Halbleitersequenzierung für Präimplantationsgenetische Tests für Aneuploidie

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Summary

Hier führen wir ein Halbleitersequenzierungsverfahren für Präimplantationsgentests für Aneuploidie (PGT-A) ein, mit den Vorteilen von kurzer Durchlaufzeit, niedrigen Kosten und hohem Durchsatz.

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Gui, B., Zhang, Y., Liang, B., Kwok, Y. K. Y., Lui, W. T., Yeung, Q. S. Y., Kong, L., Xuan, L., Chung, J. P. W., Choy, K. W. Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy. J. Vis. Exp. (150), e59273, doi:10.3791/59273 (2019).

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Abstract

Chromosomale Aneuploidie, eine der Hauptursachen für embryonalen Entwicklungsstillstand, Implantationsversagen oder Schwangerschaftsverlust, ist in menschlichen Embryonen gut dokumentiert. Präimplantationsgenetische Tests auf Aneuploidie (PGT-A) ist ein genetischer Test, der die Fortpflanzungsergebnisse signifikant verbessert, indem chromosomale Anomalien von Embryonen erkannt werden. Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) bietet einen hochdurchsatz- und kostengünstigen Ansatz für die genetische Analyse und hat die klinische Anwendbarkeit in PGT-A gezeigt. Hier präsentieren wir eine schnelle und kostengünstige, auf Halbleitersequenzierung basierende NGS-Methode zum Screening von Aneuploidie n. K. an Embryonen. Der erste Schritt des Workflows ist die gesamte Genomverstärkung (WGA) der biopsied embryonalen Probe, gefolgt von der Erstellung einer Sequenzierungsbibliothek und der anschließenden Sequenzierung des Halbleitersequenzierungssystems. Im Allgemeinen können für eine PGT-A-Anwendung 24 Samples auf jedem Chip geladen und sequenziert werden, der 60 bis 80 Millionen Lesevorgänge bei einer durchschnittlichen Lesedauer von 150 Basispaaren erzeugt. Die Methode bietet ein verfeinertes Protokoll für die Durchführung der Vorlagenverstärkung und -anreicherung der Sequenzierungsbibliothek, wodurch die PGT-A-Erkennung reproduzierbar, hochdurchlässig, kosteneffizient und zeitsparend ist. Die Laufzeit dieses Halbleiter-Sequenzers beträgt nur 2 bis 4 Stunden, wodurch die Durchlaufzeit vom Empfang von Proben bis zur Ausgabe von Berichten auf 5 Tage verkürzt wird. All diese Vorteile machen diesen Assay zu einer idealen Methode, um chromosomale Aneuploidien von Embryonen zu erkennen und so seine breite Anwendung in PGT-A zu erleichtern.

Introduction

Die Wahl von qualitativ hochwertigen lebensfähigen Embryonen mit normalen Chromosomenkopiennummern (Euploid) für den Transfer in der assistierten Reproduktion trägt zur Verbesserung der Schwangerschaftsergebnisse bei. Traditionell wird das etablierte morphologische Sortiersystem aufgrund seiner einfachen Verfügbarkeit und nicht-invasiven Natur häufig für die Embryonenbewertung verwendet. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die morphologische Bewertung nur begrenzte Informationen über embryonale Qualität1 und Implantationspotenzial2liefern kann. Ein wesentlicher Grund ist seine Unfähigkeit, die Chromosomenzusammensetzung der Embryonen zu bewerten.

Chromosomale Aneuploidie (abnorme Kopieanzahl von Chromosomen) ist eine der Hauptursachen, die zu embryonalen Entwicklungsstillstand, Implantationsversagen oder Schwangerschaftsverlust führen. Das Auftreten von Aneuploidie ist in menschlichen Embryonen gut dokumentiert, was 60 % bis 70 % bei Spalt-Embryonen3,4 und 50 % 60 % in Blastozysten5ausmacht. Dies hat in gewissem Maße zu dem Engpass bei der Verbesserung der Schwangerschaftsrate der In-vitro-Fertilisation (IVF) beigetragen, die bei etwa 35% bis 40%6,7gehalten wurde. Daher wird angenommen, dass die Auswahl von euploiden Embryonen für die Übertragung vorteilhaft für die Verbesserung der Schwangerschaftsergebnisse ist. Zu diesem Zweck wurden die genetischen Präimplantationstests für aneuploidierend (PGT-A) weiterentwickelt, um die Lebensfähigkeit von Embryonen mit genetischen Ansätzen zu untersuchen. Es gibt eine steigende Anzahl von randomisierten kontrollierten Studien und Kohortenstudien, die die entscheidende Rolle von PGT-A unterstützen. Es wurde nachgewiesen, dass die Anwendung von PGT-A die Fehlgeburtsrate senkt und die klinische Schwangerschaftsrate und Implantationsrate8, laufende Schwangerschaftsrate und Lebendgeburtsrate9erhöht.

Historisch gesehen wurden verschiedene Methoden in PGT-A angewendet, wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), vergleichende genomische Hybridisierung (CGH), Array-CGH und Single Nukleotide Polymorphism (SNP)-Mikroarray. Frühere Studien haben gezeigt, dass PGT-A für Embryos im Spaltstadium von FISH Ergebnisse liefert, die schlecht mit denen übereinstimmen, die durch umfassendes chromosomales Screening (CCS) entsprechender Blastozysten mit 59273Array-CGH oder SNP-Mikroarray5927310. Diese Diskrepanzen können auf chromosomalen Mosaikismus, technische FISCH-Artefakte oder embryonale Selbstkorrektur von Chromosomensegregationsfehlern während der Entwicklung11zurückgeführt werden. Es ist weithin anerkannt, dass die Verwendung von Blastozysten-Trophektomie (TE)-Biopsien für Array-basierte PGT-A wie Array-CGH oder SNP-Mikroarray wirksam ist, um das chromosomale Ungleichgewicht in Embryonen10,12zu identifizieren. Kürzlich bietet die single-cellnext-generation Sequencing (NGS) einen hochdurchsatz- und kostengünstigen Ansatz für die genetische Analyse und hat die klinische Anwendbarkeit in PGT-A13,14,15gezeigt, die es zu einem vielversprechende Alternative zu den derzeit verfügbaren Methoden.

Hier präsentieren wir eine schnelle, robuste und kostengünstige, auf Halbleitersequenzierung basierende NGS-Methode zum Screening von Aneuploidie nder menschlichen Embryonen. Der erste Schritt des Workflows ist die gesamte Genomverstärkung (WGA) der biopsied embryonalen Probe, mit einem einzelligen WGA-Kit, gefolgt von der Erstellung einer Sequenzierungsbibliothek und anschließender Sequenzierung des Halbleitersequenzierungssystems.

Durch die Detektion der H+ Ionen, die bei jeder Desoxyribonukleosidtriphosphat-Inkorporation während der DNA-Strangsynthese freigesetzt werden, überträgt das System die von den Halbleiterelementen erfassten chemischen Signale (pH-Änderung), um digitale Daten zu leiten. , die weiter in DNA-Sequenzinformationen interpretiert werden. Diese einfache Sequenzierungschemie entfällt die Anforderung an teure optische Detektion und komplexe Sequenzierungsreaktionen und reduziert die Gesamtkosten der Reagenzien insgesamt und verkürzt die Sequenzierungslaufzeit auf 2 bis 4 Stunden16. Noch wichtiger ist, dass die Halbleitersequenzierungsplattform auf der Grundlage der Leistungsspezifikationen des Herstellers bis zu 15 GB Sequenzierungsdaten (abhängig von der Qualität der Bibliothek) pro Durchlauf generieren kann, was deutlich höher ist als bei einigen anderen Sequenzern. nur etwa 3 x 4 GB Daten (mit 2 x 75 bp Leselänge)17. In klinischen Anwendungen von PGT-A kann diese Plattform 24 Proben pro Chip erreichen, der bis zu 80 Millionen Lesevorgänge17 und mindestens eine Million einzigartige Lesevorgänge jeder Probe generiert. Die Lesetiefe kann sicherstellen, dass jede Probe mindestens 0,05x gesamte Genomabdeckung hat. Die oben genannten Vorteile dieser Plattform machen sie zu einem idealen Screening-Verfahren und erleichtern so ihre breiten Anwendungen in PGT-A18.

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Protocol

Die ethische Zulassung wurde von der Joint Chinese University of Hong Kong–New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee erteilt (Referenznummer: 2010.432). Die Forschungslizenz wurde vom Council on Human Reproductive Technology of Hong Kong (Nummer R3004) genehmigt.

1. Gesamte Genomverstärkung

  1. Überprüfen Sie vor dem Start das Volumen der magnetischen Perlen (Materialtabelle), um sicherzustellen, dass für jede Probe nicht weniger als 135 L (mit einem Überschuss von 20 %) vorhanden sind. Halten Sie die magnetischen Perlen bei Raumtemperatur (RT) für mindestens 30 min. Bereiten Sie 720 l (mit einem 20% Überschuss) von 70% Ethanol für jede Probe vor. Einen Thermocycler (Materialtabelle) mit beheiztem Deckel bei 105 °C ausstatten.
    HINWEIS: Das neu hergestellte 70% Ethanol (Materialtabelle) sollte innerhalb von 3 Tagen aufgebraucht sein.
  2. Probenvorbereitung
    HINWEIS: In der Routinepraxis werden 5 bis 10 Trophektodermzellen der Blastozyste gemäß der Praxisrichtlinie19biopsiet.
    1. Aussetzen von Biopsien in 2 l 1x phosphatgepufferter Saline (PBS) in einem einzigen 0,2 ml Polymerase-Kettenreaktionsrohr (PCR).
    2. Drehen Sie das Rohr kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s, um die Tröpfchen zu sammeln.
  3. Zelllyse und Extraktion
    1. Den Zellextraktionspuffer (Materialtabelle) und den Extraktionsenzymverdünnungspuffer (Materialtabelle) auf Eis, Wirbel auftauen und vor Gebrauch kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s drehen.
    2. Fügen Sie jedem Rohr ab Schritt 1.2.2 3 L Zellextraktionspuffer hinzu.
    3. Bereiten Sie für jede Probe einen 5-L-Zelllyse-Master-Mix vor, indem Sie 4,8 l Extraktionsenzym-Verdünnungspuffer und ein 0,2-L-Zellextraktionsenzym(Materialtabelle)hinzufügen. Gut mischen und aliquot in jede Röhre ab Schritt 1.3.2. Drehen Sie das Rohr sanft und drehen Sie kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s.
      HINWEIS: Spitzen sollten die Flüssigkeit, die die Zellproben enthält, beim Hinzufügen der Mastermischung nicht berühren.
    4. Inkubieren Sie das Rohr ab Schritt 1.3.3 im Thermocycler mit beheiztem Deckel. Führen Sie das Programm mit den folgenden Einstellungen aus: 10 min bei 75 °C, 4 min bei 95 °C, halten Sie bei 4 °C.
  4. Vorverstärkung
    1. Den Vorverstärkungspuffer (Materialtabelle) auf Eis, Wirbel auftauen und vor Gebrauch kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s drehen.
    2. Bereiten Sie für jede Probe einen 5-L-Vorverstärkungs-Mastermix vor, indem Sie 4,8 l Vorverstärkungspuffer und 0,2 l Vorverstärkungsenzym(Materialtabelle)hinzufügen. Gut mischen und aliquot in jede Röhre ab Schritt 1.3.4. Drehen Sie das Rohr sanft und drehen Sie kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s.
      HINWEIS: Tipps sollten die Flüssigkeit, die die DNA-Proben enthält, nicht berühren, wenn sie den Master-Mix hinzufügen.
    3. Inkubieren Sie das Rohr im Thermischen Cycler mit beheiztem Deckel. Führen Sie das Programm mit den fließenden Einstellungen: 2 min bei 95 °C; 12 Zyklen für 15 s bei 95 °C, 50 s bei 15 °C, 40 s bei 25 °C, 30 s bei 35 °C, 40 s bei 65 °C, 40 s bei 75 °C; bei 4 °C halten.
  5. erläuterungen
    1. Den Amplifikationspuffer (Materialtabelle) auf Eis, Wirbel auftauen und vor Gebrauch kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s drehen.
    2. Bereiten Sie für jede Probe einen 60-L-Amplifikations-Master-Mix vor, indem Sie 25 L Amplifikationspuffer, 0,8 l Amplifikationsenzym (Materialtabelle )und 34,2 l nukleasefreies Wasser für WGA (Materialtabelle)hinzufügen. Gut mischen und aliquot in jede Röhre ab Schritt 1.4.3. Drehen Sie das Rohr sanft und drehen Sie kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s.
    3. Inkubieren Sie das Rohr im Thermischen Cycler mit beheiztem Deckel. Führen Sie das Programm mit den folgenden Einstellungen aus: 2 min bei 95 °C; 14 Zyklen für 15 s bei 95 °C, 1 min bei 65 °C, 1 min bei 75 °C; bei 4 °C halten.
  6. Reinigung von die WGA Produkte
    1. Übertragen Sie jedes WGA-Produkt von Schritt 1.5.3 in neue 1,5 ml-Rohre. Fügen Sie 112,5 L magnetische Perlen in jede Röhre. Wirbel und inkubieren bei RT für 5 min.
      HINWEIS: Mischen Sie die magnetischen Perlen vor dem Gebrauch vollständig.
    2. Legen Sie die Rohre 3 min auf einen magnetischen Ständer(Materialtabelle), bis der Überstand frei ist. Entsorgen Sie alle Überstand, ohne die Perlen zu stören.
    3. Fügen Sie 300 l 70% Ethanol in jede Röhre. Drehen Sie jedes Rohr um 180°, um die Perlen durch das Ethanol laufen zu lassen und wieder in die ursprüngliche Position zu drehen. Entsorgen Sie alle Überstand, nachdem die Perlen sich niedergelassen haben, ohne die Perlen zu stören. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
      HINWEIS: Halten Sie das Rohr auf dem magnetischen Ständer, während Sie das Rohr horizontal drehen.
    4. Drehen Sie jedes Rohr kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s. Legen Sie die Rohre auf den magnetischen Ständer, bis der Restüberstand frei ist. Entsorgen Sie alle Restüberstande, ohne die Perlen zu stören. Die Perlen bei RT ca. 3 min an der Luft trocknen.
    5. Entfernen Sie die Rohre aus dem magnetischen Ständer und setzen Sie die getrockneten Perlen wieder auf, indem Sie 35 L niedrigen Tris-EDTA (TE)-Puffer(Materialtabelle)hinzufügen. Inkubieren Bei RT für 5 min.
    6. Legen Sie die Rohre für 3 min auf den magnetischen Ständer, bis der Überstand frei ist. Übertragen Sie alle Überstande, die eluierte DNA enthalten, in neue 1,5 ml-Röhren, ohne die Perlen zu stören.

2. Qualitätskontrolle der WGA-Produkte

  1. Quantifizieren Sie jedes gereinigte WGA-Produkt ab Schritt 1.6.6 durch einen Fluorometer-Test (Materialtabelle) gemäß herstellerhandbuch unter Verwendung von 1 L WGA-Produkt als Ausgangsmaterial.
    HINWEIS: Die akzeptierte Konzentration des WGA-Produkts beträgt 10 ng/l. Es wird nicht empfohlen, mit den nächsten Schritten fortzufahren.

3. Fragmentierung von WGA-Produkten

  1. Vor dem Start einen Trockenblocker auf 37 °C vorheizen. Bereiten Sie für jede Probe 6 l (mit einem Überschuss von 20 %) von 0,5 M EDTA vor. Basierend auf der Konzentration, aliquot 300 ng DNA aus jedem gereinigten WGA-Produkt in Schritt 1.6.6 bis neue 0,2 ml PCR-Röhren und bringen Volumen auf 16 'L mit nukleasefreiem Wasser für jede Röhre.
  2. Fragmentierung
    1. Bereiten Sie für jede Probe einen 4-L-Fragmentierungs-Fragmentierungs-Reaktionsmix mit 4 L doppelsträngigen DNA-Fragmentierungsreaktionen vor, indem Sie 2 L dsDNA-Fragmentierungsreaktionspuffer (Materialtabelle) und 2 l dsDNA-Fragmentierungsenzyme (Materialtabelle )hinzufügen. Gut mischen und aliquot in jede Röhre ab Schritt 3.1. Vortex und kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s drehen. Inkubieren Sie die Rohre für 25 min bei 37 °C in einem thermischen Cycler mit beheiztem Deckel.
    2. Fügen Sie jedem Rohr sofort 5 l von 0,5 M EDTA hinzu. Durch Wirbelgut mischen und kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s drehen.
  3. Reinigung und Resuspension
    1. Übertragen Sie jedes Produkt von Schritt 3.2.2 in neue 1,5 ml Rohre. Fügen Sie 37,5 L magnetische Perlen zu jeder Röhre hinzu. Durch Vertexing mischen und bei RT für 5 min inkubieren.
    2. Reinigen Sie die Produkte wie beschrieben von Schritt 1.6.2 bis Schritt 1.6.4.
    3. Elute jedes gereinigte Produkt, wie in den Schritten 1.6.5 und 1.6.6 beschrieben, durch Zugabe von 32 L Low-TE-Puffer.

4. Bibliotheksbau

  1. Blunt- e nd r Epairment, Größenauswahl und Reinigung
    1. Bereiten Sie für jede Probe einen 20-L-Stumpf-End-Reparaturmix vor, indem Sie 9,5 l nukleasefreies Wasser, 10 l 5x Endreparaturpuffer(MaterialtabelleRohr ab Schritt 3.3.3) hinzufügen. Wirbel und kurz drehen auf einer Mini-Zentrifuge für 3 s.
    2. Fügen Sie jedem Rohr ab Schritt 4.1.1 50 l Magnetperlen hinzu. Wirbel und inkubieren bei RT für 5 min.
      HINWEIS: Mischen Sie die magnetischen Perlen vor dem Gebrauch vollständig.
    3. Legen Sie jedes Rohr für 3 min auf den magnetischen Ständer, bis der Überstand frei ist. Übertragen Sie den gesamten Überstand auf neue 1,5 ml-Röhren, in denen jeweils 25 L-Magnetperlen hinzugefügt werden. Wirbeln Sie die Rohre mit dem übertragenen Überstand und inkubieren bei RT für 5 min.
    4. Reinigen Sie die Produkte in den inkubierten Rohren wie beschrieben von Schritt 1.6.2 bis Schritt 1.6.4.
    5. Elute jedes gereinigte Produkt, wie in den Schritten 1.6.5 und 1.6.6 beschrieben, durch Zugabe von 32 L Low-TE-Puffer.
      HINWEIS: Dies ist ein sicherer Haltepunkt; die gereinigte DNA aus diesem Schritt ist bei 4 °C für nicht mehr als 24 h stabil.
  2. Adapter l und p urification
    1. Bereiten Sie für jede Probe einen 17-L-Adapterligationsmix vor, indem Sie 10 l nukleasefreies Wasser, 5 l 10-liter-Ligase-Puffer(Materialtabelle), 1 L P1-Adapter (Materialtabelle) und 1 l DNA-Ligase (Materialtabelle)hinzufügen. Mischen Sie gut durch Wirbeln für 5 s und drehen Sie auf einer Mini-Zentrifuge für 15 s, und aliquot in jedem Rohr von Schritt 4.1.5.
    2. Fügen Sie jedem Rohr ab Schritt 4.2.1 gemäß dem Musterblatt (Ergänzungsdatei: Musterblatt für Adapterligation) 1 L Adapter ( Tabelleder Materialien) hinzu. Vortex und kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s drehen. Inkubieren Sie die Rohre bei RT (20-25 °C) für 20 min.
    3. Fügen Sie jedem Rohr ab Schritt 4.2.2 75 L Magnetperlen hinzu. Durch Vertexing mischen und bei RT für 5 min inkubieren. Reinigen Sie dann die Produkte wie beschrieben von Schritt 1.6.2 bis Schritt 1.6.4.
    4. Elute jedes gereinigte Produkt, wie in den Schritten 1.6.5 und 1.6.6 beschrieben, durch Zugabe von 15 L Low-TE-Puffer. Übertragen Sie alle Überstande, die eluierte DNA enthalten, auf neue 0,2 ml 8-Rohrstreifen.
      HINWEIS: Dies ist ein sicherer Haltepunkt; die gereinigte DNA aus diesem Schritt ist bei 4 °C für nicht mehr als 24 h stabil.
  3. Verstärkung und Reinigung
    1. Bereiten Sie für jede Probe einen 50-L-Verstärkungs-Master-Mix vor, indem Sie 47,5 l Super-Mix (Materialtabelle) und 2,5 l Primer-Mix (Tabelle derMaterialien) hinzufügen. Gut durch Wirbeln mischen und kurz auf einer Minizentrifuge drehen und in die 0,2 ml 8-Rohr-Streifen ab Schritt 4.2.4 aliquotieren.
    2. Wirbeln Sie die Streifen für 30 s und drehen Sie kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s. Inkubieren Sie die Streifen im Thermocycler mit beheiztem Deckel. Führen Sie das Programm mit den folgenden Einstellungen aus: 20 min bei 72 °C; 5 min bei 95 °C; 10 Zyklen für 15 s bei 95 °C, 15 s bei 62 °C, 1 min bei 70 °C; 5 min bei 70 °C; bei 4 °C halten.
    3. Übertragen Sie jedes Produkt ab Schritt 4.3.2 in neue 1,5 ml Rohre. Fügen Sie jedem Rohr 97,5 l Magnetperlen hinzu. Mischen Sie durch Wirbel und inkubieren bei RT für 5 min.
    4. Reinigen Sie die Produkte wie beschrieben von Schritt 1.6.2 bis Schritt 1.6.4.
    5. Elute jedes gereinigte Produkt, wie in den Schritten 1.6.5 und 1.6.6 beschrieben, durch Zugabe von 25 L low-TE Puffer.

5. Qualitätskontrolle und Verdünnung der DNA-Bibliothek

  1. Quantifizieren Sie jede vorbereitete DNA-Bibliothek von Schritt 4.3.5 durch den Fluorometer-Test gemäß dem Herstellerhandbuch unter Verwendung von 2 L DNA-Bibliothek als Ausgangsmaterial.
  2. Die akzeptierte Konzentration der DNA-Bibliothek beträgt 0,5 ng/l und die der Positivkontrolle (Materialtabelle) bei 15 ng/l. Wenn die Konzentration der Positivkontrolle zu stark von 15 ng/l variiert, wiederholen Sie die Quantifizierung der Positivkontrolle, bis die Konzentration nahe 15 ng/l liegt. Wenn die Konzentration der Bibliothek unter 0,5 ng/l liegt, starten Sie die Fragmentierung neu (Abschnitt 3).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Konzentration der Positivkontrolle den akzeptierten Wert erreicht, bevor Sie die DNA-Bibliothek quantifizieren.
  3. Verdünnen Sie jede Bibliothek auf 100 pmol, indem Sie nukleasefreies Wasser hinzufügen. Fügen Sie 1 L der Bibliothek zu n L n L n-L n-L von nukleasefreiem Wasser hinzu; n mit der folgenden Gleichung berechnen:
    Equation
    wobei Q die Konzentration jeder Bibliothek ist, die durch den Fluorometer-Test gemessen wird, und C die Konzentration der positivgesteuerten, die durch den Fluorometer-Assay gemessen wird.

6. Sequenzierung

  1. Bereiten Sie vor dem Start 48 l (mit einem 20% Überschuss) von 1 M NaOH für jede Probe und ein nukleasefreies 1,5 ml-Rohr vor. Den Master-Mix PCR-Puffer (Tabelle der Materialien) (2000 l in Volumen) bei RT auftauen. Bringen Sie die Kugelpartikel (Materialtabelle) auf RT.
  2. Bibliothekspooling
    1. Wirbel jede verdünnte Bibliothek ab Schritt 5.3 und drehen sie jeweils 4x auf einer Minizentrifuge für 3 s. Nehmen Sie 5 L jeder Bibliothek, um in das nukleasefreie 1,5 ml-Rohr zu bündeln. Wirbeln Sie die gemischte Bibliothek und drehen Sie kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s.
  3. EmulsionpcR mit Emulsionssystem
    1. Fügen Sie 2 neue Rückgewinnungsrohre (Materialtabelle )150 L Bruchlösung hinzu. Installieren Sie die neuen Bergungsrohre, den Recovery-Router und die Verstärkerplatte.
    2. Mischen Sie durch Invertieren der Ölflasche (Tabelle der Materialien) 3 mal. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Öl- als auch die Rückgewinnungslösung (Materialtabelle) mindestens 2/3 voll sind.
    3. Vortex den Master-Mix PCR-Puffer für 30 s und kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s drehen. Wirbel die Kugelpartikel und die gemischte Bibliothek von Schritt 6.2.1 für 1 min und kurz drehen auf einer Minizentrifuge für 3 s.
    4. Bereiten Sie einen 2400-L-Ligationsmix vor, indem Sie 172 l nukleasefreies Wasser, 8 l gemischte Bibliothek ausSchritt 6.3.3, 120 l Enzymmischung (Materialtabelle) und 100 l Kugelpartikel in das Rohr mit einem Master-PCR-Puffer von 2000 l hinzufügen.
    5. Legen Sie eine Pipette auf 800 l. Laden Sie den Ligationsmix von Schritt 6.3.4 auf den Reaktionsfilter (Materialtabelle) durch den Probenanschluss. Verwenden Sie eine 1000P Pipette, um dem Reaktionsfilter 200 l Reaktionsöl hinzuzufügen.
    6. Wählen Sie das Programm Proton: Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit, und wählen Sie dann Assisted Taste, um sicherzustellen, dass das Gerät richtig eingerichtet wurde, indem Sie die Anweisungen auf dem Monitor befolgen. Klicken Sie dann auf Weiter, um das Programm zu starten.
  4. Anreicherung durch automatisches Anreicherungssystem
    1. Wenn das Emulsions-PCR-Programm abgeschlossen ist, klicken Sie auf Weiter, und klicken Sie dann auf Final Spin, um 10 min zu drehen. Nehmen Sie die 2 Erholungsrohre heraus, nachdem Sie auf Open Lidgeklickt haben.
    2. Entsorgen Sie den Überstand aus den 2 Rückgewinnungsrohren, bis in jedem Rohr 100 l verbleiben, und beschriften Sie ihn entsprechend. Mischen Sie die Lösung gut und übertragen Sie auf ein neues 1,5 ml Rohr.
    3. Fügen Sie jedem Rückgewinnungsrohr 200 l Nuklease-freies Wasser hinzu, waschen Sie es mehrmals durch Pipettieren nach oben und unten und übertragen Sie die gesamte Lösung in Schritt 6.4.2 auf das 1,5 ml-Rohr. Wiederholen Sie den Waschschritt einmal.
    4. Fügen Sie 200 L nukleasefreies Wasser in eines der Rückgewinnungsrohre und waschen Sie durch Pipettieren auf und ab mehrmals. Übertragen Sie die gesamte Lösung auf das andere Rückgewinnungsrohr und waschen Sie durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals. Übertragen Sie dann die gesamte Lösung ab Schritt 6.4.3 auf das gleiche 1,5 ml-Rohr. Wirbel das 1,5 ml Rohr für 30 s und Zentrifuge für 8 min bei 15.500 x g.
      HINWEIS: Das Endvolumen des Emulsions-PCR-Produkts sollte in diesem Schritt ca. 1200 l betragen.
    5. Entsorgen Sie den Überstand in der Röhre und bewahren Sie 20 l des Emulsions-PCR-Produkts auf. Fügen Sie dem Rohr 80 L Resuspension-Lösung (Materialtabelle) hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.
    6. Bereiten Sie für jeden Chip eine Schmelzlösung von 320 l l vor, indem Sie 280 L Polyethylenglykol-Sorbitan-Monolaurat-Lösung(Materialtabelle)und 40 l mit 1 M NaOH hinzufügen.
      HINWEIS: 1 M NaOH sollte bei 4 °C oder frisch zubereitet gelagert werden. Vortex vor Gebrauch.
    7. Wirbel die Röhre mit C1-Perlen (Tabelle der Materialien) für 30 s. Nehmen Sie 100 L C1-Perlen in ein neues 1,5 ml Rohr. Legen Sie das 1,5 ml Rohr für 2 min bei RT auf den magnetischen Ständer. Entsorgen Sie den ganzen Überstand, nachdem sich die Perlen abgesetzt haben, ohne die Perlen zu stören.
    8. 1 ml Waschlösung C1 (Materialtabelle) ab Schritt 6.4.7 in das Rohr geben. Wirbel für 30 s. Legen Sie das Rohr auf den magnetischen Ständer für 2 min bei RT. Entsorgen Sie alle Überstand, nachdem die Perlen sich abgesetzt haben, ohne die Perlen zu stören. Setzen Sie die Perlen wieder auf, indem Sie 130 L Perlenerfassungslösung (Tabelleder Materialien)hinzufügen.
    9. Anreicherungssystem (ES) Einrichtung
      1. Die Probe (100 l EmulsionPCR-Produkt) ab Schritt 6.4.5, die gewaschenen Perlen (130 l) ab Schritt 6.4.8, ES-Waschlösung (300 l)(Materialtabelle)und Schmelzlösung (300 l) von Schritt 6.4.6 in den 8-Rohr-Streifen laden. Die Layoutreihenfolge ist: Probe (Rohr 1), gewaschene Perlen (Rohr 2), ES-Waschlösung (Rohre 3, 4, 5) und Schmelzlösung (Rohr 7). Rohre 6 und 8 leer halten.
      2. Legen Sie den 8-Rohr-Streifen ab Schritt 6.4.9.1 auf die ES. Installieren Sie eine Pipettenspitze und ein neues 0,2 ml Rohr und starten Sie das Programm.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Pipetieren normal funktioniert.
    10. Waschen Sie die Kugelpartikel, nachdem die Anreicherung abgeschlossen ist.
      1. Zentrifugieren Sie das 0,2 ml-Rohr ab Schritt 6.4.9.2 für 5 min bei 15.500 x g. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie 10 l des Anreicherungsprodukts auf. Fügen Sie 200 L nukleasefreies Wasser in das Rohr. Mix durch Wirbel.
      2. Zentrifugieren Sie das 0,2 ml-Rohr ab für 5 min bei 15.500 x g. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie 10 l des Anreicherungsprodukts auf. Fügen Sie dem Rohr 90 l nukleasefreies Wasser hinzu. Mix durch Wirbel.
  5. Vorlagenvorbereitung
    1. Wirbel die positive Kontrolle und drehen kurz. Fügen Sie der 100-L-Vorlage (dem Anreicherungsprodukt aus Schritt 6.4.10.2) 5 L Positivkontrolle hinzu. Vortex und Zentrifuge für 5 min bei 15.500 x g. Entsorgen Sie den Überstand, und bewahren Sie 10 L der Vorlage auf.
    2. Fügen Sie dem Vorlagenrohr aus Schritt 6.5.1 2000 L Sequenzierungsgrundierung (Materialtabelle) und 15 L des Glühpuffers (Materialtabelle) hinzu. Wirbeln Sie das Rohr und drehen Sie kurz auf einer Minizentrifuge für 3 s.
    3. Inkubieren Sie das Rohr ab Schritt 6.5.2 im Thermocycler mit beheiztem Deckel. Führen Sie das Programm mit den folgenden Einstellungen aus: 2 min bei 95 °C, 2 min bei 37 °C, halten Sie bei 4 °C.
    4. Fügen Sie dem Rohr ab Schritt 6.5.3 10 L Ladepuffer (Materialtabelle) hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.
  6. Sequenzer-Initialisierung
    1. Überprüfen Sie den Tankdruck von Stickstoffgas (Gesamtdruck bei 500 psi, Ausgangsdruck bei 10 psi, optimale 20-30 psi). 100 ml entionisiertes Wasser (18,2 Mio.) auf C1- und C2-Rohre(Materialtabelle) aufladen und auf entsprechende C1- und C2-Positionen am Sequenzer installieren.
    2. Bereiten Sie die Lösungen W1 (32 l von 1 M NaOH) und W3 (40 x 50 ml W3-Puffer [Materialtabelle]) vor. Bereiten Sie die W2-Lösung vor, indem Sie 1920 ml entionisiertes Wasser (18,2 Mio. USD), eine ganze Flasche W2-Puffer (Materialtabelle) und 8 x 12 l mit 1 M NaOH hinzufügen und 4 x 8 Mal invertieren.
      HINWEIS: Da die Wasserqualität geologisch variiert, passen Sie das Volumen von 1 M NaOH nach Bedarf an. Der Start-pH-Wert von W2 beträgt 5,9-6,1, und der optimale Bereich nach der Einstellung beträgt 7,4 x 7,6. Wechseln und installieren Sie neue Reagenzrohre und verwenden Sie in letzter Zeit verwendeten Chip zum Waschen.
    3. Bereiten Sie die 4 neuen Leerrohre aus dem Sequenzierungs-Ergänzungskit (Tabelle der Materialien). Beschriften Sie die 4 Rohre als dGTP, dCTP, dATP und dTTP, und fügen Sie 70 L dGTP, dCTP, dATP oder dTTP(Materialtabelle) dem entsprechenden Rohr hinzu (d. h. 70 l dGTP in das als dGTP beschriftete Rohr usw.). Wirbeln Sie die Rohre vor Gebrauch. Installieren Sie die Rohre an den entsprechenden Positionen, die auf dem Sequenzer (Materialtabelle) angegeben sind.
  7. Chipwäsche
    1. Waschen Sie den Chip (Tabelle der Materialien) einmal, indem Sie 100 l Isopropanol in die Ladebohrung des Chips injizieren. Entfernen Sie die ausgestoßene Flüssigkeit aus dem gegenüberliegenden Brunnen.
    2. Waschen Sie den Chip zweimal, indem Sie 100 l nukleasefreies Wasser in die Ladebohrung des Chips einspritzen. Entfernen Sie die ausgestoßene Flüssigkeit aus dem gegenüberliegenden Brunnen.
    3. Waschen Sie den Chip einmal, indem Sie 100 l 0,1 M NaOH in die Ladebohrung des Chips injizieren. Entfernen Sie die ausgestoßene Flüssigkeit aus dem gegenüberliegenden Brunnen. Bei RT für 1 min inkubieren.
    4. Waschen Sie den Chip einmal, indem Sie 100 l nukleasefreies Wasser in die Ladebohrung des Chips einspritzen. Entfernen Sie die ausgestoßene Flüssigkeit aus dem gegenüberliegenden Brunnen.
    5. Waschen Sie den Chip zweimal, indem Sie 100 l Isopropanol in die Ladebohrung des Chips injizieren. Entfernen Sie die ausgestoßene Flüssigkeit aus dem gegenüberliegenden Brunnen. Trocknen Sie, indem Sie Stickstoff auf den Chip blasen. Vom Licht fernhalten.
  8. Probenbeladung und -sequenzierung
    1. Mischen Sie die 55-L-Probe ab Schritt 6.5.4, indem Sie nach oben und unten pfeifen und die Probe auf die Ladebohrung des Chips laden.
      HINWEIS: Bewahren Sie die Pipettenspitze und das in diesem Schritt verwendete 0,2 ml PCR-Rohr auf.
    2. Legen Sie den Chip auf die Chip-Minizentrifuge (Materialtabelle), wenn
    3. Bereiten Sie zwei neue 1,5 ml Rohre für den Glühpuffer und die Spüllösung vor. Bereiten Sie den 50% Glühpuffer vor, indem Sie 500 l Glühpuffer und 500 l Nuklease-freies Wasser hinzufügen. Bereiten Sie die Spüllösung vor, indem Sie 500 l Glühpuffer und 500 l 100 % 2-Propanol hinzufügen.
    4. Bereiten Sie zwei neue 1,5 ml-Rohre vor und bereiten Sie das Schaumgemisch vor, indem Sie 49 l 50 % Glühpuffer und 1 l Schaumlösung(Materialtabelle) in beiden Röhren mischen.
    5. Stellen Sie eine Pipette auf 100 l. Machen Sie Blasen, indem Sie Luft in das Schäumgegegeich aus einem der beiden Rohre aus Schritt 6.8.4 pfeifen. Machen Sie > 120 L Blasen und halten Pipettieren, bis keine herausragenden sichtbaren Blasen zu sehen sind. Laden Sie 120 L Blasen in den Ladebrunnen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine sichtbaren Blasen vorhanden sind. Andernfalls beginnen Sie es von vorn.
    6. Übertragen Sie die übermäßig ausgestoßene Flüssigkeit aus Schritt 6.8.5 durch Pipettieren vom Ausgang gut in den Ladebrunnen. Pipettenblasen nicht. Zentrifugieren Sie den Chip für 30 s auf der Chip-Minizentrifuge.
    7. Wiederholen Sie Schritt 6.8.5, indem Sie das zweite Rohr verwenden, das das Schaumgemisch aus Schritt 6.8.4 enthält.
    8. Fügen Sie dem 0,2 ml-Rohr, das in Schritt 6.8.1 gehalten wird, 55 l des 50% Glühpuffers hinzu. Verwenden Sie die gehaltene Pipettenspitze in Schritt 6.8.1, um Pipetten nach oben und unten zu pipette. Laden Sie den gesamten 55-L-Glühpuffer in den Ladebrunnen. Zentrifugieren Sie den Chip für 30 s auf der dafür vorgesehenen Chip-Minizentrifuge.
    9. 100 L Spüllösung in den Spanladebrunnen einlegen und die ausgestoßene Flüssigkeit aus dem Austrittsbrunnen entsorgen. Wiederholen Sie diesen Ladeschritt einmal.
      HINWEIS: Wenn es Blasen im Chip gibt, vertreiben Sie kleine Blasen durch große Blasen und spülen Sie durch Spüllösung. Dies kann erreicht werden, indem 100 l Spüllösung pipetiert und 5 l Luft unter der Spüllösung gelassen wird. Daher bildet Luft beim Pipettieren der 105 l in den Chip eine große Blase, die die kleinen Blasen vertreiben kann, und dann kann die große Blase durch die folgende Spüllösung ausgestoßen werden.
    10. Laden Sie 100 l des 50% Glühpuffers in den Spanladebrunnen. Wiederholen Sie diesen Ladeschritt insgesamt 3 Mal.
    11. Fügen Sie 6 l des Sequenzierungsenzyms in 60 l des 50%-Glühpuffers in ein neues 1,5 ml-Rohr ein. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten. Laden Sie 65 l dieser gemischten Lösung in den Spanladebrunnen. Pipette langsam, um Schaumbildung zu vermeiden.
    12. Halten Sie den Chip von Licht fern und brüten Bei RT für 5 min.
    13. Laden Sie den Chip nach der Inkubation sofort auf den Sequenzer und klicken Sie auf den Sequenzierungslauf auf dem Bildschirm starten, um die Sequenzierung zu starten.
      HINWEIS: Die Sequenzierung von Rohdaten und Qualitätskontrolldateien wird automatisch zur Datenanalyse in das Unternehmen hochgeladen.

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Representative Results

Basierend auf diesem modifizierten Protokoll wurde die Halbleitersequenzierungsplattform zum ersten Mal für PGT-A eingesetzt. Wir testeten Biopsien aus Spalt-Blastomeren und Blastozysten-Embryon. Es wird vermutet, dass die biopsied Zellen WGA so schnell wie möglich unterzogen werden, um einen Abbau der DNA zu verhindern. Eine frühere Studie verglich die Leistung verschiedener WGA-Methoden und zeigte, dass die hier beschriebene Methode bei der Behältergröße von 100 KB20die beste Homogenität aufwies. Unter Berücksichtigung der Leistungsfähigkeit sowohl der Homogenität als auch der medianen absoluten paarweisen Differenz (MAPD)21wurde diese WGA-Methode für PGT-A mit dem Halbleitersequenzer ausgewählt. Durch eine retrospektive statistische Analyse von 186 Spaltstadium und 1135 Blastozysten-Stadium-Embryonen stellten wir fest, dass die WGA-Erfolgsraten bei Blastomerproben bei 95,4% und bei Blastozystenproben 96,9% betrugen (Abbildung 1). Der Reinigungsschritt vor dem Bibliotheksbau als Größenauswahlverfahren war entscheidend für die Sequenzierung der Qualität durch die Erfassung großer DNA-Fragmente. Darüber hinaus erleichterte es die Eingangsmenge von 300 ng für den Bibliotheksbau. Die enzymatische Fragmentierungsmethode ermöglichte eine effiziente Scherung von WGA-Produkten in ca. 160 bp.

Die Datenanalyse wurde mit dem Euklidischen Fern- und Zirkel-Binärsegmentierungssystem (EDCBS) durchgeführt. Die in-house-Validierung wurde durchgeführt, um die Robustheit dieses bioinformatigen Algorithmus zu bewerten. Wir haben eine Referenzdatenbank exklusiv für PGT-A eingerichtet, indem 379 WGA-Produkte aus 66 Zelllinien mit bekannten Karyotypen sequenziert wurden, indem wir eine Behältergröße von 100 KB analysierten. Aus dieser Datenbank wurde ein Referenzbereich als Schwellenwert für den Aufruf der Kopiernummersvariante (CNV) und 10 MB als Cutoff für die Erkennungsstufe festgelegt. Sowohl die Empfindlichkeit als auch die Spezifität erreichten bei diesem Schwellenwert über 99 % (Tabelle1). In der Anwendung für PGT-A auf Embryobiopsien wurde die Fenstergröße auf 400 KB mit einem Schiebefensteransatz eingestellt, um genügend Lesevorgänge zu erreichen. Die Qualitätskontrolle (QC) jeder Probe wurde durch eindeutige Lesevorgänge, MAPD und Standardabweichung der Kopiernummernvariante (CNV-SD) bestimmt. Das Beispiel über einen der drei Indizes hinaus wurde als QC-Fehler definiert (Abbildung 2C). Die Interpretation von Chromosomenstreudiagrammen (Abbildung2A,B,D) wurde von qualifizierten Genetikern nach einem Workflow durchgeführt, indem die identifizierte CNV mit DECIPHER-, DGV- oder ClinGen-Datenbanken verglichen wurde. Einzelne Diskrepanzen wurden durch ein fachkundiges Kurationsverfahren kontrolliert. Chromosomale Anomalien wurden in Blastozystenproben in Aneuploidie und Mosaikismus gruppiert. Ein Kopierzahlengewinn oder -verlust im Bereich von 30 % bis 70 % wurde als tragende mosaikchromosomale Zusammensetzung klassifiziert; Andernfalls würde das Ergebnis entweder als Euploidie oder als Aneuploidie interpretiert werden. In dieser Studie lagen die Euploidraten bei Blastomeren bei 45,2% und bei Blastozysten bei 52,3%, was auf die veröffentlichten Daten22,23anknüpfte.

Figure 1
Abbildung 1: Demographische Statistiken von 1321 embryonalen Biopsien, die mit dieser Methode getestet wurden. (A) Daten von 186 Embryos im Spaltstadium. (B) Daten von 1135 Blastozysten-Stadium-Embryonen. Die WGA-Erfolgsraten liegen bei beiden Probentypen bei über 95 %. Die Fehlerquote der Sequenzierung der Qualitätskontrolle liegt in der Spaltungsphase bei 3,4 % und in der Blastozysten-Stufengruppe bei nur 1,9 %. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der klinischen Anwendung von PGT-A von Embryonen für die 23 Chromosomenpaare. Repräsentative Ergebnisse der (A) Euploidie; (B) Aneuploidie (seq[GRCh37] (2)x3, (21)x3); (C) Sequenzierung QC fehlgeschlagene Probe aufgrund von CNV-SD bei 0,6571 (Annahme 0,4); (D) segmentale Mosaiklöschung (55%) von 4p16.3p15.1 (29.50 MB). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

CNV-Schwellenwert
(-0.23, 0.20) (-0.32, 0.26) (-0.41, 0.32) (-0.51, 0.37) (-0.62, 0.43) (-0.73, 0.48)
sensibilität 100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 98.30% 96.02%
Spezifität 72.41% 81.03% 91.38% 99.10% 99.54% 100.00%

Tabelle 1: Empfindlichkeit und Spezifität zwischen verschiedenen Log-R-Verhältnissen durch den Halbleitersequenzer. Insgesamt 240 Proben mit bekannten euploiden Karyotyp-Ergebnissen wurden mit dieser Methode getestet und mit unterschiedlichen Log-R-Verhältnissen aufgerufen.

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Discussion

Im Unterscheidet von anderen Sequenzierungschemikalien verwendet der hier beschriebene Sequenzer Halbleiter für die Detektion von Nukleotiden. Der Chip selbst ist ein elektronisches Gerät, das Wasserstoffionen durch polymerase-gesteuerte Basisinkorporation17erkennt, was eine 2-4 h-Sequenzierungszeit des Proton-Programms ermöglicht. Außerdem ist der Chip ein Microwell-Chip, der die Lokalisierung eines Zielmoleküls ermöglicht, das sich von der Durchflusszellsequenzierungschemie durch andere Sequenzeranbieter unterscheidet. Dieses Protokoll ist ein modifiziertes Protokoll, das für die Anwendung von PGT-A optimiert wurde. Die Optimierung umfasst die Fragmentierung der verstärkten DNA durch die enzymatische Methode anstelle der Beschallung, um die Kontaminationsgefahr zu reduzieren, sowie die Größenauswahl und das PCR-System für eine bessere Leistung bei geringeren Kosten. Darüber hinaus haben wir im klinischen Umfeld eine validierte interne Pipeline für Variantenaufrufe verwendet.

Es gibt wichtige Schritte, die Während der Übung bekannt zu sein sind. Ethanol zur Reinigung muss vor dem Experiment frisch zubereitet werden, da eine hohe Ethanolkonzentration zu einer unzureichenden Waschung kontaminierter DNA führen würde, während eine niedrige Konzentration zum Verlust der Ziel-DNA führen würde. Das Fluorometer muss durch die Positivkontrolle mit einer bekannten Konzentration kalibriert werden, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Außerdem ist ein angemessenes Laden der Vorlage entscheidend für die Sequenzierung. Blasen der richtigen Größe helfen, die Schablonenkugel in Mikrobrunnen zu fallen, aber zu große Blasen können zu einer unzureichenden Belastung führen. Benutzer können die Anzahl der Samples (nicht unbedingt 24) ändern, die für jeden Durchlauf sequenziert werden sollen. Es gibt 96 Indizes für diesen Chip. Aber die Lesetiefe wird mit zunehmender Proben pro Chip abnehmen. Eines der häufigsten Probleme ist die geringe Bibliothekskonzentration, die auf eine geringe oder minderwertige DNA-Ausgabe durch Reinigung durch Restethanol oder magnetische Perlen oder das Knacken von Perlen, wie bereits erwähnt, zurückzuführen ist. Eine suboptimale DNA-Ausgabe kann auch durch eine geringe Effizienz der PCR entstehen, die durch eine sorgfältige Vorbereitung des Master-Mix es mit genauen Probeneingaben und Temperaturkontrolle der thermischen Cycler korrigiert werden kann. Für die Sequenzierung von QC-fehlgeschlagenen Proben, z. B. solchen mit hohen CNV-SD-Werten (Abbildung 2C), wird empfohlen, die Proben für die Größenverteilungsanalyse auf einem Bioanalyzer auszuführen.

Eine der Einschränkungen dieser Methode ist ihre höhere falsche Single-Nukleotid-Anrufrate im Vergleich zu anderen Plattformen. Die Fehlerquote beträgt 1% im Vergleich zu nur 0,1% indel falsch positive Rate von anderen Sequenzern17. Dies ist jedoch kein bestimmender Faktor für CNV-Aufrufe oder PGT-A-Analysen. Im Vergleich zu anderen Plattformen minimiert die Anwendung des Emulsionssystems operative Diskrepanzen und Pipettierfehler und erhöht so die Bibliotheksqualität. Dies ist ein wesentlicher Vorteil unserer Methode im Vergleich zu anderen Plattformen, da die dsDNA-Konzentration sehr gering ist und eine genaue Quantifizierung für das folgende Bibliothekspooling erforderlich ist. Unsere Methode führte die Kalibrierung der Fluorometer-Quantifizierung mit einer Standard-Positivsteuerung ein, um Erkennungsfehler zu steuern.

Als Hochdurchsatzplattform mit kurzer Durchlaufzeit ist der Halbleiter-Sequenzer ideal für PGT-A und kann bei IVF-Patienten mit klinischen PGT-A-Indikationen wie fortgeschrittenem mütterlichem Alter24weit verbreitet werden. Deleye et al. führten parallele Sequenzierung menschlicher Blastozysten durch, um die Leistung des Halbleitersequenzers mit anderen Sequenzern zu vergleichen25. Darüber hinaus hat dieses PGT-A-Kit das "spezielle Zulassungsverfahren für innovative Medizinprodukte" von der China Food and Drug Administration erhalten und wurde klinisch für Tausende von Embryonen verwendet. In Bezug auf die Kosten ist der Preis dieser Plattform die Hälfte des Preises pro Giga-Basen im Vergleich zu einer anderen häufig verwendeten Plattform auf dem PGT-A-Markt. Die Trophektodermzellen können zuverlässig die genetischeKonstitution des Embryos 26 darstellen. Diese Methode kann potenziell für PGT für monogene/einzelne Genkrankheiten (PGT-M) entwickelt werden, wie Treff et al.27gezeigt haben. In ihrem Modell erleichterten sie 300 MB bis 1 GB Durchsatz auf PGT-M von 16 Embryobiopsien und verglichen die Ergebnisse mit zwei konventionellen PGT-M-Methoden. Durch die Erfassung und Beladung von 16 Proben erreichte ihre Methode eine mindestens 100-fache Lesetiefe der Zielregion und führte zu 100% Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit27. Der Durchsatz des Halbleiter-Sequenzers durch unser Protokoll kann 15 GB erreichen und es gibt 96 Barcodes entwickelt; Daher kann bei Anwendung auf gezielteS PGT-M eine beträchtliche Anzahl von Embryobiopsien durch einen Chip in einer hohen Lesetiefe sequenziert werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Studie wurde vom General Research Fund (Ref. 14162417) aus Hongkong, der National Natural Science Foundation of China (Ref. 81860272), dem Major Research Plan der Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi (Ref. AB16380219) und den China Postdoctoral Science Foundation Grant (Ref. 2018M630993) aus China.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR tubes, 0.2 mL Axygen PCR-02D-C
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575020
PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free ThermoFisher 10010023
1.0 M NaOH (1.0N) solution SIGMA-ALDRICH S2567 For Melt-off solution. Molecular grade
Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL Fisher Scientific 13-698-791
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or
Equivalent 18 MΩ water system
ThermoFisher 4474524
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
PicoPLEX WGA Amplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Amplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Amplification Plate In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5
Ion PI Annealing Buffer
MyOne Beads Capture Solution
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 ThermoFisher 65001
PicoPLEX WGA Cell extraction buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.
PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion PI Chip Kit v3 ThermoFisher A26771
Ion Chip Minifuge, 230 V ThermoFisher 4479673
Ion PI dATP ThermoFisher A26772
Ion PI dCTP ThermoFisher A26772
Ion PI dGTP ThermoFisher A26772
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ThermoQ–Temperature Dry Bath TAMAR HB-T2-A
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
Ion PI dTTP ThermoFisher A26772
Ion OneTouch 2 Instrument ThermoFisher INS1005527 ThermoFisher Catalog number: 4474778.
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion One Touch ES ThermoFisher 8441-22 ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5
Ethanol SIGMA-ALDRICH 51976 This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.
Qubit 3.0 Fluorometer ThermoFisher Q33216 This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.
Qubit ds DNA HS Assay kit ThermoFisher M2002-02
Qubit Assay Tubes ThermoFisher Q32856
Ion PI Foaming Solution ThermoFisher A26772
Index for barcoding of libraries BaseCare this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)
Ion PI Loading Buffer ThermoFisher A26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer ThermoFisher 4389764
Agencour AMPure XP Kit Beckman Coulter A63880
DynaMag-2 magnet (magnetic rack) ThermoFisher 12321D
Ion PI Master Mix PCR buffer
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Micro 17 75002430
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Nuclease-free water ThermoFisher AM9922 This can be replaced by other brand.
PicoPLEX WGA Nuclease-free water Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Oil bottle Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
double-strand DNA standard This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.
PicoPLEX WGA Preamplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Preamplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Library Amplification Primer Mix ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion OneTouch Reaction Filter Extended kit component in Sheet 5
Recovery Router Extended kit component in Sheet 5
Recovery Tubes Extended kit component in Sheet 5
ISP Resuspension Solution
Ion Proton ThermoFisher DA8600 This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.
Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase ThermoFisher A26772
Ion PI Sequencing Primer
server for sequencer Lenovo T260
Ion PI Sphere Particles
Platinum PCR SuperMix High Fidelity ThermoFisher 4471252
Nalgene 25mm Syringe Filters ThermoFisher 724-2045 Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids.
Ion PI Hi?Q W2 Solution ThermoFisher A26772
Ion PI 1X W3 Solution ThermoFisher A26772
Ion OneTouch Wash Solution C1
The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit ThermoFisher A30044 Extended kit component in Sheet 2
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) ThermoFisher A26772 Extended kit component in Sheet 4
Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit ThermoFisher A26434 Extended kit component in Sheet 5

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