en fluorescentie was meer dan 8 h van inductie gecontroleerd. Stam pAfcA geïncubeerd met lactose wordt opgenomen als een besturingselement. Alle gegevens zijn een gemiddelde van drie biologische replicatieonderzoeken die elk geanalyseerd in drievoud, waarbij foutbalken standaarddeviatie van het gemiddelde vertegenwoordigen. Dit cijfer in Enam en Mansell14 en maakte zijn debuut met toestemming wordt hergebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: detectie en kwantificering van 2'-FL van een producent-stam. (A) Workflow aan te tonen het gebruik van de biosensor in een eenvoudig protocol met belangrijke focus op het verwijderen van ruis van residuele lactose. (B) verwijdering van lactose door β-galactosidase enzymatische spijsvertering. Culturen met 0,3% 2'-FL (groene vierkantje) of 0,2% lactose (blauwe cirkel) werden geïncubeerd met biosensor culturen met wisselende hoeveelheden van exogene β-galactosidase inductie tijde waren vehiculumcontrolegroep fluorescentie na een incubatieperiode van 's nachts. (C) verwijdering van lactose door incubatie met wild-type LacZ + stam. LB met 0,3% 2'-FL (groen cirkeltje), 0,2% lactose (blauw vierkant) of een 1:1-mengsel (0,2% lactose equivalent, dat wil zeggen, 0,1% lactose + 0,15% 2'-FL, magenta driehoek) was ge¨ uncubeerd meermaals met BL21 (DE3) cellen, en vervolgens toegevoegd aan de biosensor culturen voor fluorescentie-meting na een incubatieperiode van 's nachts. (D) neerslag van lysis van de cel en lactose door ethanol voorbehandeling. Fermentatie van JM109 gwBC-F2 (magenta cirkel) of JM109 gwBC (blauwe driehoek) cellen werden geïncubeerd met 2 delen ethanol en gefilterd voordat incubatie met fluorescerende biosensor cellen en vergeleken met fluorescentie van onbehandelde JM109 gwBC-F2 cultuur) groene vierkantje). (E) kwantificering van 2'-FL in cel lysate. De biosensor werd geëvalueerd voor haar vermogen om op te sporen 2'-FL van een metabolisch gemanipuleerde producent-stam. Fluorescentie metingen gegenereerd door toevoeging van hetzij ruwe lysate van JM109 gwBC-F2 (magenta cirkel, 2'-FL als gekwantificeerde door LC-MS), 2'-FL in gedefinieerde bedraagt nonproducer stam JM109 gwBC cel lysate (groene vierkantje) of ruwe lysate van JM109 gwBC stam (blauw diamant). Resultaten werden gevalideerd door HPLC kwantificering van 2'-FL bij producent stam. Alle gegevens zijn een gemiddelde van drie biologische replicatieonderzoeken elk geanalyseerd in drievoud, waar verticale foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie van de gemiddelde fluorescentie en horizontale foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie in 2'-FL gemeten door HPLC in de triplicates. Dit cijfer in Enam en Mansell14 en maakte zijn debuut met toestemming wordt hergebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 1: HPLC-MS analyse van 2'-FL. (A) geëxtraheerd ion chromatogrammen van 2'-FL (m/z 511). Chromatogram van een commerciële standaard wordt weergegeven aan de bovenkant. Chromatogram van 2'-FL van de JM109gwBC-F2-stam (10-fold verdunning) wordt weergegeven aan de onderkant. De piek op 511 m/z is het natrium adductie. (B) een uitbreiding van massaspectrum m/z van 300−800, waar de meest voorkomende signalen geconcentreerd waren weergegeven voor de commerciële standaard (boven) en de 2'-FL van de producent-stam (onder). (C) A standaard curve is gemaakt door LC-MS analyse met verschillende niveaus van commerciële 2'-FL. Foutbalken vertegenwoordigen standaardafwijking uit het drievoudige metingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We presenteren een high-throughput strategie voor de koppeling-specifieke detectie van fucosylated menselijke melk oligosacchariden. Dit werd bereikt door het bouwen van hele cel biosensoren door genetisch engineering E. coli die na inductie met specifieke glycanen reageren met een fluorescerende signaal. Het protocol is ook van details over hoe de biosensor kan worden gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van zorgorganisaties in een metabolisch gemanipuleerde bacteriële stam.

Ons protocol biedt voordelen ten opzichte van alternatieve methoden toe te schrijven aan zijn hoge doorvoer naast haar koppeling-specificiteit ten opzichte van HPLC/MS-methoden. De onderlimiet van detectie en brede dynamische waaier zorgt voor de rechtstreekse meting van de zorgorganisaties.

Kritische stappen in dit protocol optreden bij de voorbereiding van de cel lysate van producent stammen. Om te zorgen voor maximale titer van 2'-FL, is het van cruciaal belang om de optimale voorwaarden te scheppen. Variabiliteiten in batches kunnen ontstaan als gevolg van ultrasoonapparaat parameters of inductie tijden. Tijdens de karakterisering van de biosensor moet worden gezorgd. Het is ook aanbevolen om de juiste besturingselementen voor alle stappen in het experiment om consistente resultaten uitvoeren.

Een beperking van onze protocol is haar afhankelijkheid van lactose voor inductie, die een knelpunt wordt als lactose die van nature aanwezig, net als in de moedermelk, of worden gebruikt als het substraat in biotechnologische productie van zorgorganisaties. We hebben dit aangepakt met vier verschillende strategieën om de signaal / ruisverhouding zodat de biosensor selectief zorgorganisaties over lactose detecteren kan.

De genetisch gecodeerde geheel-cel biosensor hier gepresenteerd zal onderwaarde voor de vervaardiging van zorgorganisaties, zoals veel reactie voorwaarden of bioreactor parameters kunnen worden bepaald parallel in een kwestie van uren. Wanneer uitgevoerd in 96 - of 384-Wells-platen, toont de methode het potentieel aan scherm duizenden van monsters per dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de Iowa State University opstarten middelen. VB. werd gedeeltelijk gefinancierd door de NSF Trinect Fellowship en Manley Hoppe hoogleraarschap. T.J.M. werd gedeeltelijk ondersteund door de Karen en Denny Vaughn faculteit Fellowship. De auteurs danken de Iowa State University Stroom Cytometry faciliteit en het W.M. Keck metabolomica onderzoekslaboratorium voor hulp met fluorescentie en LC-MS studies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86, (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78, (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300, (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67, (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303, (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442, (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8, (1), 5562 (2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411, (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434, (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12, (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25, (10), 1292-1303 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics