Análise de fucosilado humanos leite trissacarídeos biotecnológicas contexto usando geneticamente codificado biosensores

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Descrevemos aqui a elevado-throughput detecção e quantificação de oligossacarídeos de leite humano de fucosilado (HMOs) usando um biossensor de células inteiras. Também demonstramos aqui, a adaptação desta plataforma para análise de cepas de produção de HMO, com foco na melhoria da relação sinal / ruído.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Oligossacarídeos de leite humano (HMOs) são componentes de hidrato de carbono complexo do leite materno que exibem abundantes benefícios na saúde infantil. No entanto, otimização de sua síntese biotecnológica é limitada pela relativamente baixa taxa de transferência da deteção e quantificação de monossacarídeo e ligações. Técnicas convencionais de análise de glicano incluem métodos cromatográficos/massa-espectrometria com taxa de transferência na ordem de centenas de amostras por dia sem automação. Aqui, demonstramos um biossensor bacteriano geneticamente codificado para a elevado-throughput, enlace específico detecção e quantificação das estruturas fucosilado HMO, 2'-fucosyllactose e 3-fucosyllactose, que alcançamos através de heteróloga expressão de fucosidases. Como a presença de lactose no leite ou em processos biotecnológicos poderia levar a falsos positivos, demonstraremos também a redução do sinal de lactose usando diferentes estratégias. Devido a alta taxa de transferência desta técnica, muitas condições de reação ou parâmetros de biorreator podem ser analisados em paralelo em questão de horas, permitindo a otimização da fabricação de HMO.

Introduction

Oligossacarídeos de leite humano (HMOs) são derivados de lactose oligossacarídeos, geralmente composto por monômeros de açúcar de três a oito. Eles têm uma redução de lactose (Gal-β1, 4-Glc) terminam e são mais alongados por ligações glicosídicas (β-1,3 - ou β-1,6-) para glicose (Glc), galactose (Gal) ou N-acetilglicosamina (GlcNAc). Além disso, a fucose (Fuc, α-1,2 - ou α-1,3-) ou ácido siálico (Sia ou NeuAc, α-2,3 - ou α-2,6-) resíduos são frequentemente adicionados1.

Análise atual de oligossacarídeos e outros carboidratos é limitada em escopo e throughput pela necessidade de espectrometria cromatográfica/de massa (MS) tecnologia2,3,4,5, 6 , 7, que pode demorar mais ou menos uma hora por exemplo, para não mencionar a necessidade de equipamento caro, colunas especializadas e agentes derivatizing e conhecimentos sobre o funcionamento deste equipamento8. Ligações de oligossacarídeo são particularmente difíceis de determinar, exigir avançado MS9,10 ou de técnicas de ressonância magnética nuclear (NMR)11. Otimização rápida da síntese desses oligossacarídeos assim é limitada pela taxa de transferência deste passo lento e analítico.

Neste estudo, demonstramos a deteção de ligação específica de fucosilado trissacarídeo baseada em lactose planos de saúde, enfocando o 2'-fucosyllactose (2'-FL) que é o HMO mais abundante no leite humano, usando um geneticamente codificado toda célula Escherichia coli Biosensor com um limite de detecção em 4 mg/L. Uma característica importante deste biosensor é sua capacidade de distinguir entre trissacarídeos isoméricos. O princípio de projeto baseia-se na expressão de fucosidases específico em e. coli que liberar à lactose de planos de saúde, cuja presença é detectada pelo operon lac , que por sua vez, gera um sinal fluorescente. Conseguimos isso através da construção de um sistema de dois-plasmídeo, um abrigando o enlace específico fucosidase e o outro uma proteína fluorescente repórter. Esta plataforma de biosensor é apropriada para seleção da elevado-produção por citometria de fluxo ou leitor de microplaca. Também demonstramos a utilização do biosensor para quantificar o 2'-FL produzido por uma cepa de engenharia12. Dentro deste estudo, também apresentamos três estratégias na remoção seletiva de lactose que pode resultar em falso sinal positivo do biosensor, dado que a tensão de engenharia produtor é cultivada em lactose.

Os biosensores geneticamente codificados tomados em conjunto, permitem-nos detectar e quantificar a planos de saúde de uma forma de ligação específica, que é difícil mesmo com cromatografia em fase gasosa, MS, ou NMR técnicas. Devido a sua alta produtividade e facilidade de uso, este método deve ter difundidas aplicações na engenharia metabólica e síntese dos planos de saúde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. condições de cultura e indução de célula

Nota: Nos experimentos seguintes, três cepas são utilizadas: Escherichia coli BL21 (DE3) com um vetor vazio, Escherichia coli BL21 (DE3) com plasmídeos pAfcA14 e pET28:green proteína fluorescente (GFP) e Escherichia coli BL21 (DE3) com plasmídeos pAfcB14 e pET28:GFP. Todas as cepas são cultivadas em caldo Luria-Bertani (LB) ou media mínimos com antibióticos apropriados. Prepare soluções estoque de 1.000 x canamicina (50 mg/mL) e carbenicilina (100mg/mL) em deionizada (DI) de água.

  1. Preparação de meios de comunicação
    1. Prepare a LB mídia adicionando 25g de LB estoque de pó para 1 litro de água DI. Autoclave a 121 ° C por 20 min esterilizar a solução de. Espere até a temperatura de mídia LB esterilizada é inferior a 60 ° C, antes da adição de 1 µ l de estoque de antibiótico para cada 1 mL de LB mídia.
    2. Para preparar placas LB, adicione o ágar 15 g à mídia LB antes da esterilização. Espere até a temperatura de ágar LB esterilizada é inferior a 60 ° C, antes da adição do antibiótico.
    3. 1.1.3 para as células biosensing, prepare mídia ou placas com antibióticos duas, canamicina e carbenicilina.
  2. Indutores de hidrato de carbono
    1. Preparar soluções estoque das indutores de carboidratos no molares equivalentes a 20 g/L de lactose: 29 g/L de 2'-FL e 3-FL.
      Nota: Cada 200 µ l de células exigirão 20 µ l de 2'-FL ou 3-FL.
    2. Induzir a 200 µ l de células com concentração final de 2,0 g/L de lactose ou 2,9 g/L de concentração final de 2'-FL/3-FL. Incubar a 37 ° C, com agitação contínua e deixe as culturas a crescer durante a noite.
  3. Cultura celular
    1. No dia anterior a semente do experimento 5 mL de LB suplementado com canamicina e carbenicilina de uma colônia bacteriana fresca, utilizando uma técnica estéril.
    2. Incubar as culturas a 37 ° C, com agitação e crescem as culturas durante a noite.
    3. Transferi 50 µ l de cultura durante a noite para 5 mL de fresco LB/M9 mídia com canamicina e carbenicilina. Incubar a 37 ° C, com agitação contínua e crescer até cultura chegou a densidade óptica em 600 nm (OD600) de 0,5-0,7. Nesta fase de log de mid, as células podem ser induzidas.

2. medida da fluorescência e limites de detecção

  1. Preparação de células por citometria de fluxo
    1. Transferi as culturas durante a noite para tubos de 1,5 mL e centrifugar 12.500 x g por 1 min.
    2. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 µ l de 1 x fosfato salino (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM de NaCl em água DI, pH 7,2) para preparar uma suspensão de célula única e transferir a única célula suspensão de tubos de citometria de fluxo de 5 mL.
    3. Manter as células no escuro a 4 ° C até rodando as amostras em um citômetro de fluxo. Para melhores resultados, analise as células mais rapidamente possível.
    4. Selecione 488 nm do laser para excitar a GFP. Recolha os níveis de fluorescência fluoresceína isotiocianato (FITC) (20.000 – 40.000 eventos, gated para dispersão de frente e lateral evitar detritos e agregados de células) com um filtro de passa-banda 525/50 nm.
  2. Calibrando o biosensor
    1. Para fazer uma curva de calibração, faça diluições de 8 – 10 de padrão 2'-FL na escala 0 – 2.500 mg/L.
    2. Cultura de células de biosensing o 2'-FL (contendo pAfcA e pET28:GFP) e induzi-los com as diluições padrão, conforme descrito anteriormente na seção 1.3. Realize três repetições biológicas para cada diluição.

3. detecção e quantificação de 2'-FL em uma cepa de produtor

  1. Cultivo da estirpe de produtor
    1. Para fazer a media mínimos, preparar soluções separadas de 1 M K2HPO4, Filipa4·7H2O, citrato de sódio e 1 M de tiamina-HCl. esterilizar as soluções usando um filtro de 0,22 µm. Misture M9 mídia pó de caldo com 1 L de água DI. Autoclave a solução M9 a 121 ° C durante 15 min. esfriar a solução até 50 ° C. Adicione MgSO4, CaCl2, K2HPO4, Filipa4·7H2O, citrato de sódio e tiamina para concentrações finais de 2mm, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L e 7,5 µ g/L, respectivamente.
    2. Inicie uma cultura de 2'-FL produzir tensão, por exemplo, JM109 gwBC-F2, em 5 mL de LB mídia e deixá-lo crescer durante a noite a 37 ° C, conforme descrito no Baumgartner et al.12.
    3. Subcultura em 1%, conforme descrito anteriormente na etapa 1.3.3 em 250 mL da mídia mínima preparada na etapa 3.1.1. Adicionar o glicerol a uma concentração final de 10 g/L e incubar a cultura a 37 ° C.
    4. Quando a cultura atinge uma OD600 de 0,5-0,7, adicionar isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de 0.5 mM e lactose para uma concentração final de 2 g/L.
    5. Incubar a 37 ° C, com agitação contínua e permitir culturas cresça para 24 h.
  2. Extração de 2'-FL
    1. Transferi as culturas durante a noite para tubos de 50ml estéril e centrifugar 900 x g por 15 min.
    2. 3.2.2 descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em água DI. Repeti a etapa de lavagem três vezes para remover à lactose residual e finalmente re-suspender em 5 mL de água Desionizada.
    3. Para lisar a suspensão de células, use um sonicador em 30% de energia, em 30 pulsos de s. Manter as células no gelo em todos os momentos.
    4. Centrifugar as células lisadas por 25 min a 2.000 x g. Remover o sobrenadante, passá-lo através de um estéril (por exemplo, de 0,22 µm) filtrar e armazená-lo em 4 ° C até análise.
  3. Quantificação com biosensor
    1. Inocular uma cultura de células de 2'-FL biosensing e no log de meio da fase, induzir com equivalente lisado celular concentrações estimadas de 2'-FL usado para fazer a curva de calibração, conforme descrito na seção 2.2. Executar a calibração no mesmo ambiente que a amostra a analisar (por exemplo, lisado celular total) adicionando diluições de 2'-FL para controle (ou seja, não-produtor) lisado antes de induzir células biosensor filtrado celular.
    2. Execute as amostras em um citômetro de fluxo. Gera uma curva de dose-resposta plotando a saída de fluorescência contra a concentração de oligossacarídeo. Compare a resposta das normas para o lisado celular.

4. seletiva remoção de lactose

Nota: As células biosensing são sensíveis à lactose e é desejável que o biosensor detectar seletivamente a planos de saúde de lactose. Uma estratégia incluiria lavagem de células, conforme descrito na seção 3.2. Três outras estratégias são descritas abaixo.

  1. Tratamento com comercial purificado β-galactosidase
    1. Dissolver o liofilizado β-galactosidase para 1.000 (lactase FCC) unidades/mL, em 1 mM MgCl2 ou uso comercial do β-galactosidase na solução.
    2. Para determinar a concentração óptima de enzima necessária, crescer um inóculo de 2'-FL biosensing células e induzir com lactose 2 g/L e 2,9 g / L 2'-FL em meados fase log.
    3. A 100 culturas µ l, adicionar quantidades variáveis de β-galactosidase, até 12 unidades e deixe as culturas a crescer durante a noite a 37 ° C, com agitação contínua.
    4. Medir a fluorescência, conforme descrito na seção 2.1 e calcular as unidades ideais da enzima necessária pela determinação da concentração mínima de enzima para alcançar a desejada atenuação do sinal.
    5. A 2'-FL produzindo células cultivadas por 24 h, adicionar ideais unidades de β-galactosidase e incubar durante uma noite a 37 ° C. Prossiga com o protocolo para a determinação do título 2'-FL conforme descrito na seção 3.3.
  2. Pré-tratamento com LacZ + tensão
    1. Iniciar uma cultura de 25 mL de 2'-FL produzir tensão e uma vez induzido no log de meio da fase, incubar a cultura a 37 ° C por 24 h.
    2. Inocular uma Escherichia coli BL21 (DE3) cultura em LB, cultivá-la para log de meio da fase a 37 ° C e adicionar 50 mL de cultura (2:1) para a cultura de 24 h.
    3. Incube a 37 ° C por 3 h. prosseguir com o protocolo para a determinação do título 2'-FL conforme descrito na seção 3.3.
  3. Precipitação de lactose com etanol
    Nota: Esta seção é adaptada do Matsuki et al.12.
    1. Iniciar uma cultura de 25 mL de 2'-FL produzir tensão e uma vez induzido no log de meio da fase, incubar a 37 ° C por 24 h.
    2. Adicione dois volumes de etanol 100% para a cultura, agite bem e incubar a 37 ° C por 4 h.
    3. Centrifugar a suspensão de 900 x g durante 15 min. recolher o sobrenadante e incubar durante uma noite a 4 ° C, que precipita a lactose.
    4. Remova a lactose precipitada, passando a solução através de um filtro de papel (11 µm). Recolha o filtrado que é a célula do lisado contendo o 2'-FL, que pode ser quantificada pelo seguinte seção 3.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nós projetamos um biossensor celular específico para o 2'-FL que pode ser usado em conjunto com a produção biotecnológica do oligossacarídeo. Isto baseia-se na clivagem enzimática específica de modificação de açúcares terminais gerando à lactose e, assim, a ativação do operon do lac , levando à expressão de uma proteína fluorescente repórter sob um promotor inducible à lactose, proporcionalmente à quantidade de 2'-FL. Para demonstrar a sua especificidade de ligação, 3-fucosyllactose (3-FL), um isômero, também foi testado. O circuito genético contém duas partes: um gene de fucosidase ou afcB, impulsionado por um promotor constitutivo, resultando na expressão constitutiva, afcA clonado em um vetor com uma sequência de sinal de pelB codificado montante do gene fucosidase para facilita a exportação periplasmático, bem como um sistema de repórter fluorescente contendo o promotor T7 dirigindo a expressão de GFP. A primeira parte é expressa no plasmídeo pAfcA e o segundo sistema de repórter no plasmídeo pET28:GFP. A construção final foi transformada em Escherichia coli BL21 (DE3), uma cepa amplamente disponível que possui o T7 RNA polimerase integrado no genoma sob controle do promotor pLacUV5 à lactose-responsivo. A figura 1A mostra o desenho esquemático para que o leitor possa seguir o princípio de funcionamento do biosensor. Figura 1B ilustra o sinal fluorescente sob diferentes condições de indução como analisados em um citômetro de fluxo. Consistente com nossa hipótese, sobre um aumento de 100 vezes em fluorescência observou-se com o 2'-FL biosensor comparado com o controle do vetor-somente ou com o biosensor para 3-FL. Isto mostra a ligação alta especificidade do biosensor. Para garantir que o sinal é de fato devido a defucosylation, corremos um controle adicionando α-1,2-fucosidase comercial para a cultura durante a indução, o que é confirmada como mostrado pelas barras à direita. A sensibilidade do ensaio pode ser determinada, gerando uma curva de dose-resposta com diferentes níveis de carboidratos (Figura 2A). Do terreno, a gama dinâmica linear da deteção de 2'-FL é entre 40 e 400 mg/L e o limite de detecção é de 4 mg/L. Este ensaio pode ser realizado ao longo de um dia de trabalho, como mostrado por medições instantâneo da dinâmica da expressão repórter (Figura 2B).

Finalmente, apresentamos como as células biosensing podem ser usadas para detectar e quantificar o 2'-FL de uma estirpe de produtor de engenharia 2'-FL. Desde que esta cepa usa à lactose como substrato, desenvolvemos estratégias para reduzir o sinal da exógenas à lactose, para que a leitura de sinal corresponderia diretamente na concentração de 2'-FL (Figura 3A). Uma estratégia é enzimaticamente degradar a lactose usando um β-galactosidase que não age na modificados à lactose. Isto pode ser conseguido usando β-galactosidase comercial que actua preferencialmente na lactose, reduzindo o sinal à lactose para 20% do original (Figura 3B) ou através de incubação com uma estirpe BL21 selvagem-tipo do LacZ + (DE3), que em três horas cai a lactose sinal para níveis de fundo (Figura 3). A última estratégia utiliza etanol, que não só precipita seletivamente à lactose, mas também lise o produtor células, lise celular, sendo um necessário passo a jusante (Figura 3D). Este é um processo de extração simples, mas com cuidado devido à menor recuperação de 2'-FL em comparação com outros métodos, possivelmente a partir de perdas devido a uma cristalização de 2'-FL. Apesar da adição de etanol, não observamos inibição significativa do crescimento das células biosensing, provavelmente porque as concentrações de etanol final são baixas (< 2%, v/v) nas culturas. Finalmente, o método mais eficaz mas demorado que demonstramos é de pelotas e lavar as células antes de lise celular para liberar o intracelular 2'-FL (Figura 3E). Aconselhamos o leitor a usar o critério para selecionar o método adequado para remoção de lactose baseado na eficiência e disponibilidade de tempo e reagentes.

Figura 3E também demonstra a nossa capacidade de quantificar confiantemente 2'-FL em contexto biotecnológico. Nós cultivadas ou uma tensão projetada 2'-FL-produzindo11 ou uma bandas negativo mutante (controle negativo) com lactose para monitorar a produção de 2'-FL no lisado celular. Após o cultivo das células, medimos a concentração usando o biosensor e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para validação (complementar a Figura 1). As curvas de resposta de dose para o produtor lisado e controle lisado cravado com 2'-FL são muito semelhantes, o que demonstra a medição quantitativa de 2'-FL no contexto do lisado celular.

Figure 1
Figura 1: esquema de dados de design e representante de biosensor 2'-FL. (A) 2'-Fucosyllactose (2'-FL) entra a periplasm bacteriana e é convertido à lactose por fucosidase heterologously expressa. Lactose é transportada para o citoplasma e convertida em allolactose. Isso ativa o promotor LacUV5 nativo em Escherichia coli BL21 (DE3), produzindo T7 RNAP, que transcreve GFP sob o promotor T7, levando a expressão da proteína fluorescente. (B) detecção de 2'-FL e 3-FL. células contendo pET28:GFP e pAfcA (verde), pAfcB (magenta) ou um controle de vetor vazio (azul) foram induzidas durante a noite, sem açúcar, 2'-FL, 2'-FL com exogenamente adicionado α-1,2-fucosidase, 3-FL ou à lactose. Todos os dados são uma média de três repetições biológicas que cada analisada em triplicado, onde barras de erro representam o desvio padrão da média. Significância estatística foi determinada pelo teste de comparação múltipla de Tukey e * * é um indicativo de p < 0,01.  Esta figura primeiro apareceu no Enam e Mansell14 e é reutilizada com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: caracterização de biosensor para a deteção de 2'-FL. (A) limites de deteção e a transferência de funções de biossensores. Curvas de resposta retratando média fluorescência para pAfcA/2 ' FL (círculo verde) ou vetor de controle vazio (diamante azul) em quantidades variadas de 2'-FL cultivadas. (B) curso de tempo da expressão de repórter. Estirpe pAfcA foi incubado com 2'-FL (quadrado verde) e fluorescência foi monitorizada mais de 8 h de indução. Estirpe pAfcA incubada com lactose é incluído como um controle. Todos os dados são uma média de três repetições biológicas que cada analisada em triplicado, onde barras de erro representam o desvio padrão da média. Esta figura primeiro apareceu no Enam e Mansell14 e é reutilizada com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: deteção e quantificação de 2'-FL de uma estirpe de produtor. (A) fluxo de trabalho, demonstrando o uso do biosensor em um protocolo simples, com foco principal na remoção de ruído de lactose residual. (B) remoção de lactose por digestão enzimática de β-galactosidase. Culturas contendo 0,3% 2'-FL (quadrado verde) ou 0,2% lactose (círculo azul) foram incubadas com culturas biosensor contendo quantidades variáveis de β-galactosidase exógena ao tempo de indução foram doseadas para fluorescência após incubação durante a noite. (C) remoção de lactose pela incubação com estirpe do selvagem-tipo LacZ +. LB contendo 0,3% 2'-FL (círculo verde), 0,2% lactose (azul quadrado) ou uma mistura de 1:1 (0,2% lactose equivalente, ou seja, 0,1% lactose + 0,15% 2'-FL, magenta triângulo) foi incubada por várias vezes com BL21 (DE3) células e em seguida, adicionado a culturas de biosensor para medição de fluorescência após incubação durante a noite. (D) precipitação do lactose e pilha lysis pelo pré-tratamento de etanol. Fermentações de JM109 gwBC-F2 (círculo magenta) ou JM109 gwBC (triângulo azul) células foram incubadas com 2 volumes de etanol e filtradas antes de incubação com células fluorescentes biosensor e comparadas com fluorescência de não tratados JM109 gwBC-F2 cultura ( quadrado verde). (E) quantificação de 2'-FL no lisado celular. O biosensor foi avaliado por sua capacidade de detectar 2'-FL de uma estirpe de produtor metabolicamente engenharia. Medidas de fluorescência geradas pela adição de lisado de JM109 gwBC-F2 (círculo magenta, 2'-FL quantificada por LC-MS), 2'-FL em quantidades definidas de tensão nonproducer JM109 gwBC célula lisado (quadrado verde) ou bruto lisado de JM109 gwBC estirpe (azul ou bruto diamante). Resultados foram validados pela quantificação HPLC de 2'-FL na estirpe de produtor. Todos os dados são uma média de três repetições biológicas cada analisada em triplicado, onde barras de erro vertical representam o desvio padrão da média fluorescência e erro horizontal barras representam o desvio padrão em 2'-FL medido por HPLC na triplica. Esta figura primeiro apareceu no Enam e Mansell14 e é reutilizada com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar Figura 1: análise de HPLC-MS de 2'-FL. (A) extraído de cromatogramas de íon de 2'-FL (511 m/z). Cromatograma de um padrão comercial é mostrada no topo. Cromatograma de 2'-FL da estirpe JM109gwBC-F2 (diluição de 10 vezes) é mostrada na parte inferior. O pico em 511 m/z é o sódio aduto. (B) uma ampliação do espectro de massa m/z de 300−800, onde os sinais mais abundantes foram concentrados é mostrada para o padrão comercial (topo) e o 2'-FL da estirpe produtor (parte inferior). (C), A curva padrão foi criada por análise de LC-MS, com níveis variados de comercial 2'-FL. Barras de erro representam desvios-padrão de medições triplicadas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Apresentamos uma estratégia de alto rendimento para a detecção de ligação específica de fucosilado oligossacarídeos do leite humano. Isso foi conseguido através da construção de biossensores de célula inteira por engenharia genética de e. coli , que, após indução com os glicanos específicos, responder com um sinal fluorescente. O protocolo também detalhes sobre como o biosensor pode ser usado para detectar e quantificar a planos de saúde em uma estirpe bacteriana metabolicamente engenharia.

Nosso protocolo oferece vantagens sobre métodos alternativos, devido a sua alta taxa de transferência além de sua especificidade de ligação em comparação com métodos cromatográficos/MS. O baixo limite de detecção e de amplo alcance dinâmico permite a medição directa de planos de saúde.

Passos críticos neste protocolo ocorrem na preparação da célula de lisado de cepas de produtor. Para garantir a máxima concentração de 2'-FL, é fundamental proporcionar as melhores condições. Variabilidades em lotes podem surgir devido a parâmetros sonication ou indução vezes. Deve-se tomar cuidado durante a caracterização do biosensor. Também é aconselhável executar controles adequados para todas as etapas no experimento para garantir resultados consistentes.

Uma limitação do nosso protocolo é sua dependência à lactose por indução, que se torna um gargalo quando à lactose naturalmente presentes, como o leite materno, ou utilizado como substrato na produção biotecnológica de planos de saúde. Abordámos esta com quatro estratégias distintas para remover o sinal à relação de ruído para que a biosensor pode detectar seletivamente HMOs sobre à lactose.

O biosensor de células inteiras geneticamente codificado aqui apresentado permitirá otimização para o fabrico de planos de saúde, como muitas condições de reação ou parâmetros de biorreator podem ser analisados em paralelo em questão de horas. Quando executada em placas de 96 ou 384 poços, o método mostra potencial para tela milhares de amostras por dia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização Universidade do estado de Iowa. Fe foi parcialmente financiado pela NSF Trinect Fellowship e Manley Hoppe cátedra. T.J.M. foi parcialmente apoiado pela Karen e Denny Vaughn faculdade Fellowship. Os autores agradecer o Iowa University fluxo Cytometry instituição estadual e do W.M. Keck Metabolomics Research Laboratory para assistência com fluorescência e estudos de LC-MS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86, (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78, (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300, (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67, (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303, (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442, (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8, (1), 5562 (2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411, (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434, (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12, (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25, (10), 1292-1303 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics